專利名稱：：探針、探針組、固定有探針的載體和基因檢測方法探針、探針組、固定有探針的栽體和基因檢測方法
背景技術(shù)：
：發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于檢測傳染性疾病病原性細(xì)菌-丙酸桿菌(屬)(戶/o;/(/7/6acfer/腿)的基因的探針和探針組，其用于檢測和鑒定傳染性疾病的致病性生物；固定有探針的栽體，所述探針或探針組被固定在它上面；使用該固定有探針的載體的基因檢測方法；和用于該方法的基因檢測試劑盒。相關(guān)
背景技術(shù)：
：迄今，已提出在分析物中快速并準(zhǔn)確地檢測傳染性疾病的致病性生物的試劑和方法。例如，日本專利申請?zhí)亻_平H08-089254中公開了具有特定的堿基序列的寡核苷酸(其能分別用作探針和引物以用于檢測念珠菌病和曲霉病的病原性細(xì)菌)和使用此類寡核苷酸檢測目標(biāo)細(xì)菌的方法。另外，相同的專利文件還公開了用于通過PCR同時擴(kuò)增多種目標(biāo)細(xì)菌的引物組。換言之，這些引物被用于在分析物中對作為多種目標(biāo)的來自真菌的核酸片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增?？梢允褂锰禺愑诟鱾€真特定部分的存在，從而鑒定;析^中的目標(biāo)真菌種類。"'另一方面，作為能同時檢測多個具有不同堿基序列的寡核苷酸的方法，已知使用探針陣列的方法，其中將具有與各個堿基序列互補(bǔ)的序列的探針間隔地排列在固相支撐物上(日本專利申請?zhí)亻_平2004—313181)。發(fā)明概述不過，設(shè)計特異性地檢測樣品中傳染性疾病病原性細(xì)菌基因的探針不是一件容易的工作。因為，除了目標(biāo)基因，樣品可能進(jìn)一步含有其它傳染性疾病病原性細(xì)菌的基因。因此，設(shè)計特異性地檢測傳染性疾病病原性細(xì)菌的基因并同時禁止交叉污染的探針不是一件容易的工作，所述交叉污染是其它傳染性疾病病原性細(xì)菌的基因的存在而造成的影響。在這種情況下，本發(fā)明人為獲得如下所述的探針進(jìn)行了研究，所述探針在維持低水平交叉污染的同時，甚至當(dāng)使用其中存在不同細(xì)菌的基因的樣品時，允許精確檢測后面提到的傳染性疾病病原性細(xì)菌的基因。結(jié)果，本發(fā)明的發(fā)明人最終發(fā)現(xiàn)了能精確檢測傳染性疾病病原性細(xì)菌-丙酸桿菌(屬)的基因的探針。本發(fā)明的第一個目標(biāo)是提供探針和探針組，它們能從其中同時存在多種細(xì)菌的分析物中精確鑒定目標(biāo)細(xì)菌的基因。本發(fā)明的另一個目標(biāo)是提供固定有探針的載體，它能被用于從其中同時存在多種細(xì)菌的分析物中精確地鑒定目標(biāo)細(xì)菌。本發(fā)明的另一個目標(biāo)是提供檢測目標(biāo)細(xì)菌的基因檢測方法，它能從分析物中的多種細(xì)菌中(當(dāng)它們存在其中時)快速并精確地檢測目標(biāo)細(xì)菌；和用于這種方法的試劑盒。本發(fā)明的檢測傳染性疾病病原性細(xì)菌-丙酸桿菌(屬)的基因的探針具有下述堿基序列(l)到(3)中的任一個(1)GCTTTCGATACGGGTTGACTTGAGGAA(SEQIDNO.94)或它的互4卜序列；(2)修飾的序列，所述修飾的序列是在SEQIDNO.94的序列和它的互補(bǔ)序列中的任一個上在所述修飾的序列保持作為探針的功能的范圍內(nèi)發(fā)生堿基缺失、置換或添加而制備的。此外，本發(fā)明的用于檢測傳染性疾病病原性細(xì)菌-丙酸桿菌(屬)的基因的探針組包括選自下述(A)到(D)中的至少兩個探針(A)具有GCTTTCGATACGGGTTGACTTGAGGAA(SEQIDNO.94)所示的堿基序列的探針；(B)具有SEQIDNO.94所示的堿基序列的互補(bǔ)序列的探針；(C)具有修飾的序列的探針，所述修飾的序列是在SEQIDNO.94所示的堿基序列上在使它保持用于檢測丙酸桿菌(屬)的基因的探針功能的范圍內(nèi)進(jìn)行堿基缺失、置換或添加而獲得的；(D)具有修飾的序列的探針，所迷修飾的序列是在SEQIDNO.94所示的堿基序列的互補(bǔ)序列上在使它保持用于檢測丙酸桿菌(屬)的基因的探針功能的范圍內(nèi)進(jìn)行堿基缺失、置換或添加而獲得的；并且，本發(fā)明的固定有探針的載體的特征性特點是，上述探針(A)到(D)中的至少一個被固定在固相載體上，并且當(dāng)使用多個探針時，各個探針被間隔排列。病病原性細(xì)菌-丙酸桿菌(屬)的基因的方法，包括步驟(i)讓分析物和具有上述構(gòu)成的固定有探針的栽體反應(yīng)；和(ii)檢測固定有探針的載體上的探針和分析物中的核酸之間的反應(yīng)是否存在，或檢測固定有探針的載體上的探針和分析物中的核酸之間的雜交反應(yīng)的強(qiáng)度。本發(fā)明的檢測傳染性疾病病原性細(xì)菌-丙酸桿菌(屬)的試劑盒的特征性特點是，包括上述探針(A)到(D)中的至少一個，和檢測探針與目標(biāo)核酸之間的反應(yīng)的試劑。根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)分析物被上述致病性細(xì)菌感染時，細(xì)菌能被更快速并精確地從分析物中鑒定出，即使該分析物同時并且復(fù)雜地被上述細(xì)菌之外的其它細(xì)菌感染。特別地，可以檢測出丙酸桿菌(屬)，同時精確區(qū)分它和可能引起交叉污染的大腸埃希氏桿菌。參照下述例示性實施方案的描述和附圖，本發(fā)明的進(jìn)一步特點將變得顯而易見。附圖簡述圖1是闡述第一PCR(lstPCR)操作流程的圖。圖2是闡述第二PCR(2ndPCR)操作流程的圖。發(fā)明詳述本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)從各個保藏機(jī)構(gòu)獲得了到目前為止幾乎所有的被認(rèn)為是敗血病病原性細(xì)菌的細(xì)菌(由下述a)到(so)表示)，并鑒定了所有這些細(xì)菌的16SrRNA的基因序列。隨后，在比較所有鑒定的序列時，詳細(xì)研究了丙酸桿菌(屬)的探針序列，并且最終找出本發(fā)明的能夠鑒定丙酸桿菌(屬)的探針。(1)金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(2)表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)(3)大腸埃希氏桿菌(Escherichiacoli)(4)肺炎克雷白氏桿菌(Klebsiellapneumoniae)(5)銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)(6)粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiaraarcescens)(7)肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)(8)流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)(9)P月溝腸桿菌(Enterobactercloacae)(10)糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)(11)溶血葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticus)(12)人葡萄球菌(Staphylococcushominis)(13)腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)(14)無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)(15