專(zhuān)利名稱(chēng)：：新穎的氧化還原酶及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及新近鑒定的包含下述基因的多核苷酸序列，所述基因編碼從^^Wgz7/Mm'gw分離的新穎的氧化還原酶。本發(fā)明描述了新穎基因的全長(zhǎng)核苷酸序列、包含新穎氧化還原酶的全長(zhǎng)編碼序列的cDNA序列，以及全長(zhǎng)功能蛋白質(zhì)及其功能等同物的氨基酸序列。本發(fā)明還涉及在烘焙和乳制品應(yīng)用中使用這些酶的方法。本發(fā)明還包括用根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和其中根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶被遺傳修飾以增強(qiáng)或降低其活性和/或表達(dá)水平的細(xì)胞。
背景技術(shù)：
：氧化還原酶在本文中被定義為催化氧化-還原反應(yīng)的酶。己知是氧化還原酶(EC1.#.#.#，其中#為數(shù)字)的酶種類(lèi)由NomenclatureCommitteeoftheInternationalUnionofBiochemistryontheNomenclatureandClassificationofEnzymes(EnzymeNomenclature,AcademicPress,NewYork,1992使義為催化氧化還原反應(yīng)的所有酶。被氧化的底物被視為氫或電子供體。號(hào)碼中的第二個(gè)數(shù)字指出經(jīng)受氧化的氫供體中的基團(tuán)。第三個(gè)數(shù)字指出涉及的受體類(lèi)型，3表示氧為受體。被氧化的底物被看做氫供體。氧化還原酶的例子為漆酶(EC1.10.3.2)催化鄰-和對(duì)-苯二酚二者的氧化，也時(shí)常作用于氨基苯酚和苯二胺。葡萄糖氧化酶(EC1丄3.4-GOX)催化葡萄糖和若干種其它糖的氧化。己糖氧化酶(ECl丄3.5)催化與GOX相同的反應(yīng)，即葡萄糖和若干種其它糖如半乳糖、甘露糖、麥芽糖、乳糖和纖維二糖的氧化。膽固醇氧化酶(EC1丄3.6)催化膽固醇的氧化還原。膽堿脫氫酶(E.C.1丄99.1)催化膽堿的氧化還原。葡萄糖脫氫酶(E.C.1丄99.10)催化葡萄糖的氧化還原。醇氧化酶(EC1丄3.13)催化伯醇的氧化。仲醇氧化酶(EC1丄3.18)催化仲醇的氧化。D-天冬氨酸氧化酶(EC1.4.3.1)催化天冬酶的氧化還原，其也作為天冬氨酸氧化酶已知。丁二胺氧化酶(EC1.4.3.10)催化腐胺成為4-氨基正丁醛的氧化還原，所述4-氨基正丁醛縮聚成為l-吡咯啉。胺氧化酶(EC1.4.3.4)催化胺(主要是伯胺，通常是一些仲胺和叔胺)的氧化。肌氨酸氧化酶(EC1.5.3.1)催化肌氨酸的氧化還原。多胺氧化酶(EC1.5.3.11)催化N、乙?；返难趸€原。("-6-羥基煙堿氧化酶(EC1.5.3.6)催化("-6-羥基煙堿的氧化還原。網(wǎng)脈番荔枝堿氧化酶(EC1.5.3.9)催化(5)-網(wǎng)脈番荔枝堿的氧化還原，其也被稱(chēng)作小檗堿-橋-形成酶。兒茶酚氧化酶(EC1.10.3.1)催化兒茶酚和多種被取代的兒茶酚的氧化還原。硫氧還蛋白還原酶(EC1.6.4.5)，其催化被氧化的硫氧還蛋白的還原。亞硫酸鹽還原酶(EC1.8丄2)，其催化硫化氫的還原。氯化物過(guò)氧化物酶(ECl.ll丄lO)，其導(dǎo)致有機(jī)分子氯化形成穩(wěn)定的C-C1鍵，其也可以作用于Br—和1—。過(guò)氧化物酶(EC1.11丄6)，其導(dǎo)致若干種有機(jī)物質(zhì)例如乙醇的氧化還原。氧化還原酶的其它例子為螢火蟲(chóng)熒光素酶(EC1.13.12.7)、肉桂酸4-羥化酶(EC1.14.13.11)、苯甲酸4-單加氧酶(EC1.14.13.12)、膽固醇7a-單加氧酶(EC1.14.13.17)、五氯苯酚單加氧酶(EC1.14.13.50)、單加氧酶(EC1.14.14.1)、類(lèi)固醇11/3-單加氧酶(EC1.14.15.4)、單苯酚單加氧酶(EC1.14.18.1)、前列腺素合酶(ECU4.99.1)和水楊酸酯水解酶(EC1.14.13.1)。所述例子以并非以任何方式表示限制性或限制本發(fā)明的方式給出。氧化還原酶可便利地在微生物中生產(chǎn)。微生物氧化還原酶可得自多種來(lái)源；5a"'〃w的種是細(xì)菌酶的一個(gè)常見(jiàn)來(lái)源，而真菌酶通常在^^e^'〃w的種中生產(chǎn)。已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了來(lái)自多種來(lái)源的具有氧化還原酶活性的微生物酶，所述來(lái)源包括尸^'"'///"附、ra/arom_ycay、C7at/ospon/am(W095/29996)、7VameZes/n>wta(WO97/22257)。己經(jīng)克隆了來(lái)自若干來(lái)源的微生物氧化還原酶基因，所述來(lái)源包括FmmWww(EP1157117Al)、0nWwsv^^'co/or(DE19545780Al)、7Vamefe5(US6146865)、7Wc/^dmnfl(US6248575)和Mz'cradoc/n'謹(jǐn)wWe(WO9931990)。氧化還原酶可用于還使用化學(xué)氧化劑的所有應(yīng)用領(lǐng)域中。這類(lèi)化學(xué)氧化劑通常是非特異的氧化劑，如碘酸鹽、過(guò)氧化物、抗壞血酸、溴酸鉀和偶氮二酰胺。然而，若干種目前可獲得的化學(xué)氧化劑的使用遇到了消費(fèi)者的抵制或不被管理機(jī)構(gòu)允許，特別是在食物應(yīng)用的領(lǐng)域中。氧化還原酶的使用已經(jīng)被認(rèn)為是化學(xué)氧化劑的備選方案。氧化還原酶可以被用于包括食物制劑和去污劑的多種工業(yè)應(yīng)用中。氧化還原酶的上述工業(yè)應(yīng)用僅是小量例子，該列表不表示是限制性的。其中可便利地使用氧化還原酶的食物制劑的一個(gè)例子是烘焙應(yīng)用的領(lǐng)域，例如改善面團(tuán)或烘焙制品的品質(zhì)。例如US2,783,150公開(kāi)了GOX在面粉中改善面團(tuán)強(qiáng)度和烘焙的面包的紋理和外觀的用途。EP0338452公開(kāi)了葡萄糖氧化酶與半纖維素酶和/或纖維素降解酶組合的應(yīng)用。WO02/30207公開(kāi)了GOX在烘焙中與蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶組合以改善GOX有效性的用途。W096/39851公開(kāi)了紅海藻Owm/mscn's/ms的己糖氧化酶在烘焙應(yīng)用中的用途。WO98/44804公開(kāi)了甘油氧化酶用于改善面團(tuán)流變學(xué)(rheological)特征的用途。其中可使用氧化還原酶的其它食物制劑包括乳制品食物。例如wo02/39828公開(kāi)了己糖氧化酶在批薩制備期間減少批薩乳酪中Maillard反應(yīng)的用途，WO99/31990公開(kāi)了碳水化合物氧化酶從乳糖(乳中最充裕的糖)生產(chǎn)乳糖酸的用途。目前，來(lái)自Aspergillusniger的葡萄糖氧化酶是針對(duì)上述應(yīng)用的工業(yè)中使用的唯一酶。其它氧化還原酶的問(wèn)題是它們的生產(chǎn)仍然不能以成本有效的方式進(jìn)行和/或它們的性能對(duì)于它們的預(yù)期用途而言不是最適的。因此，仍然有動(dòng)力改善用于特定應(yīng)用的氧化還原酶，例如考慮到有效性、底物特異性和/或親和力、在所需溫度范圍內(nèi)和pH范圍內(nèi)的穩(wěn)定性和活性等等。更特定地，對(duì)于烘焙應(yīng)用而言，目前烘焙中使用的氧化還原酶(主要是來(lái)自Aspergillusniger的葡萄糖氧化酶)不具有例如溴酸鉀的性能。溴酸鉀是一種化學(xué)氧化劑，其在技術(shù)上被認(rèn)為是除色的氧化劑，特別是對(duì)于長(zhǎng)烘焙工藝而言。溴酸鹽的禁用留給烘焙者時(shí)至今日仍未填補(bǔ)上的性能缺口。另一個(gè)例子是為了得到優(yōu)良的白色面包屑的酶面包屑漂白劑(enzymaticcrumbbleaching)。數(shù)年來(lái)，含有脂肪氧化酶的酶活性大豆粉一直被用于該目的。向市場(chǎng)中引入經(jīng)遺傳修飾的大豆變種引起了世界范圍的消費(fèi)者抵制在烘焙中使用這類(lèi)大豆粉。作為選擇可使用其它豆和豌豆粉，然而它們不如大豆粉有效。因此，對(duì)面包屑漂白應(yīng)用而言，仍然存在對(duì)該問(wèn)題的酶解決方案的巨大需要。更特定地，對(duì)乳制品應(yīng)用而言，在熱處理期間對(duì)工藝參數(shù)的輕微修飾或背離導(dǎo)致由增加的Maillard反應(yīng)引起的提高的顏色發(fā)生。該顏色發(fā)生是不想要的，并且存在除了通過(guò)嚴(yán)格的溫度和工藝控制之外控制該變褐過(guò)程從而使得巴氏滅菌過(guò)程更有活力的需要。還在乳酪的熱處理中，例如批薩上乳酪的變褐是不想要的。WO02/39828總結(jié)了減少變褐的若干種嘗試，所述嘗試通常旨在獲得乳酪制造工藝的非常嚴(yán)格的工藝控制或工藝修飾。這些解決方案的缺點(diǎn)在于它們難以操作和/或可能提高成本或降低產(chǎn)率。本發(fā)明致力于至少一個(gè)(如果不是所有的話)上述問(wèn)題。發(fā)明目的本發(fā)明的一個(gè)目的是提供下述新穎的多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有改善的特性的新穎的氧化還原酶。另一個(gè)目的是提供天然和重組生產(chǎn)的氧化還原酶以及生產(chǎn)所述氧化還原酶的重組菌株。制造和使用根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸和多肽的方法也是本發(fā)明的一個(gè)目的。提供下述新穎的氧化還原酶也是本發(fā)明的目的之一，所述氧化還原酶解決了至少一個(gè)上述問(wèn)題，或當(dāng)用于乳制品和/或烘焙應(yīng)用中時(shí)具有一種或多種改善的特性。乳制品的改善的特性可選自由Maillard反應(yīng)引起的變褐減少、改善的抗微生物特性和改善的蛋白質(zhì)交聯(lián)。面團(tuán)和/或烘焙制品的改善的特性可選自提高的面團(tuán)強(qiáng)度、提高的面團(tuán)彈性、提高的面團(tuán)穩(wěn)定性、降低的面團(tuán)粘稠度、改善的醒發(fā)耐性、改善的面團(tuán)延展性、改善的面團(tuán)可加工性、提高的烘焙制品體積、改善的烘焙制品碎屑結(jié)構(gòu)、改善的烘焙制品柔軟性、改善的烘焙制品口味、改善的烘焙制品抗腐性(anti-staling)、改善的烘焙制品色澤、改善的烘焙制品外皮或具有廣泛的底物特異性。發(fā)明詳述多核苷酸本發(fā)明提供了編碼新穎的氧化還原酶的新穎的多核苷酸，所述氧化還原酶尤其是具有任何上述活性的酶，優(yōu)選地，具有異戊醇氧化酶活性、碳水化合物氧化酶、漆酶、葡萄糖氧化酶或己糖氧化酶活性的酶。本發(fā)明提供了6種編碼氧化還原酶的新穎的多核苷酸，暫時(shí)稱(chēng)作OXI01、OXI02、OXI03、OXI04、OXI05、OXI06(下文稱(chēng)作OXI01-OXI06)，其具有分別根據(jù)SEQIDNO:013、SEQIDNO:014、SEQIDNO:015、SEQIDNO:016、SEQIDNO:017、SEQIDNO:018(下文稱(chēng)作"SEQIDNO:013-018")的氨基酸序列或其任何的功能等同物。編碼SEQIDNO:013-018的基因的序列通過(guò)對(duì)得自Aspergillusniger的基因組克隆測(cè)序測(cè)定。令人驚奇地，我們發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明的OXI01-OXI06多肽被用于制備面團(tuán)的工藝中時(shí)能改善面團(tuán)的強(qiáng)度。本發(fā)明提供了包含下述基因及其完全cDNA序列(分別為SEQIDNO:007、SEQIDNO:008、SEQIDNO:009、SEQIDNO:010、SEQIDNO:011、SEQIDNO:012,下文稱(chēng)作"SEQIDNO:007-012")的多核苷酸序列，所述基因編碼OXI01-OXI06氧化還原酶(分別包含SEQIDNO:001、SEQIDNO:002、SEQIDNO:003、SEQIDNO:004、SEQIDNO:005、SEQIDNO:006，下文稱(chēng)作"SEQIDNO:001—006")。因此，本發(fā)明涉及經(jīng)分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含根據(jù)SEQIDNO:001-006或SEQIDNO:007-012的核苷酸序列或其任何的功能等同物。更具體地，本發(fā)明涉及在嚴(yán)格條件下、優(yōu)選在高度嚴(yán)格條件下能與根據(jù)SEQIDNO:001-006或SEQIDNO:007-012的多核苷酸雜交的經(jīng)分離的多核苷酸。這類(lèi)多核苷酸可有利地得自絲狀真菌，尤其是來(lái)自Aspergillusniger。更特定地，本發(fā)明涉及具有根據(jù)SEQIDNO:001-006或SEQIDNO:007-012的核苷酸序列的經(jīng)分離的多核苷酸。本發(fā)明還涉及經(jīng)分離的多核苷酸，所述多核苷酸編碼分別根據(jù)SEQIDNO:013-018的多肽或其任何功能等同物的至少一個(gè)功能結(jié)構(gòu)域。為了避免任何疑惑OXI01對(duì)應(yīng)于核酸序列SEQIDNO:001和SEQIDNO:007和氨基酸序列SEQIDNO:013及其同源物功能等同物；OXI02對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:002、SEQIDNO:008和SEQIDNO:014及其同源物功能等同物等等，OXI06對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:006、SEQIDNO:012和SEQIDNO:018及其同源物功能等同物。本文使用的術(shù)語(yǔ)"基因"和"重組基因"指可從染色體DNA中分離的、包含編碼蛋白質(zhì)(例如A.niger氧化還原酶)的開(kāi)放讀碼框的核酸分子?