專利名稱：：前列腺癌的場(chǎng)效應(yīng)分析方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉皿存在于腫瘤周圍的區(qū)域，例如夕卜科手術(shù)的邊緣的甲Sit^因的檢查。冃尿墳不田野癌化(fieldcancerization)，也稱為場(chǎng)安她(fieldeffect)，于1950年代首次被提出以用來(lái)解釋多發(fā)的原發(fā)倒中瘤(primaiytumor)的發(fā)生和局部復(fù)發(fā)。，基于下列觀察結(jié)果即癌癥在多損傷區(qū)域中發(fā)展，且不正常組織環(huán)繞腫瘤周圍，,明腫瘤細(xì)KI中瘤前的細(xì)胞，于腫瘤附吐的正常組織區(qū)域內(nèi)。評(píng)估月中瘤擴(kuò)散的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)是外科切除原發(fā)性腫瘤后用光學(xué)顯微鏡仔細(xì)檢査夕卜禾好術(shù)的邊,其鵬織。艦已有的辦，M31標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)把臨腿織船，并在光學(xué)顯微鏡下檢查是否存在腫瘤細(xì)胞。準(zhǔn)確的治療分期(therapeuticstaging)倉(cāng)嫩評(píng)估腫瘤局部擴(kuò)散的范圍以及在M^端，如淋巴結(jié)處的鄉(xiāng)區(qū)域的存在。組織病理學(xué)的評(píng)tt^幫助確定存活概率的，指標(biāo)。基于視覺(jué)觀察和在光學(xué)顯微鏡下對(duì)臨近組織和淋巴結(jié)區(qū)域的形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)組織病理學(xué)方法已知具有局限性。希望有這樣的方法其倉(cāng)g^更容易地在早期確定織的擴(kuò)散，并且能夠更準(zhǔn)確地指示腫瘤轉(zhuǎn)移到臨近和周圍組織的范圍。本發(fā)明提供了這樣的方法，所述方法基于檢測(cè)樣品中的甲基化標(biāo)記物(markers)。在高等餓生物中，DNA僅在CpG二蹄酸中的相對(duì)于鳥嘌呤的5'胞嘧啶處甲基化。這一修飾在基因^h具有重要的調(diào)節(jié)效果，特別是當(dāng)它涉及位于基因啟動(dòng)子區(qū)域的富含CpG的區(qū)域(CpG島)時(shí)。正常的非甲皿CpG島的異常甲基化是不斷增殖和轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中的常見(jiàn)事件，并與特定腫瘤抑制基因或其他與特定人體癌癥的好轉(zhuǎn)有關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄失活相聯(lián)系。當(dāng)組織病理學(xué)信息不明確或者不是很有幫助的時(shí)候，或者其能增加組織滴理學(xué)信息的細(xì)時(shí)，檢測(cè)諸如,的甲基化割牛倉(cāng)^^診斷和減預(yù)后信息。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)方面是用于表征前列腺癌的方法，所述方法基于對(duì)甲基化Marker的檢測(cè)，該甲^fcMarker是在^標(biāo)準(zhǔn)的組織學(xué)技;m査時(shí)顯示正常的組織馮理學(xué)外禾4^術(shù)纖(surgicalmargins)附近可險(xiǎn)測(cè)的。本發(fā)明，一種方法，^M方法可用作細(xì)胞病理學(xué)的輔助手段、高feA群的和接受化，防或化學(xué)治療的高?；颊叩谋O(jiān)測(cè)。本發(fā)明的另一個(gè)方面是用于表征前列腺癌的試劑盒。F^試劑盒包括用于放大和檢測(cè)甲基itMarkere的試劑并包含利用夕卜禾樣術(shù)纖樣品的用于前列腺癌患者的說(shuō)明書。在發(fā)明的另一^^方面中，患者始終以這樣的方，行治療在該方式中根據(jù)腫瘤邊緣(tumormargms)存在或不存在甲基化Markei^來(lái)治療患有侵襲性(aggressive)前列腺癌^^和性(indolent)前列JM的患者。在本發(fā)明的又一個(gè)方面中，砂1^樣術(shù)職樣品中檢測(cè)來(lái)自下列組的一個(gè)或多個(gè)基因的超甲基化APC、RASSF1A和RARP2?；颊哂嘘P(guān)前列腺癌的情況基于皿檢測(cè)征。超甲基化的檢測(cè)，于該疾病的轉(zhuǎn)移或侵襲性的不良預(yù)后的指標(biāo)。所述,最連同其他指標(biāo)一^^行。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，甲基化汰態(tài)iKi定量的實(shí)時(shí)PCR領(lǐng)啶。圖1是顯示具有場(chǎng)鵬的樣品的M與距中央核(centralcore)的距離的函數(shù)關(guān)系的圖示。對(duì)于每種marker,在特定距離展示出甲基化率(任何數(shù)量)的樣品前列腺切除術(shù)的樣品總數(shù)除，所述前列腺切除術(shù)的樣品在中間的惡性核(C,)具有甲,率，在后續(xù)的核中沒(méi)有癌癥。圖2是多種場(chǎng)效應(yīng)的圖示。標(biāo)準(zhǔn)化的甲基化百分率如下計(jì)算用相應(yīng)的Co核(core)得到的甲,率除特定核得到的甲率，再乘以100。對(duì)于在例3中顯示甲基化率的樣品，其標(biāo)準(zhǔn)化的甲皿百分率作為距Q)的距離的函數(shù)被記錄，其中包括APC(前排)、RARp2(第二、第三和第四排)和RASSF1A(最后兩排)。本發(fā)明涉及一種方法，臓方法用于險(xiǎn)測(cè)雜于原發(fā)魁中瘤外部的組織凍理學(xué)組織樣品(如腫瘤邊緣樣本)中的突變,苷,列。該情況中的突變，^Markere序列的超甲基化。Bff^MarkereJ^f應(yīng)其甲基化狀態(tài)與前列I^S的狀態(tài)相關(guān)聯(lián)的基因的核酸。術(shù)語(yǔ)"腫瘤的"是指直接或間接涉剡中瘤，或引趟中瘤。術(shù)語(yǔ)"腫瘤纖"指的是位于可辨認(rèn)的腫瘤的周圍的組織。砂卜禾#術(shù)切除實(shí)體腫瘤的情況中，腫瘤纖是與可辨認(rèn)的腫瘤一起被切離的組織，贓裸眼下通?？醇钦５摹８唧w而言，"邊緣"指的是腫瘤的雌、邊界或分界。^ii^通常iWg發(fā)性腫瘤外延約lmm至約4mm，但根據(jù)原發(fā)實(shí)體瘤的大小可以延伸得^。核酸'相應(yīng)"于雜的基因當(dāng)縫因的甲基化狀^W關(guān)前列鵬的信息時(shí)，M基因的甲基化狀態(tài)代表性與前列腺癌的狀態(tài)相聯(lián)系，ff^列是該基因的編碼部分或其互補(bǔ)體、該基因的，性部分互補(bǔ)體、該基因的啟動(dòng)子或調(diào)辦列或其互補(bǔ)體、録該基因存在的序列戯互補(bǔ)體、或該基因的全長(zhǎng)序列或其互補(bǔ)體。這樣的核酸在本說(shuō)明書中稱為Markers。Marker相應(yīng)于下列基因HIN(SeqIDNo.58)、RASSF1A(SeqIDNo.69)、APC(Promoter=SeqIDNo.64，Gene=SeqroNo.65)、RARp2(SeqIDNo.62)。其Wf關(guān)注的序列包括可用作分析對(duì)照的組^M基因，如beto-肌動(dòng)蛋白(S叫ID.No.60和61)和PTGS2(Promoter=Seq.ID.No.66，gene=Seq,ID.No.67)。GSTPl(Seq.ID.No.59)皿關(guān)注的基因。檢測(cè)超甲基化的試驗(yàn)包蹄如MSP和限制性內(nèi)切核酸酶分析難術(shù)。啟動(dòng)子區(qū)域是用于檢測(cè)這樣的超甲基化分析的特別值得注意的目標(biāo)。本發(fā)明包括測(cè)定受試者的組織或其他生物學(xué)樣品中的Markers的特定區(qū)域的甲基化狀態(tài)，其中，與前列腺癌相關(guān)的DNA,增和檢測(cè)。因?yàn)镸arker相對(duì)應(yīng)的(即，更少被轉(zhuǎn)錄)基因編碼的蛋白的水平縮^31常是由定區(qū)域如啟動(dòng)子的超甲基化所致，所以希望判斷皿區(qū)域是否被超甲基化。超甲基化區(qū)域是與正常組織相比在疾病組織(或被影響以致反映,預(yù)后的組織)的樣品中被甲基化到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯l^更高的區(qū)域。iJJlMarkei^在腫瘤的,樣品中檢測(cè)到的超甲基化^在原發(fā)倒巾瘤的外面產(chǎn)生了腫瘤或可能的腫瘤。其也可以表示侵襲性更強(qiáng)的癌，以及可會(huì)^k^事實(shí)上的轉(zhuǎn)移，更高的癌。因此，其標(biāo)明哪些患者需要更為積極的治療，哪些患者可以保守的治療，例如采用觀察等待?；贛arker序列的特定部分的S^核苷酸弓嫩對(duì)Miii^諸如PCR等S^擴(kuò)增DNA特別有用。本發(fā)明的一些引物媒針或報(bào)道試劑用于檢測(cè)Marker基因的表，制序列的甲m。這些是調(diào)節(jié)核,列的轉(zhuǎn)錄的核列，并在一些情況中調(diào)節(jié)核^m列的翻譯。因此，表繼制序列可以包括與啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止子、起始密碼子(即ATG)、內(nèi)含子的剪離號(hào)、維持正確的讀碼框以許可mRNA恰當(dāng)翻譯和終止密碼子有關(guān)的序列。本發(fā)明的一種方^括使包含Marker的耙細(xì)jWl與核酸結(jié)合的試劑,。0i^耙細(xì)胞組分是核酸，例如DNA^RNA。B^f^試劑可以包括探針和引物，例如PCR^MSP引物，或其鵬設(shè)置以擴(kuò)增并檢測(cè)目標(biāo)序列的好。例如，臓試劑可以包括化合或鍵合至其自身的報(bào)道基因節(jié)段的啟動(dòng)序列(primings叫uences)，例如在Whitcombe等的美國(guó)專利6，326,145和6,270，967中描述的，稱為Scorpion試劑或Scorpion報(bào)道基因的那些啟動(dòng)序列(&tbMJi引用的方式而全部引入)。盡管它們并不相同，但術(shù)語(yǔ)"引稱，和"啟動(dòng)序列"在本說(shuō)明書中可用于指啟動(dòng)核,列的擴(kuò)增的分子或M部分。檢測(cè)甲基化樣品的一個(gè)靈敏的方法包括^使用甲基化敏感的,聚合酶敏反應(yīng)(PCR)。在艦酶消ttJ)NA后，只有當(dāng)DINA^被甲靴阻止時(shí)才通過(guò)切限制性酶切位點(diǎn)側(cè)翼的弓嫩鄉(xiāng)行PCR擴(kuò)增。本發(fā)明的方法還可以包括使含有核酸的樣^修飾非甲基化的胞嘧啶的試劑;艦CpG特異的驗(yàn)苷酸引物擴(kuò)增樣品中包饑pG的核酸；以及險(xiǎn)測(cè)甲靴的核酸。雌的{射布是把非甲靴的胞嘧啶轉(zhuǎn)換成另一個(gè)核苷酸，從而將非甲基化的胞嘧啶與甲基化的胞嘧啶區(qū)分開來(lái)。地，所述試劑^M硫酸氫鈉，將非甲基化的胞嘧啶《,為尿嘧啶，然而，也可以艦其他的飾非甲基化的胞嘧啶而不是甲基ttJ胞嘧啶的試劑。最tt^3E硫自鈉(NaHSQj)^t布，其易于與胞嘧啶的5，6-雙,生m但與甲皿胞嘧啶的反應(yīng)較差。胞嘧啶與亞硫t酸氫鹽離子鵬以形艦脫氨基作用敏感的磺化胞嘧啶反應(yīng)中間體，從而產(chǎn)生磺化尿嘧啶?；撬猁}(酯)基團(tuán)可以在堿性斜牛除去，結(jié)果形皿嘧啶。尿嘧啶ffiaTaq聚合酶被識(shí)別為胸腺嘧啶，因雌行PCR時(shí)，最終產(chǎn)品僅在初始模板中出現(xiàn)5-甲基胞嘧啶的位置處包含胞嘧啶。按此方式進(jìn)行處理，Scorpion報(bào)道基因和試劑以及其他的檢測(cè)系統(tǒng)類^itk將經(jīng)f,的樣本與未經(jīng)飾的樣本區(qū)分開來(lái)。