專利名稱：用于在器官、組織和細(xì)胞中非侵入性和定量地監(jiān)控通過離體和體內(nèi)基因靶向誘導(dǎo)的治療 ...的制作方法
用于在器官、組織和細(xì)胞中非侵入性和 定量地監(jiān)控通過離體和體內(nèi)基因靶向誘導(dǎo)的 治療和診斷性轉(zhuǎn)基因表達(dá)的方法
001相關(guān)申請(qǐng)
002本申請(qǐng)涉及2006年3月21日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)， 系列號(hào)60/743620，將其以引用方式并入本文中，且優(yōu)先權(quán)按照35U. S, C. §119對(duì)其要求優(yōu)先權(quán)。
003發(fā)明背景004發(fā)明領(lǐng)域
005本發(fā)明涉及非侵入性地監(jiān)控離體和體內(nèi)遞送的治療性和診 斷性轉(zhuǎn)基因的表達(dá)以用于治療在所有器官，組織和細(xì)胞中的任何疾病 的領(lǐng)域。
006現(xiàn)有技術(shù)說明
007基因治療在各種先天或后天人類疾病的治療中開創(chuàng)了一個(gè) 新的時(shí)代。但是，它的臨床應(yīng)用受到藥物代謝動(dòng)力學(xué)和藥物效應(yīng)動(dòng)力 學(xué)信息的缺乏的限制。需要一個(gè)基本技術(shù)，使得能夠在靶器官或組織 中確定轉(zhuǎn)基因表達(dá)的動(dòng)力學(xué)和分布。迄今為止，主要利用從尸體檢查 或活組織檢查獲得的固定的組織測(cè)量轉(zhuǎn)基因的表達(dá)或?qū)ζ涑上瘛＿€不 能獲得用于在靶器官或組織中非侵入性和定量地測(cè)量轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平 和分布的臨床上可應(yīng)用的技術(shù)。
008近來，通過直接的心肌注射已實(shí)現(xiàn)將一個(gè)或兩個(gè)腺病毒介 導(dǎo)的正電子成像術(shù)(positron emission tomography, PET)報(bào)告基因 的轉(zhuǎn)移至大鼠心臟，最近，通過直接的心肌注射已實(shí)現(xiàn)將和VEGF基因 連鎖的報(bào)告基因轉(zhuǎn)入大鼠心臟。已展示在大鼠和豬心肌中圍繞注射點(diǎn) 的很小的范圍里，報(bào)告基因的病灶性分布的Micro-PET圖象。但是，產(chǎn)生可檢測(cè)的PET信號(hào)所需要的病毒的高效價(jià)通常在心肌中誘導(dǎo)顯著 的炎癥，并阻止了報(bào)告基因的長(zhǎng)期表達(dá)。雖然PET報(bào)告基因成像的原 理很有前景，但是仍然需要為臨床應(yīng)用開發(fā)安全和可應(yīng)用的方法，以 將報(bào)告子-治療性基因遞送到整個(gè)心臟中，并定量地對(duì)治療性基因的表 達(dá)成像。在過去的十年里，我們從失敗的臨床實(shí)驗(yàn)中學(xué)到的教訓(xùn)使我 們意識(shí)到，迫切需要一種新的、更安全的基因遞送策略，以及對(duì)基因 治療的藥物代謝動(dòng)力學(xué)和藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)更好的理解。
009用于評(píng)估轉(zhuǎn)基因表達(dá)的臨床上可應(yīng)用的方法是驗(yàn)證現(xiàn)有的 和新的基因轉(zhuǎn)移策略、開發(fā)和驗(yàn)證任何臨床可應(yīng)用的新載體以及在耙 器官中闡釋轉(zhuǎn)基因表達(dá)成功的關(guān)鍵。但是，這樣的臨床上的方法以前 還不存在。在實(shí)驗(yàn)設(shè)置中，通過原位雜交技術(shù)或使用可以用各種方法 檢測(cè)的報(bào)告基因?qū)崿F(xiàn)基因表達(dá)的評(píng)估。對(duì)于體內(nèi)或離體基因轉(zhuǎn)移研究 來說，該評(píng)估仍需要在尸體檢查分析中進(jìn)行或者需要侵入性方法用于 組織采樣。
010最近利用光學(xué)成像設(shè)備，用于體內(nèi)研究的綠色熒光蛋白和 螢火蟲熒光素酶的成像的進(jìn)步，使得利用光學(xué)技術(shù)以在嚙齒類動(dòng)物中 實(shí)時(shí)分析報(bào)告基因的表達(dá)成為可能。該方法方便而且快速。生物發(fā)光 成像比熒光相對(duì)更加靈敏。但是光傳輸?shù)男适艿搅讼拗?，依賴于組 織類型和組織散射。對(duì)于用于生物發(fā)光，生物發(fā)光信號(hào)的凈減少量為 每厘米組織層厚減少10倍，而如果用于熒光信號(hào)，減少量還要進(jìn)一步 翻倍?？梢姽獾臏p弱限制了該方法在任何比嚙齒類動(dòng)物大的動(dòng)物中的 使用。這些方法沒有一個(gè)可以用于人類。
011本發(fā)明例舉的實(shí)施方案的一個(gè)目的是建立一個(gè)設(shè)想和臨床 上可使用的方法學(xué)，用于長(zhǎng)期非侵入性、定量和重復(fù)地監(jiān)控任何治療 性基因的表達(dá)的量級(jí)，持續(xù)時(shí)間和分布，所述治療性基因通過使用任 何已知的轉(zhuǎn)染方法，例如病毒，脂質(zhì)體，電穿孔，超聲等等，離體或 體內(nèi)粑向到各種組織和器官中。
012發(fā)明簡(jiǎn)述
013本發(fā)明例舉的實(shí)施方案包括2個(gè)部分1)用于在各種組織和器官中，使用報(bào)告子-治療性連鎖的基因 -探針和正電子成像術(shù)、
Y照相機(jī)或單光子發(fā)射計(jì)算斷層照相法，長(zhǎng)期非侵入性、定量和重復(fù)
地監(jiān)控離體靶治療性基因表達(dá)的技術(shù)；和2)用于在各種細(xì)胞，組織
和器官中，使用報(bào)告子-治療性連鎖的基因-探針和正電子成像術(shù)、Y照相機(jī)或單光子發(fā)射計(jì)算斷層照相法，長(zhǎng)期非侵入性、定量和重復(fù)地監(jiān)控體內(nèi)靶治療性轉(zhuǎn)基因表達(dá)的技術(shù)。本發(fā)明的設(shè)備和方法可以用于針對(duì)診斷性和治療性基因轉(zhuǎn)移，監(jiān)控任何器官、組織或細(xì)胞基因治療?？梢允褂靡粋€(gè)或多個(gè)報(bào)告基因，其可以與治療性基因相同或不同。例舉的實(shí)施方案不僅用于脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，也用于任何其他基因轉(zhuǎn)移方法。基因可以在質(zhì)粒上，在細(xì)胞中或者在棵DNA中。
014構(gòu)思是定量地對(duì)報(bào)告基因表達(dá)成像，所述報(bào)告基因在同一個(gè)質(zhì)粒栽體上與治療性基因結(jié)合，以推斷靶組織或器官中治療性基因表達(dá)的水平，位置和持續(xù)時(shí)間。這一策略需要報(bào)告基因和治療性基因在廣泛的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平范圍內(nèi)成比例且持續(xù)的共表達(dá)。閃爍報(bào)告基因-探針成像的原理是將放射性藥品用于與報(bào)告基因產(chǎn)物的基因表達(dá)相互作用的閃爍成像。在其他方法中，正電子成像術(shù)PET由于它的更高的空間分辨率和更高的靈敏度，因而是優(yōu)選的閃爍成像形式。報(bào)告基因或者編碼一種將放射性標(biāo)記的底物轉(zhuǎn)變?yōu)榇x產(chǎn)物(其在表達(dá)報(bào)
告基因的細(xì)胞中反過來被專一地捕獲)的酶，或者編碼選擇性結(jié)合放射性標(biāo)記的配體的受體，或者編碼導(dǎo)致選擇性攝取放射性標(biāo)記核素的跨膜載體(carrier )。
015本發(fā)明的例舉的實(shí)施方案中包括了 4個(gè)主要的部分。第一個(gè)部分是基于具有平衡的報(bào)告子/治療性轉(zhuǎn)基因表達(dá)的報(bào)告子-治療性連鎖的轉(zhuǎn)基因載體的設(shè)計(jì)。皰疹病毒胸苷激酶(HSVl-tk )是最普遍的酶報(bào)告基因，但是它也使內(nèi)源性胸苷磷酸化。已發(fā)現(xiàn)HSVl-tk活性位置(HSVl-sr39tk )的誘變導(dǎo)致比野生型HSVl-tk能更有效利用無環(huán)鳥苷衍生物且更低效利用內(nèi)源性胸苷的酶。存在著幾種策略，這些策略已被證實(shí)能達(dá)到治療性轉(zhuǎn)基因和成像報(bào)告基因的表達(dá)的連鎖。用病毒栽體對(duì)它們?nèi)窟M(jìn)行測(cè)試，因?yàn)槁阗|(zhì)粒/DNA的轉(zhuǎn)染效率太低。我們最先在單一質(zhì)粒中使用兩個(gè)相同的巨細(xì)胞病毒(CMV )啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)一個(gè)報(bào)告基因和一個(gè)治療性基因的表達(dá)。我們的數(shù)據(jù)顯示在心肌中平衡的報(bào)告子-治療性基因和治療性-治療性基因的表達(dá)。我們的結(jié)果表明在一個(gè)載體中2個(gè)相同的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)2個(gè)基因不會(huì)互相影響。
016近來，我們也開發(fā)了一種載體，它具有1個(gè)報(bào)告基因和2個(gè)治療性基因，可以用于監(jiān)控組合的基因治療。另一方面，我們也開發(fā)了幾種不同的方式，以在報(bào)告子和治療性基因表達(dá)不平衡時(shí)優(yōu)化載體設(shè)計(jì)。因此，這個(gè)技術(shù)可以應(yīng)用于在各種器官疾病中使用各種治療性轉(zhuǎn)基因的受控基因治療。
017雖然自身免疫是質(zhì)粒毒性所主要關(guān)心的，但迄今為止沒有令人信服的與DNA疫苗關(guān)聯(lián)的自身免疫的證據(jù)。因此質(zhì)粒DNA可以誘導(dǎo)細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)。當(dāng)DNA單獨(dú)使用時(shí)，這些反應(yīng)的量級(jí)一般是溫和的。靈長(zhǎng)類動(dòng)物的研究和人體試驗(yàn)初步的結(jié)果表明可以通過將DNA和佐劑結(jié)合，或通過用重組病毒栽體或蛋白激發(fā)，或通過佐劑作用和激發(fā)作用誘導(dǎo)更有效特異的免疫反應(yīng)。