；蚩砂幋a序列、非編碼序列、內(nèi)含子和調(diào)節(jié)序列。此外，基因是指本文定義的經(jīng)分離的核酸分子?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)和本文提供的序列信息，來(lái)分離本發(fā)明的核酸分子(如具有SEQIDNO:001-006或SEQIDNO:007-012的核苷酸序列的核酸分子或其功能等同物)。例如，使用SEQIDNO:001-006或SEQIDNO:007-012的所有或部分核酸序列作為雜交探針，能夠使用標(biāo)準(zhǔn)雜交和克隆技術(shù)(例如描述于Sambrook，J.,Fritsh,E.F.，andManiatis,T.MolecularCloning:ALaboratoryManual.2nd，ed"ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，1989中)分離根據(jù)本發(fā)明的核酸分子。另外，可以使用合成的寡核苷酸引物通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，來(lái)分離包含SEQIDNO:001-006或SEQIDNO:007-012所有或部分的核酸分子，所述引物以SEQIDNO:001-006或SEQIDNO:007-012中含有的序列信息為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)。可以使用cDNA、mRNA或者基因組DNA作為模板，并使用適當(dāng)?shù)墓押塑账嵋锔鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增技術(shù)，來(lái)擴(kuò)增本發(fā)明的核酸。這樣擴(kuò)增的核酸可以被克隆進(jìn)適當(dāng)?shù)妮d體中并通過(guò)DNA序列分析被表征。另外，可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的合成技術(shù)(例如使用自動(dòng)化DNA合成儀)制備下述寡核苷酸，所述寡核苷酸對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的核苷酸序列或能夠與本發(fā)明的核苷酸序列雜交。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的經(jīng)分離的核酸分子包含SEQIDNO:007-012中所示核苷酸序列。SEQIDNO:007-012的序列對(duì)應(yīng)于A.nigerOXI01-OXI06cDNA的編碼區(qū)。該cDNA包含編碼根據(jù)SEQIDNO:013—018的A.nigerOXI01-OXI06多肽的序列。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的經(jīng)分離的核酸分子包含下述核酸分子，所述核酸分子是SEQIDNO:001-006或SEQIDNO:007-012中所示核苷酸序列或這些核苷酸序列功能等同物的互補(bǔ)體。與另一核苷酸序列互補(bǔ)的核酸分子是與所述另一核苷酸序列足夠互補(bǔ)，從而其能夠與所述另一核苷酸序列雜交形成穩(wěn)定雙鏈體的核酸分子。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及經(jīng)分離的核酸分子，所述核酸分子編碼本發(fā)明的多肽或其功能等同物(如生物活性片段或結(jié)構(gòu)域)，以及足夠用作雜交探針(以鑒定編碼本發(fā)明多肽的核酸分子)的核酸分子，和適合用作PCR引物(用于擴(kuò)增或突變核酸分子)的這類(lèi)核酸分子的片段。"經(jīng)分離的多核苷酸"或"經(jīng)分離的核酸"是與所述DNA或RNA來(lái)源的天然存在的生物基因組中緊鄰的兩條編碼序列(一個(gè)在5'端，一個(gè)在3'端)均不緊鄰的DNA或RNA。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)分離的核酸包含與編碼序列緊鄰的部分或所有5'非編碼(例如啟動(dòng)子)序列。該術(shù)語(yǔ)因此包括例如被整合進(jìn)載體、整合進(jìn)自主復(fù)制的制?；虿《尽⒒蛘线M(jìn)原核生物或真核生物的基因組DNA中的重組DNA，或作為不依賴(lài)于其它序列的獨(dú)立分子(例如通過(guò)PCR或限制性內(nèi)切酶處理產(chǎn)生的cDNA或基因組DNA片段)存在的重組DNA。其還包括編碼下述額外多肽的雜交基因的一部分的重組DNA，所述額外多肽基本不含細(xì)胞材料、病毒材料或培養(yǎng)基(通過(guò)重組DNA技術(shù)生產(chǎn)時(shí))或化學(xué)前體或其它化學(xué)品(化學(xué)合成時(shí))。另外，"經(jīng)分離的核酸片段"是天然不作為片段存在并且在天然狀態(tài)下不被發(fā)現(xiàn)的核酸片段。本文使用的術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"或"核酸分子"旨在包括DNA分子(例如cDNA或基因組DNA)和RNA分子(例如mRNA)和使用核苷酸類(lèi)似物產(chǎn)生的DNA或RNA類(lèi)似物。核酸分子可以是單鏈的或雙鏈的，但是優(yōu)選是雙鏈DNA?？梢允褂霉押塑账犷?lèi)似物或衍生物(例如肌苷或硫代膦酸核苷酸)來(lái)合成核酸。這類(lèi)寡核苷酸可被用于例如制備核酸，所述核酸具有改變的堿基配對(duì)能力或提高的核酸酶抗性。本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供了經(jīng)分離的核酸分子，所述核酸分子與OXI01-OXI06核酸分子(例如OXI01-OXI06核酸分子的編碼鏈)是反義的。還包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的是本文所述核酸分子的補(bǔ)體鏈。觀!l序錯(cuò)誤(sequencingerrors)本文提供的序列信息不應(yīng)被狹義地解釋為要求包括錯(cuò)誤鑒定的堿基。本文公開(kāi)的特定序列可以容易地被用于從絲狀真菌(尤其是A.niger)分離整個(gè)基因，隨后可容易地對(duì)所述基因進(jìn)行進(jìn)一步序列分析，從而鑒定測(cè)序錯(cuò)誤。除非另有說(shuō)明，通過(guò)對(duì)本文的DNA分子測(cè)序確定的所有核苷酸序列均使用自動(dòng)DNA測(cè)序儀測(cè)定，由本文測(cè)定的DNA分子編碼的多肽的所有氨基酸序列是通過(guò)翻譯如上測(cè)定的DNA序列來(lái)預(yù)測(cè)的。因此，如本領(lǐng)域所已知的，對(duì)通過(guò)該自動(dòng)化途徑測(cè)定的任何DNA序列而言，本文測(cè)定的任何核苷酸序列可含有一些錯(cuò)誤。通過(guò)自動(dòng)化測(cè)定的核苷酸序列與被測(cè)序的DNA分子的實(shí)際核苷酸序列典型地至少約90%同一，更典型地至少約95%到至少約99.9%同一?？梢酝ㄟ^(guò)其它途徑(包括本領(lǐng)域公知的手動(dòng)DNA測(cè)序法)更精確地測(cè)定實(shí)際序列。又如本領(lǐng)域所已知的，與實(shí)際序列相比，被測(cè)定的核苷酸序列中的單個(gè)插入或刪除會(huì)引起核苷酸序列翻譯中的移碼(frameshift)，從而由被測(cè)定的核苷酸序列編碼的預(yù)測(cè)氨基酸序列會(huì)與由被測(cè)定的核苷酸序列實(shí)際編碼的氨基酸序列完全不同(從該插入或刪除的位點(diǎn)開(kāi)始)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠鑒定這類(lèi)被錯(cuò)誤鑒定的堿基，并知道如何糾正這類(lèi)錯(cuò)誤。核苷酸片段、探針和引物根據(jù)本發(fā)明的核酸分子可僅包含SEQIDNO:001-006或SEQIDNO:007-012所示核酸序列的部分或片段，例如可以用作探針或引物的片段或編碼0X101-OXI06蛋白質(zhì)的部分的片段。通過(guò)克隆0X101-OXI06基因和cDNA測(cè)定的核苷酸序列允許生產(chǎn)探針和引物，所述探針和引物被設(shè)計(jì)為用于鑒定和/或克隆其它OXI01-OXI06家族成員，以及來(lái)自其它物種的OXI01-OXI06同源物。探針/引物典型地包含基本上被純化的寡核苷酸，所述寡核苷酸典型地包含下述核苷酸序列，所述核苷酸序列優(yōu)選地在高度嚴(yán)格的條件下與SEQIDNO:001-006或SEQIDNO:007-012所示核苷酸序列或其功能等同物的至少約12或15個(gè)、優(yōu)選約18或20個(gè)、優(yōu)選約22或25個(gè)、更優(yōu)選約30、35、40、45、50、55、60、65或75個(gè)或更多個(gè)相鄰的核苷酸雜交。以O(shè)XI01-OXI06核苷酸序列為基礎(chǔ)的探針可以被用于檢測(cè)轉(zhuǎn)錄本或基因組OXI01-OXI06序列，所述轉(zhuǎn)錄本或基因組OXI01-OXI06序列編碼例如其它生物中的相同或同源蛋白質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，探針還包含與之結(jié)合的標(biāo)簽基團(tuán)，例如所述標(biāo)簽基團(tuán)可以是放射性同位素、熒光化合物、酶，或酶輔因子。這類(lèi)探針也可以被用作診斷測(cè)試試劑盒的部分，所述試劑盒用于鑒定表達(dá)OXIOl-0乂106蛋白質(zhì)的細(xì)胞。同一性&同源性術(shù)語(yǔ)"同源性"或"同一性百分比"在本文可互換使用。就本發(fā)明的目的而言，其在本文被定義來(lái)測(cè)定兩條氨基酸序列或兩條核酸序列的同一性百分比，所述序列就最適比較的目的被排列(例如為了與第二氨基酸或核酸序列最適比對(duì)，可以向第一氨基酸或核酸序列的序列中引入缺口)。然后比較相應(yīng)的氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)?shù)谝粭l序列中的一個(gè)位置被與第二序列中相應(yīng)位置上相同的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時(shí)，則所述分子在該位置上是同一的。兩條序列之間的同一性百分比是所述序列共享的同一位置數(shù)的函數(shù)(即％同一性=同一位置數(shù)/位置總數(shù)(即重疊位置)x100)。優(yōu)選兩條序列是相同的長(zhǎng)度。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白下述事實(shí)可獲得若干種不同的計(jì)算機(jī)程序以測(cè)定兩條序列之間的同源性。例如，可以使用數(shù)學(xué)算法完成兩個(gè)序列之間的序列比較和同一性百分比測(cè)定。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用NeedlemanandWunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))算法，使用Blossom62矩陣或PAM250矩陣和16、14、12、10、8、6或4的缺口權(quán)重和1、2、3、4、5或6的長(zhǎng)度權(quán)重測(cè)定兩條氨基酸序列之間的同一性百分比，所述算法已經(jīng)被整合進(jìn)GCG軟件包內(nèi)的GAP程序中(可得自http:〃www.gcg.com)。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道這些不同的參數(shù)會(huì)產(chǎn)生輕微差異的結(jié)果，但是使用不同的算法時(shí)兩條序列的整體同一性百分比不會(huì)被顯著改變。還在另一實(shí)施方案中，使用GCG軟件包(可得自http:〃www.gcg.com)中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩陣和40、50、60、70或80的缺口權(quán)重和1、2、3、4、5或6的長(zhǎng)度權(quán)重測(cè)定兩條核苷酸序列之間的同一性百分比。在另一實(shí)施方案中，使用E.MeyersandW.Miller算法(CABIOS,4:11-17(1989))，使用PAM120權(quán)重殘表、12的缺口長(zhǎng)度罰分和4的缺口罰分測(cè)定兩條氨基酸或核苷酸序列的同一性百分比，所述算法已被整合進(jìn)ALIGN程序(2.0版)中(可得自http:〃vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi)。本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)序列還可以被用作"查詢序列"，針對(duì)公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索，以例如鑒定其它家族成員或相關(guān)序列。這類(lèi)搜索可以使用Altschul，etal.(1990)J.Mol.Biol.215:403—10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)進(jìn)行?？梢允褂肗BLAST程序(計(jì)分=100，字長(zhǎng)=20)進(jìn)行BLAST核苷酸搜索，以獲得與本發(fā)明的OXI01-OXI06核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序(計(jì)分=50，字長(zhǎng)=3)進(jìn)行BLAST蛋白質(zhì)搜索，以獲得與本發(fā)明的OXI01-OXI06蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。為了獲得加缺口的比對(duì)用于比較的目的，可以如Altschuletal.,(1997)NucleicAcidsRes.25(17):3389-3402中所述使用GappedBLAST。使用BLAST和GappedBLAST程序時(shí)，可以使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的默認(rèn)參數(shù)。