)變異鏈球菌(Streptococcusrautans)(16)化膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)(17)血鏈球菌(Streptococcussanguis)(18)鳥腸球菌(Enterococcus■avium)(19)屎腸球菌(Enterococcusfaecium)(20)焚光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)(21)惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)(22)洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderiacepacia)(23)嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)(24)鮑氏不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)(25)乙酸4丐不動桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)(26)木糖氧化產(chǎn)堿菌(Achroraobacterxylosoxidans)(27)創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)(28)豬霍亂沙門(氏)菌(Salmonellacholeraesuis)(29)弗勞地氏檸檬桿菌(CUrobacterfreundii)(30)產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)(ATCC12600)(ATCC14990)(ATCC11775)(ATCC13883)(ATCC10145)(ATCC13380)(ATCC33400)(ATCC33391)(ATCC13047)(ATCC19433)(ATCC29970)(ATCC27844)(ATCC15305)(ATCC13813)(ATCC25175)(ATCC12344)(ATCC10556)(JCM8722)(ATCC19434)(ATCC13525)(ATCC12633)(JCM5964)(ATCC13637)(ATCC19606)(ATCC23055)(ATCC27061)(ATCC27562)(JCM1651)(ATCC8090)(ATCC13182)(31)產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)(ATCC13048)(32)蜂房哈夫尼菌(Hafniaalvei)(ATCC13337)(33)液化沙雷氏菌(Serratia1iquefaciens)(ATCC27592)(34)奇異變形菌(Proteusmirabilis)(ATCC29906)(35)普通變形菌(Proteusvulgaris)(ATCC33420)(36)摩氏摩才艮(氏)菌(Morganellamorganii)(ATCC25830)(37)雷氏普羅威登斯菌(Providenciarettgeri)(JCM1675)(38)嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)(JCM1027)(39)溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)(ATCC43979)(40)P月道加德納氏菌(Gardnerellavaginalis)(ATCC14018)(41)白喉棒狀桿菌(Corynebacteriumdiphtheriae)(ATCC2701)(42)侵肺軍團(tuán)菌(Legionellapneumophila)(ATCC33152)(43)蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)(ATCC14579)(44)枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)(ATCC6051)(45)堪薩斯氏分枝桿菌(Mycobacteriumkansasii)(ATCC12478)(46)胞內(nèi)分枝桿菌(Mycobacteriumintracellulare)(ATCC13950)(47)龜分支桿菌(Mycobacteriumchelonae)(ATCC35752)(48)星狀諾卡氏菌(Nocardiaasteroides)(ATCC19247)(49)脆弱類桿菌(Bacteroidesfragilis)(JCM11019)(50)多形類桿菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)(JCM5827)(51)難辨梭狀芽孢桿菌(Clostridiumdifficile)(ATCC51695)(52)產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(Clostridiumperfringens)(JCM1290)(53)遲緩埃格特菌(Eggerthellalenta)(JCM10763)(54)壞死梭桿菌(Fusobacteriumnecrophorum)(JCM3718)(55)核粒梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum)(ATCC25586)(56)嗜酸享L芽孢桿菌(Lactobacillusacidophilus)(ATCC4356)(57)普氏厭氧球菌(Anaerococcusprevotii)(JCM6490)(58)不解糖嗜胨菌(Peptoniphilusasaccharolyticus)(JCM8143)(59)不解糖p卜淋單胞菌(Porphyromonasasaccharolytica)(JCM6326)(60)牙齦外啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis)(JCM8525)(61)棲牙普雷沃氏菌(Prevotelladenticola)(ATCC38184)(62)痤疳丙酸桿菌(Propionibacteriumacnes)(JCM6473)(63)約氏不動桿菌(Acinetobacterjohnsonii)(ATCC17909)(64)瓊氏不動桿菌(Acinetobacterjunii)(ATCC17908)(65)舒氏氣單胞菌(Aeromonasschubertii)(ATCC43700)(66)維羅納氣單胞菌(Aeromonasveronii)(ATCC35624)(67)吉氏類桿菌(BacteroidesdisUsonis)(ATCC8503)(68)普通類桿菌(Bacteroidesvulgatus)(ATCC8482)(69)大腸彎曲桿菌(Campylobactercoli)(ATCC33559)(71)空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)(72)水生黃桿菌(Flavobacteriumaquatile)(73)水氏黃桿菌(Flavobacteriummizutaii)(74)黑色消化球菌(Peptococcusniger)(75)親合丙酸桿菌(Propionibacteriumavidum)(70)豚腸彎曲桿菌(Campylobacterhyointestinalis)(ATCC35217)(ATCC33560)(ATCC11947)(ATCC33299)(ATCC27731)(ATCC25577)(76)佛羅伊登氏丙酸桿菌(Propionibacteriumfreudenreichii)(ATCC6207)所獲得的細(xì)菌菌種的保藏號示于上述右側(cè)的各個括號中。