018DNA是復(fù)雜的高分子，其免疫學(xué)性質(zhì)隨堿基順序而變化。如用合成寡核苷酸所示，有效的免疫刺激由稱為CpG基序或免疫刺激序列(ISS)的6堿基基序引起。這些序列集中于未甲基化的CpG二核苷酸，且在細(xì)菌DNA中比在哺乳動(dòng)物DNA中更經(jīng)常出現(xiàn)。同樣地，CpG基序可能作為危險(xiǎn)的信號(hào)起作用，以刺激B淋巴細(xì)胞激活和細(xì)胞因子產(chǎn)生。為了減少和消除可能的(但尚未證實(shí)的)質(zhì)粒DNA的免疫原性，可以采取4種策略l)避免使用病毒載體；2)使用脂質(zhì)體封裝以減少免疫反應(yīng)，令人感興趣地，和脂質(zhì)體復(fù)合的DNA也可減少陽(yáng)離子脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性，如我們?cè)谝陨喜糠置枋龅模?)通過在乾器官和組織中定位基因遞送避免異位基因轉(zhuǎn)染；4)構(gòu)建無CpG質(zhì)粒的栽體。在我們的研究中提出的離體和體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移的方法已遵照前3個(gè)要求。最近，我們構(gòu)建了一個(gè)無CpG的、具有由2個(gè)相同的無CpG人延長(zhǎng)因子1 oc( EF-1 oc )啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的HSVl-sr39tk和人IL-10基因的質(zhì)粒載體，pCpGf-EFlHSVlsr39tk-EFlhIL-lO。 *019與CMV載體(最有效但也最有免疫原性的啟動(dòng)子)不同，人EF-lct具有少得多的免疫原性，因?yàn)樗鼛缀醪缓珻pG。 EF-la啟動(dòng)子由Invivogene， San Diego， CA制造，在體內(nèi)呈現(xiàn)強(qiáng)活性并產(chǎn)生持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)。我們目前正在兔同系移植物移植模型中利用我們的脂質(zhì)體介導(dǎo)的離體冠狀動(dòng)脈內(nèi)基因轉(zhuǎn)移方法驗(yàn)證這一栽體。我們已經(jīng)在兔心臟移植模型中在6個(gè)兔心臟同系移植物中利用我們的脂質(zhì)體介導(dǎo)的離體冠狀動(dòng)脈內(nèi)基因轉(zhuǎn)移方法驗(yàn)證了這一栽體。我們的初始數(shù)據(jù)已經(jīng)表明，用這一新的載體誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)比用具有2個(gè)CMV啟動(dòng)子的常規(guī)質(zhì)粒顯著更高。觀察到平衡的報(bào)告子和治療性基因的表達(dá)。在這些兔子中，沒有發(fā)現(xiàn)心臟副作用和免疫原性。
020本發(fā)明例舉的實(shí)施方案的第二個(gè)主要的部分是，報(bào)告探針對(duì)宿主細(xì)胞代謝和功能沒有影響，但針對(duì)和用于成像的同位素的結(jié)合效應(yīng)具有高特異性。
021已研究2個(gè)主要的底物種類，用放射性碘標(biāo)記的尿嘧啶衍生物(例如，I-標(biāo)記的2，氟-2，-脫氧-l-p-D-阿拉伯呋喃糖基-5-碘-尿嘧啶(FIAU) )，和用放射性"F-氟標(biāo)記的無環(huán)鳥苷衍生物(例如，9- (4-rF]-氟-3-羥甲基丁基)鳥嘌呤(FHBG)和8-["F]潘昔洛韋(fluropenciclorivr) ( FPCV ))，作為報(bào)告探針，用于對(duì)HSVl-tk報(bào)告基因表達(dá)的成像。我們發(fā)現(xiàn)FHBG比FPCV是用于在體內(nèi)對(duì)野生型HSV1-tk和HSVl-sr39tk PET報(bào)告基因成像的更有效的探針。
022本發(fā)明例舉的實(shí)施方案的第三個(gè)主要的部分是，在大型動(dòng)物和人的各種器官和組織中臨床上可應(yīng)用的離體和體內(nèi)報(bào)告子和治療性連鎖的基因遞送系統(tǒng)。
02 3大部分報(bào)告基因成像研究是在體外或者通過將基因注射入腫瘤的體內(nèi)。迄今，可獲得很少的關(guān)于心臟中非侵入性的轉(zhuǎn)基因表達(dá)成像的信息。在所有的先前的研究中，報(bào)告基因直接被注射到心肌中。這些研究?jī)H集中在定量地對(duì)注射位點(diǎn)的局部報(bào)告基因表達(dá)的成像。
024我們已開發(fā)了在大型動(dòng)物的整個(gè)心臟中的離體和體內(nèi)基因遞送策略。我們事先開發(fā)了兔異位功能性心臟移植物/急性心臟排斥模型，其是迄今為止可獲得的唯一的功能性心臟移植動(dòng)物模型，且已用 于證實(shí)各種基因轉(zhuǎn)移技術(shù)和治療性基因。我們事先開發(fā)的離體冠狀動(dòng)
脈內(nèi)遞送和脂質(zhì)體介導(dǎo)的IL-10基因治療方法是最詳細(xì)表征的非病毒 基因治療模型，其可再現(xiàn)地誘導(dǎo)了定位的免疫抑制且延長(zhǎng)了心肌同種 異體移植物的生存。我們最近開發(fā)的IL-4和IL-IO聯(lián)合基因治療方法 是唯一成功的基因治療方法，其能在大型動(dòng)物中促進(jìn)同種異體移植物 的耐受性，而不需要常規(guī)免疫抑制試劑。我們已經(jīng)開發(fā)了非病毒的報(bào) 告子-治療性連鎖的離體基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，用于在整個(gè)心臟中，用 microPET非侵入性和定量地監(jiān)控心臟轉(zhuǎn)基因表達(dá)。我們將兔心臟移植 物/IL-10基因治療模型作為工具，通過系統(tǒng)地檢驗(yàn)報(bào)告子-治療性連 鎖基因轉(zhuǎn)移功效和與組織分析結(jié)果相比的PET定量精確性，驗(yàn)證該技 術(shù)的可行性。更重要地，利用這一模型，我們驗(yàn)證并證實(shí)了 PET報(bào)告 子-治療性連鎖基因轉(zhuǎn)移并沒有局部和全身副作用，且報(bào)告基因并不削 弱共轉(zhuǎn)染的治療性基因的治療功效。這些問題在臨床應(yīng)用中是至關(guān)重 要的，但是它在之前的任何報(bào)告基因的研究中從沒有被提出過。因此， 在我們進(jìn)一步改善定量方法的同時(shí)，近來我們針對(duì)microPET對(duì)在兔體 內(nèi)轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)的成像，開發(fā)了冠狀竇退行性報(bào)告子-治療性基因遞 送技術(shù)。最近，我們已展示了在犬類心臟中利用常規(guī)PET掃描器監(jiān)控 體內(nèi)經(jīng)由皮膚的冠狀竇退行性遞送的報(bào)告子-治療性連鎖的轉(zhuǎn)基因表 達(dá)的可行性。
025本發(fā)明例舉的實(shí)施方案的第四個(gè)主要的部分是在靶器官和 組織中用于監(jiān)控治療性轉(zhuǎn)基因表達(dá)的臨床可應(yīng)用的定量方法。
OM到目前為止，從未能夠定量分析報(bào)告基因表達(dá)，且從未檢 驗(yàn)其在心臟中與報(bào)告探針積累的相關(guān)性。雖然已經(jīng)做出嘗試，將具有 報(bào)告子-VEGF連鎖的基因的腺病毒栽體注射入大鼠心肌，但從未檢驗(yàn) 基因表達(dá)水平。尚未建立利用體內(nèi)定量方法在培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞中評(píng)估 報(bào)告蛋白和VEGF蛋白表達(dá)的相關(guān)性。迄今為止，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，用于 microPET成像的信號(hào)的定量仍是通過在給定組織位點(diǎn)中積累的示蹤 物的量(用注射量和被檢驗(yàn)組織的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化，。/。ID/g)來測(cè)量。因此，動(dòng)物必須被處死。收集心臟組織并稱重。在體內(nèi)，心臟質(zhì)量只能基于 總體重來假定。
027在本發(fā)明的例舉的實(shí)施方案中，我們開發(fā)并驗(yàn)證了連續(xù) [18F] -FHBG積累的PET成像的方法用于定量報(bào)告基因的表達(dá)，[18F] -FDG 積累用于活心肌的代謝成像。我們比較了示蹤物積累的量(通過 [18F] -FHBG的。/。ID/g相對(duì)％10- [18F] -FHBG /，- [18F] -FDG的比例評(píng)估) 與轉(zhuǎn)基因和蛋白的表達(dá)水平(通過離體定量RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡分析 評(píng)估)之間的相關(guān)性。HSVl-sr39tk基因和蛋白表達(dá)與y。ID-rF]-FHBG /%ID- [18F] -FDG的比例的相關(guān)性比其與[18F] -FHBG的。/。ID/g的相關(guān)性顯 著更緊密(分別是？=0. 95相對(duì)r2=0. 92， P<0. 05，和r2=0. 94相對(duì) r2-0. 91， P<0. 05) 。 IL-10基因和蛋白水平與°/。ID-[18F]-FHBG /%ID- [1SF] -FDG的比例的相關(guān)性也比其與[18F] -FHBG的。/。ID/g的相關(guān)性 顯著更強(qiáng)(分別是？=0. 97相對(duì)r2=0. 88, P<0. 05，和r2-0. 95相對(duì) r2-0. 91, P<0. 05 )。
028因此，應(yīng)理解的是，本發(fā)明的例舉的實(shí)施方案通過使用報(bào) 告子-治療性連鎖的基因/探針和正電子成像術(shù)、y照相機(jī)或單光子發(fā) 射計(jì)算斷層照相法，在各種組織和器官中長(zhǎng)期非侵入性、定量和重復(fù) 地監(jiān)控離體靶向的治療性轉(zhuǎn)基因的表達(dá)而被最好地實(shí)踐。
02 9本發(fā)明例舉的實(shí)施方案還被通過使用報(bào)告子-治療性連鎖
的基因/探針和正電子成像術(shù)、y照相機(jī)或單光子發(fā)射計(jì)算斷層照相 法，在各種組織和器官中長(zhǎng)期非侵入性、定量和重復(fù)地監(jiān)控體內(nèi)把向 的治療性轉(zhuǎn)基因的表達(dá)而被最好地實(shí)踐。
030我們已經(jīng)證實(shí)了報(bào)告子-治療性連鎖的基因轉(zhuǎn)移在兔和狗 的心臟中的離體基因療法中的效率、功效和副作用。已在兔中檢驗(yàn)了 毒性。
0 31我們還檢測(cè)了報(bào)告子-治療性連鎖的基因轉(zhuǎn)移在兔和狗的 心臟中的體內(nèi)基因療法中的效率、功效和副作用。該技術(shù)用于在其他 器官(如關(guān)節(jié)、肺、肝、腎)中的基因療法的驗(yàn)證是預(yù)期的。
032在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)報(bào)告基因表達(dá)定量成像的步驟包含對(duì)2個(gè)或更多報(bào)告基因表達(dá)定量成像的步驟，其中報(bào)告基因與2個(gè)或 更多轉(zhuǎn)染的基因-探針連鎖，以推斷轉(zhuǎn)染的基因表達(dá)在靶向的組織、器 官或細(xì)胞中的水平、位置或持續(xù)時(shí)間。