見(jiàn)http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov。雜交本文使用術(shù)語(yǔ)"雜交"旨在描述用于下述雜交和洗滌的條件，典型地，在所述條件下彼此至少約50%、至少約40%、至少約70%、更優(yōu)選地至少約80%、進(jìn)一步更優(yōu)選地至少約85%到90%、更優(yōu)選地至少95%同源的核苷酸序列保持彼此雜交。這類(lèi)雜交條件的一個(gè)優(yōu)選的非限制性例子是于約45"C下在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交，然后于50°C、優(yōu)選55°C、優(yōu)選60'C和進(jìn)一步更優(yōu)選65'C下，在1XSSC、0.1y。SDS中洗滌一次或多次。高度嚴(yán)格條件包括例如于68'C下在5xSSC/5xDenhardt's溶液/1.0%SDS中雜交并于室溫下在0.2xSSC/0.1%SDS中洗滌。或者，洗滌可以在42t:進(jìn)行。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道對(duì)于嚴(yán)格和高度嚴(yán)格的雜交條件而言應(yīng)用何種條件。涉及這類(lèi)條件的其它指示在該領(lǐng)域能夠容易地獲得，例如在Sambrooketal.，1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,N.Y.;禾口Ausubeletal.(eds.),1995，CurrentProtocolsinMolecularBiology,(JohnWiley&Sons,N.Y.)中。當(dāng)然，僅與多聚A序列(例如mRNA的3'末端多聚(A))或互補(bǔ)的T(或U)殘基段雜交的多核苷酸不應(yīng)被包括于與本發(fā)明的核酸部分特異雜交的本發(fā)明多核苷酸中，因?yàn)檫@類(lèi)多核苷酸會(huì)與含有多聚(A)段或其補(bǔ)體的任何核酸分子(例如尤其是任何雙鏈cDNA克隆)雜交。從其它生物獲得全長(zhǎng)DNA可以以一種典型的途徑，來(lái)篩選從其它生物(例如絲狀真菌，尤其是來(lái)自Aspergillus的種)構(gòu)建的cDNA文庫(kù)。例如，可以通過(guò)Northern印跡針對(duì)同源的OXI01-OXI06多核苷酸篩選Aspergillus菌株。檢測(cè)到與根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸同源的轉(zhuǎn)錄物后，可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從分離自適當(dāng)菌株的RNA構(gòu)建cDNA文庫(kù)?；蛘?，可以使用能夠與根據(jù)本發(fā)明的OXIOl-0乂106多核苷酸雜交的探針來(lái)篩選總基因組DNA文庫(kù)?？梢岳缤ㄟ^(guò)進(jìn)行PCR分離同源的基因序列，所述PCR使用以本文所述核苷酸序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的兩個(gè)簡(jiǎn)并寡核苷酸引物池。用于反應(yīng)的模板可以是通過(guò)反轉(zhuǎn)錄mRNA獲得的cDNA，所述mRNA從已知或懷疑表達(dá)本發(fā)明多核苷酸的菌株中制備?？梢詫?duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行亞克隆和測(cè)序，以確保被擴(kuò)增的序列代表了新OXI01-OXI06核酸序列的序列或其功能等同物。然后可以通過(guò)多種己知方法，使用PCR片段來(lái)分離全長(zhǎng)cDNA克隆。例如，被擴(kuò)增的片段可以被標(biāo)記，并用于篩選噬菌體或粘粒cDNA文庫(kù)。或者，被標(biāo)記的片段可以被用于篩選基因組文庫(kù)。也可以用PCR技術(shù)來(lái)從其它生物中分離全長(zhǎng)cDNA序列。例如，可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)步驟從合適的細(xì)胞或組織來(lái)源中分離RNA。可以使用特異于被擴(kuò)增片段最5'端的寡核苷酸引物，引導(dǎo)第一鏈合成，針對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。然后可以使用標(biāo)準(zhǔn)的末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)將得到的RNA/DNA雜交體"加尾"(例如用鳥(niǎo)嘌呤)，可以用RNaseH消化所述雜交體，然后(例如用多聚-C引物)引物起始第二鏈合成。因此，被擴(kuò)增片段上游的cDNA序列可以容易地被分離。有用的克隆策略的綜述，參閱例如上文Sambrooketal.;和上文的Ausubeletal.。無(wú)論同源的DNA片段是否編碼功能OXIOl-OXI06蛋白質(zhì)，其均可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法容易地被測(cè)試。載體本發(fā)明的另一方面涉及含有下述核酸的載體，優(yōu)選表達(dá)載體，所述核酸編碼OXI01-OXI06蛋白質(zhì)或其功能等同物。本文使用的術(shù)語(yǔ)"載體"指能夠轉(zhuǎn)運(yùn)與之連接的另一核酸的核酸分子。一種類(lèi)型的載體是"質(zhì)粒"，質(zhì)粒是指其中可以連接其它DNA區(qū)段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一種類(lèi)型的載體是病毒載體，其中其它DNA區(qū)段可以被連接進(jìn)病毒基因組中。某些載體在它們被引入的宿主細(xì)胞中能夠自主復(fù)制(例如具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和附加體哺乳動(dòng)物載體)。其它載體(例如非附加體哺乳動(dòng)物載體)在引入宿主細(xì)胞時(shí)被整合進(jìn)宿主細(xì)胞的基因組中，從而隨宿主細(xì)胞的基因組一起被復(fù)制。另外，某些載體能夠指導(dǎo)與它們可操作地連接的基因的表達(dá)。這類(lèi)載體在本文中被稱(chēng)作"表達(dá)載體"。一般而言，重組DNA技術(shù)中使用的表達(dá)載體通常是以質(zhì)粒的形式存在的。術(shù)語(yǔ)"質(zhì)粒"和"載體"在本文中可互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常用的載體形式。然而，本發(fā)明旨在包括這類(lèi)表達(dá)載體的起等同作用的其它形式，如病毒載體(例如復(fù)制缺陷反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。本發(fā)明的重組表達(dá)載體以適合核酸在宿主細(xì)胞中表達(dá)的形式包含本發(fā)明的核酸，這意味著重組表達(dá)載體含有一個(gè)或多個(gè)與待表達(dá)的核酸序列可操作地連接的調(diào)節(jié)序列，以要用于表達(dá)的宿主細(xì)胞為基礎(chǔ)選擇所述調(diào)節(jié)序列。在重組表達(dá)載體中，"可操作地連接"旨在表示感興趣的核苷酸序列與調(diào)節(jié)序列以允許核苷酸序列表達(dá)(例如在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯體系中或當(dāng)載體被引入宿主細(xì)胞中時(shí)在宿主細(xì)胞中)的方式連接。術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)序列"旨在包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其它表達(dá)控制元件(例如多腺苷酸化信號(hào))。這類(lèi)調(diào)節(jié)序歹U描述于例如Goeddel;GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego，CA(1990)中。調(diào)節(jié)序列包括在許多類(lèi)型的宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列組成型表達(dá)的那些和僅在某種宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列表達(dá)的那些(例如組織特異調(diào)節(jié)序列)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道對(duì)表達(dá)載體的設(shè)計(jì)可以以下述因素為基礎(chǔ)，如待轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、期望的蛋白質(zhì)表達(dá)水平等。本發(fā)明的表達(dá)載體可以被引入宿主細(xì)胞中，從而生產(chǎn)由本文所述的核酸編碼的蛋白質(zhì)或肽(例如OXI01-OXI06蛋白質(zhì)，OXI01-OXI06蛋白質(zhì)的突變體形式，其任何的片段、變體或功能等同物等)。本發(fā)明的重組表達(dá)載體可以被設(shè)計(jì)，以用于OXI01-OXI06蛋白質(zhì)在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中的表達(dá)。例如OXIOl-0乂106蛋白質(zhì)可以在細(xì)菌細(xì)胞如E.coli、昆蟲(chóng)細(xì)胞(使用桿狀病毒表達(dá)載體)、酵母細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。合適的宿主細(xì)胞在Goeddel,GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego,CA(1990)中進(jìn)一步討論?；蛘撸梢岳缡褂肨7啟動(dòng)子調(diào)節(jié)序列和T7聚合酶體外轉(zhuǎn)錄和翻譯重組表達(dá)載體?？捎糜诒景l(fā)明的表達(dá)載體包括來(lái)自染色體、附加體和病毒的載體，例如來(lái)自細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母附加體、酵母染色體元件、病毒(如桿狀病毒、乳多空病毒、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒)的載體和來(lái)自其組合的病毒，如來(lái)自質(zhì)粒和噬菌體遺傳元件的病毒(如粘粒和噬菌粒)。DNA插入物應(yīng)與合適的啟動(dòng)子可操作地連接，所述啟動(dòng)子如噬菌體XPL啟動(dòng)子，五.co/Hac、trp和tac啟動(dòng)子，SV40早期和晚期啟動(dòng)子和反轉(zhuǎn)錄病毒LTR的啟動(dòng)子，但不限于這些。其它合適的啟動(dòng)子是技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道的。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，能夠在絲狀真菌中指導(dǎo)氧化還原酶高水平表達(dá)的啟動(dòng)子是優(yōu)選的。這類(lèi)啟動(dòng)子是本領(lǐng)域已知的。表達(dá)構(gòu)建體可含有轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、終止位點(diǎn)和(在被轉(zhuǎn)錄的區(qū)域中)用于翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建體表達(dá)的成熟轉(zhuǎn)錄本的編碼部分應(yīng)包含位于起點(diǎn)的翻譯起始AUG和適當(dāng)?shù)匚挥诖g多肽末端的終止密碼子?？梢酝ㄟ^(guò)常規(guī)的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)將載體DNA引入原核或真核細(xì)胞中。本文使用的術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)化"和"轉(zhuǎn)染"旨在表示用于向宿主細(xì)胞中引入外源核酸(例如DNA)的多種本領(lǐng)域公認(rèn)的技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、陽(yáng)離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或電穿孔。用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的合適方法可見(jiàn)于Sambrook,etal.(MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nd,ed.ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor，NY,1989)，Davisetal.,BasicMethodsinMolecularBiology(1986)和其它實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中。對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染而言，已知取決于使用的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)染技術(shù)，只有非常小的細(xì)胞級(jí)分可以將外源DNA整合進(jìn)它們的基因組中。為了鑒定并選擇這些整合體，通常將編碼可選擇標(biāo)記(例如抗性或抗生素)的基因與感興趣的基因一起引入宿主細(xì)胞中。優(yōu)選的可選擇標(biāo)記包括賦予藥物(例如G418、潮霉素和甲氨喋呤)抗性的基因。編碼可選擇標(biāo)記的核酸可以被引入宿主細(xì)胞中與編碼OXI01-OXI06蛋白質(zhì)的核酸相同的載體上，或可以被引入獨(dú)立的載體上?？梢酝ㄟ^(guò)藥物選擇來(lái)鑒定用被引入的核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(例如，已經(jīng)整合了可選擇標(biāo)記基因的細(xì)胞能夠存活，而其它細(xì)胞死亡)。