本發(fā)明中用于擴(kuò)增樣本中包含CpG的核酸的引被f,(例如艦亞硫體鹽)后，倉(cāng),明確區(qū)分未處理的DNA、甲基化的DNA和非甲基化的DNA。在甲基化特異的PCR(MSPCR)中，用于非甲基ftoNA的引物鵬動(dòng)序列ttit在3'CG對(duì)具前，從而將其與甲基化的DNA中保留的C相區(qū)別，互補(bǔ)微設(shè)計(jì)為反義引物。用于非甲^^JDNA的MSP引物^動(dòng)序列(primingsequence)通m^ff列中包含相對(duì)很少的Cs或Gs，因?yàn)镃魂TOiOC引物中缺失，而Gs在反向弓嫩中缺失(C被1ii布為U(尿嘧啶)，雜擴(kuò)增產(chǎn)物中被擴(kuò)增為T(胸腺嘧啶核鄰。本發(fā)明的弓l物是具有足夠長(zhǎng)度和適當(dāng)序列的鎌苷酸，從而1在多態(tài)性基因座(polymorphiclocus)的對(duì)于大量核酸的特異的聚合啟動(dòng)。當(dāng)暴露于適當(dāng)?shù)奶綄?duì)-或報(bào)道基因時(shí)，被擴(kuò)增的序列顯示出甲皿狀態(tài)，由皿示診斷信息。的弓l物由八個(gè)或更多個(gè)能夠弓l發(fā)引物延伸產(chǎn)物合成的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸,，其基本上與多態(tài)性基因座^S補(bǔ)。有助于合成的環(huán)境斜牛包括三磷酸核苷和聚合用試劑,例如DNA聚，的，，以皿當(dāng)?shù)?amp;S和pH。所述弓1物的啟動(dòng)部分或啟動(dòng)序列是為具有最大擴(kuò)增效率而單鏈化，不過(guò)也可以^X鏈的。如果為35(鏈，則皿引用恪延伸產(chǎn)物前首先被處理以分離其鏈。所述引物必須足夠長(zhǎng)以在，聚合用誘導(dǎo)試劑時(shí)啟動(dòng)延伸產(chǎn)物的合成。弓I物的精確長(zhǎng)度取決TO如MS、緩沖劑和核苷離成等因素。寡核苷酸弓l物最tt^包含約1220個(gè)核苷酸，盡能們可以包含更多或更少的蹄酸優(yōu)選按照公知的設(shè)計(jì)方針或規(guī)則。引物經(jīng)設(shè)計(jì)以基本互補(bǔ)于將被擴(kuò)增的基因組基因座的^^，并包，上所述的適當(dāng)?shù)腉或C核苷酸。這意J^0M引物必須充分互補(bǔ)從而在允iWffl聚合用試劑的斜牛下與賂自的麟交。換言之，臓引物應(yīng)當(dāng)充分互補(bǔ)去5'和3'側(cè)翼序列(s)，以進(jìn)行雜交和容iW因組基因座擴(kuò)增。引物用于擴(kuò)增工藝。也就是說(shuō)，相對(duì)^括的反應(yīng)步驟的數(shù)目來(lái)說(shuō)反應(yīng)(優(yōu)選,式反應(yīng))產(chǎn)生更大的,因座。在最優(yōu)的實(shí)皿式中,^M^z按指數(shù)規(guī)律產(chǎn)生更媳的鵬因座。^S樣的反應(yīng)包括PCR鵬。通常，一個(gè)弓嫩互補(bǔ)于基因座的負(fù)(-)鏈，而另一個(gè)互補(bǔ)于正(+)鏈。核,性使引物退火然后ffiffl齢銣DNA聚合敏(Klenow)的;Ut段和核苷^a行擴(kuò)增，結(jié)果得到新合成的包含+鏈和-鏈的,因座序列。賦反應(yīng)的產(chǎn)物是不纖的核酸雙鏈體，其末端>^應(yīng)于^的1#異引物的0所述引物可以艦i頓樹可適當(dāng)?shù)姆椒ㄖ苽?例如包括自動(dòng)化方法的常規(guī)的磷酸三酯和磷酸二酯法。在一個(gè)這樣的自動(dòng)化的實(shí)施方式中，二乙基亞磷單體用作起始材料，并可以使用Beaucage等描述的方法合成(TetrahedronLetter^22:1859-1862，1981)。美國(guó)專利號(hào)4，458,066中描述了用于體像飾的載體上合成鎌苷酸的方法。樹可由夕卜科ii^樣品獲得的核酸樣本(以純磁非純化的形式)均可用作本發(fā)明的起始核酸，只要其包含，離想其包含具有IGS因座(例如CpG)的特定的核,列。因此，所述;^法可以使用例如，DNA^RNA，包括信ffiRNA。^DNA或RNA可以是單鏈的，也可以是雙鏈的。^NA用f^fe的^f牛中，可以使用將模^it轉(zhuǎn)錄為DNA的最佳的柳減餅。另外，可以艦DNA-RNA雜交體，其中包含各一。還可以O(shè)T核酸的混^吻，或者也可以O(shè)T皿利用相同或不同的引物在本文中前述的擴(kuò)增反應(yīng)中生產(chǎn)的核酸。將被擴(kuò)增的特定的核,列，即IGS因座，可能是更大分子的1分，或在開始時(shí)顯現(xiàn)為不連續(xù)的分子從而使特定序列構(gòu)成全部核酸。包含核酸的樣本可利用各種技術(shù)提取，例如由Maniatis等描述的技7^(MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,N.Y.,第280頁(yè)，281頁(yè)，1982)。如m取的樣品不純，貝陀可以在擴(kuò)增之前艦一定量的試劑進(jìn)行處理，所述試劑f,效地打開樣品的細(xì)胞、液體、組t喊動(dòng)物細(xì)鵬，并會(huì)灘暴露和/或分離核酸的鏈。用于暴露并分離鏈的該溶胞和核酸變性步驟將允wr增更容易艦行。樣品的耙核,列包含兩錯(cuò)時(shí)，其用f鎖fe^前必須分離核酸的鏈。鏈分離可以作為的步驟鄉(xiāng)，也可以與弓嫩延伸/^的合成同時(shí)進(jìn)行。這樣的鏈分離可以515iOT各種適當(dāng)?shù)模瑮l件，包理的、化學(xué)的或酶的方法完成。一種分離核,的物理方^a括加熱核MM其變性。典型的熱變性包括在纟ij8or105匸的溫度范圍內(nèi)加熱不少于io分鐘。鏈的分離也可以aai來(lái)自被稱作解螺旋酶的麟的酶或SlRecA誘導(dǎo)，臓敏ecA具有解螺旋酶活性，并在存在riboATP時(shí)己知倉(cāng)^KDNA變性。適于iliiiM解螺旋酶分離核,的反應(yīng)^f牛由KuhnHoffmann-BerIing描述(CSH-QuaiititativeBiology,43:63,1978)。在C.Radding中對(duì)艦RecA的技術(shù)進(jìn)行了評(píng)敏Ann.Rev.Genetics^16:405-437，1982)。這^^術(shù)的細(xì)節(jié)現(xiàn)在也是M周知的。當(dāng)核酸的互補(bǔ)微分離時(shí)，不管核m^來(lái)是單鏈還^x鏈，分離的鏈將可以用作合成其他核,的模板。該合允許引物雜交到模板的條件下進(jìn)行。合繊常發(fā)生在水性緩M液中，^ilkpH働7-9，最^8。具有多余摩爾量(對(duì)于基因核酸，通常為引物:微約108:1)的兩種寡核苷酸引tftt^被添加到包含分離的微鏈的緩沖液中。如果本發(fā)明的方法用于診斷應(yīng)用，則互補(bǔ)鏈的量可以不知道，因此相對(duì)于互補(bǔ)鏈的量的引物的量不一定能準(zhǔn)確地確定。然而，當(dāng)將被擴(kuò)增的序列包含在復(fù)雜的長(zhǎng)鏈核,的混^tl中時(shí)，引物的實(shí)際添加SM常與互補(bǔ)鏈(模板)的M相比過(guò)量(摩爾量)。33較多的摩爾量以改善^^方法的效率。將足夠量的脫氧核糖核苷三磷酸dATP、dC!P、dGTP和dTTPWK與引物一起添加至合成混^t/，所,液加熱到大約9(rcioox:最多io5Ht,皿l到4，。在該加熱階段后，使溶漲冷卻至室溫，就于弓嫩雜交^m的。向冷卻的混合物中加入用于產(chǎn)生引物延伸產(chǎn)物的適宜試劑("聚合用試靴')，并使反1^在本領(lǐng)域公知的^#下發(fā)生。聚合用試劑也可以與其他試劑一同加入，只要聚合用試劑具有熱穩(wěn)定性即可。該合成(或擴(kuò)增)反應(yīng)可以在室^M聚合用試劑不再起作用的M下進(jìn)行。聚合用試劑可以是ffi可倉(cāng)綑于完成弓l物延伸產(chǎn)物的合成的化激縣統(tǒng)，優(yōu)選酶。用于該目的的適宜的,括，例如，E.coilDNA聚合胸、E.coUDNA聚合酶l的克列諾片段、T4DNA聚合酶、其他的可利用的DNA聚合酶、聚，突變體、反轉(zhuǎn)錄酶、和其他酶，包括熱穩(wěn)定的酶(例如，經(jīng)受充，高直至導(dǎo)致變性的aSig進(jìn)行引物延伸的那些酶)。tt^試劑是Taq聚合酶。適宜的SI^通艦當(dāng)?shù)姆绞酱龠M(jìn)核苷酸的結(jié)合，從而形成與絲因座核^te:補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物。通常，合^lt在各弓嫩W3'端開始，并沿^l^被5'方向進(jìn)行，；SS合成結(jié)束，以得到不同長(zhǎng)度的好。然而，也可以艦這樣的聚合用試抓利用與，方法相同的方法，合5'端開始，并沿另一個(gè)方向進(jìn)行。最tt^，擴(kuò)增方法利用PCR。也可以O(shè)T替代性的擴(kuò)增方法，只要使用本發(fā)明的引物、ffliiPCR擴(kuò)增的甲基化和非甲基化的基因座倉(cāng)嫩fflil^^f戈性手段被相iiT增即可。擴(kuò)增產(chǎn)物使用產(chǎn)物特異性的探針或報(bào)道基因被tt^鑒別為甲基化或非甲基化，如授予MulHs等的美國(guó)專利4，683,195所描述的，此^iM弓照而鄉(xiāng)引入。用于檢測(cè)多核苷酸的探針和報(bào)道基因的領(lǐng)域的進(jìn)展為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知?？蛇x地，核酸的甲皿模式可以ilii其他技術(shù)確認(rèn)，例如限制性內(nèi)切酶酶解和DNA印跡分析?？捎糜陔U(xiǎn)測(cè)5'CpG甲皿的甲皿敏感的限制性核酸內(nèi)切酶的例賴撤mal、SacII、Eagl、Mspl、HpaII、BstUI和BssHlI。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，^頓甲靴率(methylationratio)。i!5i確定所得到的Marker的擴(kuò)增的甲基化種類的數(shù)量與擴(kuò)增的參考標(biāo)記物或擴(kuò)增的非甲^Marker區(qū)域的f[fi之間的比例可以得到甲基化率。當(dāng)PCR是實(shí)時(shí)定iPCR時(shí)其m乓最多信息。比率^3i確定的或預(yù)定的臨皿(cutoffvalue)或閾值時(shí)被認(rèn)為是超甲基化的，并且與沒(méi)有趣過(guò)臨界值的比率相比其指示更差的復(fù)發(fā)預(yù)后。臨im按照已知的方、法確定，其中所^^方法用于至少兩組樣品具有已知的所關(guān)注的條件的樣品(復(fù)發(fā)或侵襲性)和具有己知的正常割牛的樣品。本發(fā)明的參考標(biāo)記物還可以用作內(nèi)部對(duì)照。所^#考^^物,是在樣品細(xì)胞中以^M皿的基因，如Beta肌動(dòng)蛋白。已確定的或預(yù)定的數(shù)值(臨界值或閾值)也可以在不使用比率的本發(fā)明的方法中被確定并使用。在這種情況下，臨界值由相對(duì)于某^值，例如正常樣品或臨床無(wú)意義的腫瘤樣品(已知不會(huì)發(fā)展為臨床相應(yīng)的狀態(tài)或是非錢性的)中的甲基化的數(shù)量或程度的甲基化的數(shù)量或程度來(lái)建立。這些臨界值按照公知的方法建立，正如其，于基于甲皿率方法中的情況一樣。本發(fā)明的方法和試劑盒可包括用于多路復(fù)用(multiplexing)的步驟和試劑。也就是說(shuō)，一個(gè)以上的Marker可以同HtM測(cè)定。有趣的是，GSTP1，對(duì)于腫瘤評(píng)定來(lái)說(shuō)可能是最有用的Marker，卻微現(xiàn)不能用作用于本發(fā)明的目的的外科手術(shù)皿feiB物。也就是說(shuō)，甚至在具有侵襲性或轉(zhuǎn)鵬的患者的腫瘤雌樣品中也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)該+疏物。