033在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)報(bào)告基因表達(dá)定量成像的步驟包 含對(duì)報(bào)告子-治療性連鎖的轉(zhuǎn)基因栽體的表達(dá)定量成像的步驟，所述轉(zhuǎn) 基因栽體的表達(dá)通過質(zhì)粒中帶有定位在報(bào)告基因和治療性或診斷性基 因之間的雙向啟動(dòng)子的平衡的報(bào)告子/治療性或平衡的報(bào)告子/診斷性 的轉(zhuǎn)基因表達(dá)誘導(dǎo)。
034在又一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)報(bào)告基因表達(dá)定量成像的步驟包 含對(duì)平衡的報(bào)告子治療性轉(zhuǎn)基因的表達(dá)定量成像的步驟，或?qū)Τ杀壤?的報(bào)告子和治療性或診斷性轉(zhuǎn)基因的表達(dá)定量成像的步驟。
035在一個(gè)例舉的實(shí)施方案中，對(duì)報(bào)告基因表達(dá)定量成像的步 驟包含對(duì)靶向的器官、組織或細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因或異位轉(zhuǎn)基因表達(dá)定量 PET成像的步驟。
036在另 一個(gè)例舉的實(shí)施方案中，對(duì)報(bào)告基因表達(dá)定量成像的 步驟包含通過同時(shí)測(cè)量代謝探針的表達(dá)和治療性或診斷性轉(zhuǎn)基因的表 達(dá)以及比率化測(cè)量值對(duì)器官、組織或細(xì)胞的強(qiáng)烈轉(zhuǎn)染密度的比率定量 成像的步驟。
037雖然已經(jīng)或?qū)⒁獮榱苏Z(yǔ)法通順和功能說明對(duì)儀器和方法進(jìn) 行描述，但是應(yīng)清楚地理解，除非特別根據(jù)35 USC 112被明確地表達(dá)， 否則權(quán)利要求不應(yīng)理解為通過"方法"或"步驟"限制的結(jié)構(gòu)以任何 方式必要地被限制，而是根據(jù)司法上的等同原則與由權(quán)利要求書提供 的定義的含義和等價(jià)物的全部范圍一致，并且在權(quán)利要求根據(jù)35 USC 112被明確地表達(dá)的情況下，根據(jù)35 USC 112與全部的法定等價(jià)物一 致。通過借助下列附圖(其中相同的元件引用相同的數(shù)字)，可以使 本發(fā)明更直觀。
038附圖簡(jiǎn)述
039

圖1A是展示質(zhì)粒載體結(jié)構(gòu)的圖表，在所述載體中啟動(dòng)子、 報(bào)告基因和治療性基因是連鎖的。040圖1B是展示基因轉(zhuǎn)染效率的柱狀圖。
041圖1C是展示來自sr39tk和hlL-10轉(zhuǎn)基因在各種器官和 心臟區(qū)域中表達(dá)的RT-PCR分析的結(jié)果的圖。
042圖1D是展示針對(duì)報(bào)告子和治療性基因的轉(zhuǎn)基因/GAPDH表 達(dá)比率的劑量依賴性的柱狀圖。
043圖1E是展示針對(duì)連鎖的基因栽體和"空"脂質(zhì)體載體的 轉(zhuǎn)基因/GAPDH表達(dá)比率相對(duì)于手術(shù)后天數(shù)的時(shí)間依賴性的圖。
044圖2A是展示報(bào)告子和治療性基因的蛋白表達(dá)相對(duì)于手術(shù) 后天數(shù)的時(shí)間依賴性的圖。
045圖2B是展示鑒定報(bào)告子和治療性基因共定位的免疫熒光 染色的顯微照片。
046圖2C展示了心臟中各個(gè)位置的報(bào)告子和治療性基因蛋白 質(zhì)印跡分析的結(jié)果，在上面展示了心臟中相同位置的報(bào)告子和治療性 基因的蛋白表達(dá)的柱狀圖。
047圖2D是治療性基因相對(duì)于報(bào)告基因的蛋白表達(dá)的圖，展 示了二者之間的相關(guān)性。
048圖3A是一系列的在不同手術(shù)后天數(shù)拍攝的兔心臟的 microPET圖象。
049圖3B是15只兔的心肌y。ID的時(shí)間依賴性的圖。
050圖3C是一系列的來自兔頸部和胸部的microPET圖象，展 示了與報(bào)告子-治療性連鎖的轉(zhuǎn)基因/ [18F] FHBG探針(僅在頸部的基因 轉(zhuǎn)染的移植供體心臟中，而不在胸部的兔天然心臟中)相比較的代謝 探針(在頸部的供體心臟和胸部的兔天然心臟兩者中)的積累。
051圖4A是一系列的整個(gè)心臟的斷層分析PET圖象，比較了 [188F]FHBG圖象(表明了均勻分布的報(bào)告子-治療性基因表達(dá))和 ["F]FDG圖象(展示了有活力的心肌)。
052圖4B是展示心肌組織中["F]FHBG積累(％ID/g)和離體 移植心臟的Y計(jì)數(shù)以及TK蛋白表達(dá)水平的蛋白質(zhì)印跡量化之間的相 關(guān)性的圖。
1053圖4C是展示供體兔心臟中IL-10基因表達(dá)和 [18F]FHBG/[18F]FDG比率以及["F]FHBG積累(%ID/g )之間的相關(guān)性 的圖。
054圖5A是展示針對(duì)各種組合(脂質(zhì)體與空和報(bào)告子-治療性 基因連鎖的載體復(fù)合)的心臟同種異體移植物的平均存活(天數(shù))的 柱狀圖。
055圖5B是與圖5A的柱狀圖數(shù)據(jù)點(diǎn)相應(yīng)的組織學(xué)顯微照片。056圖5C是圖5A和5B的同種異體移植物的排斥評(píng)分的圖。057圖5D是展示心臟同種異體移植物中通過脂質(zhì)體
pCMVh IL-10基因治療和通過報(bào)告子-治療性連鎖的基因治療減少的
CD3+淋巴細(xì)胞滲透的比較的柱狀圖。
058圖5E是展示針對(duì)用不同載體組合處理的各種心臟同種異
體移植物的左心室收縮壓與對(duì)照(同種異體移植物)和同系移植物中
的左心室收縮壓相比)的柱狀圖。
0"圖5F是展示圖5E的同種異體移植物中心律不齊的事件的
數(shù)目的柱狀圖。
060本發(fā)明及其各個(gè)實(shí)施方案可以通過借助下列優(yōu)選的實(shí)施方 案的詳細(xì)描述更好的理解，所述優(yōu)選實(shí)施方案是作為權(quán)利要求中定義 的本發(fā)明的例舉的實(shí)施例而提出的。應(yīng)清楚地理解，通過權(quán)利要求定 義的本發(fā)明可以比下面描述的例舉的實(shí)施方案更廣泛。
061優(yōu)選實(shí)施方案詳述
062例舉的實(shí)施方案是臨床可應(yīng)用的方法，其可用于在大型動(dòng) 物的整個(gè)心臟中利用PET成像非侵入地監(jiān)控報(bào)告子和治療性連鎖的基 因表達(dá)。已在兔頸部異位功能心臟移植模型中驗(yàn)證了報(bào)告子和治療性 連鎖的基因轉(zhuǎn)移的功效和心臟副作用。在移植前，與載體(包含單純 皰疹病毒1型突變體胸苷激酶(HSVl-sr39tk)作為報(bào)告基因和重組人 免疫抑制細(xì)胞因子，白介素-10 (hIL-lO)作為治療性基因)復(fù)合的陽(yáng) 離子脂質(zhì)體冠狀動(dòng)脈內(nèi)離體遞送入心臟同種異體移植物。在同種異體 移植物中觀察到，HSVl-sr39tk和hlL-10轉(zhuǎn)基因和蛋白長(zhǎng)期的過表達(dá)與心肌PET報(bào)告探針9- (4-["F]-氟-3-羥甲基丁基)鳥嘌呤 ([18F]FHBG)的積累相關(guān)。HSVl-sr39tk基因的表達(dá)與hlL-10基因表 達(dá)和總心肌的「F]FHBG積累(量化為靜脈內(nèi)注射的[18F]FHBG的劑量 的百分比)有顯著相互關(guān)系。在整個(gè)心臟中看到[18F] FHBG積累的均勻 分布，類似于["F]氟脫氧葡萄糖(PET葡萄糖代謝探針)的分布。在 用報(bào)告子-治療性連鎖的基因和僅用治療性基因處理的同種異體移植 物中，免疫抑制治療功效保持相同。沒有發(fā)現(xiàn)心臟副作用。我們的結(jié) 果第一次表明PET報(bào)告子-治療性連鎖的基因成像可應(yīng)用于在整個(gè)心 臟中非侵入性地監(jiān)控離體冠狀動(dòng)脈內(nèi)遞送的治療性轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。
063例舉的實(shí)施方案關(guān)注于臨床可應(yīng)用的方法，用于離體將非 病毒介導(dǎo)的PET報(bào)告子-治療性連鎖的轉(zhuǎn)基因冠狀動(dòng)脈內(nèi)遞送至大型 動(dòng)物的真?zhèn)€心臟中。報(bào)告子-治療性基因/探針的PET成像的精確性用 于非侵入性和定量地監(jiān)控治療性轉(zhuǎn)基因表達(dá)的分布和動(dòng)力學(xué)，并利用 兔異位功能心臟移植模型檢驗(yàn)心臟副作用和驗(yàn)證報(bào)告子/免疫抑制的 治療性基因療法的功效。
064在考慮例舉的實(shí)施方案的方法學(xué)的結(jié)果和驗(yàn)證之前，考慮
作為例舉的實(shí)施方案進(jìn)行的方法。必須清楚地理解，在例舉的方法學(xué) 中可以作出許多不同的改變而不脫離本發(fā)明的范圍。
065首先述及脂質(zhì)體-基因復(fù)合物的制備。如圖1A中圖解說明 的，我們構(gòu)建了質(zhì)粒載體10，其包含突變體單純皰滲病毒l型胸苷激 酶基因(HSVl-sr39tk)(作為PET報(bào)告基因12 )和人重組白介素10 基因(作為治療性基因14)，它們通過2個(gè)相同的CMV啟動(dòng)子16驅(qū) 動(dòng)。由GIBCO BRL提供在陽(yáng)離子脂質(zhì)基本骨架的2，3-二氧-丙銨類
(propaniminium)中的陽(yáng)離子脂質(zhì)體GAP: DLRIE,其還包括(+) 一N- (2-羥乙基)-N，N- 二甲基-2，3-雙(十四烷氧基)-l-溴丙銨
(propaniminium bromide ) (DLRIE) 、 N-[l-(2， 3-二油酰氧)丙 基]-N，N，N-三甲基銨、1，2-雙(油酰氧)-3-(三甲基銨基)丙烷和2，3-二油酰氧-N- [2- (精胺甲酰胺基(sperminecarboxa邁ido ))乙基]-N, N-二甲基-1-丙銨。pCMVHSVl-sr39tk 、pCMV-hIL-lO 或pCMV-HSVl-sr39tk-CMV-hIL-10 cDNA (50 jag)的最佳濃度是通過20 分鐘溫和渦旋與脂質(zhì)體(50 jig)復(fù)合。
066如下使用異位功能頸部心臟移植模型和離體冠狀動(dòng)脈內(nèi)基 因遞送。從地理學(xué)上不相關(guān)的賣主購(gòu)買重3. 5kg的新西蘭白色供體兔 (Charles River Laboratories, St. Constant, QC， Canada)和重4kg 的受體兔(Myrtle's Rabbitry， Thompson Station, TN， USA)。之前 已描述該不匹配急性排斥反應(yīng)模型的病理學(xué)特征。簡(jiǎn)而言之，在全身 麻醉下，通過經(jīng)由大動(dòng)脈套管灌輸威斯康星州大學(xué)溶液(University of Wisconsin solution) ( 48C， 20 ml/kg， 120 ml/h)使供體兔心 臟停止跳動(dòng)。在20分鐘內(nèi)，通過離體冠狀動(dòng)脈內(nèi)灌輸施用在10邁l 正常鹽溶液中的脂質(zhì)體-基因復(fù)合物。使供體大動(dòng)脈和肺動(dòng)脈分別與受 體近端的右頸動(dòng)脈和普通的頸靜脈吻合，使左和右心房分別與受體的 遠(yuǎn)端右頸動(dòng)脈和普通的肺動(dòng)脈吻合。