蛋白質(zhì)在原核生物中的表達(dá)常在E.coli中用下述載體完成，所述載體含有指導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)的組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。如所指出的，表達(dá)載體優(yōu)選地含有可選擇標(biāo)記。這類(lèi)標(biāo)記包括用于真核細(xì)胞培養(yǎng)的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，和用于在五.a^'和其它細(xì)菌中培養(yǎng)的四環(huán)素或氨節(jié)西林抗性。合適的宿主細(xì)胞的代表性例子包括細(xì)菌細(xì)胞，如co/Z、iS^^Zom少c&y禾口iSa/mowe〃a0;//'mwn'"m;真菌細(xì)胞，如酵母；昆蟲(chóng)細(xì)胞如Z)msopMaS2和5^oJop&raSf9;動(dòng)物細(xì)胞如CHO,COS和5owmme/a朋mfl;和植物細(xì)胞。用于上述宿主細(xì)胞的適當(dāng)培養(yǎng)基和條件是本領(lǐng)域已知的。載體中優(yōu)選用于細(xì)菌的是可得自Qiagen的pQE70、pQE60和PQE-9;可得自Stratagene的pBS載體、Phagescript載體、Bluescript載體、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A和可得自Pharmacia的ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5。優(yōu)選的真核載體為可得自Stratagene的PWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pZTl和pSG;和可得自Pharmacia的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。其它合適的載體是技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的。用于本發(fā)明的己知的細(xì)菌啟動(dòng)子包括Kco/Hacl和lacZ啟動(dòng)子，T3和T7啟動(dòng)子，gpt啟動(dòng)子，XPR、PL啟動(dòng)子和trp啟動(dòng)子，HSV胸苷激酶啟動(dòng)子，早期和晚期SV40啟動(dòng)子，反轉(zhuǎn)錄LTR的啟動(dòng)子如Rous肉瘤病毒("RSV")的啟動(dòng)子和金屬硫蛋白啟動(dòng)子如小鼠金屬硫蛋白-I啟動(dòng)子。可以通過(guò)向載體中插入增強(qiáng)子序列，來(lái)提高高等真核生物對(duì)編碼本發(fā)明多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子是DNA的順式作用元件，通常約10到300bp，其作用于提高啟動(dòng)子在給定的宿主細(xì)胞類(lèi)型中的轉(zhuǎn)錄活性。增強(qiáng)子的例子包括SV40增強(qiáng)子(其位于復(fù)制起點(diǎn)下游的bp100到270)、巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子、復(fù)制起點(diǎn)下游的多瘤增強(qiáng)子和腺病毒增強(qiáng)子。為了將翻譯的蛋白質(zhì)分泌進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中、進(jìn)入壁膜間隙中或進(jìn)入細(xì)胞外環(huán)境中，可以向被表達(dá)的多肽中整合進(jìn)適當(dāng)?shù)姆置谛盘?hào)。所述信號(hào)對(duì)多肽可以是同源的或它們可以是異源信號(hào)。多肽可以以經(jīng)修飾的方式被表達(dá)，并可不僅含有分泌信號(hào)而且含有額外的異源功能區(qū)。因此，例如額外氨基酸區(qū)(尤其是帶電荷的氨基酸)可被添加至多肽的N端，以促進(jìn)純化期間或隨后的操作和儲(chǔ)存期間在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性和持久性。還可向多肽添加肽基元，以便于純化。根據(jù)本發(fā)明的多肽本發(fā)明提供了經(jīng)分離的多肽，所述多肽具有根據(jù)SEQIDNO:013-018的氨基酸序列、可通過(guò)在適當(dāng)?shù)乃拗髦斜磉_(dá)SEQIDNO:001-077的多核苷酸獲得的氨基酸序列，以及可以通過(guò)在合適的宿主中表達(dá)SEQIDNO:007-012的多核苷酸序列獲得的氨基酸序列。包含上述多肽的功能等同物的肽或多肽也包含在本發(fā)明中。上述多肽集體包含在術(shù)語(yǔ)"本發(fā)明的多肽"中。術(shù)語(yǔ)"肽"和"寡肽"被認(rèn)為是同義的(如其通常被認(rèn)為的那樣)，且當(dāng)上下文需要表示通過(guò)肽鍵偶合的至少兩個(gè)氨基酸鏈時(shí)，每個(gè)術(shù)語(yǔ)可以互換使用。詞語(yǔ)"多肽"在本文中使用表示含有多于七個(gè)氨基酸殘基的鏈。所有的寡肽和多肽式或序列在本文中從左到右和從氨基端到羧基端的方向書(shū)寫(xiě)。本文使用的單字母氨基酸代碼是本領(lǐng)域普遍已知的，并可見(jiàn)于Sambrook,etal.(MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nd,ed.ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，1989)。"分離的"多肽或蛋白質(zhì)表示被從其天然環(huán)境中取出的多肽或蛋白質(zhì)。例如，就本發(fā)明的目的而言，在宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組產(chǎn)生的多肽和蛋白質(zhì)被認(rèn)為是分離的，與通過(guò)任何合適的技術(shù)已基本純化的天然或重組多肽一樣，所述合適的技術(shù)例如SmithandJohnson,Gene67:31-40(1988)中公開(kāi)的單步驟純化方法?？梢酝ㄟ^(guò)公知的方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化根據(jù)本發(fā)明的OXI01-0乂106氧化還原酶，所述方法包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸萃取、陰離子或陽(yáng)離子交換色譜、磷酸纖維素色譜、疏水相互作用色譜、親和色譜、羥基磷灰石色譜和凝集素色譜。最優(yōu)選地，使用高效液相色譜("HPLC")用于純化。本發(fā)明的多肽包括天然純化的產(chǎn)物、化學(xué)合成步驟的產(chǎn)物，和通過(guò)重組技術(shù)從原核或真核宿主生產(chǎn)的產(chǎn)物，所述宿主包括例如細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。取決于重組生產(chǎn)步驟中使用的宿主，可以將本發(fā)明的多肽糖基化或不糖基化。另外，本發(fā)明的多肽也可以包含最初被修飾的殘基(在一些情況下由宿主介導(dǎo)的過(guò)程產(chǎn)生)。蛋白質(zhì)片段本發(fā)明還包括根據(jù)本發(fā)明的多肽的生物活性片段。本發(fā)明的多肽的生物活性片段包括包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與OXI01-OXI06蛋白質(zhì)的氨基酸序列(其包含比全長(zhǎng)蛋白質(zhì)更少的氨基酸，并限制相應(yīng)的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的至少一種生物活性)足夠同一或來(lái)自后者(例如SEQIDNO:013-018的氨基酸序列)。典型地，生物活性片段包含具有OXI01-OXI06蛋白質(zhì)的至少一種活性的結(jié)構(gòu)域或基序。優(yōu)選的是具有葡萄糖氧化酶活性(E.C.l丄3.4)的片段。本發(fā)明的蛋白質(zhì)的生物活性片段可以是多肽，所述多肽長(zhǎng)度為例如10、25、50、100或更多個(gè)氨基酸。另外，其它生物活性部分(其中蛋白質(zhì)的其它區(qū)域被刪除)可以通過(guò)重組技術(shù)被制備，并針對(duì)本發(fā)明多肽的天然形式的一種或多種生物活性做出評(píng)價(jià)。本發(fā)明還包括編碼OXI01-OXI06蛋白質(zhì)的上述生物活性片段的核酸片段。功能等同物術(shù)語(yǔ)"功能等同物"和"功能變體"在本文可互換使用。OXI01-OXI06DNA的功能等同物是編碼下述多肽的經(jīng)分離的DNA片段，所述多肽顯示本文公開(kāi)的0X101-0X106DNAAm'gw氧化還原酶的具體功能。根據(jù)本發(fā)明的OXI01-OXI06多肽的功能等同物是顯示本文定義的A.niger氧化還原酶的至少一種功能的多肽。因此，功能等同物包括生物活性片段。功能蛋白質(zhì)或多肽等同物可含有SEQIDNO:013-018的僅一個(gè)或多個(gè)氨基酸的保守取代或非必需氨基酸的取代、插入或刪除。因此，非必需氨基酸是SEQIDNO:013-018中能夠被改變而基本不改變生物功能的殘基。例如，在本發(fā)明的OXI01-OXI06蛋白質(zhì)間保守的氨基酸殘基被預(yù)測(cè)為尤其不應(yīng)進(jìn)行改變。另外，在根據(jù)本發(fā)明的OXI01-0乂106蛋白質(zhì)和其它氧化還原酶間保守的氨基酸可能不適合被改變。術(shù)語(yǔ)"保守取代"旨在表示下述取代其中氨基酸殘基被具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基取代。這些家族是本領(lǐng)域已知的，并包括具有堿性側(cè)鏈(例如賴(lài)氨酸、精氨酸和組氨酸)、酸性側(cè)鏈(天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、]8-分支側(cè)鏈(蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。典型地，功能核酸等同物可含有沉默突變或不改變所編碼的多肽生物功能的突變。因此，本發(fā)明提供了編碼下述OXI01-OXI06蛋白質(zhì)的核酸分子，所述蛋白質(zhì)含有對(duì)于具體生物活性并非必需的氨基酸殘基改變。這類(lèi)OXI01-OXI06蛋白質(zhì)在氨基酸序列上與SEQIDNO:013-018差異，但仍保留至少一種生物活性。因此，本發(fā)明還包括包含編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的經(jīng)分離的核酸分子，其中所述蛋白質(zhì)含有與SEQIDNO:013所示氨基酸序列至少約63%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更同源的基本同源的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，經(jīng)分離的核酸分子包含編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列，其中所述蛋白質(zhì)含有與SEQIDNO:014-018所示氨基酸序列至少約40%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更同源的基本同源的氨基酸序列。例如，涉及如何制造表型沉默的氨基酸取代的指導(dǎo)在Bowie，J.U.etal.,Science247:1306-1310(1990)中提供，其中作者指出，存在兩種途徑，用于研究氨基酸序列對(duì)改變的耐受。第一種途徑依賴(lài)于進(jìn)化過(guò)程，其中突變由自然選擇接受或拒絕。第二種途徑使用基因工程在被克隆的基因的特定位點(diǎn)引入氨基酸改變并選擇或篩選，以鑒定保留功能性的序列。如作者所述，這些研究已揭示了蛋白質(zhì)令人驚奇地對(duì)氨基酸取代耐受。作者還指出蛋白質(zhì)某位置上的何種改變很可能被允許。例如，最深埋(buried)的氨基酸殘基需要非極性側(cè)鏈，而表面?zhèn)孺湹暮苌偬卣魇瞧毡楸Ｊ氐?。其它這類(lèi)表型沉默取代在上文Bowieetal及其中所引用的參考文獻(xiàn)中描述?？梢匀缦挛乃鰜?lái)制造編碼與根據(jù)SEQIDNO:013-018的蛋白質(zhì)同源的OXI01-OXI06蛋白質(zhì)的經(jīng)分離的核酸分子向根據(jù)SEQIDNO:001-006或SEQIDNO:007-012的編碼核苷酸序列中引入一個(gè)或多個(gè)核苷酸取代、添加或刪除，使得一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、刪除或插入被引入所編碼的蛋白質(zhì)中。這類(lèi)突變可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)引入，如定點(diǎn)誘變和PCR-介導(dǎo)的誘變。術(shù)語(yǔ)"功能等同物"還包括A.nigerOXI01-OXI06蛋白質(zhì)的直向同源物。A.nigerOXI01-OXI06蛋白質(zhì)的直向同源物是能夠從其它菌株或物種中分離并具有相似或相同生物活性的蛋白質(zhì)。這類(lèi)直向同源物可容易地被鑒定，因?yàn)楹信cSEQIDNO:013-018基本同源的氨基酸序列。本文定義術(shù)語(yǔ)"基本同源"是指含有與第二氨基酸或核苷酸序列足夠或最少的同一或等同(例如具有相似側(cè)鏈)的氨基酸或核苷酸的第一氨基酸或核苷酸序列，使得所述第一和第二氨基酸或核苷酸序列具有共同的結(jié)構(gòu)域。例如，含有下述共有結(jié)構(gòu)域的氨基酸或核苷酸序列在本文中被定義為足夠同一，所述共有結(jié)構(gòu)域具有約40%、優(yōu)選65%、更優(yōu)選70%、進(jìn)一步更優(yōu)選75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性或更多。