在各鄉(xiāng)例中提及的GSTP1弓l物和探針如下SEQIDNO,19(GSTP1蝎(SCORPION):CGCACGGCGAACTCCCGCCGACGTGCGBHQ-HEG-TGTAGCGGTCGTCGGGGTTGSEQIDNO.20(GSTP1蝎反義引物):GCCCCAATACTAAATCACGACG據(jù)發(fā)現(xiàn)可用于本發(fā)明的方法和試劑盒中的示例性的Marker^APC、RARp2^ASSF1A?？捎糜跈z測(cè)這些區(qū)域的甲靴的探針在這樣的診斷或預(yù)測(cè)方法中也是有用的。用于檢測(cè)Markere的tti^分子如下^f^。Marke遂因的簡(jiǎn)稱連同艦的檢測(cè)系統(tǒng)的鄉(xiāng)寫顯示在括號(hào)中。反向僅指引物的方向，臓引物經(jīng)指定而相關(guān)于與其f^的，的另一成員的啟動(dòng)序列。不必相對(duì)于基因MDNA反義。SEQDNO.30(RASSF1A蝎)GCCGCGGTTTCGTTCGGTTCGCGGC-BHQ-HEG-CCCGTACTTCGCTAACTTTAAACGSEQIDNO.31(RASSF1A蝎反義引物)GCGTTGAAGTCGGGGTTCSEQIDNO.32(RA腦蝎)CGGCGCCCGACGATACCCAAAGCGCCG-BHQ-HEG-AACGCGAGCGATTCGAGTAGSEQIDNO.33(RARB2蝎反義引物)CTTACAAAAAACCTTCCGAATACGSEQIDNO.34(APC蝎.)GCCGGCGGGTTTTCGACGGGCCGGC-BHQ-HEG'-CGAACCAAAACGCTCCCCASEQ13)NO.35(APC蝎反義引物)GTCGGTTACGTGCGTTTATATTTAGSEQIDNO.36(肌動(dòng)蛋白蝎)GCGCCCAACCGCACAAGGGCGC-BHQ-HEG-GGGTATATTTTCGAGGGGTACGSEQIDNO.37(肌動(dòng)蛋白蝎反義引物)CGACCCGCACTCCGCAATSEQIDNO.38(fL動(dòng)蛋白蝎)SEQIDNO.39(肌動(dòng)蛋白蝎反義引物)AACACACAATAACAAACACAAATTCACSEQIDNO.40(肌動(dòng)蛋白蝎)CCCGGCTAAACCCACCATCCAGCCGGG-BHQ-HEG-GGGAGGGTAGTTTAGTTG'TGGTTSEQIDNO.41(肌動(dòng)蛋白蝎反義引物)CAAAACAAAAAAACTAAATCTACACAACCSEQIDN0.42(肌動(dòng)蛋白蝎')CCGCGGAACATTCAACTCAACCGCGG-BHQ-HEG-GGAGGAGGAAGGTAGGmTTSEQIDNO.43(肌動(dòng)蛋白蝎反義引物)ACATACAACAATCAATAACATAAAACCACSEQIDNO.54(HIN曙l蝎')CGGCGCCCGAACCTCGAAAGCGCCG-BHQ-HEG-GGTTTTAGCGTTTGTTAAGAGSEQl:DNO.55(HIN-1竭反義引物)AACTTCCTACT八CGACCGAC■BHQ=BlackHoleQuencher(BioSearchTechnologies,SanFransisco,CA)HEG-六乙二醇(Hexaethyleneglycol)在本發(fā)明的一個(gè)雌^"式中，J^VIarkere和方法與組織信息學(xué)齢使用。當(dāng)兩者結(jié)合時(shí)，組織學(xué)的假陰性率略有下降。也就是說(shuō)，當(dāng)組織學(xué)與本發(fā)明的方法和Markere指出患者具W^M的預(yù)后或侵襲性的赫時(shí)，則情況如此的概率非常高。當(dāng)僅有組織學(xué)未指出患者可能經(jīng)歷疾病的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或侵襲,展時(shí)，Markers的超甲基化的陽(yáng)鵬果則il^a織學(xué)的結(jié)果是不M的。本發(fā)明的試劑盒可以Kg有各種構(gòu)^件，只要它們都^^含至少一個(gè)引物或探針或檢測(cè)分刊例如Scorpion報(bào)道基因)即可。在一個(gè)^式中，臓試劑盒包括用于擴(kuò)增和檢魏甲^fcMarker片段的試劑?？膳?，^M試劑盒包括樣品制備試劑和/皿樣品中提取核酸的制品(例如，管)。在雌的試劑盒中，包括單管(one^tube)MSP所必需的試劑，例如，相應(yīng)的PCR引物組、熱穩(wěn)定的DNA聚合酶(如Taq聚合酶)和適當(dāng)?shù)?t領(lǐng)!H^劑，如水解探針或分子信標(biāo)(molecularbeacon)。在可選的^i^試劑盒中，檢測(cè)試劑是Scorpion報(bào)道基因或試劑。還可以艦對(duì)雙敬NA特異的頓的她引物或熒光染料，如溴化乙錠。引物雌是能產(chǎn)生高濃度的量。試劑盒中的其他材料可包括適宜的aSZ管或瓶、隔離成分，通常為,(waxbead)，可選的包括鎂；必需的緩沖液和試劑如dNTP;對(duì)照核酸和/或ft^J用于MSP反應(yīng)的另外的緩沖劑、化合物、輔因子、離子組分、蛋白質(zhì)和酶、聚，等。可選地，臓試劑盒包括核酸提取試劑和材料。在本發(fā)明最雌的試劑盒中，還包娜明書，臓說(shuō)明書規(guī)定測(cè)定衫卜科手術(shù)ii^樣品，行，并指出相對(duì)于腫瘤核心最適合獲得,樣品的位置。在本發(fā)明的另一賴劑盒中，臓說(shuō)明書規(guī)定進(jìn)行測(cè)定的外禾樣術(shù)纖樣品是組織病理學(xué)顯示正常的樣品。說(shuō)明書還指出應(yīng)當(dāng)對(duì)甲基化陽(yáng)性結(jié)^^t，別的治療，，例如積極的或延長(zhǎng)的治療。在本發(fā)明的測(cè)定中OT的材料理想ife^f^備試劑盒。,的試劑盒可以包括載體工具，所述載體工具被分隔以密閉地容納一個(gè)或多個(gè)容器，例如小瓶、管等，#^容1^括一個(gè)將^^法中]1的隔離元件。例如，^^鄉(xiāng)中的一個(gè)可包含雜魏針，0針被豐?；蚩梢员豢蓹z測(cè)地標(biāo)記。第二容器可以包含細(xì)胞溶解緩沖液。試劑盒還可具有容納用于擴(kuò)增耙核酸序列的核苷酸的容器和/或包含與^I基因分子(如酶、熒光^1"性核素豐示記)結(jié)合的報(bào)道工具，例如生物素結(jié)合蛋白(如抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素)的^^器。鄉(xiāng)例各實(shí)施例描述了使用來(lái)自37例前列腺切除術(shù)的樣品對(duì)48個(gè)損傷的研究和分析。離皿組織樣品也由此產(chǎn)生，各樣品均從核心向外延伸，并按線性排列以相距大約一，分離。第一個(gè)核心活檢樣品被證實(shí)對(duì)于癌為組織學(xué)陽(yáng)性。隨后的,織檢査SBII—個(gè)為l4mm，被證實(shí)為組織學(xué)陰性。測(cè)^Markers的甲基化率以說(shuō)明場(chǎng)效應(yīng)的大小和空間依賴。^jl例l(樣品采集)離,檢核心取自回顧性收集的根治性前列腺切除術(shù)組織的石蠟塊，Bffm織沬自于^￡5年內(nèi)接^±手術(shù)的患者。微的核心活檢樣品(corebiopsy)取自癌損傷的中央，34個(gè)離條心由從中鵬損傷增加1mm的距離處的看起來(lái)為正常的前列腺Pf逝的組織收集。將直徑1.5111加、厚3-4mm的各活檢核心水平地再次包埋在石蠟塊中。切出切片(5xl0ji)用于甲基化分析，對(duì)各核心制備支，&E玻片并謝fM織學(xué)評(píng)價(jià)。例2:樣品制備、DNA分離和亞硫maikf,。為提I50)NA，將來(lái)自各核心塊的50n組織(5xl0n切片)在二甲苯中脫石斷10^m),隨后艦100'K乙^fe滌2次(每次5，)。乙麟滌后，將體在50-55。C的爐中培辨敞口)以蒸發(fā)倒可殘留的乙醇。脫去石蠟的組織在以500rpm搖動(dòng)的加熱塊中在56。C的40nl的提取緩沖液(10mMTris^pH8.0;150mMNaCI,2mMEDTA和0.5"/。SDS)和IOnl蛋白酶K(Qiagen)中培養(yǎng)。次日早晨將樣品在7(TC下加熱失活10分沖，并在16000xg下旋轉(zhuǎn)5分鐘。使50nl的組織溶胞物(或500ng整體甲基似非甲基化基因組對(duì)照DNA)進(jìn)行DNA的亞硫酸氫鈉修飾，使用EZDNA甲M:試劑盒(ZymoResearch)按照制造者的^t行下列培養(yǎng)時(shí)間和溫度的修飾。將樣品在以UOOrpm搖動(dòng)的加熱塊中在70"下培養(yǎng)3小時(shí)。婦5^1M^緩沖液中對(duì)頻硫MMb理的DNA進(jìn)行最后的洗脫。樣品在-80t:儲(chǔ)存。修飾的DNA用作定量甲基化特異的PCR的模板。鄉(xiāng)例3:甲靴特異的PCR(MSP)So)rpion探針和引物經(jīng)設(shè)計(jì)以擴(kuò)增所關(guān)注的基因的啟動(dòng)子區(qū)域中的甲基化的CpG島。選擇甲^無(wú)關(guān)區(qū)域以用家(housekeeping)基因P-肌動(dòng)蛋白的擴(kuò)增。艦DNAmfoWgj^模擬Scorpion微折疊(probefolding)和擴(kuò)增子探測(cè)。Scorpion探針和引物由ScandinavianGeneSynthesisAB獲，針在5'位置^獨(dú)特的熒光染料(FAM、Cy5、Cy3和TexasRed)進(jìn)行fei3。通過(guò)使用甲基化特異的引物對(duì)來(lái)自亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換的細(xì)胞系DNA(MCF-7、LNCaP和HCT-116)的針基因的所關(guān)注的啟動(dòng)子序列進(jìn)行擴(kuò)增來(lái)校準(zhǔn)控制縫因。擴(kuò)增的PCR,在,之后艦標(biāo)準(zhǔn)鵬在TOPOTA克ltM:劑盒(Invitrogeii)中克隆，并轉(zhuǎn)4fcA;^M桿菌。質(zhì)御NA被分離、線性化并以2xl07拷貝/5^1的儲(chǔ)#度(stockdilution)在-80。C儲(chǔ)存。對(duì)于所有的PCR反應(yīng)，購(gòu)自O(shè)iemicon的整體甲基化和非甲基化的基因組DNA(CpG-M和CpG-U)分別用作陽(yáng)1W照和陰',照。鵬martCyclerII(Cephdd，SunnyvaleCA)進(jìn)行熒光多重定量MSP測(cè)定，其能夠aa^ffi每種基因獨(dú)特標(biāo)記的特異探針而同時(shí)檢測(cè)一個(gè)^^蟲樣品內(nèi)的4個(gè)目標(biāo)(使用4個(gè)熒光通道)。對(duì)兩管中的各樣品和對(duì)照DNA進(jìn)行4基因(GSTP1、APC、RARB2、Beta-肌動(dòng)蛋白)和2基因(RASSF1A、Beta-肌動(dòng)蛋白)多^MSP。所淑CR反應(yīng)混^S含500nM的用于皿因的每"^引物和探針、與快速啟新aq聚^SI(Roche)偶聯(lián)的5U抗體、1.25mM的緩沖混，(67.0mMTris，pH8.8、6.7mMMgCl2、16.6mM(NH02SO4、lOmM-巰基乙斷中的dATP、dCTP、dGTP和dTTP中的每一個(gè)、以及5fil的在最終^R25jU中的亞硫,謝,的DNA^。熱循環(huán)^f牛如下趙5。Cl，，隨皿fi^5。C持續(xù)30秒和59"持續(xù)30秒的循環(huán)40次，并在72。C延伸5分鐘。為了形成^h基因的拷貝數(shù)(copy加mber)標(biāo)準(zhǔn)曲線，M31在管中等^^混^^用于旨基因的校準(zhǔn)儲(chǔ)液(2xl()7拷貝/5Ml)以鵬!)備校準(zhǔn)混，。S/K中對(duì)該混^tl進(jìn)行10倍連,釋(2xl()62xl02)，并在J^PCR員中復(fù)制。用于4個(gè)基因中的每一個(gè)的Cts(循環(huán)閾值)被換算為各樣品中的甲基化基因的拷貝數(shù)。