067在IL-10基因療法組中手術(shù)后第2、 4、 6、 8、 12、 20和 28天以及在對(duì)照組中手術(shù)后第2、 4、 6和8天進(jìn)行Micro-PET掃描。 往受體兔靜脈內(nèi)注射1 mCi的["F]FHBG PET報(bào)告探針。靜置lh以使 得示蹤物攝取和清除之后，用micro-PET-P4 (PrimateP4; Concorde Microsystems, Inc., Knoxville， TN， USA)在頸部和胸部上對(duì)兔成 像45分鐘。Micro-PET圖象數(shù)據(jù)通過過濾的反投影重建并且重新定位 至短，垂直和水平長(zhǎng)軸切片。利用從掃描圓柱模型(cylindrical phantom)獲得的校準(zhǔn)常數(shù)，將從前面偏一邊的壁上的關(guān)注的區(qū)域 (short axis cut)得到的計(jì)數(shù)/象素/分鐘轉(zhuǎn)化為計(jì)數(shù)/ml/分鐘。 將所關(guān)注的區(qū)域(ROI)計(jì)數(shù)/ml/分鐘轉(zhuǎn)化為計(jì)數(shù)/g/分鐘(假定組織 密度為lg/ml )并除以注射劑量，以獲得源自ROI圖象的[18F]FHBG的 百分比注射劑量每克的心臟(％ID/g)。在每個(gè)關(guān)注的區(qū)域中，對(duì)總心 肌TF]FHBG劑量作背景活性校正，針對(duì)12個(gè)切片求和，并表達(dá)為。"D - (在l2個(gè)關(guān)注的區(qū)域(ROI)左心室(LV)中的總活性(MBq) -在 l2個(gè)ROI BG中的總活性(MBq) ) /注射劑量(MBq ) x 100。在掃描 [18F]FHBG的前一天，將2-["F]氟-2-脫氧-d-葡萄糖(1 mCi )注射入兔的耳靜脈。進(jìn)行["F]FDG掃描1小時(shí)。在["F]FDG注射后，利用與 用于[1SF] FHBG的相同的方法進(jìn)行心肌代謝PET成像60分鐘。
068如下在移植的心臟中進(jìn)行18F放射性的Y計(jì)數(shù)。在 micro-PET掃描后，在y孑匕計(jì)數(shù)器(Cobra II Auto-Gamma， Packard) 中針對(duì)"F放射性對(duì)移植的心臟計(jì)數(shù)。["F]FHBG的總心積累表達(dá)為y。ID。
069如下進(jìn)行用于評(píng)價(jià)基因轉(zhuǎn)移效率的原位雜交。為了確定基 因轉(zhuǎn)移效率，合成HSVl-sr39tk和hlL-lG mRNA的反義和有義洋地黃 毒苷標(biāo)記的核糖核酸探針(Boehringer Mannheim )并且如之前描述的， 將其用于石蠟切片上的原位雜交。基因轉(zhuǎn)移效率被確定為染上藍(lán)色的 陽(yáng)性細(xì)胞在總心肌細(xì)胞中(在每個(gè)切片的10倍鏡的顯微視野(放大率 為x 400 )中計(jì)數(shù))的百分比。轉(zhuǎn)基因不僅在心肌細(xì)胞中表達(dá)，而且也 在內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá)。僅把那些沒有血管的觀察視野 用于分析。隨后用蘇木精和伊紅(H&E)染色的切片用于辨別心肌細(xì)胞 和其他細(xì)胞。
070如下進(jìn)行比較反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)分析。使 用之前描述的引物和方法，進(jìn)行比較反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以檢測(cè) HSV1-sr39tk和hIL-10在心臟同種異體移植物中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。構(gòu)建 了 3個(gè)竟?fàn)幮阅０?CT)，每一個(gè)分別針對(duì)HSVl-sr39tk， hlL-10和看 家基因GAPDH。每一個(gè)CT的擴(kuò)增產(chǎn)物在大小上與原始的70-170 bp的 cDM產(chǎn)物不同。為了控制單獨(dú)的RT-PCR反應(yīng)(從中提取樣本cDNA模 板)的效率，首先使用相同的擴(kuò)增技術(shù)以測(cè)量看家基因GAPDH的表達(dá)。 對(duì)來自每一個(gè)單獨(dú)RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物的相當(dāng)于50 ng總RM的 HSVl-sr39tk和hIL-lO cDNA樣本進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂?，以包含CT cDNA 的相等濃度，并且根據(jù)樣本中GAPDH的表達(dá)對(duì)其進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。對(duì)于每 一個(gè)具體的基因，5 ju 1的標(biāo)準(zhǔn)化的RT-PCR產(chǎn)物與固定量的基因特異 性CT DNA —起共擴(kuò)增。通過比較它們各自樣本的測(cè)試基因cDNA/CT DNA 的比率乘以在比較模板RT-PCR中針對(duì)具體基因使用的CT DNA固定量， 確定各種樣本中測(cè)試基因cDNA的相對(duì)量。另外，所有的樣本根據(jù)各自 的GAPDH cDNA/CT DNA比率進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。該標(biāo)準(zhǔn)化控制了在所有樣本中加栽的cDNA的量。PCR樣本在2%的瓊脂糖膠上跑膠。用Eagle Sight 3. 0軟件(Stratagene， La Jolla， CA， USA)測(cè)量溴化乙錠發(fā)光的強(qiáng) 度，以獲得數(shù)字圖象釆集，處理和分析。該軟件提供了凝膠圖象的相 對(duì)密度的分析，其代表了象素的二維陣列。用NIH Image 1.54進(jìn)一步 分析和量化凝膠圖象。
071如下進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。將蛋白(lOOA-jag)進(jìn)行SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳。印跡與1: IOOO稀釋的鼠抗人IL-10單克隆抗體 (eBioscience， San Diego, CA， USA )或與1: 1000稀釋的兔抗胸苷 激酶抗體(來自M. E. Black, University of Washington, Seattle, WA， USA)溫育，然后與山羊抗鼠或大鼠抗兔IgG二抗溫育(Jackson Laboratories, West Grove, PA， USA)。
072如下進(jìn)行用于評(píng)價(jià)蛋白表達(dá)的分布的雙免疫熒光染色。在 10%山羊血清中封閉石蠟切片2個(gè)小時(shí)。切片用1:100稀釋的鼠抗人 IL-10單克隆抗體(eBioscience )和1: 100稀釋的兔抗胸苷激酶抗體 溫育過夜。然后切片用山羊抗鼠IgG-FITC結(jié)合的二抗和大鼠抗兔 IgG-RPE結(jié)合的二抗(Southern Biotechnology, 1: 100 )孵育90分 鐘。
073如下進(jìn)行組織學(xué)分析和心臟同種異體移植物的排斥評(píng)分。 在LV組織的連續(xù)切片上進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的H&E染色用于組織學(xué)評(píng)價(jià)。基于由 心肺移植國(guó)際協(xié)會(huì)(International Society for Heart and Lung Transplantation )建立的在心臟排斥的診斷中的命名法的標(biāo)準(zhǔn)，確定 心臟同種異體移植物的排斥評(píng)分。
074如下進(jìn)行用于檢驗(yàn)滲透細(xì)胞的免疫組化染色。連續(xù)切片用 生物素化的抗兔CD3—抗(Spring Valley Laboratories, Woodbine, MD， USA)溫育1小時(shí)。用AutoProbe III試劑盒(Biomed Corp. ， Foster City, CA, USA)和H&E復(fù)染檢測(cè)抗體-生物素綴合物。
075如下進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移和心臟同種異體移植物功能的致心律失 常效應(yīng)的評(píng)估。為了檢測(cè)基因轉(zhuǎn)移的致心律失常效應(yīng)，在心臟同種異 體移植物移植后24小時(shí)，在心臟同系移植物和同種異體移植物上連續(xù)
20記錄ECG l小時(shí)。為了評(píng)價(jià)心臟功能，來自對(duì)照和處理組的移植物在 ECG記錄后立即進(jìn)行經(jīng)心房的導(dǎo)管插入，以量化左和右心室壓。用 B10pac MP100系統(tǒng)(BI0pac， Inc., Santa Barbara, CA， USA)確定 最高收縮壓。
076所有的數(shù)據(jù)表示為平均值+標(biāo)準(zhǔn)差。進(jìn)行配對(duì)或未配對(duì) Student t檢驗(yàn)以比較2組的差異。P<0. 05認(rèn)為有顯著性。
077已經(jīng)說明了所使用的方法的詳情，轉(zhuǎn)而考慮所述方法的結(jié) 果。首先，考慮離體冠狀動(dòng)脈內(nèi)遞送和脂質(zhì)體介導(dǎo)的報(bào)告子-治療性連 鎖的基因轉(zhuǎn)移的效率。心臟同種異體移植物中的脂質(zhì)體介導(dǎo)的離體報(bào) 告子-治療性連鎖的基因轉(zhuǎn)移的效率(通過原位雜交評(píng)價(jià))是適當(dāng)?shù)?分 別是15. 5和15. 4%)。報(bào)告基因的基因轉(zhuǎn)移效率和治療性基因的基因 轉(zhuǎn)移效率一樣。當(dāng)或者報(bào)告子或者治療性基因單獨(dú)轉(zhuǎn)移時(shí)，它也是類 似的(分別是15. 3和15. 7%，如在圖1B的柱狀圖中所示)。在圖1B 中在供體心臟(在手術(shù)后第8天，用單獨(dú)的報(bào)告基因pCMVsr39tk(n-8)， 單獨(dú)的治療性基因pCMVhIL-10 (n-8)或報(bào)告子-治療性連鎖的基因轉(zhuǎn) 染(pCMVsr39tk -CMVhIL-lO， n - 8))之間比較基因轉(zhuǎn)染的效率。 轉(zhuǎn)基因不僅在心肌細(xì)胞中表達(dá)，還在內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞中以 稍微更高的基因轉(zhuǎn)移效率表達(dá)(分別是18. 8和17. 1%)。