此外，編碼其它OXI01-OXI06家族成員的核酸(其因而具有與SEQIDNO:001-006或SEQIDNO:007-012不同的核苷酸序列)也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。另外，編碼來(lái)自不同物種的OXIOl-0乂106蛋白質(zhì)的核酸(其因此具有與SEQIDNO:001-006或SEQIDNO:007-012不同的核苷酸序列)在本發(fā)明的范圍內(nèi)?？梢愿鶕?jù)它們與本文公開(kāi)的OXI01-OXI06核酸的同源性，使用本文公開(kāi)的cDNA或其合適的片段作為雜交探針，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的雜交技術(shù)，優(yōu)選地在高度嚴(yán)格的雜交條件下，來(lái)分離對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的OXI01-OXI06DNA的變體(例如天然等位基因變體)或同源物的核酸分子。除了OXI01-OXI06序列的天然存在的等位基因變體外，技術(shù)人員知道，可以通過(guò)突變向SEQIDNO:001-006或SEQIDNO:007-012的核苷酸序列中引入改變，從而導(dǎo)致OXI01-OXI06蛋白質(zhì)的氨基酸序列中的改變，而不顯著改變OXI01-0乂106蛋白質(zhì)的功能。在本發(fā)明的另一方面，提供了經(jīng)改進(jìn)的OXI01-OXI06蛋白質(zhì)。經(jīng)改進(jìn)的OXI01-OXI06蛋白質(zhì)是其中至少一種生物活性被改進(jìn)的蛋白質(zhì)。這類(lèi)蛋白質(zhì)可以如下獲得沿全部或部分OXIOl-0乂106編碼序列隨機(jī)地引入突變，重組表達(dá)得到的突變體并針對(duì)生物活性進(jìn)行篩選。例如，本領(lǐng)域提供了用于測(cè)量氧化還原酶酶活性的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)，因而經(jīng)改進(jìn)的蛋白質(zhì)可以容易地被選擇。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，OXI01-OXI06蛋白質(zhì)具有根據(jù)SEQIDNO:013-018的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，OXI01-OXI06多肽與根據(jù)SEQIDNO:013-018的氨基酸序列基本同源，并保留根據(jù)SEQIDNO:013-018的多肽的至少一種生物活性，但是由于如上所述的天然變異或誘變而在氨基酸序列上有差異。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，OXI01-0乂106蛋白質(zhì)具有由下述經(jīng)分離的核酸片段編碼的氨基酸序列，所述經(jīng)分離的核酸片段能夠與根據(jù)SEQIDNO:001-006或SEQIDNO:007-012的核酸優(yōu)選地在高度嚴(yán)格的雜交條件下雜交。對(duì)于包含根據(jù)SEQIDNO:013的氨基酸序列的蛋白質(zhì)而言，與功能酶最接近的同系物是來(lái)自^spwgz7/i/wm^fl似s的異戊醇氧化酶，該異戊醇氧化酶顯示與SEQID01362%的同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)分離的核酸分子包含編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列，其中所述蛋白質(zhì)包含與SEQIDNO:013所示氨基酸序列至少約63%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同源的基本同源的氨基酸序列，并且是包含根據(jù)SEQIDNO:013的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的功能等同物。對(duì)于包含根SEQIDNO:014的氨基酸序列的蛋白質(zhì)而言，與功能酶最接近的同源物是來(lái)自J"http://ra6acter的6-羥基煙堿氧化酶，該酶顯示與SEQID014xx^的同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)分離的核酸分子包含編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列，其中所述蛋白質(zhì)包含與SEQIDNO:014所示氨基酸序列至少約40%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同源的基本同源的氨基酸序列，并且是包含根據(jù)SEQIDNO:014的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的功能等同物。對(duì)于包含根SEQIDNO:015的氨基酸序列的蛋白質(zhì)而言，與功能酶最接近的同源物是來(lái)自^pe^7/M/am^ctw的雜色曲霉素B合酶，該酶顯示與SEQID01531%的同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)分離的核酸分子包含編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列，其中所述蛋白質(zhì)包含與SEQIDNO:015所示氨基酸序列至少約40%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同源的基本同源的氨基酸序列，并且是包含根據(jù)SEQIDNO:015的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的功能等同物。包含根SEQIDNO:016的氨基酸序列的蛋白質(zhì)顯示與任何功能酶無(wú)同源性。在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)分離的核酸分子包含編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列，其中所述蛋白質(zhì)包含與SEQIDNO:016所示氨基酸序列至少約40%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同源的基本同源的氨基酸序列，并且是包含根據(jù)SEQIDNO:016的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的功能等同物。對(duì)于包含根SEQIDNO:017的氨基酸序列的蛋白質(zhì)而言，與功能酶最接近的同源物是來(lái)自^^raZ^cter的6-羥基-D-煙堿氧化酶，該酶顯示與SEQID017<25%的同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)分離的核酸分子包含編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列，其中所述蛋白質(zhì)包含與SEQIDNO:017所示氨基酸序列至少約40%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同源的基本同源的氨基酸序列，并且是包含根據(jù)SEQIDNO:017的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的功能等同物。包含根SEQIDNO:018的氨基酸序列的蛋白質(zhì)顯示與任何功能酶無(wú)同源性。在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)分離的核酸分子包含編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列，其中所述蛋白質(zhì)包含與SEQIDNO:018所示氨基酸序列至少約40%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同源的基本同源的氨基酸序列，并且是包含根據(jù)SEQIDNO:018的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的功能等同物。因此，OXI01蛋白質(zhì)是包含下述氨基酸序列的蛋白質(zhì)，所述氨基酸序列與SEQIDNO:013所示氨基酸序列至少約63%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同源，并保留根據(jù)SEQIDNO:013的多肽的至少一種功能活性。類(lèi)似地，OXI2-OXI06蛋白質(zhì)是包含下述氨基酸序列的蛋白質(zhì)，所述氨基酸序列分別與SEQIDNO:014-018所示氨基酸序列至少約40%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同源，并保留根據(jù)SEQIDNO:014-018的多肽的至少一種功能活性。也可以如下文所述來(lái)鑒定根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的功能等同物例如，針對(duì)氧化還原酶活性，篩選本發(fā)明蛋白質(zhì)的突變體(例如截短突變體)的組合文庫(kù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)核酸水平上的組合誘變產(chǎn)生有斑文庫(kù)(variegatedlibrary)。可以通過(guò)例如將合成的寡核苷酸混合物酶連接為基因序列來(lái)產(chǎn)生變體的有斑文庫(kù)，從而可能的蛋白質(zhì)序列的簡(jiǎn)并集合(degenerateset)可作為個(gè)體多肽表達(dá)。存在可用于從簡(jiǎn)并寡核苷酸生產(chǎn)本發(fā)明多肽的可能變體文庫(kù)的多種方法。用于合成簡(jiǎn)并寡核苷酸的方法是本領(lǐng)域已知的(見(jiàn)例如Narang(1983)Tetrahedron39:3;Itakuraetal.(1984)Annu.Rev.Biochem.53:323;Itakuraetal.(1984)Science198:1056;Ikeetal.(1983)NucleicAcidRes.11:477)。另外，本發(fā)明多肽的編碼序列的片段文庫(kù)可以被用于產(chǎn)生有斑的多肽群，用于篩選隨后的變體選擇。例如，可以如下產(chǎn)生編碼序列片段的文庫(kù)在每個(gè)分子僅發(fā)生約一次切割的條件下用核酸酶處理感興趣的編碼序列的雙鏈PCR片段，變性雙鏈DNA，將DNA復(fù)性形成雙鏈DNA(其可包含來(lái)自被不同切割的產(chǎn)物的有義/反義對(duì))，通過(guò)用Sl核酸酶處理從再形成的雙鏈體上去除單鏈部分，并將得到的片段文庫(kù)連接進(jìn)表達(dá)載體中。通過(guò)該方法，可以得到下述表達(dá)文庫(kù)，所述表達(dá)文庫(kù)編碼感興趣的蛋白質(zhì)的不同大小的N-末端和內(nèi)部片段。本領(lǐng)域已知有若干種技術(shù)可用于篩選組合文庫(kù)(其通過(guò)截短的點(diǎn)突變制造)的基因產(chǎn)物，和用于篩選cDNA文庫(kù)以獲得具有選定特性的基因產(chǎn)物。用于篩選大基因文庫(kù)的、適用于高通量分析的、最廣泛使用的技術(shù)典型地包括將基因文庫(kù)克隆進(jìn)可復(fù)制的表達(dá)載體中，用得到的載體文庫(kù)轉(zhuǎn)化合適的細(xì)胞，和在下述條件下表達(dá)組合基因，所述條件下想要的活性的檢測(cè)簡(jiǎn)化編碼基因(其產(chǎn)物被檢測(cè))的載體的分離。循環(huán)總體誘變(Recursiveensemblemutagenesis,REM)，一種增強(qiáng)文庫(kù)中功能突變體頻率的技術(shù)，可以與篩選實(shí)驗(yàn)組合使用以鑒定本發(fā)明蛋白質(zhì)的變體(ArkinandYourvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:7811-7815;Delgraveetal.(1993)ProteinEngineering6(3):327-331)。除了SEQIDNO:1中所示的OXI01-OXI06基因序列外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道給定的種群中可存在DNA序列多態(tài)，所述多態(tài)導(dǎo)致OXI01-OXI06蛋白質(zhì)氨基酸序列中的改變。這類(lèi)遺傳多態(tài)性可存在于來(lái)自不同種群的細(xì)胞中或由于天然等位基因變異而存在于一個(gè)種群中。等位基因變體也可包括功能等同物。根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的片段也可包括不編碼功能多肽的多核苷酸。這類(lèi)多核苷酸可作為PCR反應(yīng)的探針或引物作用。根據(jù)本發(fā)明的核酸無(wú)論是編碼功能多肽還是無(wú)功能的多肽，均可被用作雜交探針或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物。不編碼具有OXI01-OXI06活性的多肽的本發(fā)明核酸分子的用途尤其包括(l)從cDNA文庫(kù)分離編碼OXI01-OXI06蛋白質(zhì)的基因或其等位基因變體，所述cDNA文庫(kù)例如來(lái)自除A.niger之外的其它生物；(2)與中期染色體涂片原位雜交(例如FISH)以提供OXI01-OXI06基因的精確染色體定位，如Vermaetal.,HumanChromosomes:aManualofBasicTechniques,PergamonPress,NewYork(1988)所述；(3)Northem印跡分析，用于檢測(cè)OXI01-OXI06mRNA在特定組織中的表達(dá)；和4)能夠被用作診斷工具來(lái)分析給定的生物(例如組織)樣品中核酸存在的探針和引物，所述核酸能與OXI01-OXI06探針雜交。本發(fā)明還包括獲得OXI01-OXI06基因或cDNA功能等同物的方法。