具有以"ATCC"、"JCM"和"NBRC"開頭的保藏號的細(xì)菌菌種分別得自于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)、日本微生物保藏中心(JapanCollectionofMicroorganisms,RIKENBioResourceCenter)和美國呼吸治療協(xié)會(NationalBoardforRespiratoryCare)。本發(fā)明提供了鑒定傳染性疾病病原性細(xì)菌的寡核苷酸探針(在下文中，簡稱為探針)和包括兩種或更多種探針的組合的探針組。使用這種探針或探針組能檢測通過感染來引起炎癥的下述細(xì)菌。丙酸桿菌(屬)就是說，本發(fā)明的探針能檢測上述細(xì)菌的基因中的16SrRNA基因序列，包含下述的序列(A)具有GCTTTCGATACGGGTTGACTTGAGGAA(SEQIDNO.94)所表示的堿基序列的探針；(B)具有SEQIDNO.94所表示的堿基序列的互補(bǔ)序列的探針；(C)具有修飾的序列的探針，所述修飾的序列是在SEQIDNO.94所表示的堿基序列上在使它保持用于檢測丙酸桿菌(屬)的基因的探針功能的范圍內(nèi)進(jìn)行堿基缺失、置換或添加而獲得的；(D)具有修飾的序列的探針，所述的修飾的序列是在SEQIDNO.94(77)顆粒丙酸桿菌(Propionibacteriumgranulos測)(78)丁酸梭狀芽孑包軒菌(Clostridiumbutyricum)(79)Flavobacteriumhydatis(80)約氏黃桿菌(Flavobacteriumjohnsoniae)(ATCC25564)(ATCC13949)(NBRC14958)(NBRC14942)所表示的堿基序列的互補(bǔ)序列上在使它保持用于檢測丙酸桿菌(屬)的基因的探針功能的范圍內(nèi)進(jìn)行堿基缺失、置換或添加而獲得的；和所述探針組可以使用這些探針中的至少兩種來形成。這些探針的功能顯著依賴每個探針序列對感興趣的目標(biāo)核酸序列的特異性。探針序列的特異性可以通過目標(biāo)核酸序列和探針序列的堿基一致性程度來評估。進(jìn)一步地，當(dāng)多種探針組成探針組時，探針間解鏈溫度的變化可以影響探針組的性能。為了設(shè)計探針序列，選擇不管菌林的任何差異而對感興趣的特定細(xì)菌菌種顯示高特異性的區(qū)域。該區(qū)域含有3個或更多個和其它任意細(xì)菌菌種序列中的對應(yīng)堿基不一致的堿基。設(shè)計該探針序列，使在該探針序列和感興趣的特定細(xì)菌菌種對應(yīng)序列間的解鏈溫度與在該探針序列和任意其它細(xì)菌菌種對應(yīng)序列間的解鏈溫度相差I(lǐng)O'C或更多。進(jìn)一步地，可以缺失或增加一個或多個堿基，使固定在單個載體上的各個探針可以具有預(yù)定范圍內(nèi)的解鏈溫度。本發(fā)明的發(fā)明人通過實驗發(fā)現(xiàn)，如果80%或更多的堿基序列連續(xù)保守，探針的雜交強(qiáng)度將不會顯著降低。因此根據(jù)該發(fā)現(xiàn)可以得出結(jié)論，如果探針80。/或更多的堿基序列連續(xù)保守，從公開在說明書中的探針序列修飾而得的任意序列將具有足夠的探針功能。上述修飾的序列可以包括任意變體，只要它不損害探針功能；或任何變體，只要它和作為檢測目標(biāo)的感興趣的核酸序列雜交。尤其是，希望包括任何變體，只要它能在嚴(yán)格條件下和作為檢測目標(biāo)的感興趣的核酸序列雜交。優(yōu)選的界定所述變體的雜交條件包括下述實施例中的那些。此處使用的術(shù)語"檢測目標(biāo)"可以是包括在樣品中的、將被用于雜交的序列，其可以是傳染性疾病病原性細(xì)菌獨有的堿基序列、或可以是獨有序列的互補(bǔ)序列。進(jìn)一步地，變體可以是在使它保持作為探針的功能的范圍內(nèi)通過缺失、置換或添加至少一個堿基所獲得的修飾的序列。這些探針序列僅特異性于編碼上述細(xì)菌16SrRNA的DNA序列，因此即使是在嚴(yán)格條件下也能期望獲得對該序列的足夠的雜交靈敏度。此外，即使探針序列被固定在設(shè)計成產(chǎn)生優(yōu)良結(jié)果的載體上時，這些探針序列中的任一個通過和目標(biāo)分析物的雜交反應(yīng)形成穩(wěn)定的雜交產(chǎn)物。進(jìn)一步地，通過在栽體上的預(yù)定位置供給探針并將探針固定其上，能夠獲得上面具有本發(fā)明的檢測傳染性疾病病原性細(xì)菌的探針的固定有探針的載體(例如DNA芯片)。可以使用多種方法來供給探針到載體上。其中，例如，一種能被適當(dāng)使用的方法是保持表面狀態(tài)能讓探針通過化學(xué)結(jié)合(例如共價結(jié)合)固定在載體上，并且隨后通過噴墨方法在預(yù)定位置上提供含有探針的液體。這種方法讓探針難以從栽體上脫離，并具有增強(qiáng)靈敏度的附加效果。換句話說，當(dāng)使用常規(guī)使用的并被稱為Stanford方法的壓印方法制備DNA芯片時，產(chǎn)生的DNA芯片具有所施用的DNA趨于脫落的缺點。另一個形成DNA芯片的方法是通過在載體表面上合成DNA來進(jìn)行探針排列(例如來自于Affymetrix公司的DNA芯片)。在這種在載體上合成探針的方法中，難以為每個探針序列制備相等數(shù)量的合成DNA。因此，對應(yīng)于每個探針來說每個固定區(qū)域(點)的固定的探針數(shù)量趨于很大的變化。這種各個固定的探針數(shù)量的變化會引起對于采用那些探針的檢測結(jié)果的錯誤評價?；谶@一事實，優(yōu)選使用上述噴墨方法來制備本發(fā)明的探針栽體。上述噴墨方法具有一個優(yōu)點，即探4f能被穩(wěn)定地固定在載體上并難以脫離載體，從而有效地提供能高靈敏度和高準(zhǔn)確度地進(jìn)行檢測的探針載體。此外，探針組可以包括選自于一組序列中的至少兩個，所述一組序列含有上述SEQIDNO.94、它的互補(bǔ)序列和通過在這些序列上在使之保持檢測丙酸桿菌(屬)基因的探針功能的范圍內(nèi)進(jìn)行堿基缺失、置換或添加所獲得的序列。這樣，檢測丙酸桿菌(屬)基因的準(zhǔn)確度能進(jìn)一步提高。在下文中，詳細(xì)描述本發(fā)明的優(yōu)選實施例。待使用探針載體(例如DNA芯片)進(jìn)行檢測的測試對象包括源自人和動物(例如家畜)的那些，在所述探針載體中本發(fā)明的探針被固定在載體上。例如，測試對象是可能含有細(xì)菌的那些中的任何一個，包括任意體液，例如血液、腦脊液、咳出液、胃液、陰道分泌物和口腔粘膜液；和排泄物，例如尿和糞。也可以使用DNA芯片對能被細(xì)菌污染的所有介質(zhì)進(jìn)行檢測。此類介質(zhì)包括食物、飲用水和天然環(huán)境中的水，例如溫泉水，其能通過污染引起食物中毒；空氣清潔器等的濾膜等。進(jìn)/出口中應(yīng)該檢疫的動物和植物也可用作感興趣的分析物。當(dāng)上述樣品能被直接用于和DNA芯片反應(yīng)時，它被用作和DNA芯反應(yīng)的分析物并且隨后分析反應(yīng)的結(jié)果。可選擇地，當(dāng)樣品不能直接和DNA芯片反應(yīng)時，如果需要，可對樣品進(jìn)行抽提、純化和其它處理來獲得目標(biāo)物質(zhì)，并隨后提供作為分析物來和DNA芯片進(jìn)行反應(yīng)。例如，當(dāng)樣品含有目標(biāo)核酸時，從樣品中制備提取物(所述提取物假定含有這種目標(biāo)核酸)，并隨后清洗、稀釋或等等來獲得分析物溶液，隨后和DNA芯片進(jìn)行反應(yīng)。進(jìn)一步，當(dāng)目標(biāo)核酸包括在通過進(jìn)行多種擴(kuò)增操作(例如PCR擴(kuò)增)獲得的分析物中時，該目標(biāo)核酸可以被擴(kuò)增并隨后和DM芯片反應(yīng)。擴(kuò)增的核酸的此類分析物包括如下(a)通過使用設(shè)計用于檢測16SrRNA基因的PCR反應(yīng)引物制備的擴(kuò)增的分析物。