齡樣品的數(shù)據(jù)以甲基化率([基因的甲基化拷貝^/p-肌動(dòng)蛋白的拷貝數(shù)lxl000)表示。分別形^f于4基因和2基因多路復(fù)用的標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過(guò)用中央的惡性核心的甲基化率除各距離處的甲基化率來(lái)計(jì)#^準(zhǔn)甲基化％。用于這些多路飾的Markeis相應(yīng)于下列基因Multiplex1:GSTP1(Seq.ID.No59)，B-肌動(dòng)蛋白(S叫ID,No.60/61),APC(Seq，ID，No，64/65)，RA鄧2(Seq.瓜No.62)Mutliplex2:RASSF1A(Seq.ID.No,69)，B-肌動(dòng)蛋白(Seq.ID.No.60/61)Multiplex3:Hin-1(Seq.ID.No.58)，B-肌動(dòng)蛋白(Seq.ID.No.60/61)用于BfM測(cè)試的引物和探針GSTP1:探針Seq.IDNo.19;引物Seq.IDNo.20頁(yè)B-肌動(dòng)蛋白探針Seq.IDNo.38;引物Seq.IDNo.39APC:探針Seq.IDNo.34;引物Seq.IDNo.35KASSF1A:探針Seq.IDNo.30;引物Seq.IDNo.31Hin-h探針Seq.IDNo.54;引物Seq.IDNo.55下面的表1顯示出用5個(gè)基因中的每一個(gè)在遠(yuǎn)端核心中觀察到的場(chǎng)鵬。M顯示為皿因的甲基化率。結(jié)合核心與周圍區(qū)域的精確的組織病理學(xué)以限定用于場(chǎng)效應(yīng)的樣品，OT下述標(biāo)準(zhǔn)證鄉(xiāng)傷是否^"場(chǎng)鵬"l.癌損傷(CO)具有對(duì)于基因的陽(yáng)性甲基化率。2.鄉(xiāng)輻射狀的核心(C1-C4)和周圍的組織不具有癌癥或高等敬IN的組織學(xué)證據(jù)。表l:<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>從以上,可知，對(duì)于MarkersAPC、RAR卩2、和RASSF1A和HIN-1可以觀察到場(chǎng)效應(yīng)。頓離惡性核心2mm，且在大多數(shù)瞎況下距離楊。、最多3mm處可以觀察到場(chǎng)效應(yīng)。通3i^測(cè)甲皿的Marker產(chǎn)生的信號(hào)的強(qiáng)Sa常作為樣品距核心的距離的函數(shù)而改變，但不呈線性方式(圖1和2)。這可能是由于癌割牛，多個(gè)病灶所致。令人驚i她是，對(duì)TCSTP1沒(méi)有觀察到場(chǎng)效應(yīng)。序列表<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><400〉1ccccgaacgtcgaccgctcggggcgatttcggggat.tttagggcgt46<210>2<211〉21<212〉DNA<213>人工<220〉<223〉GSTP1蝎子反義引物<400>2aaaatcccgcgaactcccgcc21<210〉3<211>46<212>DNA<213〉人工<220><223>GSTP1蝎子<220><221〉modified—base<222>(23)..(23)<223>-BHQ-HEG-<400>3cccgaacgtcgaccgctttcgggcgatttcggggattttagggcgt46<210〉4《211〉21<212>腿<213>人工〈220〉<223>GSTP1蝎子反義引物<400〉4aaaatcccgcgaactcccgcc21<210>5<211>44<212>DNA<213>人工<220><223>GSTP1蝎子<220><221>modified—base<222〉(22)..(22)<223>-BHQ-HEG-<400>5cggcgggagttcgcgggcgccgactaaatcacgacgccgaccgc44<210>6<211〉22<212>DNA<213〉人工<220><223〉GSTP1蝎子反義引物<400〉6cggtt.agttgcgcggcgatttc22<210〉7<211>41<212>腿<213>人工<220><223>GSTP1蝎子<220><221>modified—base<222>(19)..(19)<223〉-BHQ-HEG-<220><221>modified—base<222>(25)..(25)<223>-BHQ-HEG-<400>7cgggagttcgcgggtcccgactaaatcacgacgccgaccgc41<210>8<211>22<212>DNA<213>人工<220〉<223〉GSTP1蝎子反義引物<400>8cggttagttgcgcggcgatttc22<210〉9<211>50<212>DNA<213>人工〈220〉<223〉GSTP1蝎子<220><221>modified—base<222〉(27)..(27)<223〉-BHQ-HEG-<400>9gtggttgatgtttggggtatcaaccacaat.cccacaaactcccaccaacc50<210〉10<211>27<212>DNA<213〉人工<220><223〉GSTP1蝎子反義引物<400〉10gtggtgattttggggattttagggtgt27<210>11<211>47<212〉DNA<213>人工<220〉<223>GSTP1蝎子<220〉<221〉modifiedbase<222>(24)..(24)<223〉-BHQ-HEG-<400〉11accccagtggttgatgtttggggtaatcccacaaactcccaccaacc47<210〉12<211>27<212>DNA<213>人工<220〉<223>GSTP1蝎子<400>12gtggtgatt,ttggggattttagggtgt27<210〉13<211>56<212>腿<213〉人工<220><223>GSTP1蝎子<220〉<221>modified—base<222>(28)..(28)<223>-BHQ-HEG-<400>13ccccacaggttggtgggagtttgtggggcccaatactaaatcacaacaccaaccac56<210>14<211>27<212>腿〈213>人工<220><223〉GSTP1蝎子反義引物<400〉14tggttagttgtgtggtgattttgggga2了<210>15<211>46<212>DNA<213>人工<220〉<223>GSTP1蝎子<220><221>modified—base<222>(23)..(23)<223>-BHQ-HEG-<400>15ccccgaacgtcgaccgctcggggcgatttcggggattttagggcgt46<210>16<211>21<212>DNA<213〉人工<220〉〈223〉GSTP1蝎子反義引物〈400〉16aaaatcccgcgaactcccgcc21<210>17<211>53<212〉DNA<213>人工<220><223〉GSTP1蝎子<220><221>modified—base<222>(30)..(30)<223>-BHQ-HEG-<400〉17cgcacgccgaacgtcgaccgcaaacgtgcgcgatttcggggattttagggcgt53<210〉18<211〉21<212〉DNA<213>人工<220><223>GSTP1蝎子反義引物<400〉18aaaatcccgcgaactcccgcc21<210>19<211>47<212〉DNA<213〉人工<220><223〉GSTP1蝎子<220〉<221>modified_base<222>(27)..(27)<223>-BHQ-HEG-<400>19cgcacggcgaactcccgccgacgtgcgtgtagcggtcgtcggggttg47<210>20<211>22<212>腿<213>人工<220〉<223〉GSTP1蝎子反義引物<400>20gccccaatactaaatcacgacg22<210>21<211>55<212>DNA<213>人工<220><223〉GSTP1蝎子<220〉<221>modified—base〈222〉(35)..(35)<223>-BHQ—HEG—<400〉21ccgacgcacaaaaaaacaccctaaaatccgtcggggttagttgtgtggtgatttt55<210>22<211>20<212〉薩<213>人工<220><223>GSTP1蝎子反義引物<400>22cacaacaccaaccactcttc20<210>23<211>29〈212〉DNA<213>人工<220〉<223〉GSTPlTaqman引物<400>23cgtgatttagtattggggcggagcggggc29<210>24<211>25<212>DNA〈213〉人工<220><223〉GSTPlTaqman引物<400〉24atccccgaaaaacgaaccgcgcgta25<210>25<211>26<212>DNA<213〉人工<220〉<223〉GSTPlTaqman探針<400>25tcggaggtcgcgaggttttcgttgga26<210>26<211>48<212〉DNA<213>人工<220><221>misc_feature<223〉GSTP1蝎子<220〉<221>inodified_base<222〉(27)..(27)<223>-BHQ-HEG-<400>26cggccctaaaaccgctacgagggccggaagcgggtgtgtaagtttcgg48<210>27<211>26<212〉DNA<213>人工<220><221>misc—feature<223>GSTP1蝎子反義引物<400>27acgaaatatacgcaacgaactaacgc26<210>28<211〉44<212〉DNA<213〉人工<220〉<223〉GSTP1蝎子<220><221〉misc—feature<223〉GSTPI蝎子<220><221〉modified—base<222>(24)..(24)<223>-BHQ-HEG-<400>28ccggtcgcgaggttttcgaccggccgaaaaacgaaccgcgcgta44<210〉29<211>27<212〉DNA<213>人工<220><223>GSTP1蝎子'<220〉<221>邁isc一feature<223>GSTP1蝎子反義引物<400>29gggcgggattatttttataaggttcgg27<210〉30<211〉49<212>DNA<213〉人工<220〉<223>RASSFIA蝎子<220><221>modified—base<222〉(25)..(25)<223>-,-HEG-<400>30gccgcggtttcgttcggttcgcggccccgtacttcgctaactttaaacg49<210〉31<211>18<212〉DNA<213>人工<220><223〉RASSFIA蝎子反義引物<400〉31gcgttgaagtcggggttc18<210〉32<211>47<212>DNA〈213〉人工<220〉<221>邁isc一feature<223>RARB2蝎子<220〉<221>modified—base<222〉(27)..(27)<223〉-朋Q-HEG-<400>32cggcgcccgacgatacccaaagcgccgaacgcgagcgattcgagtag47<210>33<211>24<212>DNA<213>人工<220><223>RARB2蝎子<220〉<221>misc一feature<223>RARB2蝎子反義引物<400>33cttacaaaaaaccttccgaatacg24<210>34<211>44<212>DNA<213〉人工<220><223>APC蝎子<220><221>modified—base<222>(25)..(25)<223>-BHQ-HEG-<400>34gccggcgggttttcgacgggccggccgaaccaaaacgctcccca44<210>35<211>25<212>DNA<213〉人工<220><223〉A(chǔ)PC蝎子反義引物<400〉35gtcggttacgtgcgtttatatttag25<210〉36<211>44<212>DNA<213〉人工<220><223>肌動(dòng)蛋白蝎子<220><221〉modified—base<222>(22)..