這類(lèi)方法需要獲得被標(biāo)記的含有被分離的核酸的探針，所述被分離的核酸編碼根據(jù)SEQIDNO:013-018的序列或其變體的全部或部分；在允許探針與文庫(kù)中的核酸片段雜交從而形成核酸雙鏈體的條件下，用被標(biāo)記的探針篩選核酸片段文庫(kù)，和從任何被標(biāo)記的雙鏈體中的核酸片段制備全長(zhǎng)的基因序列，以獲得與OXI01-OXI06基因相關(guān)的基因。宿主細(xì)胞在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括細(xì)胞，例如含有本發(fā)明所包括的核酸的經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或重組的宿主細(xì)胞。"經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞"或"重組細(xì)胞"是其中(或其祖先中)已經(jīng)借助于重組DNA技術(shù)引入了本發(fā)明核酸的細(xì)胞。原核和真核細(xì)胞均包括在內(nèi)，例如細(xì)菌、真菌、酵母等等，特別優(yōu)選的是來(lái)自絲狀真菌(尤其是Aspergillusniger)的細(xì)胞?？蛇x用調(diào)控插入序列表達(dá)并以特異的、期望的方式加工基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞。蛋白質(zhì)產(chǎn)物的這類(lèi)修飾(例如糖基化)和加工(例如切割)可促進(jìn)蛋白質(zhì)發(fā)揮最佳功能。多種宿主細(xì)胞具有用于翻譯前加工和修飾蛋白質(zhì)和基因產(chǎn)物的特性和特異機(jī)制。可選用分子生物學(xué)和/或微生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的適當(dāng)細(xì)胞系或宿主系統(tǒng)，以確保對(duì)所表達(dá)的外源蛋白質(zhì)的想要的和正確的修飾與加工。為此，可以使用具有下述細(xì)胞機(jī)制的真核宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞機(jī)制用于適當(dāng)?shù)丶庸ぴ嫁D(zhuǎn)錄本、糖基化和磷酸化基因產(chǎn)物。這類(lèi)宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域公知的。宿主細(xì)胞還包括但不限于哺乳動(dòng)物細(xì)胞系如CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38和脈絡(luò)叢細(xì)胞系。如果想要的話，可以由穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系來(lái)生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的多肽。公眾可獲得多種適用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的載體，用于構(gòu)建這類(lèi)細(xì)胞系的方法也是公眾己知的，例如Ausubeletal.(上文)中。氧化還原酶在工業(yè)過(guò)程中的用途本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶在選定數(shù)量的工業(yè)過(guò)程中的用途。盡管用這些過(guò)程獲得了長(zhǎng)期的經(jīng)驗(yàn)，但是根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶具有超出目前所用酶的大量顯著優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)特定的應(yīng)用，這些優(yōu)點(diǎn)可包括下述方面，如更好的性能、更低的生產(chǎn)成本、更高的底物特異性、更低的抗原性、更少的不想要的副活性、在合適的微生物中生產(chǎn)時(shí)更高的產(chǎn)率、更合適的pH和溫度范圍、更好的最終產(chǎn)物味道以及食物級(jí)別和猶太教規(guī)方面(kosheraspect)。本發(fā)明的氧化還原酶可被用于下述任何應(yīng)用中，所述應(yīng)用中期望氧化底物或獲得其特定反應(yīng)產(chǎn)物。例如，根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶的應(yīng)用能夠與醛、醇、羧酸等一起產(chǎn)生過(guò)氧化氫?？梢允褂酶鶕?jù)本發(fā)明的新穎氧化還原酶的工業(yè)過(guò)程之一是烘焙應(yīng)用。本發(fā)明還涉及提供面粉面團(tuán)的方法(其具有經(jīng)改進(jìn)的流變學(xué)特性)，并涉及從這類(lèi)面團(tuán)制造的完成烘焙的或干燥的制品(其具有經(jīng)改進(jìn)的結(jié)構(gòu)、食用品質(zhì)和尺寸特性)。本發(fā)明還涉及烘焙預(yù)混合物，所述預(yù)混合物包含面粉、酶制劑和合適的運(yùn)載體。本發(fā)明導(dǎo)致產(chǎn)生更強(qiáng)的面團(tuán)，其具有經(jīng)改進(jìn)的流變學(xué)特性以及具有經(jīng)改進(jìn)的品質(zhì)的最終烘焙制品。對(duì)小規(guī)模和大規(guī)模應(yīng)用而言，面團(tuán)的強(qiáng)度均是烘焙的重要方面。結(jié)實(shí)的面團(tuán)在面團(tuán)轉(zhuǎn)運(yùn)期間具有更大的混合時(shí)間、醒發(fā)時(shí)間和機(jī)械振動(dòng)耐性，而軟弱的面團(tuán)對(duì)這些處理更不耐受。具有更好的流變學(xué)和操作特性的結(jié)實(shí)面團(tuán)來(lái)自含有強(qiáng)谷蛋白網(wǎng)狀系統(tǒng)的面粉。具有低蛋白質(zhì)含量或差的谷蛋白品質(zhì)的面粉導(dǎo)致軟弱的面團(tuán)。面團(tuán)調(diào)節(jié)齊l」(conditioner)是烘焙工業(yè)公知的。向面包面團(tuán)中添加調(diào)節(jié)劑導(dǎo)致產(chǎn)生經(jīng)改進(jìn)的面團(tuán)可加工性和經(jīng)改進(jìn)的面包結(jié)構(gòu)、體積、口味和新鮮度(抗腐性)。非特異性的氧化劑(如碘酸鹽、過(guò)氧化物、抗壞血酸、溴酸鉀和偶氮二酰胺)被用于促進(jìn)面粉的烘焙性能、獲得具有經(jīng)改進(jìn)的流變學(xué)特性的面團(tuán)以及獲得具有想要的強(qiáng)度和穩(wěn)定性的面團(tuán)。已經(jīng)提出這些調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)蛋白質(zhì)之間鍵的形成，所述鍵強(qiáng)化谷蛋白從而強(qiáng)化面團(tuán)。然而，若干種目前可獲得的化學(xué)氧化劑的使用遇到了消費(fèi)者的抵制，或不被管理機(jī)構(gòu)允許。酶作為面團(tuán)調(diào)節(jié)劑的用途已經(jīng)被認(rèn)為是化學(xué)調(diào)節(jié)劑的備選方案。目前大量的酶已經(jīng)被用作面團(tuán)和/或面包改進(jìn)劑，尤其是作用于面團(tuán)中大量存在的成分的酶。這類(lèi)酶的例子是淀粉酶、蛋白酶、葡萄糖氧化酶、己糖氧化酶、木聚糖酶和(半)纖維素酶，包括聚戊糖酶(pentosanase)和脂酶、磷脂酶和半乳糖脂酶。烘焙制品從下述面團(tuán)制備，所述面團(tuán)通常由堿性成分面粉、水和任選的鹽制成。取決于烘焙制品，其它任選的成分為糖、調(diào)味劑等。對(duì)發(fā)酵劑制品而言，在化學(xué)發(fā)酵系統(tǒng)之后主要使用面包酵母(baker'syeast)，所述化學(xué)發(fā)酵系統(tǒng)如酸(產(chǎn)酸化合物)和碳酸氫鹽的組合。為了改進(jìn)面團(tuán)的操作特性和/或烘焙制品的最終特性，存在開(kāi)發(fā)加工助劑(aids)的持續(xù)努力，所述加工助劑具有改進(jìn)的特性。待改進(jìn)的面團(tuán)特性包括可加工性、氣體保留能力等。可以被改進(jìn)的烘焙制品的特性包括面包體積、面包屑易碎性(crustcrispiness)、粉碎結(jié)構(gòu)和柔軟性、口味和香味和保質(zhì)期。目前存在的加工助劑可以被分為兩組化學(xué)添加劑和酶。具有改進(jìn)特性的化學(xué)添加劑包括化學(xué)氧化劑如抗壞血酸、溴酸鹽和偶氮碳酸氫鹽(azodicarbonate)，還原劑如L-半胱氨酸和谷胱甘肽，作為面團(tuán)調(diào)節(jié)劑(如二乙酰酒石酸酯)發(fā)揮作用的乳化劑如單/雙甘油酯(DATEM)、硬脂酰乳酸鈉(sodiumstearoyllactylate,SSL)或硬脂酰乳酸鈣(CSL)，或作為面包防硬劑發(fā)揮作用的如單硬脂酸甘油酯(GMS)等，脂肪材料如甘油三酯(脂肪)或卵磷脂等等。最近，存在用酶代替化學(xué)添加劑的趨勢(shì)。酶被認(rèn)為是更天然的化合物并屈此更被消費(fèi)者接受。合適的酶可選自氧化酶，由淀粉降解酶、阿拉伯木聚糖和其它半纖維素降解酶、纖維素降解酶、脂肪材料裂解酶和蛋白質(zhì)降解酶組成的組。本發(fā)明還涉及用于制備面團(tuán)或烘焙制品的方法，所述方法包括向面團(tuán)中摻入有效量的本發(fā)明的氧化還原酶，這相對(duì)于其中未摻入多肽的面團(tuán)或烘焙制品而言促進(jìn)面團(tuán)或得自面團(tuán)的烘焙制品的一種或多種特性。短語(yǔ)"摻入面團(tuán)中"在本文中定義為向面團(tuán)中、要用于制造面團(tuán)的任何成分中、和/或要制造面團(tuán)的面團(tuán)成分的混合物中添加根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶。換言之，根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶可以在面團(tuán)制備的任何步驟中被添加，并可以在一個(gè)、兩個(gè)或更多步驟中被添加。根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶被添加進(jìn)面團(tuán)的成分中，所述成分使用本領(lǐng)域公知的方法被揉捏和烘焙以制造烘焙制品。參閱例如U.S.專(zhuān)利No.4,567,046、EP-A-426，211、JP隱A-60-78529、JP-A-62-111629和JP-A-63-258528。術(shù)語(yǔ)"有效量"在本文中定義為根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶的下述量，所述量足夠?qū)γ鎴F(tuán)和/或烘焙制品的至少一個(gè)感興趣的特性提供可測(cè)量的作用。術(shù)語(yǔ)"經(jīng)改進(jìn)的特性"在本文中定義為面團(tuán)和/或得自面團(tuán)的制品(尤其是烘焙制品)的任何特性，所述特性相對(duì)于其中未摻入本發(fā)明氧化還原酶的面團(tuán)或產(chǎn)物而言被本發(fā)明的氧化還原酶的作用改進(jìn)。經(jīng)改進(jìn)的特性可包括但不限于提高的面團(tuán)強(qiáng)度、提高的面團(tuán)彈性、提高的面團(tuán)穩(wěn)定性、經(jīng)改進(jìn)的烘焙制品香味、經(jīng)改進(jìn)的烘焙制品抗腐性和經(jīng)改進(jìn)的面包屑白度?？梢愿鶕?jù)以下實(shí)施例中所述的本發(fā)明的方法，通過(guò)將添加和不添加本發(fā)明多肽而制備的面團(tuán)和/或烘焙制品進(jìn)行比較，來(lái)測(cè)定經(jīng)改進(jìn)的特性。感覺(jué)品質(zhì)可以使用烘焙工業(yè)中明確的流程來(lái)評(píng)價(jià)，并可包括例如使用一組受過(guò)訓(xùn)練的口味測(cè)試人員(apaneloftrainedtaste-testers)。術(shù)語(yǔ)"提高的面團(tuán)強(qiáng)度"在本文中定義為面團(tuán)的下述特性，所述面團(tuán)一般具有更具彈性的特性和/或需要更多的勞動(dòng)輸入來(lái)用模具成形和造型。術(shù)語(yǔ)"提高的面團(tuán)彈性"在本文中定義為面團(tuán)的下述特性，所述面團(tuán)具有在經(jīng)受過(guò)某些物理張力之后恢復(fù)其原始形狀的更高趨勢(shì)。術(shù)語(yǔ)"提高的面團(tuán)穩(wěn)定性"在本文中定義為面團(tuán)的下述特性，所述面團(tuán)對(duì)機(jī)械損傷更不敏感，因此更好地維持其形狀和體積。術(shù)語(yǔ)"降低的面團(tuán)粘稠度"在本文中定義為面團(tuán)的下述特性，所述面團(tuán)具有更小的與表面(例如在面團(tuán)生產(chǎn)機(jī)器中)粘附的趨勢(shì)，并如本領(lǐng)域所已知的，由熟練的測(cè)試烘焙者根據(jù)經(jīng)驗(yàn)評(píng)價(jià)或通過(guò)使用紋理分析儀(例如TAXT2)測(cè)量。術(shù)語(yǔ)"經(jīng)改進(jìn)的面團(tuán)延展性"在本文中定義為面團(tuán)的下述特性，所述面團(tuán)可以接受提高的張力或拉伸而不破裂。術(shù)語(yǔ)"經(jīng)改進(jìn)的面團(tuán)可加工性"在本文中定義為面團(tuán)的下述特性，所述面團(tuán)一般更不粘和/或更堅(jiān)硬和/或更有彈性。術(shù)語(yǔ)"提高的面團(tuán)醒發(fā)抗性"被定義為面團(tuán)經(jīng)受延長(zhǎng)的醒發(fā)時(shí)間的能力。術(shù)語(yǔ)"提高的烘焙制品的體積"被測(cè)量為給定的面包的比體積(specificvolume,體積/重量)，這典型地通過(guò)傳統(tǒng)的油菜籽替換方法測(cè)定。術(shù)語(yǔ)"經(jīng)改進(jìn)的烘焙制品面包屑結(jié)構(gòu)"在本文中定義為烘焙制品的特性，所述烘焙制品的面包屑中具有更精細(xì)和/或更薄的細(xì)胞壁和/或細(xì)胞在面包屑中更均一/同質(zhì)的分布，并通常由熟練的測(cè)試烘焙者根據(jù)經(jīng)驗(yàn)評(píng)價(jià)。