078在整個(gè)心臟中報(bào)告子和治療性基因表達(dá)的分布和共定位
(通過RT-PCR和RNA印跡分析)揭示了 PET報(bào)告基因和hlL-10二者 都僅在心臟同種異體移植物中表達(dá)，而不在受體的心臟，腦，肺，肝， 腎和骨骼肌中表達(dá)，如在圖1C的柱狀圖中所示。冠狀動(dòng)脈內(nèi)基因遞送 導(dǎo)致共定位和均勻分布的報(bào)告子和治療性基因在整個(gè)心臟中過表達(dá)
(圖1C)。圖1C的頂部展示了來自在心臟同種異體移植物的LV (道 1和2)和受體心臟，肺，腦，肝，腎和骨骼肌(道3-8)中的sr39tk 和hIL-10轉(zhuǎn)基因表達(dá)的定量RT-PCR分析的代表性數(shù)據(jù)。圖1C的底部 展示了在心臟同種異體移植物的左心室(LV)，室間隔(IVS)，右心 室(RV)，左心房(LA)和右心房(RA)中均勻分布的過表達(dá)的報(bào)告 子和治療性轉(zhuǎn)基因的定量RT-PCR分析。079考慮報(bào)告子和治療性轉(zhuǎn)基因表達(dá)的量級(jí)和時(shí)間進(jìn)程。在靶 向的器官中轉(zhuǎn)基因表達(dá)是劑量依賴性的，如在圖1D的柱狀圖中所示。 sr39tk和hlL-10轉(zhuǎn)基因cDNA在心臟同種異體移植物中的表達(dá)的劑量 依賴性在圖1D中用柱狀圖總結(jié)。在手術(shù)后(p.o.d.)第8天收集心臟 組織樣本。定量的sr39tk和hlL-IO轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平圖示為與看家基 因GAPDH表達(dá)的比率"P〈0. 05)。我們觀察到在全劑量范圍里報(bào)告子 和治療性轉(zhuǎn)基因表達(dá)的平行增加(除了最高劑量之外)。早在手術(shù)后 第2天就可以在供體心臟中觀察到HSVl-sr39tk和hlL-10轉(zhuǎn)基因表達(dá) 的顯著增加，并在手術(shù)后第8天達(dá)到頂峰，而后緩慢下降，如在圖1E 的時(shí)間曲線圖中所示。在圖1E中通過RT-PCR評(píng)估sr39tk和hIL-lO 基因在用報(bào)告子-治療性連鎖的基因或"空"脂質(zhì)體處理的同種異體移 植物中表達(dá)的時(shí)間依賴性。為了確定轉(zhuǎn)基因和蛋白表達(dá)的時(shí)間進(jìn)程， 在Lipsr39TKhlL-10處理組中，在p. o. d.第0天(n - 5)、第2天(n - 5)、第4天(n - 5)、第6天(n - 8)、第8天(n -15)、第12 天(n = 5)、笫18天(n = 5)或第28天(n - 5)天處死動(dòng)物，并收 集左心室組織用于分析。在用空脂質(zhì)體處理的對(duì)照組中，大部分同種 異體移植物只能存活8天；因此在p, o. d.第O天(n- 5)、第2天(n =5)、第4天(n = 5)、第6天(n - 8)或第8天(n -15)處死動(dòng)物 并收集左心室組織。在心臟同種異體移植物中，由報(bào)告子-治療性連鎖 的基因誘導(dǎo)的報(bào)告子基因表達(dá)的量級(jí)和時(shí)間進(jìn)程與治療性轉(zhuǎn)基因表達(dá) 的量級(jí)和時(shí)間進(jìn)程相似，還與分開轉(zhuǎn)移的這2個(gè)基因表達(dá)的量級(jí)和時(shí) 間進(jìn)程相同。
080考慮報(bào)告子和治療性基因產(chǎn)物的平衡表達(dá)的動(dòng)力學(xué)。蛋白 質(zhì)印跡分析表明，HSVl-sr39tk和hIL-lO兩者的蛋白表達(dá)的時(shí)間進(jìn)程 與基因表達(dá)的時(shí)間進(jìn)程相同，如在圖2A中所示，圖2A描述了 TK和 IL-IO蛋白在心臟同種異體移植物中過表達(dá)的時(shí)間依賴性。最重要的 是，IL-10蛋白表達(dá)在同種異體移植物中表達(dá)的量級(jí)和時(shí)間進(jìn)程與 HSVl-sr39tk的量級(jí)和時(shí)間進(jìn)程一致。
081考慮報(bào)告子和治療性基因產(chǎn)物的分布和共定位。雙免疫熒光染色揭示了 ， HSVl-sr39tk和hIL-IO蛋白在心肌中表達(dá)的均勻分布 和共定位，如在圖2B中所示，圖2B展示了免疫熒光染色的結(jié)果以鑒 定TK和IL-10蛋白在心臟同種異體移植物中表達(dá)的共定位。蛋白質(zhì)印 跡分析表明在供體心臟的左心房(LA)，右心房(RA)，右心室(RV)， 室間隔(IVS)和左心室(LV)中HSVl-sr39tk和IL-IO兩者蛋白水平 相似，如在圖2C中所示，圖2C中蛋白質(zhì)印跡分析的代表性結(jié)果表明 過表達(dá)的TK和IL-IO在LV,RV,IVS,LA和RA中均勻分布。通過ELISA 檢驗(yàn)，與具有用"空"脂質(zhì)體(作為對(duì)照)處理的同種異體移植物的 受體兔相比，在受體的腦，肺，脾，肝，腎和骨骼肌中，在所有時(shí)間 相位，HSVl-sr39tk和IL-1G濃度沒有顯著變化。
082圖2D中展示了報(bào)告子和治療性基因和蛋白表達(dá)之間的相 關(guān)性。在心臟同種異體移植物中報(bào)告子基因表達(dá)與治療性基因表達(dá)有 顯著相互關(guān)系(r = 0.94， P < 0.001，數(shù)據(jù)未展示)。另外，在靶向 心肌中HSVl-sr39tk蛋白表達(dá)也與IL-10蛋白表達(dá)非常緊密相關(guān)(圖 2D)，圖2D中明確證明了在用報(bào)告子-治療性連鎖的基因轉(zhuǎn)染的心臟 同種異體移植物中TK和IL-10蛋白水平之間的相關(guān)性。
083圖示地表明了報(bào)告子-治療性連鎖的基因在整個(gè)心臟中表 達(dá)的Micro-PET成像。此處，我們已首次能夠展示9- (4-[18F]-氟-3-羥甲基丁基)鳥嘌呤(["F]FHBG)在整個(gè)心臟(用報(bào)告子-治療性連鎖 的基因pCMV-HSVl-sr39tk-CMVhlL-10轉(zhuǎn)染)中的均勻分布，如在圖 3A的圖象中所描述。展示了 ["F]FHBG在兔心臟同種異體移植物心肌中 積累的Micro-PET成像。植入受體兔(用脂質(zhì)體-pCMVsr39tk-CMVhIL-lO離體冠狀動(dòng)脈內(nèi)遞送)頸部的供體兔心臟同種異體移植物 的代表性橫斷面圖象。在p.o.d.第4天，觀察到明顯的示蹤物積累。 在p. o. d.第8天，觀察到[18F] FHBG在LV心肌中的均勻分布。在p. o. d. 第1S和"天觀察到rF]FHBG活性的下降，同時(shí)由于急性同種異體移 植物排斥反應(yīng)出現(xiàn)了 LV增厚。與此相反，在p.o.d.第8天，在用空 脂質(zhì)體或脂質(zhì)體-pCMVhIL-lO處理的同種異體移植物中沒有觀察到 「F]FHBG積累?？梢栽缭趐. o. d.第2天，在pCMV-HSV1-sr39tk-CMVhlL-10處理的心臟同種異體移植物中觀察到積累的 [18F]FHBG的PET成像，并在p. o. d.第8天到達(dá)峰值，在p.o. d.的12 天維持高水平并緩慢下降，如圖2A和2B所示。圖3B的圖展示了從 15只兔子中連續(xù)掃描的micro-PET圖象計(jì)算出的心肌[18F] FHBG積累 %ID的時(shí)間進(jìn)程。報(bào)告探針活性的清晰信號(hào)持續(xù)至超出p. o. d. 28天。 通過長(zhǎng)期、重復(fù)和非侵入性的PET成像觀察到的[18F] FHBG活性的動(dòng)力 學(xué)與在組織樣本的轉(zhuǎn)基因和蛋白測(cè)量(如在圖1E中所觀察到的)中觀 察到的類似。我們?cè)诳罩|(zhì)體或pCMVhlL-10處理的同種異體移植物中 沒有看到["F]FHBG活性。我們僅在頸部的靶向的供體心臟中觀察到 tf]FHBG活性，而沒有在受體天然心臟或其他器官，如肺，腦，骨骼 肌或肝中觀察到rF]FHBG活性，如在圖3C中所示，圖3C是與代謝探 針(「F]FDG)積累比較的報(bào)告子-治療性連鎖的轉(zhuǎn)基因/rF]FHBG探 針積累的定位的micro-PET成像。與此相反，在圖3C中，我們?cè)诠w 心臟以及受體心臟和肢骨骼肌和頸部中觀察到顯著的2-[188F]氟-2-脫氧-d-葡萄糖(TF]FDG)活性。
084我們?cè)诠w心臟中看到的tf]FHBG的均勻分布與圖4A中 由「F]FDG展示的分布類似，圖4A是整個(gè)心臟micro-PET圖象的斷層 分析視圖。圖4A中，["F]FHBG圖象示范了在整個(gè)心臟中均勻分布的 報(bào)告子-治療性基因表達(dá)，[18F]FDG圖象展示了有活力的心肌。比色刻 度尺表達(dá)為。/JD/g。雖然脂質(zhì)體的基因轉(zhuǎn)移效率比腺病毒的基因轉(zhuǎn)移效 率低5倍，但是用這個(gè)先進(jìn)的高分辨率PET系統(tǒng)仍可以在短，垂直和 水平軸圖象中的RV和LV壁和IVS中清楚地看到["F]FHBG活性的擴(kuò)散 分布。
085考慮治療性轉(zhuǎn)基因表達(dá)的量化。在來自用 pCMV-HSVl-sr39tk-pCMVhlL-10處理的同種異體移植物的LV中18F放 射性的傳統(tǒng)Y計(jì)數(shù)比來自用pCMVhIL-10或空脂質(zhì)體處理的同種異體 移植物的"F放射性的傳統(tǒng)y計(jì)數(shù)高17 F - 4倍。離體移植心臟的18F y 計(jì)數(shù)活性與ROI衍生的micro-PET ["F]FHBG活性高度相關(guān)，如在圖 4B中所示，圖4B展示了心肌組織中["F]FHBG積累(％ID/g)和離體移植心臟的Y計(jì)數(shù)或蛋白質(zhì)印跡量化的TK蛋白表達(dá)水平之間的相關(guān) 性。量化為靜脈內(nèi)注射的[18F]FHBG劑量(°/JD/g)百分比的總心肌 TF]FHBG積累顯著與心肌中的HSVl-sr39tk mRNA水平(r2 = 0. 83， P < 0.001,數(shù)據(jù)未顯示)和圖4B中的HSVl-sr39TK蛋白水平相關(guān)。在 用pCMV-HSVl-sr39tk-pCMVhIL-10處理的同種異體移植物中或僅用 pCMVHSVl-sr39tk處理的同種異體移植物中HSV1-srt39tk蛋白水平和 FHBG。/。ID/g之間的相關(guān)性保持相同。最重要的是，hlL-10基因和蛋白 表達(dá)水平也與rF]FHBG積累高度相關(guān)(分別是r2 = 0.88， P < 0.001 和r2 - 0. 91， P < 0. 001 )(圖4C)，圖4C展示了供體心臟中IL-IO 基因表達(dá)和["F]FHBG/["F]FDG比率或["F]FHBG積累(％攝取劑量 (ID/g))之間的相關(guān)性?？梢酝ㄟ^在活組織中測(cè)量轉(zhuǎn)染的報(bào)告基因 或分子(如「F]FHBG)的射線照片密度和測(cè)量葡萄糖標(biāo)記分子(如 [18F] FDG )的射線照片密度完成定量成像。這兩個(gè)射線照片密度的比率 提供了每單位體積，每單位質(zhì)量或每任何其他單位化量度標(biāo)準(zhǔn)的器官， 組織和細(xì)胞攝取的轉(zhuǎn)染物質(zhì)的量的定量方法。在體內(nèi)實(shí)例中，不存在 其他實(shí)用的方法以獲得精確度量的體積或質(zhì)量或器官，組織或細(xì)胞， 因?yàn)椴煌膫€(gè)體之間或甚至單一個(gè)體身體內(nèi)部的不同位置之間器官， 組織和細(xì)胞的體積和質(zhì)量大小變化很大。對(duì)在活組織中攝取的葡萄糖 進(jìn)行標(biāo)記，然后計(jì)算它與攝取的轉(zhuǎn)染物質(zhì)的比率，提供了精確的對(duì)轉(zhuǎn) 染密度定量測(cè)量或作圖的方法。