(b)通過額外的PCR反應(yīng)等從PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中制備的擴(kuò)增的分析物。(c)通過PCR之外的擴(kuò)增方法制備的分析物。(d)通過各種不同標(biāo)記方法中的任一種方法進(jìn)行標(biāo)記以便可視化的分析物。進(jìn)一步，用于制備固定有探針的載體(例如DNA芯片)的載體可以是滿足進(jìn)行感興趣的固相/液相反應(yīng)的特性的那些載體中的任意一個。載體的例子包括平坦基板例如玻璃基板、塑料基板和硅片；具有不規(guī)則表面的三維結(jié)構(gòu)；和球形體例如珠，和竿、帶和絲狀結(jié)構(gòu)。載體的表面可以被處理，這樣探針能固定在它上面。特別地，從重復(fù)性的觀點上看，通過在其表面引入官能團(tuán)使其能發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而制備的載體具有較好的形式，因為在雜交反應(yīng)過程中探針被穩(wěn)定地結(jié)合?？梢允褂枚喾N方法固定探針。此類方法的一個例子是使用馬來酰亞胺基團(tuán)和巰基(-SH)基團(tuán)的組合。在這個方法中，巰基(-SH)基團(tuán)結(jié)合到探針末端，并且事先進(jìn)行加工以使載體(固體)表面具有馬來酰亞胺基團(tuán)。由此，供給到載體表面上的探針的巰基和載體表面上的馬來酰亞胺基團(tuán)反應(yīng)，形成共價鍵，由此探針被固定。能利用如下過程引入馬來酰亞胺基團(tuán)首先讓玻璃基板和氨基硅烷偶聯(lián)劑發(fā)生反應(yīng)，并隨后通過氨基基團(tuán)和EMCS試劑(N-(6-馬來酰亞氨基己酰氧基)琥珀酰亞胺，購自Dojindo公司)反應(yīng)將馬來酰亞胺基團(tuán)引入到玻璃基板上。能在通過自動DNA合成儀合成DNA時使用5'-巰基-修飾物C6(購自GlenResearch公司)將巰基引入到DNA上。代替巰基和馬來酰亞胺基團(tuán)的上述組合，還可以使用，例如環(huán)氧基(在固相上)和氨基(核酸探針末端)的組合作為官能團(tuán)的組合用于固定。使用不同種類的硅烷偶聯(lián)試劑進(jìn)行表面處理也是有效的。使用其中引入了能和通過硅烷偶聯(lián)試劑引入的官能團(tuán)反應(yīng)的官能團(tuán)的探針。還可以使用施用帶有官能團(tuán)的樹脂的方法。能通過基因檢測方法，使用本發(fā)明的固定有探針的載體對傳染性疾病病原性細(xì)菌的基因進(jìn)行檢測，所述基因檢測方法包括步驟(i)讓分析物和上面固定有本發(fā)明的探針的固定有探針的栽體反應(yīng)；(iU檢測分析物中的核酸和固定有探針的載體上的探針之間的反應(yīng)存在與否，或檢測分析物中的核酸和固定有探針的載體上的探針之間的雜交反應(yīng)強(qiáng)度；和(iii)當(dāng)檢測到探針和分析物中的核酸的反應(yīng)時，指明已經(jīng)和分析物中的核酸反應(yīng)的探針，并且根據(jù)探針的核酸序列指明傳染性疾病病原性細(xì)菌的基因。固定在固定有探針的載體上的探針是上述(A)到(D)中的至少一個。在載體上，根據(jù)檢測目的，用于檢測除丙酸桿菌(屬)以外的其他細(xì)菌菌種的探針可以作為其它探針被固定。此時，其它探針可以是能檢測丙酸桿菌(屬)以外的菌菌種而不引起交叉污染的那些探針，并且使用這樣的探針能同時高準(zhǔn)確性地檢測多種細(xì)菌菌種。進(jìn)一步，如上所述，當(dāng)通過PCR擴(kuò)增分析物中的傳染性疾病病原性細(xì)菌的16SrRNA基因序列，并且將其提供為和探針栽體反應(yīng)的樣品時，可以使用用于檢測所述傳染性疾病病原性細(xì)菌的引物組。該引物組適當(dāng)?shù)匕ㄟx自下述(l)到(21)所示的寡核普酸中的至少一個，和選自下述(22)到(28)所示的寡核苷酸中的至少一個，更合適地包括下述(1)到(28)所示的所有寡核苷酸Q)具有5，gcggcgtgcctaatacatgcaag堿基序列的寡核苷酸；(2)具有5，gcggcaggccUacacatgcaag堿基序列的寡核苷酸；(3)具有5，gcggcaggcttaacacatgcaag堿基序列的寡核苷酸；(4)具有5，gcggtaggcctaacacatgcaag堿基序列的寡核苷酸；(5)具有5，gcggcgtgctUacacatgcaag堿基序列的寡核苷酸；(6)具有5，gcgggatgccttacacatgcaag堿基序列的寡核苷酸；(7)具有5，gcggcatgcctUcac"gcaag堿基序列的寡核苷酸；(8)具有5，gcggcatgcttaacacatgcaag堿基序列的寡核苷酸；(9)具有5，gcggcgtgcttaatacatgcaag堿基序列的寡核苷酸；(10)具有5，gcggcaggcctaatacatgcaag3，(SEQIDNO:10)的堿基序列的寡核苷酸；(11)具有5，gcgggatgctttacacatgcaag3，(SEQIDNO:11)3，(SEQIDNO:1)的3，(SEQIDNO:2)的3，(SEQIDNO:3)的3，(SEQIDNO:4)的3，(SEQIDNO:5)的3，(SEQIDNO:6)的3，(SEQIDNO:7)的3，(SEQIDNO:8)的3，(SEQIDNO:9)的的堿基序列的寡核苷酸；(12)具有5，gcggcgtgcctaacacatgcaag3，的堿基序列的寡核苷酸；Q3)具有5，gcggcgtgc"aacacatgcaag3，的堿基序列的寡核苷酸；(14)具有5，gcggcatgccUacacatgcaag3，的堿基序列的寡核苷酸；(15)具有5，gcggcgcgcctaacacatgcaag3，的堿基序列的寡核苷酸；(16)具有5，gcggcgcgcttaacacatgcaag3，的堿基序列的寡核苷酸；(17)具有5，gcgtcatgccUacacatgcaag3，的堿基序列的寡核苷酸；U8)具有5，gcgataggctUacacatgcaag3，的堿基序列的寡核苷酸；(19)具有5，gcgacaggcttaacacatgcaag3，的堿基序列的寡核苷酸；(20)具有5，gctacaggctUacacatgcaag3，的堿基序列的寡核苷酸；(21)具有5，acagaEitgctUacacatgcaag3，的堿基序列的寡核苷酸；(22)具有5，atccagccgcaccttccgatac3，的堿基序列的寡核苷酸；(23)具有5，atccaaccgcaggttcccctac3，的堿基序列的寡核苷酸；(24)具有5，atccagccgcaggttcccctac3，的堿基序列的寡核苷酸；(25)具有5，atccagccgcaccttccggtac3，的堿基序列的寡核苷酸；(SEQIDNO:12)卿IDNO:13)卿IDNO:14)卿IDNO:15)卿IDNO:16)卿IDNO:17)卿IDNO:18)卿IDNO:19)卿IDNO:20)(SEQIDNO:21)卿IDNO:22)(SEQIDNO:23)(SEQIDNO:24)(SEQIDNO:25)(26)具有5,atccagcgccaggttcccctag3，(SEQIDNO:26)的堿基序列的寡核苷酸；(27)具有5，atccagccgcaggttctcctac3，(SEQIDNO:27)的堿基序列的寡核苷酸；和(28)具有5，atccagccgcacgttcccgUc3，(SEQIDNO:28)的堿基序列的寡核苷酸。在它們中，設(shè)計用于使丙酸桿菌(屬)擴(kuò)增的引物是下述引物組(5)具有5，gcggcgtgcttaacacatgcaag3，(SEQIDNO:5)的堿基序列的寡核苷酸；和(25)具有5，atccagccgcaccttccggtac3，(SEQIDNO:25)的堿基序列的寡核苷酸。為了檢測丙酸桿菌(屬)，至少可以包括這樣的引物。通過對SEQIDNO.1到28的每個序列與包括佛羅伊登氏丙酸桿菌(ATCC6207，SEQIDNO.95)的16SrRNA編碼區(qū)的DNA序列進(jìn)^f亍比較，能評價和驗證各個引物(l)到(28)對于丙酸桿菌(屬)的擴(kuò)增的效用。