術(shù)語(yǔ)"經(jīng)改進(jìn)的烘焙制品柔軟性"是"硬度"的反義詞，并在本文中定義為烘焙制品的特性，所述烘焙制品更容易被壓縮，并且如本領(lǐng)域已知由熟練的測(cè)試烘焙者根據(jù)經(jīng)驗(yàn)評(píng)價(jià)或通過(guò)使用紋理分析儀(例如TAXT2)測(cè)量。術(shù)語(yǔ)"經(jīng)改進(jìn)的烘焙制品香味"由受過(guò)訓(xùn)練的測(cè)試組評(píng)價(jià)。術(shù)語(yǔ)"經(jīng)改進(jìn)的烘焙制品抗腐性"在本文中被定義為烘焙制品的特性，所述烘焙制品儲(chǔ)存期間具有降低的品質(zhì)參數(shù)(例如柔軟度和/或彈性)衰退速率o術(shù)語(yǔ)"面團(tuán)"在本文中定義為面粉和其它成分的混合物，所述混合物足夠堅(jiān)硬到被揉捏或滾動(dòng)。面團(tuán)可以是新鮮的、冷凍的、預(yù)先暴露的(pre-bared)或預(yù)先烘焙的。冷凍面團(tuán)的制備由KulpandLorenz在FrozenandRefrigeratedDoughsandBatters中描述。術(shù)語(yǔ)"烘焙制品"在本文中定義為從面團(tuán)制備的、具有軟或脆特征的任何制品?？捎欣赜杀景l(fā)明生產(chǎn)的烘焙制品(無(wú)論是白色、淺色或深色類(lèi)型)的例子為面包(尤其是白面包、全麥面包或裸麥面包)，典型地以棍或巻(loavesorrolls)的形式，法棍面包，意大利面，皮塔(pita)面包，玉米餅(tortillas),墨西哥玉米巻，蛋糕，煎餅，餅干，曲奇，餡餅皮(piecrust)，饅頭和脆面包(crispbread)等等。本發(fā)明的氧化還原酶和/或本發(fā)明方法中要使用的其它酶可以是適用于所述用途的任何形式，例如干粉、凝聚的粉末、顆粒(尤其是無(wú)塵顆粒)、液體(尤其是經(jīng)穩(wěn)定的液體)或受保護(hù)的酶(如WO01/11974和WO02/26044中所述)的形式?？梢酝ㄟ^(guò)常規(guī)方法制備顆粒和凝聚的粉末，例如通過(guò)將根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶噴霧在流動(dòng)床顆粒劑上的運(yùn)載體上。運(yùn)載體可由顆粒核心組成，所述顆粒核心具有合適的顆粒大小。運(yùn)載體可以是可溶的或不溶的，例如鹽(例如NaCI或硫酸鈉)、糖(例如蔗糖或乳糖)、糖醇(例如山梨糖醇)、淀粉、稻、玉米粒或大豆。根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶和/或其它酶可以含在緩釋的配方中。用于制備緩釋配方的方法是本領(lǐng)域公知的。添加營(yíng)養(yǎng)學(xué)可接受的穩(wěn)定劑(如糖、糖醇或其它多元醇和/或乳酸或根據(jù)已知方法的其它有機(jī)酸)可例如對(duì)液體酶制劑加以穩(wěn)定。根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶也可以被摻入包含酵母的組合物中，如EP-A-0619947、EP-A-0659344和WO02/49441中公開(kāi)的組合物。對(duì)于包含在面粉的預(yù)先混合物中而言，根據(jù)本發(fā)明的多肽是干燥制品(例如無(wú)塵顆粒)是有利的，而對(duì)于與液體一起被包含而言，液體形式是有利的。也可以向面團(tuán)中摻入一種或多種其它酶。所述其它酶可以是任何來(lái)源，包括哺乳動(dòng)物和植物來(lái)源，優(yōu)選地為微生物(細(xì)菌、酵母或真菌)來(lái)源，并可通過(guò)本領(lǐng)域常用技術(shù)獲得。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，其它酶可以是淀粉酶如a-淀粉酶(適用于提供可被酵母發(fā)酵的糖并延緩腐敗)或/3-淀粉酶，環(huán)糊精葡萄糖轉(zhuǎn)位酶，肽酶尤其是外肽酶(適用于增強(qiáng)香味)、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，脂酶/磷脂酶/半乳糖脂酶(適用于修飾面團(tuán)或面團(tuán)組分中存在的脂解化合物)，氧化還原酶，纖維素酶，半纖維素酶，尤其是戊聚糖酶如木聚糖酶(適用于戊聚糖的部分水解，這提高面團(tuán)的延展性)，蛋白酶(適用于削弱谷蛋白，尤其是使用硬小麥粉時(shí))，蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶，例如WO95/00636中公開(kāi)的蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶，糖基轉(zhuǎn)移酶，過(guò)氧化物酶(適用于改進(jìn)面團(tuán)的稠度)，漆酶，兒茶酚氧化酶或其它氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、己糖氧化酶、醛糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、脂肪氧化酶或L-氨基酸氧化酶(適用于改進(jìn)面團(tuán)的稠度)。當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的方法要添加一種或多種其它酶添加劑時(shí)，這些添加劑可以單獨(dú)地或與根據(jù)本發(fā)明的多肽一起，任選地作為面包改進(jìn)和/或面團(tuán)改進(jìn)組合物的組分被添加。其它酶活性可以是上述的任何酶，并可以根據(jù)己確立的烘焙實(shí)踐確定劑量。本發(fā)明還涉及用于制備烘焙制品的方法，包括烘焙通過(guò)本發(fā)明方法獲得的面團(tuán)，以生產(chǎn)烘焙制品。烘培面團(tuán)以生產(chǎn)烘培制品可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行。本發(fā)明還涉及分別通過(guò)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的面團(tuán)和烘焙制品。本發(fā)明還涉及用于面團(tuán)和/或由面團(tuán)制成的烘焙制品的預(yù)混合物(例如為面粉組合物形式)，其中所述預(yù)混合物包含本發(fā)明的多肽。術(shù)語(yǔ)"預(yù)混合物"在本文定義為以其常規(guī)含義理解，即作為烘焙劑的混合物，一般包含不僅可用于工業(yè)面包烘焙劑中的面粉，一般包含不僅可用于工業(yè)面包烘焙工廠/設(shè)施、而且也可用于零售面包房的面粉。可以通過(guò)將本發(fā)明的多肽或包含多肽的本發(fā)明的面包改進(jìn)和/或面團(tuán)改進(jìn)組合物與合適的運(yùn)載體(如面粉、淀粉、糖或鹽)混合來(lái)制備預(yù)混合物。預(yù)混合物可含有其它面團(tuán)改進(jìn)和/或面包改進(jìn)添加劑，例如包括上述酶的任何添加劑。本發(fā)明還涉及顆?；蚰鄯勰┬问降暮姹禾砑觿?，所述添加劑包含本發(fā)明的多肽。烘焙添加劑優(yōu)選地具有狹窄的顆粒大小分布，多于95%(按重量計(jì))的顆粒在25到500/xm的范圍內(nèi)。在面團(tuán)和面包制造中，本發(fā)明可與前文定義的加工助劑組合使用，所述加工助劑如化學(xué)加工助劑，如氧化劑(例如抗壞血酸)、還原劑(例如L-半胱氨酸)、磷脂酶和/或其它酶，如多糖修飾酶(例如ce-淀粉酶、半纖維素酶、分支酶等)和/或蛋白質(zhì)修飾酶(內(nèi)切蛋白酶、外切蛋白酶、分支酶等)。還發(fā)現(xiàn)OXI01蛋白質(zhì)能夠在面團(tuán)中產(chǎn)生過(guò)氧化氫。其令人驚奇地使甩至少9,12，13-三羥基-10-十八碳烯酸作為底物，從而生產(chǎn)氧代-二羥基-lO-十八碳烯酸。該底物存在于例如面粉中，并因此使得OXI01蛋白質(zhì)特別適用于烘焙。這類(lèi)酶在烘焙中的用途之前是未知的。因此，本發(fā)明還包括下述酶在烘焙中的用途，所述酶催化羥基脂肪酸(例如單羥基脂肪酸或二羥基脂肪酸或三羥基脂肪酸如9,12,13-三羥基-10-十八碳烯酸)的氧化從而產(chǎn)生過(guò)氧化氫。合適的酶類(lèi)型的一個(gè)例子是醇氧化酶，例如仲醇氧化酶或異戊醇氧化酶。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，能夠氧化羥基脂肪酸的酶與脂肪氧合酶和/或過(guò)氧化物酶組合。本發(fā)明還涉及適用于烘焙的組合物，包括能夠氧化羥基脂肪酸的酶和脂氧合酶和/或過(guò)氧化物酶。優(yōu)選地，能夠氧化羥基脂肪酸的該酶能夠氧化9,12，13-三羥基-10-十八碳烯酸。更優(yōu)選地，能夠氧化羥基脂肪酸的該酶為OXI01蛋白質(zhì)，進(jìn)一步更優(yōu)選為包含根據(jù)SEQIDNO:013的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶的另一用途是乳制品應(yīng)用領(lǐng)域內(nèi)的。對(duì)乳的熱處理總是伴隨著一些程度的麥拉德反應(yīng)(Maillardreaction),導(dǎo)致被處理的乳發(fā)生輕微的褐色。盡管在一些情況下這可以是想要的(例如在牛油糖(butterscotchconfection)或焦糖中)，但是變褐通常是不想要的。麥拉德反應(yīng)是還原乳中存在的糖(特別是乳糖、葡萄糖和乳糖)與乳蛋白質(zhì)(如酪蛋白或乳清蛋白)中存在的游離氨基反應(yīng)的結(jié)果。根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶OXI01-06可用于在提高的溫度下降低乳、乳衍生制品或含有這類(lèi)乳衍生(乳)制品的食物中的麥拉德反應(yīng)。這類(lèi)處理的一個(gè)例子是巴氏消毒乳，以提高其保質(zhì)期穩(wěn)定性。在低溫長(zhǎng)時(shí)間(LTLP)巴氏消毒(也稱(chēng)作大桶(vat)巴氏消毒)中，典型地將乳在62.80。C保持不少于30分鐘。在連續(xù)的過(guò)程中，使用高溫短時(shí)間(HTST)巴氏消毒，其中乳在不低于71.7(TC的溫度下保持最少15秒(或在更高溫度下更短時(shí)間段的等同條件)。更最近開(kāi)發(fā)的是超高溫處理(UHT)巴氏消毒，其中乳被加熱至至少135X:保持最少l秒。UHT處理特別需要、LTLP和HTST處理也以較小的程度需要非常嚴(yán)格的溫度和過(guò)程控制。使用根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶的合適的應(yīng)用的一個(gè)例子是涂在批薩上面的乳酪。在許多情況下，在批薩餡料中使用莫扎里拉(Mozzarella)型乳酪。在該領(lǐng)域中，凝乳(pastafileta)是指莫扎里拉。許多批薩制造者在>260°C的溫度下烘焙批薩。在這些高溫下，乳酪成為褐色的傾向極度成為摩蘇里拉工業(yè)的具體擔(dān)心，因?yàn)槟μK里拉制造者必須使用在這些高溫下烘烤時(shí)不會(huì)產(chǎn)生黑色水泡和棕色區(qū)域的乳酪。變褐色的效應(yīng)典型地由乳糖和特別是半乳糖的殘余量產(chǎn)生。本領(lǐng)域已知半乳糖和被烘焙的乳酪的顏色水平之間存在強(qiáng)的相關(guān)系數(shù)，并且文獻(xiàn)中提到了降低莫扎里拉中半乳糖和乳糖水平的許多嘗試。這些是最難以操作的和/或可提高成本或降低產(chǎn)率。在熱處理之前使用根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶減少麥拉德反應(yīng)，提供了在提高的溫度下處理時(shí)控制乳變?yōu)楹稚挠行緩健８鶕?jù)本發(fā)明的氧化還原酶優(yōu)選在乳處理的早期被添加，從而允許酶有最大的時(shí)間來(lái)氧化還原糖。因?yàn)樵撁敢蕾?lài)于氧的可用性，所以早期添加是優(yōu)選的，從而允許在乳加工期間進(jìn)入氧，并因此使得還原糖濃度水平盡可能高的減少。根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶具有廣泛的底物特異性，允許大范圍還原糖的氧化。對(duì)于在乳制品或含乳食物中的乳制品應(yīng)用而言，根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶能夠有效地氧化乳糖、葡萄糖和半乳糖。酶可以與更多的固體食物(例如乳酪)以若干種方式接觸?？梢酝ㄟ^(guò)在制造工藝中的一些階段添加酶(例如添加至乳酪乳中)而將乳酪與酶在乳酪制造工藝中接觸，導(dǎo)致酶被摻入乳酪基質(zhì)中。存在氧時(shí)酶會(huì)開(kāi)始有活性；這在一些程度上可以在乳酪自身中進(jìn)行，但是在乳酪加工如切割或磨碎(這導(dǎo)致暴露于空氣的乳酪表面和氧暴露的顯著增加)期間和/或之后最為有效。或者，可以在加熱之前將酶噴霧在含乳酪食品上，以這種方式防止麥拉德反應(yīng)最有效發(fā)生的表面上的麥拉德反應(yīng)。在該情況下酶可以在溶液中或分散系中被提供，并被噴霧在食物表面上。溶液/分散系可以包含用量為l-50單位OXI01-OXI06/ml的酶?；蛘撸梢蕴砑痈稍镄问?如粉末)的酶。干燥形式或液體形式的酶可以單獨(dú)或與其它添加劑組合添加。令人驚奇地，己經(jīng)發(fā)現(xiàn)，使用本發(fā)明的氧化還原酶也能夠降低乳中的需氧微生物的生長(zhǎng)，從而有助于新鮮乳的保存。在這類(lèi)情況下，氧化還原酶可以被用作乳制品應(yīng)用中(例如在乳、乳衍生制品和含這類(lèi)制品的食物中)的抗微生物劑。使用根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶的一個(gè)額外優(yōu)點(diǎn)是過(guò)氧化物的形成。己知這類(lèi)過(guò)氧化物能與蛋白質(zhì)反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)交聯(lián)(參閱例如J.A.Gerrard，TrensinFoodScience&technology(2002)，13,391-399)。然而，交聯(lián)的程度取決于產(chǎn)生的過(guò)氧化氫的量。令人驚奇地，根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶能夠大量交聯(lián)乳中的蛋白質(zhì)。交聯(lián)的程度還取決于底物的預(yù)處理、氧化還原能得到的氧量等等。