086迄今為止，micro-PET成像信號(hào)的量化仍是通過在給定的 組織位置中積累的示蹤物的量(用注射量和所檢驗(yàn)組織的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化， MID/g)來測(cè)量。在體內(nèi)，心臟質(zhì)量只能基于總體重來推斷。此處我們 驗(yàn)證了 rF]FHBG積累(用于定量報(bào)告基因表達(dá))和「F]FDG積累(用 于活心肌的代謝成像)的連續(xù)PET成像方法。我們比較了示蹤物積累 的量(通過「F]FHBG的。/。ID/g相對(duì)^ID ["F〗FHBG/ %ID ["F]FDG的比 率評(píng)估)與轉(zhuǎn)基因和蛋白表達(dá)水平(通過離體定量RT-PCR和蛋白質(zhì)印 跡分析評(píng)估)之間的相關(guān)性。HSVl-sr39tk基因和蛋白表達(dá)與。/ilD ["F]FHBG〃oID TF]FDG的比率的相關(guān)性顯著比它與[18F] FHBG的。/。ID/g
25的相關(guān)性更緊密(分別是r2 = 0.95相對(duì)r2 - 0.92， P < 0.05，和 r2 - 0. 94相對(duì)r2 - 0.91， P < 0. 05 ) 。 IL-10基因和蛋白表達(dá)與WID
「F]FHBG/ %ID [18F]FDG的比率的相關(guān)性也顯著比它與[18F]FHBG的 。/。ID/g的相關(guān)性更強(qiáng)(分別是r2 = 0. 97相對(duì)r2 - 0.88， P < 0.05， 和r2 = 0. 95相對(duì)r2 = 0. 91， P < 0. 05，在圖4C中)。
087考慮報(bào)告子-治療性連鎖的基因轉(zhuǎn)移的治療功效和副作用。 在p. o.d.第2， 34， 6， 8， 12， 20和28天監(jiān)控的2小時(shí)期間，報(bào)告 子-治療性連鎖的基因轉(zhuǎn)移不影響同系移植物(在近交的新西蘭兔的第 三代上進(jìn)行心臟移植)中的RV和LV收縮壓或者心率。沒有發(fā)現(xiàn)明顯 的致心律失常效應(yīng)。我們還檢驗(yàn)了報(bào)告子-治療性連鎖的轉(zhuǎn)基因是否會(huì) 削弱免疫抑制基因治療的功效。在圖5A的柱狀圖中，心臟同種異體移 植物的存活從用空脂質(zhì)體或pCMV-HSVl-sr39tk處理的同種異體移植 物中的7 ± 1天增加到用pCMV-HSVl-sr39tkpCMVhlL-10或 pCMVhlL-10處理的同種異體移植物中的28 ± 7天。圖5A-5F展示了 心臟同種異體移植物中報(bào)告子-治療性連鎖的基因轉(zhuǎn)染對(duì)心臟功能和 基因治療功效的影響。圖5A是心臟同種異體移植物(用空脂質(zhì)體(Lip; n-15)，脂質(zhì)體-pCMVsr39、k (Lip-TK; n=15)，月一質(zhì)體-pCMVhIL-lO
(Lip-IL-10; n=15 )或脂質(zhì)體-PCMVsr39tk-CMVhIL-10 ( Lip-TK-IL-10; n=l5)處理)中平均存活的比較的柱狀圖。在圖5B的顯微照 片中，在用與報(bào)告基因連鎖或不連鎖的治療性基因處理的同種異體移 植物中，排斥反應(yīng)評(píng)分也相同程度的改善，圖5B是p.o.d.第8天在 心臟同種異體移植物(用空脂質(zhì)體(Lip),脂質(zhì)體-pCMVsr39tk
(Lip-TK )，脂質(zhì)體-pCMVhIL-10 ( Lip-IL 10 )或脂質(zhì)體 -pCMVsr39tk-CMVhlL-10 (Lip-TK- IL 10)處理)的左心室組織中的 代表性組織學(xué)檢查所見(H&E染色)。我們?cè)谟脠?bào)告子-治療性連鎖的 基因或單獨(dú)用治療性基因處理的同種異體移植物中發(fā)現(xiàn)相同程度的淋 巴細(xì)胞滲透減少(圖5C的圖)，圖5C是心臟同種異體移植物(受空 脂質(zhì)體(Up; n=15)，脂質(zhì)體-pCMVsr39tk (Lip-TK; n=15 ),脂質(zhì) 體-pCMVhIL-lO( Lip-IL-10; n=15 )或脂質(zhì)體-pCMVsr39tk-CMVhIL-10(Lip-TK- IL-10; n=15)影響)中的排斥反應(yīng)評(píng)分的比較的柱狀圖。 在圖5D的柱狀圖中，我們發(fā)現(xiàn)LV收縮壓在治療性基因處理的和報(bào)告 子-治療性連鎖的基因處理的心臟同種異體移植物中改善至相同程度， 圖5D是心臟同種異體移植物中CD3+淋巴細(xì)胞滲透(被脂質(zhì)體 -pCMVhIL-10基因治療和報(bào)告子-治療性連鎖的基因治療減少)的比較 的柱狀圖。在圖5E的柱狀圖中，我們?cè)趫?bào)告子-治療性基因轉(zhuǎn)移組中 沒有觀察到致心律失常效應(yīng)，圖5E是心臟同種異體移植物(用空脂質(zhì) 體(Lip; n-15)，僅脂質(zhì)體-治療性基因(Lip-IL-10; n=15 )或報(bào)告 子-治療性連鎖的基因治療(Lip-TK- IL-10; n=15 )處理)中的LV 收縮壓與心臟同系移植物中(n=15， 'P < 0.05)和沒有任何處理的同 種異體移植物中(n-15, "P < 0.05)的LV收縮壓的比較的柱狀圖。 收縮壓在p.o.d.第4天記錄。圖5F心律失常事件的柱狀圖，其包括 在重新灌注后24小時(shí)時(shí)心臟同種異體移植物(用空脂質(zhì)體(Lip; n=15),僅脂質(zhì)體-治療性基因(Lip-ILIO; n=15 )或報(bào)告子-治療性 連鎖的基因治療(Lip-TK- IL 10; n-15 )處理)，心臟同系移植物(n-15 ) 和沒有任何處理的同種異體移植物(n=15)中的室上性心動(dòng)過速，心 '房震顫和纖維性顫動(dòng)以及室性心動(dòng)過速和纖維性顫動(dòng)。連續(xù)記錄ECG 1 小時(shí)。值表達(dá)為總事件的百分比。
088鑒于上述結(jié)果，可以認(rèn)識(shí)到，我們的結(jié)果首次證明PET 報(bào)告基因成像可應(yīng)用于非侵入性地監(jiān)控和定量冠狀動(dòng)脈內(nèi)遞送的治療 性轉(zhuǎn)基因在整個(gè)心臟中的表達(dá)。對(duì)于該方法，構(gòu)建一個(gè)能夠?qū)崿F(xiàn)平衡 且緊密相關(guān)的雙基因表達(dá)的載體是重要的。雖然之前使用內(nèi)部核糖體 進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)的雙順反子方法展示了由腺病毒攜帶的2個(gè)PET報(bào) 告基因良好的相關(guān)性，但是IRES下游的轉(zhuǎn)基因表達(dá)通常被削弱了 。雙 向轉(zhuǎn)錄載體利用了在其中治療性和報(bào)告基因每一個(gè)均由包含四環(huán)素響 應(yīng)元件的巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的載體；但是需要融合蛋白以 共表達(dá)。在本研究中，包含由2個(gè)相同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的報(bào)告子和治療性 基因的栽體能夠在靶向的心肌中誘導(dǎo)平衡且共定位的報(bào)告子和治療性 轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。全面的評(píng)價(jià)證實(shí)在一個(gè)質(zhì)粒中報(bào)告子和治療性基因的連鎖不改變?nèi)我粋€(gè)基因的轉(zhuǎn)移效率且對(duì)于間接的治療性基因表達(dá)的成
像是可行的。相反，當(dāng)我們使用2個(gè)不同的啟動(dòng)子時(shí)，由CMV啟動(dòng)子 驅(qū)動(dòng)的報(bào)告基因的表達(dá)水平比由SV40啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的治療性基因更高 (未發(fā)表的觀察資料)。
089除了報(bào)告基因表達(dá)和報(bào)告探針活性之間的強(qiáng)相關(guān)性之外， 報(bào)告子和治療性基因和蛋白表達(dá)之間的緊密相關(guān)性為間接監(jiān)控治療性 基因表達(dá)(通過用PET報(bào)告探針對(duì)連鎖的報(bào)告基因成像)奠定了基礎(chǔ)。 在之前的研究中，病毒效價(jià)與2個(gè)共轉(zhuǎn)染的報(bào)告探針的積累的相關(guān)性 很差，這據(jù)認(rèn)為是由于可變的腺病毒運(yùn)輸。脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移在 靶向的器官中誘導(dǎo)了穩(wěn)定并且均勻的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，這可能也在轉(zhuǎn)基因/ 蛋白表達(dá)和報(bào)告探針的積累之間的優(yōu)秀的相關(guān)性中起了一定的作用。
090利用整個(gè)心臟PET報(bào)告探針積累圖像，心臟灌注的PET 成像不再需要定位心臟的位置。但是，["F]FDG的積累代表著具有更 好的轉(zhuǎn)錄和翻譯功能的活肌細(xì)胞。["8F]FHBG/ TF]FDG的比率代表著 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞占總活肌細(xì)胞的比例，可用于真正的基因轉(zhuǎn)移效率的定量。 心肌中，T8F]FHBG/ ["F]FDG比率與報(bào)告子和治療性基因和蛋白表達(dá) 的優(yōu)秀的相關(guān)性暗示了優(yōu)于用體重標(biāo)準(zhǔn)化的標(biāo)準(zhǔn)攝取值(°/JD/g )的優(yōu) 點(diǎn)。