(22)<223>-BHQ-HEG-<400>36gcgcccaaccgcacaagggcgcgggtatat.tt,tcgaggggtacg44<210>37<211>18<212>DNA<213>人工<220><223>ACTIN蝎子反義引物<400>37cgacccgcactccgcaat18<210>38<211>52<212>DNA<213>人工<220〉<223>肌動(dòng)蛋白蝎子〈220〉<221>modified—base<222>(27)..(27)<223〉--BHQ-HEG-<400>38ccgcgcatcaccaccccacacgcgcggggagtatataggttggggaagtttg52<210〉39<211〉27<212>DNA<213>人工<220〉<223>ACTIN蝎子反義引物<400〉39aacacacaataacaaacacaaattcac27<210>40<211>50<212〉DNA<213>人工<220><223〉肌動(dòng)蛋白蝎子<220〉<221>modified_base<222〉(27)..(27)<223>-BHQ-HEG-<400〉40cccggctaaacccaccatccagccggggggagggtagtttagttgtggt.t50<210〉41<211>29<212>DNA<213>人工<220><223>ACTIN蝎子反義引物<400〉41caaaacaaaaaaactaaatctacacaacc29<210〉42<211〉47<212〉DNA<213〉人工<220〉<223>肌動(dòng)蛋白蝎子<220><221>modified_base<222>(26)..(26)<223>-BHQ-HEG-〈400>42ccgcggaacattcaactcaaccgcggggaggaggaaggtaggttttt47<210>43<211>29<212〉DNA<213〉人工<220><223>ACTIN蝎子反義引物<400>43acatacaa.caatcaataacataaaaccac29<210>44<211>47〈212〉DNA<213〉人工<220><223>PTGS2/C0X2蝎子<220><221>邁odified一base<222>(22)..(22)<223>-BHQ-HEG-<400〉44cacgccgccgtatctaggcgtggtttgtttcgacgtgattttttcga47<210>45<211>21<212〉DNA〈213〉人工<220〉<223>PTGS2/COX2反義引物<400>45gcaaaaaatcccctctcccgc21<210〉46<211>45<212>DNA<213>人工<220><223>PTGS2/C0X2蝎子<220><221>modified—base<222〉(22)..(22)<223>-朋Q-HEG-<400〉46gccgcgcacaaatttccgcggcgaattggttttcggaagcgttcg45<210>47<211>16<212〉脆<213>人工<220>〈223〉PTGS2/C0X2反義引物<400>47cccgaat.tccaccgcc16<210〉48<211〉46<212〉DNA<213〉人工<220><223>PTGS2/C0X2蝎子<220><221〉modified—base<222>(23)..(23)<223>-BHQ-HEG-<400>48ggcggaacgcacaaatt.tccgccgaattggtt,ttcggaagcgttcg46<210>49<211>16<212>靈<213>人工<220><223>PTGS2/C0X2反義引物<400>49cccgaattccaccgcc16<210〉50<211>51<212〉DNA<213>人工<220><223>PTGS2/C0X2蝎子<220><221>modified_base<222>(30)..(30)<223>-BHQ-HEG-<400>50tgccgccgccgtatctaatggcggcagtttgtttcgacgtgattttttcga51<210>51<211>21<212>腿<213>人工<220><223〉PTGS2/C0X2反義引物<220><221>邁isc—feature<223>PTGS2/C0X2反義引物<400>51gcaaaaaatcccctctcccgc21<210〉52<211>39<212>DNA<213〉人工<220〉<223>CDHI蝎子<220〉<221>modified—base<222>(19)..(19)<223>-BHQ-HEG-<400>52cgccgaatacgatcggcggttcgttt,tagttcggttcga39<210>53<211〉18<212〉DNA<213>人工<220><223>CDH1蝎子反義引物<400〉53accgaaaacgccgaacga18<210〉54<211〉46<212>DNA<213〉人工<220><223>HIN-1蝎子<220〉<221>modified—base<222〉(26)..(26)<223>-BHQ-HEG-<400>54cggcgcccgaacctcgaaagcgccgggttttagcgtttgttaagag46<210〉55<211>20<212>DNA<213>人工<220><223>HIN-1蝎子反義引物.<400>55肌cttcctactacgaccgac20<210〉56<211>2671<212>DNA<213〉人類〈220〉〈221〉iiiisc_feature〈223〉15L01〉gi|l87190|gb|M23892.l|HUML0X15A人序列<400〉56aagatgggtctctaccgcatccgcgtgtccactggggcctcgctctatgcaaccaggtgcagctgtggctggtcggccagcacggggaggcggcgctcggtggcccgcacggggcaaggagacagaactcaaggtggaagt,accggagtactgctgtttgtgaaactgcgcaaacggcacctccttaaggacgacgcctgtggatctctgtgcagggccccggagccggggacgaggtcaggttcccttggtggagggcaacggcgtcctgagcctgcctgaaggcaccggccgcactgtcctcagggcctgttccagaaacaccgggaagaagagctggaagagagaagcggtggggaaactggaaggacgggttaattct.gaatatggctggggccaactccctgtggatgagcgatttctggaagacaagagagttgacttt.gaggtaaggggctggccgacctcgctatcaaagactctctaaatgttctgacttgctagatgacttcaaccgga/ttttctggtgtggtcagagcaagctggctgagactcctggaaggaagatgccttatttgggtaccagtttcttaatggcgcgtgctgaggcgctctgctcacct,tcctgctcgcctagtgttccctccaggctgcaggcccagctggagaaggagctggagggaggcacactgttcgaagcctgctggatgggatcaaggccaacgtcattctctgtagccagcagcacctcta.gtcatgctgaaattgcagcctgatgggaaactcttgcccatggtca.t15-脂氧合酶mRNA，全部編碼cggttccaac60gaagcgactg120tctggggccg180gttctgcaac240ttaccgctgg300gggcgaggac360gaagttgtac420actatatgac480ttcgctggcc540ctggaaggat600gcgcgtgcgg660caaccccgtg720cat.ggaggaa780tgacttctcc840ggctgcccct900ccagctccag960ctgccccgcacaggatccccaccacctccccttttcttgcctacggatcccccaatggcc1020tggcttctggccaaatgctgggtgcgcagctctgacttccagctccatgagctgcagtct1080catcttctgaggggacacttgatggctgaggtcattgttgtggccaccatgaggtgcctg1140ccgtcgatacatcctatcttcaagcttataattccccacctgcgatacaccctggaaatt1200aacgtccgggccaggactgggctggtctctgacatgggaattttcgaccagataatgagc1260actggtgggggaggccacgtgcagctgctcaagcaagctggagccttcctaacctacagc1320tccttctgtccccctgatgacttggccgaccgggggctcctgggagtgaagtcttccttc1380tatgcccaagatgcgctgcggctctgggaaatcatctatcggtatgtggaaggaatcgtg1440agtctccactataagacagacgtggctgtgaaagacgacccagagctgcagacctggtgt1500cgagagatcactgaaatcgggctgcaaggggcccaggaccgagggtttcctgtctcttta1560caggctcgggaccaggtttgccacttt.gtcaccatgtgtatctt.cacctgcaccggccaa1620cacgcctctgtgcacctgggccagctggactggtactcttgggtgcctaatgcaccctgc1680acgatgcggctgcccccgccaaccaccaaggatgcaacgctggagacagtgatggcgaca1740ctgcccaacttccaccaggcttctctccagatgtccatcacttggcagctgggcagacgc1800cagcccgttatggtggctgtgggccagcatgaggaggagtatttttcgggccct,gagcct1860aaggctgtgctgaagaagtt,cagggaggagctggctgccctggataaggaaat.tgagatc1920cggaatgcaaagctggacatgccctacgagtacctgcggcccagcgtggt,ggaaaacagt1980gtggccatctaagcgtcgccaccctttggtt.atttcagcccccatcacccaagccacaag2040ctgacccctt.cgtggttatagccctgccct,cccaagtcccaccctcttcccatgtcccac2100cctccctagaggggcaccttttcatggtctctgcacccagtgaacacattttactctaga2160ggcatcacctgggaccttactcctctttccttccttcctcctttcctatcttccttcctc2220tctctcttcctctttcttcattcagatctatatggcaaatagccacaattatataaatca2280tttcaagactagaatagggggatataatacatattactccacacct.tttatgaatcaaat2340atgatttttttgttgttgttaagacagagtctcactttgacacccaggctggagtgcagt2400ggtgccatcaccacggctcactgcagcctcagcgtcctgggctcaaatgatcctcccacc2460t,cagcctcctgagtagctgggactacaggctcatgccatcatgcccagctaatatttttt2520t.attttcgtggagacggggcctcact,atgttgcctaggctggaaataggattttgaaccc2580aaattgagtttaacaataataaaaagttgttttacgctaaagatggaaaagaactaggac2640tgaactattttaaataaaatattggcaaaag2671〈210〉57〈211〉1193〈212〉腿〈213〉人類<220〉<221〉miscfeature<223〉CDH1〉giI5096041