使用至少一種如上所述的探針和用于檢測該探針和分析物中的核酸的反應(yīng)的試劑，可以構(gòu)建用于檢測傳染性疾病病原性細(xì)菌的試劑盒。試劑盒中的探針可以優(yōu)選地被提供為如上所述的固定有有探針的載體。進(jìn)一步地，檢測試劑可以含有標(biāo)記物以檢測反應(yīng)或含有用于進(jìn)行作為預(yù)處理的擴(kuò)增的引物。實施例在下文中，通過使用用于檢測傳染性疾病病原性細(xì)菌的探針以檢測丙酸桿菌(屬)的實施例對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的描述。(實施例1)在這個實施例中，將描述使用兩步PCR的微生物檢測。l.探針DNA的制備示于表1的核酸序列被設(shè)計作為用于檢測丙酸桿菌(屬)的探針。具體而言，下面的探針堿基序列選自于編碼丙酸桿菌(屬)16srRNA基因的基因組部分。這種探針堿基序列被設(shè)計為它能具有對所迷細(xì)菌的非常高的特異性，并且可以期望在探針堿基序列沒有變化的情況下具有足夠的雜交靈敏度。探針堿基序列不必總是與表1所示的那些完全匹配。除了具有表1所示堿基序列的探針以外，還可以使用包括表l所示堿基序列的具有20到30個堿基長度的探針。不過，應(yīng)該確保在這樣的探針中的除表1所示部分以外的其它堿基序列部分對檢測準(zhǔn)確性沒有影響。表1微生物名稱丙酸桿菌(屬)探針號SE(JIDNO.序列115-G—PRO_01945'GCTTTCGATACGGGTTGACTTGAGGAA3'對于具有表1所示堿基序列的每種探針，在依照常規(guī)方法進(jìn)行合成后在核酸的5'末端引入作為用于將探針固定在DNA芯片上的官能團(tuán)的巰基。在引入官能團(tuán)后，進(jìn)行純化和凍干。用作內(nèi)標(biāo)物的凍干的探針儲存于-3(TC水箱。2.PCR引物的制備2-l.制備用于分析物擴(kuò)增的PCR引物作為用于病原性細(xì)菌檢測的16SrRNA基因(目標(biāo)基因)擴(kuò)增PCR引物，設(shè)計了如下面的表2所示的核酸序列。具體地，設(shè)計了特異性擴(kuò)增編碼16SrRNA的基因組部分的引物組，即，位于堿基長度為1400到1700的16SrRNA編碼區(qū)的兩個末端部分的、特定解鏈溫度盡可能相等的引物。為了同時擴(kuò)增列于下述(l)到(80)的多個不同細(xì)菌菌種、突變體或基因組中的多個16SrRNA基因，設(shè)計了多種類型的引物。注意，引物組不局限于表2所示的引物組，只要該引物組能共同地擴(kuò)增幾乎全長的所述病原性細(xì)菌16SrRNA基因即可。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>(1)金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(2)表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)(3)大腸埃希氏桿菌(Escherichiacoli)(4)肺炎克雷白氏桿菌(Klebsiellapneumoniae)(5)銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)(6)粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)(7)肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)(8)流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)(9)P月溝腸桿菌(Enterobactercloacae)(10)糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)(11)溶血葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticus)(12)人葡萄球菌(Staphylococcushominis)(13)腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)(14)無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)(15)變異鏈球菌(Streptococcusmutans)(16)化膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)(17)血鏈球菌(Streptococcussanguis)(18)鳥腸球菌(Enterococcusavium)(19)屎腸球菌(Enterococcusfaecium)(20)焚光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)(21)惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)(22)洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderiacepacia)(23)嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)(24)鮑氏不動桿菌(Acinetobacterbauraannii)(25)乙酸^丐不動軒菌(Acinetobactercalcoaceticus)(26)木糖氧化產(chǎn)堿菌(Achromobacterxylosoxidans)(27)創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)(28)豬霍亂沙門(氏)菌(Salmonellacholeraesuis)(29)弗勞地氏檸檬桿菌(Citrobacterfreundii)(30)產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)(31)產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)(32)蜂房哈夫尼菌(Hafniaalvei)(33)液化沙雷氏菌(Serratia1iquefaciens)(34)奇異變形菌(Proteusrairabilis)(35)普通變形菌(Proteusvulgaris)(36)摩氏摩才艮(氏)菌(Morganellamorganii)(37)雷氏普羅威登斯菌(Providenciarettgeri)(38)嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila):39)溫和氣單胞菌(Aeromonassobria):40)P月道加德納氏菌(Gardnerellavaginalis):41)白喉棒狀桿菌(Corynebacteriumdiphtheriae):42)侵肺軍團(tuán)菌(Legionellapneumophila):43)蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)44)枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis):45)堪薩斯氏分枝桿菌(MycobacteriumkansasU)46)胞內(nèi)分枝桿菌(Mycobacteriumintracellulare)47)龜分支桿菌(Mycobacteriumchelonae):48)星狀諾卡氏菌(Nocardiaasteroides)49)脆弱類桿菌(Bacteroidesfragilis)50)多形類桿菌(BacteroidesthetaioUomicron)51)難辨梭狀芽孢桿菌(Clostridiumdifficile)52)產