091對(duì)于PET成像，報(bào)告子轉(zhuǎn)基因的圖象低信號(hào)(由于與腺病 毒相比低5倍的脂質(zhì)體的基因轉(zhuǎn)移效率)是主要的負(fù)擔(dān)。本研究中使 用的Micro-PET-P4系統(tǒng)，其針對(duì)兔和靈長(zhǎng)類PET掃描而設(shè)計(jì)，不僅具 有與之前的micro-PET系統(tǒng)相比大約4倍的軸向觀察視野，還具有高 4倍的靈敏度，這補(bǔ)救了脂質(zhì)體的低效率。另一方面，在本研究中冠 狀動(dòng)脈內(nèi)基因遞送誘導(dǎo)了報(bào)告子和治療性基因的擴(kuò)散分布。這是與心 肌內(nèi)注射的由腺病毒攜帶的報(bào)告基因(在所有之前的研究中，其集中 在針側(cè)周圍并且在非常小的區(qū)域內(nèi)產(chǎn)生高信號(hào))相比通常低信號(hào)的另 一個(gè)原因。然而，在整個(gè)心臟中均勻分布的轉(zhuǎn)基因/蛋白表達(dá)和 ["F]FHBG積累極大地促進(jìn)了治療性基因表達(dá)的非侵入性和定量的PET 成^f象的臨床應(yīng)用。092脂質(zhì)體介導(dǎo)的報(bào)告子-治療性連鎖的基因轉(zhuǎn)移消除了病毒 誘導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)，使我們能夠驗(yàn)證長(zhǎng)期PET報(bào)告基因/探針成像的 可能性。報(bào)告基因產(chǎn)物的免疫原性已經(jīng)成為一個(gè)關(guān)鍵，但是因?yàn)椴《?栽體或質(zhì)粒-cDNA本身的使用，它從未被證實(shí)。我們展示了，脂質(zhì)體 介導(dǎo)的報(bào)告子-治療性連鎖的基因轉(zhuǎn)染具有與單獨(dú)的治療性基因轉(zhuǎn)染 相同的量級(jí)和動(dòng)力學(xué)。在這2組中，CD3+滲透保持相同。所有這些發(fā) 現(xiàn)表明，腺病毒，而非報(bào)告基因產(chǎn)物，才是導(dǎo)致自身免疫反應(yīng)和瞬時(shí) 報(bào)告基因表達(dá)的原因。我們的結(jié)果也表明，報(bào)告基因及其產(chǎn)物在心臟 同系移植物和同種異體移植物中并沒有顯著的副作用。轉(zhuǎn)移成對(duì)的報(bào) 告子和治療性基因不削弱兔異位功能心臟同種異體移植物移植模型中 IL-1(H秀導(dǎo)的免疫抑制的治療功效。
093作為主要的免疫抑制細(xì)胞因子和抗炎癥試劑，IL-10具有 治療同種異體移植物排斥的潛能。但是，移植后全身性施用IL-10不 展示任何益處，這主要是因?yàn)轱@著的多向性效應(yīng)，尤其是它對(duì)B細(xì)胞 和激活的CD8+T細(xì)胞的免疫刺激效應(yīng)。之前在嚙齒類動(dòng)物和兔中的研 究表明，重組IL-10基因在移植的心臟中的定位表達(dá)可能有助于預(yù)防 和治療移植中的主要問題，例如急性排斥反應(yīng)和加速的同種異體移植 物冠狀動(dòng)脈粥樣硬化。由于臨時(shí)離體保存的技術(shù)需要，獲得的器官使 它們本身易于進(jìn)行遺傳工程操作。在心臟移植物的收獲和植入之間的 這段時(shí)間提供了用于治療性基因離體冠狀動(dòng)脈內(nèi)遞送的唯一機(jī)會(huì)，以 從生物學(xué)上修飾移植物并為局部或器官特異的免疫抑制做好準(zhǔn)備，尤 其在避免全身性副作用和需要常規(guī)的全身性免疫抑制的時(shí)候。之前的 研究已表明離體冠狀動(dòng)脈內(nèi)基因遞送的基因轉(zhuǎn)移效率比體內(nèi)冠狀動(dòng)脈 內(nèi)基因遞送的基因轉(zhuǎn)移效率高3至5倍。體內(nèi)基因遞送中巨大的全身 性分散是造成低的局部治療性基因表達(dá)，高的異位基因轉(zhuǎn)染和在臨床 試驗(yàn)中缺乏成功的原因。雖然脂質(zhì)體介導(dǎo)的離體冠狀動(dòng)脈內(nèi)基因遞送 的效率仍然相對(duì)低，但是可溶性IL-10在整個(gè)心臟中均勻分布。在同 種異體移植物中過表達(dá)的IL-10的功效比在腺病毒介導(dǎo)的離體基因轉(zhuǎn) 移中觀察到的更高并且作用時(shí)間也持續(xù)得更久得多。特別地，在器官獲得期間20分鐘的離體冠狀動(dòng)脈內(nèi)基因遞送的方法在臨床上是可應(yīng) 用的。本申請(qǐng)報(bào)道的非侵入性報(bào)告子-治療性連鎖的轉(zhuǎn)基因PET成像系 統(tǒng)可在進(jìn)一步證實(shí)免疫抑制細(xì)胞因子或其他治療性基因療法在大型動(dòng) 物的心臟移植中的藥物代謝動(dòng)力學(xué)和藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)的過程中起到關(guān) 鍵作用。
094總之，非侵入性定量報(bào)告子-治療性基因表達(dá)和活心肌細(xì) 胞完善了用于潛在地表征人基因治療的藥物代謝動(dòng)力學(xué)的真正非侵入 性轉(zhuǎn)基因量化系統(tǒng)。更重要地，這個(gè)離體冠狀動(dòng)脈內(nèi)非病毒載體介導(dǎo) 的定位PET報(bào)告子-治療性基因靶向方法的安全特性提供了用于臨床 應(yīng)用的顯著優(yōu)點(diǎn)。
095那些具有本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)的人可以做出改變和修改而不脫 離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍。因此，必須理解，所陳述的例舉的實(shí)施方案 僅是為了舉例，不應(yīng)被認(rèn)為是把本發(fā)明限制為由以下發(fā)明及其各種實(shí) 施方案所限定的。
096因此，必須理解，所陳述的例舉的實(shí)施方案僅是為了舉例， 不應(yīng)被認(rèn)為是把本發(fā)明限制為由以下權(quán)利要求所限定的。例如，雖然 在下文在確定的組合中陳述權(quán)利要求的元素，但是必須清楚地理解， 本發(fā)明包括其他更少，更多或不同元素的組合，其在上文中被公開(即 使在這些組合中最初沒有被主張) 2個(gè)元素在主張的組合中結(jié)合的 教導(dǎo)應(yīng)進(jìn)一步理解為還允許一種如下的主張的組合，即其中2個(gè)元素 不是互相結(jié)合，而是可以單獨(dú)使用或在其他組合中結(jié)合。本發(fā)明任何 被公開的元素的刪除被明確地預(yù)期為在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
097本說明書中用于描述本發(fā)明及其各種實(shí)施方案的言語(yǔ)將理 解為不僅在它們通常定義含義的意義上，還包括根據(jù)本說明書中特定 定義，超過通常定義含義范圍的材料和行動(dòng)。因此，如果一個(gè)元素在 本說明書的上下文中可以被理解為包括多于1個(gè)含義，那么它在權(quán)利 要求中的使用必須理解為屬于由本說明書和詞語(yǔ)本身支持的所有可能 的含義。
O98因此，以下權(quán)利要求的言語(yǔ)或元素的定義在本說明書中被
30定義為不僅包括字面上陳述的元素的組合，還包括所有等價(jià)的結(jié)構(gòu)， 材料或行動(dòng)，用于以基本相同的方式進(jìn)行基本相同的功能以荻得基本
相同的結(jié)果。因此在這個(gè)意義上，預(yù)期在下述權(quán)利要求中可以用2個(gè) 或更多的元素的等價(jià)替代物代替任一個(gè)元素，或者在權(quán)利要求中一個(gè) 元素可以替代2個(gè)或更多的元素。雖然在上文元素可以被描述為在確 定的組合中起作用，甚至最初可以同樣被主張，但是應(yīng)清楚地理解來 自一個(gè)主張的組合的一個(gè)或更多元素可以在一些情況中從組合中切除 并且主張的組合可以被指向亞組合或亞組合的變種。
099從主張的主題的非實(shí)質(zhì)變化(如具有本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)的人 所見)，不管現(xiàn)在已知的還是將要設(shè)計(jì)的，都被清楚地預(yù)期為相當(dāng)于 在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。因此，現(xiàn)在或即將為具有本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)的人 員所知的顯而易見的替代物被定義為在定義的元素的范圍之內(nèi)。
100因此權(quán)利要求應(yīng)理解為包括上述特別例舉和描述的那些事 物、概念上的等價(jià)物、可以顯而易見替代的那些事物和本質(zhì)上納入本 發(fā)明的本質(zhì)想法的那些事物。
權(quán)利要求
1、在用于非侵入性地監(jiān)控離體和/或體內(nèi)遞送的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的方法中的改進(jìn)，包含對(duì)報(bào)告基因表達(dá)定量成像以推斷轉(zhuǎn)染的基因在靶向的組織，器官或細(xì)胞中表達(dá)的水平，位置和持續(xù)時(shí)間，其中所述報(bào)告基因與所述轉(zhuǎn)染的基因連鎖。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1的改進(jìn)，其中對(duì)報(bào)告基因表達(dá)定量成像包含 使報(bào)告基因與轉(zhuǎn)染的基因在質(zhì)粒栽體上，在細(xì)胞中或在DNA上連鎖， 其中所述報(bào)告基因與所述轉(zhuǎn)染的基因連鎖。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1的改進(jìn)，其中對(duì)報(bào)告基因表達(dá)定量成像包含 對(duì)與治療性基因連鎖的報(bào)告基因表達(dá)定量成像，其中所述報(bào)告基因與 所述轉(zhuǎn)染的基因連鎖。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1的改進(jìn)，其中對(duì)報(bào)告基因表達(dá)定量成像包含 對(duì)與診斷性基因連鎖的報(bào)告基因表達(dá)定量成像，其中所述報(bào)告基因與 所述轉(zhuǎn)染的基因連鎖。
5、 根據(jù)權(quán)利要求l的改進(jìn)，其中對(duì)報(bào)告基因表達(dá)定量成像包含 對(duì)與用作治療性基因的相同基因連鎖的報(bào)告基因表達(dá)定量成像，其中 所述報(bào)告基因與所述轉(zhuǎn)染的基因連鎖。
6、 根據(jù)權(quán)利要求l的改進(jìn)，其中對(duì)報(bào)告基因表達(dá)定量成像包含 對(duì)與用作治療性基因的不同基因連鎖的報(bào)告基因表達(dá)定量成像，其中 所述報(bào)告基因與所述轉(zhuǎn)染的基因連鎖。
7、 根據(jù)權(quán)利要求l的改進(jìn)，其中對(duì)報(bào)告基因表達(dá)定量成像包含 對(duì)多于一個(gè)報(bào)告基因的報(bào)告基因表達(dá)定量成像，其中所述報(bào)告基因與 所述轉(zhuǎn)染的基因連鎖。