gb|L34545.11HUMECADN人E-f丐粘蛋白基因，5,i山'順啟動(dòng)子區(qū)域和<400〉57tctagaaaaattttttaaaaaattaggccgctcgagcgagagtgcagt.ggctcacgcctg60t.aatccaacacttcaggaggctga.agagggtggatcacctgaggtcaggagtt.ccagacc120agcctggccaacatggtgaaa.ccccgt.ctt.gtactaaaaatacaaaat.tagccggtgtgg180tggcacacgcctgtagtcccagctactcaataggctgagacaggagagtctcttgaaccc240ggcaggcggaggttgcagtgagccgagatcgtgccactgcactccagcctgggcaagaca300gagcgagactccgtctcaaaaaatacaaacaaaacaaacaaacaaaaaattaggctgcta360gctcagtggctcatggctcacacctgaaatcctagcactttgggaggccaaggcaggagg420atcgcttcagcccaggagttcgagaccaggctgggcaatacagggagacacagcgccccc480actgcccctgtccgccccgacttgtctctctacaaaaaggcaaaagaaaaaaaaaattag540cctggcgtggtggtgtgcacctgtactcccagctactagagaggctggggccagaggacc600gcttgagcccaggagtt'cgaggctgcagtgagctgtgatcgcaccactgcactccagctt660gggtgaaagagtgagccccatctccaaaacgaacaaacaaaaaatcccaaaaaacaaaag720aactcagccaagtgtaaaagccctttctgatcccaggtcttagtgagccaccggcggggc780tgggat,tcgaacccagtggaatcagaaccgtgcaggtcccataacccacctagaccctag840caactccaggctagagggtcaccgcgtctatgcgaggccgggtgggcgggccgtcagctc900cgccctggggaggggtccgcgctgctgattggctgtggccggcaggtgaaccctcagcca%0atcagcggtacggggggcggtgctccggggctcacctggctgcagccacgcaccccctct1020cagtggcgtcggaactgcaaagcacctgtgagcttgcggaagtcagttcagactccagcc1080cgctccagcccggcccgacccgaccgcacccggcgcctgccctcgctcggcgtccccggc1140cagccatgggcccttggagccgcagcctctcggcgctgctgctgctgctgcag1193〈210〉58<211〉2635〈212〉DNA<213〉人類<220>〈221〉misc—feature<223〉染色體5(另一個(gè)名稱(SCGB3A1))上的Hin-l區(qū)域〈220〉<221>misc—feature<223〉這個(gè)基因可以在染色體上的179，949，712-179，951，146位置找到所述基因的起始位置在重疊群AC122714.2.1.190024.〉染色體NCBI35:5:179949112:179951746:-l<400〉58atctgtcatacttctgcaggtgacagacgagtgaggacatttagagaaactcaggaacaa60accaggcccatccactggcgtcgaggctagtttcgaagacagaaaaacgccccacttctg120tttgcactgtggctgcctgtggcccggccggggaggcggccgggagtgaggcctgatcgt180ccctggcgcctccacctccccaggcgcagaaggcgcccacgaggacccccagtgcccgac240gttgccacggtctgggatcagaggcagggaccagggagccaggaactgcgccgcccccgc300ccctgccctggcgcgagggaagctcccctcacccgggcccagccctgcaggggggcgcgt360ggggtcagaccgcaaagcgaaggtgcgggccggggtgggcctcgcggagacaaaggccgg420gcctgcctgctctcagagggccccagcgcct,gccaagaggaagtcctcgaggcccgggca480gggaagggggcacgggcttcccagggcccgccggccgcagcaggaagttggccagggcac540ggccgtgagcggagcgggcagggctttctcaggagcgcgggcgaggccggcgctgg鄉(xiāng)g600gcgaggaccgggtataagaagcctcgtggccttgcccgggcagccgcaggttccccgcgc660gccccgagcccccgcgccat.gaagctcgccgccctcctggggct.ctgcgt.ggccctgtcc720tgcagctccggtgagcgccccgggctcctggcgcgcacggtggggcctgaggcctcggcg780cccgctgcgcccccgccgctgcctgcgccgatcgtggatcccaggtccttccagcctcgc840ccggcgcccagagggctccgccaccccggggccccgcgcctgcagcccgcggcctccccc900tctcagggctgtct.ccagcctcgtgccgggatggaggccgcccctggcctggggacaccc960gtctgccccccgtctggagaccggctcctcatcctgcaaggcgcagcgcgagtgtcccct1020cccttgggggcctgtcccggaccctgcacagagttcaccggtcct,tccgccaccctcagg1080ccactccggtgaccctgcagcgtctcctggcggggccgcctccccagacccgcctgt,gtc1140ccgggggctcgcacctggcaggcctcggcgcaggagggaggggcggtcggggagccgggc1200agggcgcgacggttcctgggcgcctcccgcgggggcgcgtcctggacctgccttctgggg1260accccggcgcgcaggcggtgacccctccctgttcgcttgcagctgctgctttcttagtgg1320gctcggccaagcctgtggcccagcctgtcgctgcgctggagtcggcggcggaggccgggg1380ccgggaccctggccaaccccctcggcaccctcaacccgctgaagctcctgctgagcagcc1440tgggcatccccgtgaaccacctcatagagggctcccagaagtgtgtggctgagctgggtc1500cccaggccgtgggggccgtgaaggccctgaaggccctgctggtaaagtgggca,ccccggg1560tgcccttcctgcgcgggcatcccttcccggcca.gcctcaaaactgcaccagaggtgtccc1620ggccctacgtcagggctgtttcccgtcct,gcccctccaagccctgtccctgggagaagcc1680cgggtctccgggtgggaactgggtggggcgcatccgagctgcaggggcggggaaggcgga1740gatggccccgcgcgggtgcgcgtcccccggagacgccagcggaaccgccccgctcccgct1800ccccacagagccggccgctgccgcgcccccgcct,gagttcttggtggcagggct.gggggc1860actcaagctcggcttctgctttccagggggccctgacagtgtttggctgagccgagactg1920gagcatctacacctgaggacaagacgctgcccacccgcgagggctgaaaaccccgccgcg1980gggaggaccgtccatccccttcccccggcccctctcaataaacgtggttaagagcagctc2040gagcctggtattttctcatccaaatgctgatccctgtgggggaccgagagtgccaagt,cc2100cagattttgtgaggggtgctgcgt.ga.gagagggagagagaggccgcgaga.gtctgcaggt2160ggcatagagccagcagtgcaaggtgacagagatggggccagtatcagaggtaaaccggat2220ttggaaacaaaactggcaggtctttctt,cctgttgtgctctgtaactgtttatgaagcat2280aaaaat,tatctactccttgaagactggcgagaatgcaaacgcaccaaagccatttgtt.gc2340taaaatttgaaagtttttattttt.tccctctatacttgtagatttcttcctcggaatggg2400ggaggaatgagggcttcaggaaatccgctgttgggcttgttttccctgcagtttctgctg2460gt,tt'tgtccaaataacctagtgactttgattccttctactctagcggagagaccaccttt2520tgt,caactgatctagtgttggtgggaaggtgcccagggaacccagacatcggtgtccctt2580tcaggggaagcctcccagttgacttccttgctgggatgaataactctgcct.cagg2635〈210〉59<211〉4260〈212〉DNA<213>人類<220>〈221〉inisc—feature<223〉〉gi|341173|gb|M24485.llHUMGSTPIG人(克隆pHGST-pi)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶pi<220>〈221〉inisc—feature<223〉〉gi|341173|gb|M2448(GSTP1)基因，全部編碼序列<400〉59aacaagagatcaatatctagaataaatggagatctgcaaatcaacagaaagtaggcagca60aagccaaagaaaatagccteaggcacagccactaaaaggaacgtgatcatgtcctttgca120gggacatgggtggagctggaagccgttagcctcagcaaactcacacaggaacagaaaacc180agcgagaccgcatggtctcacttataagtgggagctgaacaatgagaacacatggtcaca240tggcggcgatcaacacacactggtgcctgttgagcggggtgctggggagggagagtacca300ggaagaatagctaagggatactgggct.taatacctgggtgatgggatgatctgtacagca360aaccatcatggcgcacacacctatgtaacaaacctgcacatcctgcacatgtaccccaga420act'tcaaataaaagt.tggacggccaggcgtggtggctcacgcctgtaatcccagcacttt480gggaagccgaggcgtgcagatcacctaaggtcaggagttcgagaccagcccggccaacat540ggtgaaaccccgtctctactaaaaatacaaaaatcagccagatgtggcacgcacctataa600ttccacctactcgggaggctgaagcagaattgcttgaacccgagaggcggaggttgcagt660gagccgccgagatcgcgccactgcactccagcctgggccacagcgtgagactacgtcata720aaataaaataaaataacacaaaataaaataaaataaaataaaataaaataa3^taataaa