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(Clostridiumperfringens)53)遲緩埃格特菌(Eggerthellalenta)54)壞死梭桿菌(Fusobacteriumnecrophorum)55)核粒梭桿菌(Fusobacteriumnucieatum)56)嗜酸乳芽孢桿菌(Lactobacillusacidophilus)57)普氏厭氧球菌(Anaerococcusprevotii)58)不解糖嗜胨菌(Peptoniphilusasaccharolyticus)59)不解糖外啉單胞菌(Porphyromonasasaccharolytica)60)牙齦吟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis)61)棲牙普雷沃氏菌(Prevotelladenticola):62)痤齊丙酸桿菌(Propionibacteriuraacnes):63)約氏不動桿菌(Acinetobacterjohnsonii):64)瓊氏不動桿菌(Acinetobacterjunii):65)舒氏氣單胞菌(Aeromonasschubertii):66)維羅納氣單胞菌(Aeromonasveronii):67)吉氏類桿菌(Bacteroidesdistasonis):68)普通類桿菌(Bacteroidesvulgatus):69)大腸彎曲桿菌(Campylobactercoli):70)豚腸彎曲桿菌(Campylobacterhyointestinalis):71)空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni):72)7K生黃桿菌(Flavobacteriumaquatile):73)7jc氏黃桿菌(FlavobacteriummizuUii):74)黑色消化球菌(Peptococcusniger):75)親合丙酸桿菌(Propionibacteriumavidum):76)佛羅伊登氏丙酸桿菌(Propionibacteriumfreudenreichii)〔77)顆粒丙酸桿菌(Propionibacteriumgranulosum)(78)丁酸梭狀芽孢桿菌(Clostridiumbutyricum)(79)Flavobacteriumhydatis(80)約氏黃桿菌(Flavobacteriumjohnsoniae)在合成后通過高效液相色語(HPLC)純化表2所示引物。將21個正向引物和7個反向引物混合并溶于TE緩沖液，每個引物的終濃度為10pmo1/jn1。2-2.標(biāo)記式PCR引物的制備采用和上述分析物擴(kuò)增引物相似的方式，具有如下面表3所示的序列的寡核苷酸用作用于進(jìn)行標(biāo)記的引物。表3引物號SEQIDNO.序列Cy3R9-l295zTACCTTGTTACGACTTCACCCCACy3R9-2305'TACCTTGTTACGACTTCGTCCCA3'Cy3R9-331TACCTTGTTACGACTTAGTCCCA3'Cy3R9-4325'TACCTTGTTACGACTTAGCCCCA3'Cy3R9-5335'TACCTTGTTACGACTTAGTCCTA3'Cy3R9-6345'TACCTTGTTACGACTTAGCCCTA3'用熒光染料Cy3標(biāo)記表3所示引物。合成后通過高效液相色譜(HPLC)純化引物。將所述6個標(biāo)記的引物混合并溶于TE緩沖液中，使每個引物的終濃度為10praol/ju1。3.丙酸桿菌(屬)基因組DM(模型分析物)的提取3-1.微生物培養(yǎng)和基因組DNA提取首先，按照常規(guī)方法培養(yǎng)丙酸桿菌(屬)的3種菌種痤瘡丙酸桿菌(JCM6473)、親和丙酸桿菌(ATCC25577)和佛羅伊登氏丙酸桿菌(ATCC6207)。使用核酸純化試劑盒(FastPrepFP100AFastDNAKU，F(xiàn)unakoshi公司制造)對這種微生物培養(yǎng)基施行基因組DNA的提取和純化。3-2.收集的基因組DNA的檢測按照常規(guī)方法對收集的微生物丙酸桿菌(屬)的基因組DM進(jìn)行瓊脂糖電泳和260/280nm吸收測定。因此，檢測了質(zhì)量(低分子核酸的混入量和分解程度)和收集量。在這個實施例中，大約收集了10pg的基因組DNA。沒有觀察到基因組DM的降解或rRNA污染。收集的基因組DM以50ng/u1的終濃度溶于TE緩沖液中，并用于下面的實驗。4.DNA芯片的制備4-1.清潔玻璃基板將合成石英制備的玻璃基板(尺寸25mmx75mrax1mm，購自IiyamaPrecisionGlass公司)放在耐熱和堿的架子中并浸泡在已經(jīng)調(diào)節(jié)到具有預(yù)定濃度的清潔溶液中進(jìn)行超聲波清洗。玻璃基板在清潔溶液中持續(xù)浸泡一夜并用超聲波清洗20分鐘。取出基板，用純水輕輕沖洗，并在高純水中用超聲波清洗20分鐘。將該基板在加熱到8(TC的1N氫氧化鈉水溶液中浸泡IO分鐘。再次用純水清洗和用高純水清洗。如此制備了DNA芯片的石英玻璃基板。4-2.表面處理硅烷偶聯(lián)試劑KBM-603(購自Shin-EtsuSilicone公司)以1重量。/。(wt。/。)的濃度溶于純水，并在室溫下攪拌2小時。清潔的玻璃基板浸泡到硅烷偶聯(lián)試劑水溶液中并在室溫下持續(xù)放置20分鐘。取出玻璃基板。用純水輕輕沖洗其表面，并通過噴射氮氣至基板的兩個表面上來進(jìn)行干燥。干燥的基板在烘箱中以120。C烘烤1小時來完成偶聯(lián)試劑處理，由此氨基基團(tuán)被引入到基板表面上。下一步，N-馬來酰亞氨基己酰氧基琥珀酰亞胺(下文簡寫為EMCS)溶于二甲亞砜和乙醇的1:1(體積比)溶劑混合物中，以獲得0.3mg/ml的終濃度。結(jié)果，制備了EMCS溶液。此處，EMCS是N-(6-馬來酰亞氨基己酰氧基)琥珀酰亞胺，購自Dojindo。烘烤的玻璃M保持靜置并冷卻，并在室溫下浸泡到制備好的EMCS溶液中2小時。通過這個處理，通過硅烷偶聯(lián)試劑引入到基板表面上的氨基基團(tuán)和EMCS中的琥珀酰亞胺基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，將馬來酰亞胺基團(tuán)引入到玻璃基板表面上。使用上述溶有EMCS的溶劑混合物清洗從EMCS溶液中取出的玻璃基板。用乙醇進(jìn)一步清洗玻璃M并在氮氣氛圍中干燥。4-3.探針DNA將在實施例1的階段l(探針DNA的制備)中制備的微生物檢測探針溶于純水。溶液配制為終濃度(溶解在墨水中時)為10pM。隨后，溶液被凍干以去除水。4-4.用BJ打印機(jī)吐出DNA并結(jié)合到基板上制備含有7.5-wt。/。丙三醇、7.5-wt。/。硫二甘醇、7.5-wt。/。尿素和1.0-wt%AcetylenolEH(購自KawakenFineChemicals公司)的7jc溶液。事先制備的探針(表l)按特定濃度溶于該溶劑混合物中。用所得到的DNA溶液充滿噴墨打印才幾(商品名BJF-850,購自Canon/>司)的墨盒，并安裝到打印頭上。此處所用的噴墨打印機(jī)事先已經(jīng)被改良，能在平板上打印。當(dāng)根據(jù)預(yù)定的文件創(chuàng)建方法輸入打印模式時，可將大約5皮升DNA溶液以大約120ym的間j巨點才羊。通過使用改良的噴墨打印機(jī)來對一片玻璃基板進(jìn)行打印操作以制備陣列。在確證打印已經(jīng)確實完成后，玻璃基板在潮濕的倉室中靜置30分鐘，讓玻璃基板表面上的馬來酰亞胺基團(tuán)和核酸探針末端的巰基基團(tuán)反應(yīng)。4-5.清洗反應(yīng)30分鐘后，使用含有100mMNaCl的10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.O)清洗表面殘留的DNA溶液，由此獲得DNA芯片，在該芯片中單鏈DNA被固定在玻璃基板的表面上。5.分析物的擴(kuò)增和標(biāo)記5-1.