蛋白質(zhì)的交聯(lián)具有下述優(yōu)點(diǎn)包含交聯(lián)的蛋白質(zhì)的制品具有被改變的構(gòu)造特性，例如從這類(lèi)交聯(lián)蛋白質(zhì)形成的凝膠的存水能力。實(shí)施例實(shí)施例1流變學(xué)測(cè)試粉質(zhì)圖(farinograph)和伸展圖(extensograph)被全世界的烘焙者用來(lái)評(píng)價(jià)面團(tuán)的流變學(xué)和技術(shù)特性?？梢酝ㄟ^(guò)根據(jù)InternationalAssociationofCerealChemistry(ICC)禾口theAmericanAssociationofCerealChemistry(AACC)的標(biāo)準(zhǔn)方法，來(lái)測(cè)量氧化還原酶對(duì)面團(tuán)的流變學(xué)特性的影響，所述標(biāo)準(zhǔn)方法包括快速黏度分析儀(RapidViscoAnalyser)、粉質(zhì)儀方法(AACC54-2,ICC115)和拉伸儀(AACC54-10，ICC114)。事實(shí)上，用伸展圖方法來(lái)測(cè)量面團(tuán)的相對(duì)強(qiáng)度。結(jié)實(shí)的面團(tuán)顯示比軟弱的面團(tuán)更高的和(在一些情況下)更長(zhǎng)的伸展圖曲線。AACC方法54-10以以下的方式定義了伸展圖"伸展圖記錄測(cè)試的一塊面團(tuán)的負(fù)荷-伸展曲線，直至其斷裂。負(fù)荷-伸展曲線或伸展圖的特征被用于評(píng)價(jià)面粉的一般品質(zhì)機(jī)器對(duì)促進(jìn)劑(improvingagent)的反應(yīng)"。粉質(zhì)圖方法測(cè)定具體面粉的水?dāng)z入和得到的面團(tuán)的混合耐性。更好的烘焙面粉和面團(tuán)會(huì)顯示更高的粉質(zhì)圖值。如果具體的面粉顯示相對(duì)高的水?dāng)z入，并且得到的面團(tuán)的混合耐性良好，則粉質(zhì)圖曲線在全部時(shí)間顯示保留大部分(如果不是所有的話)初始高度。這類(lèi)面團(tuán)的可加工性和烘焙品質(zhì)可能是極好的。AACC方法54-12定義粉質(zhì)圖如下"粉質(zhì)圖測(cè)量并記錄面團(tuán)對(duì)混合的抗性。其被用于評(píng)價(jià)面粉的吸收和測(cè)定面團(tuán)在混合時(shí)的穩(wěn)定性和其它特征"。實(shí)施例2測(cè)量面團(tuán)的游離硫醇含量可以通過(guò)測(cè)量面團(tuán)中游離巰基的含量來(lái)研究氧化還原酶對(duì)硫醇交聯(lián)形成的作用。所述方法描述于CerealChemistry,1983，70,22-26中。該方法以下述原則為基礎(chǔ)5,5'-二硫代-二(2-硝基苯甲酸)(DTNB)與面團(tuán)中的硫醇反應(yīng)形成高度有色的2-硝基-5-巰基-苯甲酸陰離子，在412nm處用分光光度計(jì)對(duì)其加以測(cè)量。實(shí)施例3迷你巴塔德(Mini-batard)烘焙測(cè)試針對(duì)谷蛋白強(qiáng)化使用迷你巴塔德烘焙測(cè)試。為了檢測(cè)酶對(duì)谷蛋白強(qiáng)化的作用，省略化學(xué)氧化劑的添加。所有的測(cè)試一式兩份進(jìn)行。配方_<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>工藝<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>Scaling2x150g第一次醒發(fā)25分鐘，室溫模塑Bertmnd棒狀制模機(jī)調(diào)節(jié)16最終醒發(fā)90分鐘，32。C，85%RH烘焙240/235°C下20分鐘，0.21蒸汽針對(duì)面團(tuán)的穩(wěn)定性測(cè)量高度/寬度比。烘焙爐膛面包時(shí)，當(dāng)不存在氧化劑時(shí)面團(tuán)是不穩(wěn)定的并變成又扁又寬。相同的特征也出現(xiàn)在最終的面包中。促進(jìn)面團(tuán)穩(wěn)定性的酶的添加導(dǎo)致更高的高度/寬度比。在加工期間，由烘焙者評(píng)價(jià)面團(tuán)品質(zhì)。用尺子測(cè)量高度/寬度比。結(jié)果用ANOVA，Statgraphicsplus5.1進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)價(jià)。實(shí)施例3.1在迷你巴塔德中測(cè)試具有根據(jù)SEQIDNO:013、014、015、016、017和018的氨基酸序列的氧化還原酶。所有的測(cè)試一式兩份進(jìn)行。所有的酶作為超濾濃縮物被遞送被在每kg面粉5mg總蛋白質(zhì)下測(cè)試。陰性對(duì)照是不添加氧化還原酶的面團(tuán)。使用抗壞血酸(68mm)作為參考。結(jié)果:<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>*帶有不同字母的結(jié)果是在90.0%置信水平上統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異的。用于在均值間鑒別的方法是Fisher's最小顯著差數(shù)(LSD)程序。清楚地看到含有根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶的面包顯示與不含這些酶的面包相比更好的高度/寬度比。實(shí)施例3.2在迷你巴塔德中測(cè)試包含根據(jù)SEQIDNO:013的氨基酸序列的酶對(duì)高度/寬度比的劑量應(yīng)答。測(cè)試了三種劑量1、2和3mg總蛋白質(zhì)/kg面粉。陰性對(duì)照是不添加氧化還原酶的面團(tuán)。使用抗壞血酸(68mm)作為參考。測(cè)試一式兩份進(jìn)行。結(jié)果:<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>*帶有不同字母的結(jié)果是在90.0%置信水平上統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異的。用于在均值間鑒別的方法是Fisher's最小顯著差數(shù)(LSD)程序。發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶在烘焙的迷你巴塔德的高度/寬度比中顯示良好的劑量應(yīng)答。與實(shí)施例3.1的結(jié)果相比，該測(cè)試中高度/寬度比的絕對(duì)值更高。這與下述事實(shí)相關(guān)實(shí)施例3.1的測(cè)試用來(lái)自2005年收獲的面粉完成，而實(shí)施例3.2用來(lái)自2006年收獲的面粉完成。權(quán)利要求1.經(jīng)分離的多核苷酸，其能夠與SEQIDNO:001-006或SEQIDNO:007-012中任一多核苷酸雜交。2.根據(jù)權(quán)利要求1的經(jīng)分離的多核苷酸，所述多核苷酸能夠在高嚴(yán)格度條件下與SEQIDNO:001-006或SEQIDNO:007-012中任一多核苷酸雜交。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的經(jīng)分離的多核苷酸，其能從絲狀真菌獲得。4.根據(jù)權(quán)利要求3的經(jīng)分離的多核苷酸，其能從Aspergillusniger獲得。5.編碼下述氧化還原酶的經(jīng)分離的多核苷酸，所述氧化還原酶包含氨基酸序列SEQIDNO:013-018之任一或其任何的功能等同物。6.編碼下述氧化還原酶的至少一個(gè)功能結(jié)構(gòu)域的經(jīng)分離的多核苷酸，所述氧化還原酶包含氨基酸序列SEQIDNO:013-018之任一或包含其中任何的功能等同物。7.經(jīng)分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含核苷酸序列SEQIDNO:001-077或SEQIDNO:007-012之任一或其任何的功能等同物。8.由SEQIDNO:001—006或SEQIDNO:007—012之任一組成的經(jīng)分離的多核苷酸。9.包含根據(jù)權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)的多核苷酸序列的載體。10.根據(jù)權(quán)利要求9的載體，其中根據(jù)權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)的所述多核苷酸序列與下述調(diào)節(jié)序列可操作地連接，所述調(diào)節(jié)序列適用于所述多核苷酸序列在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)。11.根據(jù)權(quán)利要求IO的載體，其中所述合適的宿主細(xì)胞是絲狀真菌。12.制造根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的多核苷酸或根據(jù)權(quán)利要求9到11中任一項(xiàng)的載體的方法，所述方法包括下述步驟培養(yǎng)用所述多核苷酸或所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，并從所述宿主細(xì)胞中分離所述多核苷酸或所述載體。13.具有氨基酸序列SEQIDNO:013-018之任一或其任何的功能等同物的經(jīng)分離的氧化還原酶。14.根據(jù)權(quán)利要求13的經(jīng)分離的氧化還原酶，其能從Aspergillusniger獲得。15.通過(guò)在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞例如Aspergillusniger中表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)的多核苷酸或根據(jù)權(quán)利要求9到11中任一項(xiàng)的載體能夠獲得的經(jīng)分離的氧化還原酶。16.包含根據(jù)權(quán)利要求13到15中任一項(xiàng)的任何氧化還原酶功能結(jié)構(gòu)域的重組氧化還原酶。17.制造根據(jù)權(quán)利要求13到16中任一項(xiàng)的氧化還原酶的方法，所述方法包括下述步驟用根據(jù)權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)的經(jīng)分離的多核苷酸或根據(jù)權(quán)利要求9到11中任一項(xiàng)的載體轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞，在允許所述多核苷酸表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞，和任選地，從所述細(xì)胞或培養(yǎng)基中純化被編碼的多肽。18.重組宿主細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)的多核苷酸或根據(jù)權(quán)利要求9到11中任一項(xiàng)的載體。19.重組宿主細(xì)胞，其表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求13到16中任一項(xiàng)的多肽。20.經(jīng)純化的抗體，其與根據(jù)權(quán)利要求13到16中任一項(xiàng)的氧化還原酶具有反應(yīng)性。21.用于制造面團(tuán)的工藝，所述工藝包括添加根據(jù)權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)的氧化還原酶。22.用于從通過(guò)權(quán)利要求21的工藝制備的面團(tuán)生產(chǎn)烘焙制品的工藝。23.根據(jù)權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)的氧化還原酶用于制備面團(tuán)和/或其烘焙制品的用途。24.能夠水解羥基脂肪酸的酶用于制備面團(tuán)和/或其烘焙制品的用途。25.根據(jù)權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)的氧化還原酶用于制備乳制品的用途。26.根據(jù)權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)的氧化還原酶用于在乳制品中降低Maillard反應(yīng)的用途。27.根據(jù)權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)的氧化還原酶用于在乳制品中防止Maillard反應(yīng)的用途。28.根據(jù)權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)的氧化還原酶作為乳制品中抗微生物劑的用途。29.根據(jù)權(quán)利要求28的氧化還原酶的用途，其特征在于所述抗微生物劑被用于乳中的乳過(guò)氧化物酶-硫氰酸體系。30.根據(jù)權(quán)利要求25-28中任一項(xiàng)的氧化還原酶的用途，其特征在于所述乳制品為乳或乳酪。全文摘要本發(fā)明涉及新鑒定的包含下述基因的多核苷酸序列，所述基因編碼從Aspergillusniger分離的新穎的氧化還原酶。本發(fā)明描述了新穎基因的全長(zhǎng)核苷酸序列、包含新穎氧化還原酶的全長(zhǎng)編碼序列的cDNA序列，以及全長(zhǎng)功能蛋白質(zhì)及其功能等同物的氨基酸序列。本發(fā)明還涉及在烘焙和乳制品應(yīng)用中使用這些酶的方法。本發(fā)明還包括用根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和其中根據(jù)本發(fā)明的氧化還原酶被遺傳修飾以增強(qiáng)或降低其活性和/或表達(dá)水平的細(xì)胞。文檔編號(hào)A23C9/12GK101379184SQ200780004609公開(kāi)日2009年3月4日申請(qǐng)日期2007年2月6日優(yōu)先權(quán)日2006年2月6日發(fā)明者彼得呂斯·雅各布斯·西奧多瑞斯·蒂克爾,約翰娜·亨瑞克娜·格迪娜·瑪麗亞·馬特瑟斯,羅埃爾弗·伯恩哈德·梅瑪,阿伯圖斯·阿拉德·范蒂克申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司