8、 根據(jù)權(quán)利要求l的改進(jìn)，其中對(duì)報(bào)告基因表達(dá)定量成像包含 使用放射性藥物對(duì)與報(bào)告基因的基因表達(dá)相互作用的閃爍成像，其中 所述報(bào)告基因與所述轉(zhuǎn)染的基因連鎖。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1的改進(jìn)，其中對(duì)報(bào)告基因表達(dá)定量成像包含 通過正電子成像術(shù)、Y照相機(jī)或單光子發(fā)射計(jì)算斷層照相法進(jìn)行定量成像，其中所述報(bào)告基因與所述轉(zhuǎn)染的基因連鎖。
10、 根據(jù)權(quán)利要求1的改進(jìn)，進(jìn)一步包含提供具有平衡的報(bào)告子/治療性轉(zhuǎn)基因表達(dá)的報(bào)告子-治療性基因連鎖的轉(zhuǎn)基因栽體。
11、 根據(jù)權(quán)利要求10的改進(jìn)，其中提供具有平衡的報(bào)告子/治療性轉(zhuǎn)基因表達(dá)的報(bào)告子-治療性連鎖的轉(zhuǎn)基因載體包含在單一質(zhì)粒中提供皰滲病毒胸苷激酶(HSn-tk )和2個(gè)相同巨細(xì)胞病毒(CMV )啟動(dòng)子以及一個(gè)報(bào)告基因和一個(gè)治療性基因。
12、 根據(jù)權(quán)利要求10的改進(jìn)，其中提供具有平衡的報(bào)告子/治療 性轉(zhuǎn)基因表達(dá)的報(bào)告子-治療性連鎖的轉(zhuǎn)基因載體包含在單一質(zhì)粒中 提供2個(gè)或多個(gè)相同或不同的啟動(dòng)子以及一個(gè)報(bào)告基因和2個(gè)或多個(gè) 治療性基因。
13、 根據(jù)權(quán)利要求l的改進(jìn)，進(jìn)一步包含用脂質(zhì)體封裝，以減少 免疫反應(yīng)和增加報(bào)告子和治療性連鎖的基因轉(zhuǎn)移的效率。
14、 根據(jù)權(quán)利要求10的改進(jìn)，其中提供具有平衡的報(bào)告子/治療 性轉(zhuǎn)基因表達(dá)的報(bào)告子-治療性連鎖的轉(zhuǎn)基因載體包含提供2個(gè)相同 的EF-1 oc啟動(dòng)子以及一個(gè)報(bào)告基因和2個(gè)或更多的治療性基因。
15、 根據(jù)權(quán)利要求l的改進(jìn)，其中對(duì)報(bào)告基因表達(dá)定量成像包含 將FHBG用于野生型HSVl-tk和HSVl-sr39tk PET報(bào)告基因的體內(nèi)成像。
16、 根據(jù)權(quán)利要求1的改進(jìn)，進(jìn)一步包含提供具有平衡的報(bào)告子/ 治療性轉(zhuǎn)基因表達(dá)的報(bào)告子-治療性連鎖的轉(zhuǎn)基因載體并且其中提供 具有平衡的報(bào)告子/治療性轉(zhuǎn)基因表達(dá)的報(bào)告子-治療性連鎖的轉(zhuǎn)基因 載體包含提供與載體復(fù)合的陽(yáng)離子脂質(zhì)體，所述載體包含單純皰滲病 毒1型突變體胸苷激酶(HSVl-sr39tk)作為報(bào)告基因和重組人免疫抑 制細(xì)胞因子白介素-10 (hIL-10)作為治療性基因。
17、 根據(jù)權(quán)利要求16的改進(jìn)，進(jìn)一步包含包括PET報(bào)告探針9-(4-rF]-氟-3-羥甲基丁基)鳥嘌呤(["F]FHBG)和報(bào)告基因。
18、 轉(zhuǎn)基因組合物，用于非侵入性地監(jiān)控離體和/或體內(nèi)遞送的轉(zhuǎn) 基因的表達(dá)，其包含一個(gè)報(bào)告基因；包含于報(bào)告基因且能夠用正電子成像術(shù)、Y照相機(jī)或單光子發(fā)射計(jì)算斷層照相法成像的基因探針；和至少一個(gè)與所述寺艮告基因連鎖的轉(zhuǎn)染的基因。
19、 根據(jù)權(quán)利要求18的組合物，其中與轉(zhuǎn)染的基因連鎖的報(bào)告基 因在質(zhì)粒載體上，在細(xì)胞中或在DNA上。
20、 根據(jù)權(quán)利要求18的組合物，其中對(duì)報(bào)告基因表達(dá)定量成像包 含對(duì)與治療性基因連鎖的報(bào)告基因表達(dá)定量成像，其中所述報(bào)告基因 與所述轉(zhuǎn)染的基因連鎖。
21、 根據(jù)權(quán)利要求18的組合物，其中對(duì)報(bào)告基因表達(dá)定量成像包 含對(duì)與診斷性基因連鎖的報(bào)告基因表達(dá)定量成像，其中所述報(bào)告基因 與所述轉(zhuǎn)染的基因連鎖。
22、 根據(jù)權(quán)利要求18的組合物，其中對(duì)報(bào)告基因表達(dá)定量成像包 含對(duì)與用作治療性基因相同的基因連鎖的報(bào)告基因表達(dá)定量成像，其中所述報(bào)告基因與所述轉(zhuǎn)染的基因連鎖。
23、 根據(jù)權(quán)利要求l的組合物，其中對(duì)報(bào)告基因表達(dá)定量成像包 含對(duì)與用作治療性基因不同的基因連鎖的報(bào)告基因表達(dá)定量成像，其中所述報(bào)告基因與所述轉(zhuǎn)染的基因連鎖。
24、 根據(jù)權(quán)利要求18的組合物，其中對(duì)報(bào)告基因表達(dá)定量成像包 含對(duì)多于一個(gè)報(bào)告基因的報(bào)告基因表達(dá)定量成像，其中所述報(bào)告基因 與所述轉(zhuǎn)染的基因連鎖。
25、 根據(jù)權(quán)利要求18的組合物，其中基因探針包含放射性藥物， 用于對(duì)與報(bào)告基因的基因表達(dá)相互作用的閃爍成像。
26、 根據(jù)權(quán)利要求18的組合物，進(jìn)一步包含具有平衡的報(bào)告子/ 治療性轉(zhuǎn)基因表達(dá)的報(bào)告子-治療性連鎖的轉(zhuǎn)基因栽體。
27、 根據(jù)權(quán)利要求19的組合物，其中報(bào)告子-治療性連鎖的轉(zhuǎn)基 因載體包含在單一質(zhì)粒中的皰滲病毒胸苷激酶(HSVl-tk)和2個(gè)相同 的巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子。
28、 根據(jù)權(quán)利要求19的組合物，其中報(bào)告子-治療性連鎖的轉(zhuǎn)基 因載體包含2個(gè)相同或不同的啟動(dòng)子和其中所述組合物進(jìn)一步包含在單一質(zhì)粒中的2個(gè)或多個(gè)治療性基因。
29、 根據(jù)權(quán)利要求18的組合物，進(jìn)一步包含脂質(zhì)體封裝，以減少 免疫反應(yīng)和增加報(bào)告子和治療性連鎖的基因轉(zhuǎn)移的效率。
30、 根據(jù)權(quán)利要求19的組合物，其中報(bào)告子-治療性連鎖的轉(zhuǎn)基 因載體進(jìn)一步包含提供2個(gè)相同EF-1 oc啟動(dòng)子以及一個(gè)報(bào)告基因和2 個(gè)或更多治療性基因。
31、 根據(jù)權(quán)利要求18的組合物，進(jìn)一步包含具有平衡的報(bào)告子/ 治療性轉(zhuǎn)基因表達(dá)的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合的報(bào)告子-治療性連鎖的轉(zhuǎn)基 因載體，所述轉(zhuǎn)基因載體包含單純皰滲病毒1型突變體胸苷激酶(HSVl-sr39tk)作為報(bào)告基因和重組人免疫抑制細(xì)胞因子白介素-IO (hIL-10)作為治療性基因。
32、 根據(jù)權(quán)利要求18的組合物，進(jìn)一步包含與載體復(fù)合的陽(yáng)離子 脂質(zhì)體和包括關(guān)于所述報(bào)告基因的PET報(bào)告探針9- (4-["F]-氟-3-羥 甲基丁基)鳥嘌呤(["F]FHBG)。
33、 根據(jù)權(quán)利要求l的改進(jìn)，其中對(duì)報(bào)告基因表達(dá)定量成像包含 對(duì)2個(gè)或更多報(bào)告基因表達(dá)定量成像，以推斷轉(zhuǎn)染的基因表達(dá)在乾向 的組織，器官或細(xì)胞中的水平，位置或持續(xù)時(shí)間，其中報(bào)告基因與2 個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)染的基因探針連鎖。
34、 根據(jù)權(quán)利要求l的改進(jìn)，其中對(duì)報(bào)告基因表達(dá)定量成像包含 對(duì)報(bào)告子-治療性連鎖的轉(zhuǎn)基因栽體的表達(dá)定量成像，所述轉(zhuǎn)基因載體 的表達(dá)通過在質(zhì)粒中具有定位于報(bào)告基因和治療性或診斷性基因之間 的雙向啟動(dòng)子的平衡的報(bào)告子/治療性轉(zhuǎn)基因或平衡的報(bào)告子/診斷性 轉(zhuǎn)基因表達(dá)誘導(dǎo)。
35、 根據(jù)權(quán)利要求l的改進(jìn)，其中對(duì)報(bào)告基因表達(dá)定量成像包含 對(duì)平衡的報(bào)告子治療性轉(zhuǎn)基因的表達(dá)定量成像，或?qū)Τ杀壤膱?bào)告子 和治療性或診斷性轉(zhuǎn)基因的表達(dá)定量成像。
36、 根據(jù)權(quán)利要求l的改進(jìn)，其中對(duì)報(bào)告基因表達(dá)定量成像包含 對(duì)靶向的器官，組織或細(xì)胞中的轉(zhuǎn)基因或異位轉(zhuǎn)基因表達(dá)定量PET成 像。
37、根據(jù)權(quán)利要求l的改進(jìn)，其中對(duì)報(bào)告基因表達(dá)定量成像包含 通過同時(shí)測(cè)量代謝探針的表達(dá)和治療性或診斷性轉(zhuǎn)基因的表達(dá)以及比 率化測(cè)量值對(duì)器官、組織或細(xì)胞的強(qiáng)烈轉(zhuǎn)染密度的比率定量成像。
全文摘要
用于非侵入性監(jiān)控用于治療疾病的、離體和體內(nèi)遞送的治療性轉(zhuǎn)基因表達(dá)的方法中的組合物，包括對(duì)在質(zhì)粒載體上與治療性基因結(jié)合的報(bào)告基因表達(dá)定量成像的步驟，以推斷在靶向的組織或器官中治療性基因表達(dá)的水平、位置或持續(xù)時(shí)間。使用用于對(duì)與報(bào)告基因相互作用的基因表達(dá)閃爍成像的放射性藥物對(duì)報(bào)告基因成像，即正電子成像術(shù)、γ照相機(jī)或單光子發(fā)射計(jì)算斷層照相法。用脂質(zhì)體封裝的、具有平衡的報(bào)告子/治療性轉(zhuǎn)基因表達(dá)的報(bào)告子-治療性連鎖的轉(zhuǎn)基因載體遞送基因。轉(zhuǎn)基因組合物包括與治療性基因或由脂質(zhì)體封裝的報(bào)告子-治療性連鎖的轉(zhuǎn)基因載體并入和遞送的基因連鎖的報(bào)告基因。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101460631SQ200780010158
公開日2009年6月17日 申請(qǐng)日期2007年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月21日
發(fā)明者L·森, S·S·甘姆伯黑爾 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)