分析物的擴(kuò)增第一PCR提供作為分析物的微生物基因的擴(kuò)增反應(yīng)(第一PCR)和標(biāo)記反應(yīng)(第二PCR)如下面表4所示。表4AmpliTaqGoldLD(5.0U/pL)引物混合物<FR21x7>正向引物(x21[每種0.625yM])反向引物(x07[每種1.875pM])10xPCR緩沖液MgCl2(25mM)dNTP混合物(每種2.5mM)模板H20_0.5pL(2.5單位/管)2.0pL(最終每種1.25pmol/管)(最終每種3.75pmol/管)5.0nL(最終l倍濃度)8.0nL(最終4.0mM)4.0pL(最終每種200jliM)可變直到50pL_50^使用市售的熱循環(huán)儀根據(jù)圖1所示的操作流程進(jìn)行具有上述的組成的反應(yīng)溶液的擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，使用純化柱(QIAquickPCRPurificationKit,購自QIAGEN公司)純化引物。隨后進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的定量測定。5-2.標(biāo)記反應(yīng)第二PCR使用市售的熱循環(huán)儀根據(jù)圖組成的反應(yīng)溶液的擴(kuò)增反應(yīng)。表5PremixTaq(ExTaqVersion)Cy3-標(biāo)記的反向引物混合物Cy3R9混合物(x06[每種10pM])模板H202所示操作流程進(jìn)行具有表5所示25nL0.83iaL(最終每種8.3pmol/管)可變(最終30ng/管)直到50HiL總計50pL反應(yīng)結(jié)束后，^f吏用純4匕才主(QIAquickPCRPurificationKit,購自QIAGEN)純化引物來獲得標(biāo)記的分析物。6.雜交使用在階段4(DNA芯片的制備)制備的DNA芯片和在階段5(分析物的擴(kuò)增和標(biāo)記)制備的標(biāo)記的分析物進(jìn)行檢測反應(yīng)。6-1.DNA芯片的封閉牛血清白蛋白(BSA，F(xiàn)ractionV:購自Sigma公司)溶于100mMNaCl/10mM磷酸鹽緩沖液中，獲得1wt%的溶液。隨后，在階段4(DNA芯片的制備)制備的DNA芯片在室溫下在所述溶液中浸泡2小時以進(jìn)行封閉。封閉結(jié)束后，使用如下所述的清洗溶液清洗芯片，用純水沖洗，并用旋轉(zhuǎn)式干燥機(jī)脫水。清洗溶液含有0.lw"/。十二烷基硫酸鈉(SDS)的2xSSC溶液(NaC1300mM，檸檬酸鈉(檸檬酸三鈉二水合物，C6H5Na3.2H20)30mM，pH7.0)。6-2.雜交脫水的DNA芯片置于雜交4義(HybridizationStation,購自GenomicSolutions公司)。在雜交溶液中在下述條件下進(jìn)行雜交反應(yīng)。6-3.雜交溶液6xSSPE/10。/。甲酰胺/目標(biāo)(所有第二PCR產(chǎn)物)/0.05wt%(6xSSPE:NaCl900raM，NaH2P04H2050mM，EDTA6mM，pH，7.4)6-4.雜交條件65匸3分鐘，55°C4小時，用2xSSC/0.1%SDS在50。C下清洗，用2xSSC/0.1%SDS在20。C下清洗(用H20沖洗手工)，并旋轉(zhuǎn)甩干。7.微生物基因組檢測(熒光測定法)雜交反應(yīng)結(jié)束后用DNA芯片熒光檢測器(GenePix4000B，購自Axon公司)對DM芯片進(jìn)行熒光測定。結(jié)果，能夠具有足夠信號地、可高重復(fù)性地檢測出丙酸桿菌(屬)。熒光測定結(jié)果顯示于下面的表6。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>8.和其它細(xì)菌菌種的雜交為了證實表1所示探針組能特異性地只和丙酸桿菌(屬)雜交這一事實，和大腸埃希氏桿菌(JCM1649)的雜交反應(yīng)的結(jié)果顯示于下面的表7。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>9.結(jié)果如從上面的描述可以看出的，制備了固定有能以特異性的方式只檢測丙酸桿菌(屬)的探針的DNA芯片。進(jìn)一步地，使用這種DNA芯片能鑒定傳染性疾病病原性細(xì)菌，因此來自于微生物的DNA探針的問題能被解決。換句話說，所述寡核苷酸探針能被大量地化學(xué)制備，同時它的純化或濃縮能被控制。此外，對于微生物菌種的分類，能夠提供探針組，所述探針組能匯總性地檢測相同屬的菌林，并能將它們從其它屬細(xì)菌中區(qū)別性地檢測出來。進(jìn)一步地，除了如上述的大腸埃希氏桿菌以外，對提取自上述(l)到(80)所示的細(xì)菌的每種核酸進(jìn)行雜交反應(yīng)。其結(jié)果證實，除了丙酸桿菌(屬)以外，對于那些細(xì)菌中的每種細(xì)菌，和大腸桿菌相似，沒有觀察到實質(zhì)上的反應(yīng)。列于上述(l)到(80)的細(xì)菌是敗血病病原性細(xì)菌，并且它們兒乎覆蓋了過去在人血液中檢測到的所有的病原性細(xì)菌。因此，通過使用本實施方案的引物，血液中的傳染性疾病病原性細(xì)菌的核酸能被提取出來并隨后和本發(fā)明的探針進(jìn)行雜交反應(yīng)，由此能夠以高準(zhǔn)確性進(jìn)行丙酸桿菌(屬)的鑒定。進(jìn)一步地，根據(jù)上述的實施例，通過完全地檢測傳染性疾病病原性細(xì)菌的16SrRNA基因，能夠以高準(zhǔn)確性且有效地確定傳染性疾病病原性細(xì)菌的存在。(實施例2)能同時確定多種細(xì)菌菌種的DNA芯片的制備按照和實施例1的階段l(探針DNA的制備)相似的方式，制備具有顯示于下面表8的堿基序列的探針。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>嗜水^胞菌(Aeromonashydrophila)GCCTAATACGTATCAACTGTGACGTTAC92GCCTAATACGTGTCAACTGTGACGTTAC93丙酸桿菌(屬)(Propionibacteriura)GCTTTCGATACGGGTTGACTTGAGGAA94這些探針能特異性地檢測列于表中左欄的特定細(xì)菌菌種(或?qū)?，正如實施例1中的能特異性地針對丙酸桿菌(屬)的探針一樣。進(jìn)一步地，這些探針被設(shè)計為它們具有和目標(biāo)相同的Tra值、和非目標(biāo)序列相同的反應(yīng)性等，因此在相同的反應(yīng)條件下，感興趣的細(xì)菌菌種的核酸能被特異性地檢測。對于各個探針，按照和實施例1的階段4-3相似的方式制備探針溶液。隨后，使用在實施例1的階段4-4中使用的噴墨打印機(jī)將每個探針溶液吐出到相同的基板上，形成具有以大約120mm的間隔排列的各個探針的點的多個DNA芯片。按照和實施例1的階段6相似的方式將所述DNA芯片之一用于和提取自丙酸桿菌(屬)的核酸雜交。結(jié)果，特異性檢測丙酸桿菌(屬)的探針點顯示出和實施例1幾乎相等的熒光強(qiáng)度。相反，其它探針的點顯示非常低的熒光強(qiáng)度。進(jìn)一步，使用其它制備的DNA芯片和表8所列的除丙酸桿菌(屬)以外的細(xì)菌雜交。結(jié)果，丙酸桿菌(屬)的點顯示非常低的熒光強(qiáng)度，同時針對感興趣的細(xì)菌菌種的探針的點顯示非常高的焚光強(qiáng)度。因此，證實了本實施例制備的DNA芯片還能同時測定列于表8的除丙酸桿菌(屬)以外的16個細(xì)菌菌種和6個屬。通過同時使用針對目標(biāo)種和相應(yīng)屬(例如丙酸桿菌屬和痤瘡丙酸桿菌)的探針，能夠高度準(zhǔn)確地鑒定目標(biāo)種或同時鑒定相同屬的多個目標(biāo)種。(實施例3)當(dāng)分析物中存在多種細(xì)菌菌種時，嘗試了使用實施例2所制備的DNA芯片進(jìn)行檢測。