780ataaaataaaataaaataaaataaaataaaataaagcaatttcctttcctctaagcggcc840tccacccctctcccctgccctgtgaagcgggtgtgcaagctccgggatcgcagcggtctt900agggaat.ttccccccgcgatgtcccggcgcgccagttcgctgcgcacacttcgctgcggt.960cctct.tcctgctgt'ctgtttactccctaggccccgctggggacctgggaaagagggaaag1020gcttccccggccagctgcgcggcgactccggggactccagggcgcccctct.gcggccgac1080gcccggggtgcagcggccgccggggctggggccggcgggagtccgcgggaccctccagaa.1140gagcggccggcgccgtgactcagcactggggcggagcggggcgggaccacccttataagg1200ctcggaggccgcgaggccttcgctggagtttcgccgccgcagtcttcgccaccagtgagt1260acgcgcggcccgctccccggggatggggctcagagctcccagcatggggccaacccgcag1320catcaggcccgggctcccggcagggctcctcgcccacctcgagacccgggacgggggcct1380aggggacccaggacgtccccagtgccgttagcggctttcagggggcccggagcgcctcgg1440ggagggatgggaccccgggggcggg柳ggggggcaggctgcgctcaccgcgccttggca1500tcctcccccgggctccagcaaacttttctttgttcgctgcagtgccgccctacaccgtgg1560tctatttcccagttcgaggtaggagcatgtgtctggcagggaagggaggcaggggctggg1620gctgcagcccacagcccctcgcccacccggagagatccgaacccccttatccctccgtcg1680tgtggcttttaccccgggcctccttcctgttccccgcctctcccgccatgcctgctcccc1740gccccagtgttgtgtgaaatcttcggaggaacctgtttacctgt,tccctccctgcactcc1800tgacccctccccgggttgctgcgaggcggagtcggcccggtccccacatctcgtacttct1860ccctccccgcaggccgctgcgcggccctgcgcatgctgctggcagatcagggccagagct1920ggaaggaggaggtggtgaccgtggagacgtggcaggagggctcactcaaagcctcctgcg1980taagtgaccatgcccgggcaaggggagggggtgctgggcct.tagggggctgtgactagga2040tcgggggacgcccaagctcagtgcccct.ccctgagccatgcctcccccaacagctatacg2100ggcagctccccaagttccaggacggagacctcaccctgtaccagtccaataccatcctgc2160gtcacctgggccgcaccct.tggtgagtcttgaacctccaagtccagggcaggcatgggca2220agcctctgcccccggagcccttttgttt'aaatcagctgccccgcagccctctggagtgga2280ggaaactgagacccactgaggttacgtagttccttgccctgtgccaggctgcctcccaggggcagtctctcatccttccacgcacatcctacagccccctggttggcccatccccagtgagcctgctcccctccacccaaccccagggctggtggacatggtg犯tgacggcgtggaggacaccaactatgtgagcatctgcaccagggtcttcttgtgccctcaccccccttacccctcagggtgcaggggctgggtcagctctgggcccctgcacccttattgcctgggacatcaaccaaggacagagacctccagcaactggtggttggagtagccagaggtggaggaggatttgtcttagctgaggaaaatatgcagacacagagcaggcagcgtgtgtgcgcgtgcgtgtgcgtgtgtgtcgggtgggtaaggagatagagatggtgaacccactggtttggagtctcctaaggggctgtgtctgaatgtgaggtctagaaggatcaa,tcatctggtgagagaacccagcaaggaggcagctgaagtggacaggatttggtact.attgcccaaggtcaagcctgggtgcctgcaa2340tgtcaggtgagctctgagcacctgctgtgt2400cttcccctcctcccaggctggggctcacag2460ctgtgtgttgatcaggcgcccagtcacgcg2520ctatgggaaggaccagcaggaggcagccct2580cctccgctgcaaatacatctccctcatcta2640tgggcactgggggctgaacaaagaaagggg2700aggtggcttgggctgaccccttcttgggtc2760aggggcccaggggcctgggacaagacacaa2820agccaagtaacgggtcatgggggcgagtgc2880tctgatct,cctggggtggcgagggcttcct2940gccagtttctggatggaggtgctggcactt3000acatttggggacctgggaccagttcagcag3060tgtgtgcgtgtgtgtgtgtacgcttgcatt3120gcgggcagtaggcccaggtcccgaaggcct3180caatgggggccattgagaagtctgaacagg3240cctccagagaagccagctct,aaagcttttg3300tggacaggcagaatggaatagagatgagt,t3360gcctggtt.gtggggagcaagcagaggagaa3420tctgggactctggtgtctggcctggggcagacgggggtgtctcaggggctgggagggatg3480agagtaggatgatacatggtggtgtctggcaggaggcgggcaaggatgactatgtgaagg3540cactgcccgggcaactgaagccttttgagaccctgctgtcccagaaccagggaggcaaga3600ccttcattgtgggagaccaggtgagcatctggccccatgctgttccttcctcgccaccct3660ctgcttccagatggacacaggtgtgagccatttgtttagcaaagcagagcagacctaggg3720gatgggcttaggccctctgcccccaattcctccagcctgctcccgctggctgagtcccta3780gcccccctgccctgcagatctccttcgctgactacaacctgctggacttgctgctgatcc3840atgaggtcctagcccctggctgcctggatgcgttccccctgctctcagcatatgtggggc3900gcctcagtgcccggcccaagctcaaggccttcctggcctcccctgagtacgtgaacctcc3960ccatcaatggcaacgggaaacagtgagggttggggggactctgagcgggaggcagagtt,t4020gccttcctt'tctccaggaccaataaaatttctaagagagctactatgagcactgtgtttc4080ctgggacggggcttaggggttctcagcctcgaggtcggtgggagggcagagcagaggact4140agaaaacagctcctccagcacagtcagtggcttcctggagccctcagcctggctgtgttt4200actgaacctcacaaactagaagaggaagaaaaaaaaagagagagagaaacaaagagaaat4260<210>60<211>2011<212>〈213>人類<220〉<221>miscfeature〈223〉B-肌動(dòng)蛋白〉giI283371embIY00474.llHSACTBPR人beta-肌動(dòng)蛋白基因5'側(cè)翼區(qū)，CPG島1656至1955〈400〉60gagctctgtctcttggccagctgaatggaggcccagcggcaacacaggtcctgcctgggg60atcaggtctgctctgcaccccaccttgctgcctggagccgcccacctgacaacctctcat'120ccctgctctgtagat.ccggtcccatccccactgcccaccccacccccccagcactccacc180cagttcaa,cgttccacgaacccccagaaccagccctcatcaacaggcagcaagaagggcc240ccccgcccatcgccccacaacgccagccgggtgaactgtagcgttggcaggtcctgaggc300agctgaaagatacaaggccagggacaggacagtcccatccccaggaggcagggagtatac360a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cacattaactatttacagggteactgcttaggaccagtattatgagga6360gaatttacctttcccgcctctctttccaagaaacaaggagggggtgaaggtacggagaac6420agtat.ttcttctgttgaaagcaacttagctacaaagataaattacagctatgtacactga6480aggtagctatt.tcattccacaaaataagagttttttaaaaagctatgtatgtatgtcctg6540catatagagcagatatacagcctattaagcgtcgtcactaaaacataaaacatgtcagcc6600tt,tctt,aaccttactcgccccagtctgtcccgacgtgacttcctcgaccctctaaagacg6660tacagaccagacacggcggcggcggcgggagaggggattccctgcgcccccggacctcag6720ggccgct,cagattcct,ggagaggaagccaagtgtcctt.ct—gccctcccccggtatcccat6780ccaaggcgatcagtccagaactggctctcggaagcgctcgggcaaagactgcgaagaaga6840a.a.aga.catctggcggaaacctgtgcgcctggggcggtggaactcggggaggagagggagggatcagacaggagagtggggactaccccctctgctcccaaattggggcagcttcctgggtttccgattttctcatttccgtgggtaaaaaaccctgcccccaccgggcttacgcaatttttttaaggggagaggagggaaaaatttgtggggggtacgaaaaggcggaaagaaacagtcatttcgtcacatgggcttggttttcagtcttataaaaaggaaggttctctcggttagcgaccaattgtcatacgacttgcagtgagcgtcaggagcacgtccaggaactcctcagcagcgcctccttcagctccacagccagacgccctcagacagcaaagcctaccccccgcgccgcgccctgcccgaagctt<210>67<211>4465<212〉腿<213>人類<220><221>misc_feature<223>>gi145062641refINM—000963.l|人類前列腺素-內(nèi)過(guò)氧化場(chǎng)合酶2(前列腺素G/H合酶和環(huán)氧化酶)(PTGS2)，邁RNA<400>67caattgtcatacgacttgcagtgagcgtcaggagcacgtccaggaactcctcagcagcgc60ctccttcagctccacagccagacgccctcagacagcaaagcctacccccgcgccgcgccc120tgcccgccgctcggatgctcgcccgcgccctgctgctgtgcgcggtcctggcgctcagcc180atacagcaaatccttgctgttcccacccatgtcaaaa.ccgaggtgtatgtatgagtgtgg240gatt.tgaccagtataagtgcgattgtacccggacaggat.t.ctatgga.gaaaactgctcaa30069006960702070807140720072607273caccggaatttttgacaagaataaaattatttctgaaacccactccaaacacagtgcact360acatacttacccacttcaagggattttggaacgttgtgaataacattcccttccttcgaa420atgcaa,ttatgagttatgtcttgacatccagatcacatttgattgacagtccaccaactt化Oacaatgctgactatggctacaaaagctgggaagcctt'ctctaacctctcctattatacta540gagcccttcctcctgtgcctgatgattgcccgactcccttgggtgtcaaaggtaaaaagc600agcttcctgattcaaatgagattgtggaaaaattgcttctaagaagaaagttcatccctg660atccccagggctcaaacatgatgtttgcattctttgcccagcacttcacgcatcagtttt720tcaagacagatcataagcgagggccagctttcaccaacgggctgggccatggggtggact780taaatcatatttacggtgaaactctggctagacagcgtaaactgcgccttttcaaggatg840gaaaaatgaaatatcagataattgatggagagatgtatcctcccacagtcaaagatactc900aggcagagatgatctaccctcctcaagtccctgagcatctacggtttgctgtggggcagg960aggtctttggtctggtgcctggtctgatgatgtatgccacaatctggctgcgggaacaca1020acagagtatgcgatgtgcttaaacaggagcatcctgaatggggtgatgagcagttgttcc1080agacaagcaggctaatactgataggagagactattaagattgt.gattgaagattatgtgc1140aacacttgagtggctatcacttcaaactgaaatttgacccagaactacttttcaacaaac1200aattccagtaccaaaatcgtattgctgctgaatttaacaccctctatcactggcatcccc1260ttctgcctgacacctttcaaattcatgaccagaaatacaactatcaacagtttatctaca1320acaactctatattgct.ggaacatggaattacccagtttgtt.gaatcattcaccaggcaaa1380t.tgctggcagggttgctggtggt,aggaatgttccacccgcagtacagaaagtatcacagg1440cttccattgaccaga.gcaggcagatgaaataccagt.cttttaatgagtaccgcaaacgct1500ttatgctgaagccctatgaatcatttgaagaacttacaggagaaaaggaaatgtctgcag1560agttggaagcactctatggtgacatcgatgctgtggagctgtatcctgcccttctggtag1620aaaagcctcggccagatgccatctttggtgaaaccatggtagaagttggagcaccattct1680ccttgaaaggacttatgggtaatgttatatgttctcctgcctactggaagccaagcactt1740ttggtggagaagtgggttttcaaatcatcaacactgcctcaattcagtctctcatctgca1800ataacgtgaagggctgtccctttacttcattcagtgttccagatccagagctcattaaaa1860cagtcaccatcaatgcaagttcttcccgctccggactagatgatatcaatcccacagtac1920t.actaaaagaacgttcgactgaactgtagaagtctaatgatcatatttattt,atttatat1980gaaccatgtctattaatttaattatttaataatatttatattaaactccttatgttactt2040aacatctt.ctgtaacagaagtcagtactcctgttgcgga,gaaaggagtcatacttgtgaa2100gacttttatgtcactactctaaagattttgctgttgctgttaagtttggaaaacagtttt2160tattctgttttataaaccagagagaaatgagttttgacgtctttttacttgaatttcaac2220ttatattat.aagaacgaaagtaaagatgtttgaatacttaaacactatcacaagatggca2280aaatgctgaaagtt.tttacactgtcgatgtttccaatgcatcttccatgatgcattagaa2340gtaactaatgtttgaaattttaa.agtacttttggttatttt.tctgtcatcaaacaaaaac2400aggtatcagtgcattattaaatgaatatttaaattagacattaccagtaatttcat.gtct2460actttttaaaatcagcaa.tgaaacaataatttgaaatttctaaattcatagggt.agaatc2520acctgtaaaagct'tgttt,ga.tttcttaaagttatt,aaacttgtacatataccaaaaagaa.2580gctgtcttggatttaaatctgtaaaatcagatgaaattttactacaattgcttgttaaaa2640tattttataagtgatgttcctttttcaccaagagtataaacctttttagtgtgactgtta2700aaacttccttttaaatcaaaatgccaaatttattaaggtggtggagccactgcagtgtta2760tctcaaaataagaatattttgttgagatattccagaatttgtttatatggctggtaacat2820gtaaaatctatatcagcaaaagggtctacctttaaaataagcaataacaaagaagaaaac2880caaattattgttcaaatttaggtttaaacttttgaagcaaacttttttttatccttgtgc2940actgcaggcctggtactcagattttgctatgaggttaatgaagtaccaagctgtgcttga3000ataacgatatgttttctcagattttctgttgtacagtttaatttagcagtccatatcaca3060ttgcaaaagtagcaatgacctcataaaatacctcttcaaaatgcttaaattcatttcaca3120cattaattttatctcagtcttgaagccaattcagtaggtgcattggaatcaagcctggct,3180acct'gcatgctgttccttttcttttcttcttttagccattttgctaagagacacagtctt3240ctcatcacttcgtttctcctattttgttttactagttttaagatcagagttcactttctt3300tggactctgcctatattttcttacctgaacttttgcaagttttcaggtaaacctcagctc3360aggactgctatttagctcct,cttaagaagattaaaagagaaaaaaaaaggcccttttaaa3420aatagtatacacttattttaagtgaaaagcagagaattttatttata.gctaattttagct3480a/tctgtaaccaagatggat.gcaaagaggctagtgcctcagagagaactgtacggggtttg3540tgactggaa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臓的方法，其中，如果mMarker的數(shù)量蹄在沒(méi)有超過(guò)預(yù)定働鵬^M鑒定為溫和性的。3、如權(quán)利要求l臓的t法，其中，^Marke魂自由APC、RASSF1A、R卿2和fflN-l艦的組。4、一種用行表征前列腺癌的分析的試劑盒，0f^試劑盒包括Marker試劑。5、如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其中，所^Marker是用于選自由APC、RASSF1A、RARJ32和HTN-1組成的組的基因。6、如權(quán)利要求4臓的試劑盒，其中，^^試劑包括由S叫IDNo.34和35組成的組的成員。7、如權(quán)利要求6臓的試劑盒，其中PCR啟動(dòng)試齊謹(jǐn)本上由S叫IDNo.34和35構(gòu)成。8、如權(quán)利要求4臓的試劑盒，其中，ff^試布泡括由Seq.IDNo.30和31組成的組的成員。9、如權(quán)利要救臓的試劑盒，其中，PCR啟動(dòng)試齊JS本上由Seq.IDNo.30抑1構(gòu)成。10、如權(quán)利要求4臓的試劑盒，其中，ff^試劑包括由S叫K)No.32和33組成的組的成員。11、如權(quán)利要求10職的試劑盒，其中，PCR啟動(dòng)試劑基本上由Seq.IDNo.32和33構(gòu)成。12、如權(quán)利要求4臓的試劑盒，其中，0^試劑包括由8叫101\0.54和55組成的組的成員。13、如權(quán)利要求12臓的試劑盒，其中，PCR啟動(dòng)試劑基本上由S叫IDNo.54和55構(gòu)成。14、如權(quán)利要求4臓的試劑盒，0f^試劑盒還包括用于擴(kuò)增和檢測(cè)組鵬^ii基因之存在的^C劑。15、女嫩利要求im的方法，0M方法還包括確定甲皿率辯I漸是否所述甲基化率^il臨界值。16、女trfe利要求i皿的方法，用于治療監(jiān)測(cè)。17、如權(quán)利要求4臓的試劑盒，其中，^Markers基本上由用于RASSF1A和，型^iS因的Markere構(gòu)成。18、女?dāng)±?7臓的試劑盒，其中，臓^M^ii基因是B-肌動(dòng)蛋白。19、如權(quán)利要求4臓的試劑盒，其中，fft&Markei^本上由用于Hin-l和^M敬基因的Marker構(gòu)成。全文摘要本發(fā)明涉及前列腺癌的場(chǎng)效應(yīng)分析方法和試劑盒。本發(fā)明一方面提供了一種用于表征患者前列腺癌的方法，所述方法包括取得原發(fā)性前列腺腫瘤外部的組織樣品，其中，所述樣品沒(méi)有顯示出腫瘤病理學(xué)的形態(tài)特征；在所述樣品中確定Marker的存在或數(shù)量；以及如果所述Marker的數(shù)量或存在超過(guò)了預(yù)定值，則評(píng)定所述癌為侵襲性的。本發(fā)明另一方面提供了一種用于進(jìn)行表征前列腺癌的分析的試劑盒，所述試劑盒包括Marker試劑。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101270388SQ20071030615公開日2008年9月24日申請(qǐng)日期2007年10月31日優(yōu)先權(quán)日2006年10月31日發(fā)明者A·馬祖姆達(dá),J·梅羅特拉,J·瓦戈,K·格雷,S·瓦德申請(qǐng)人:維里德克斯有限責(zé)任公司