制備其中培養(yǎng)有作為丙酸桿菌(屬)的痤瘡丙酸桿菌和遲緩埃格特菌的培養(yǎng)基，并進(jìn)行和實施例1相同的處理來和DNA芯片反應(yīng)。結(jié)果，只有具有SEQIDNO.49、50、51、87、88、89和94的探針點顯示高熒光強(qiáng)度，因此能同時證實這些細(xì)菌的共同存在。本發(fā)明不局限于上述實施例，并且在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)可以進(jìn)行多種改變和修飾。因此為了向公眾通告本發(fā)明的范圍，指定了下面的權(quán)利要求。雖然已經(jīng)用例示性實施方案描述了本發(fā)明，不過應(yīng)該知道該發(fā)明不局限于公布的例示性實施方案。下面的權(quán)利要求的范圍符合使之包括所有這些修改和相同的結(jié)構(gòu)和功能的最廣泛的解釋。<110〉佳能株式會社<120>探針、探針組、固定有探針的載體和基因檢測方法<130〉10048413CN01<150>JP2006-306004〈151〉2006-11-10〈160>95<170〉Patentlnversion3.1〈210〉1<211>23<212>腿<213>人工序列<220〉<223〉引物〈400〉1gcggcgtgcctaatacatgcaag23<210〉2〈211〉23<212〉DNA<213>人工序列〈220〉<223〉引物<400〉2gcggcaggcctaacacatgcaag23<210>3<211〉23<212>DNA<213〉人工序列<220><223〉引物〈400〉3gcggcaggcttaacacatgc肪g〈210〉4<211〉23<212〉DNA<213〉人工序列<220>〈223〉引物<400〉4gcggtaggcctaacacatgcaag<210>5<211>23<212〉DNA<213>人工序列<220〉<223>引物<400〉5gcggcgtgcttaacacatgcaag〈210〉6<211〉23<212〉DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>6gcgggatgccttacacatgcaag〈210>7說明書第29/55頁232323<211〉23<212〉DNA<213>人工序列<220><223〉引物<400>7gcggcatgccttacacatgcaag23<210>8<211>23<212>DNA<213〉人工序列<220><223>引物<400〉8gcggcatgcttaacacatgcaag23<210〉9<211>23<212>DNA<213〉人工序列<220><223〉引物〈400>9gcggcgtgcttaatacatgcaag23<210〉10〈211〉23<212>DNA<213>人工序列<220><223〉引物〈400>10gcggcaggcctaatacatgcaag<210>11<211〉23<212>腿<213〉人工序列〈220〉<223>引物<400>11gcgggatgctttacacatgcaag<210〉12〈211〉23<212〉DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>12gcggcgtgcctaacacatgc幼g<210>13<211〉23<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<223>引物<400>13gcggcgtgcataacacatgcaag<210>14<211〉23<212>DNA<213>人工序列23232323<220><223〉引物<400〉14gcggcatgcct肌cacatgcaag23<210>15<211〉23<212〉DNA<213>人工序列<220><223〉引物<400>15gcggcgcgcctaacacatgcaag23<210〉16<211>23<212〉DNA<213〉人工序列〈220〉<223>引物<400〉16gcggcgcgcttaacacatgcaag23<210>17<211〉23<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400〉17gcgtcatgcctaacacatgcaag23<210>18<211>23〈212〉DNA<213〉人工序列<220><223〉引物<400〉18gcgataggcttaacacatgcaag23<210〉19<211>23〈212〉DNA<213>人工序列<220><223>引物<400〉19gcga.caggcttaacacatgcaag23<210>20<211〉23<212>DNA<213>人工序列<220>〈223〉引物<400>20gctacaggcttaacacatgcaag23<210〉21<211>23<212〉DNA<213>人工序列<220><223〉引物〈400〉21acagaatgcttaacacatgc肌g<210>22<211>22<212〉DNA<213>人工序列<220><223〉引物<400〉22atccagccgcaccttccgatac〈210〉23〈211〉22<212〉DNA<213〉人工序列<220><223〉引物<400〉23atccaaccgcaggttcccctac<210〉24<211>22<212>DNA<213〉人工序列<220><223>引物<400〉24atccagccgcaggttcccctac<210〉25<211〉22<212>DNA<213>人工序列23222222<220〉<223〉引物<400>25atccagccgcaccttccggtac<210〉26<211〉22<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>26atccagcgccaggttcccctag<210>27<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223〉引物<400>27atccagccgcaggttctcctac<210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chii)<400〉95ctcaggacgaacgctggcggcgtgcttaacacatgcaagtcggacggt肌ggcccctttc60ggggggtacacgagtggcgaacgggtgagt犯cacgtgaggaacgtgcccttgacttcgg120tatagctccaggaaactggtggtaatcccgaatatgagcctggcctgcatgggtcgggtt180gga^gctttatgcggtcaggg3tcgtctcgcggcctatcagcttgttggtggggt肌tg240gcctaccaaggcagcgacgggtagccggcctgagagggtgaccggccacattgggactga300gatacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagc360ctgatgcagcaacgccgcgtgcgggatgacggccttcgggttgt犯accgctttcstcca420tgacgaagcgcaagtgacggtagtgggagaagaagcaccggctaactacgtgccagcagc480cgcggtgatacgtagggtgcgagcgttgtccgg犯ttattgggcgt犯agagcttgtagg540cggttgatcacgtcggaagtgaaattccagggcttaactctgggcttgctttcgatacgg600gttgacttgsgg犯tgtagggg卿atgg3sctctcggtggagcggtgg￡i3tgcgc卿t660atcgggaagaacaccagtggcgaaggcggttctctggacatttcctgacgctgagaagcg720船agcgtggggagc犯3C3ggcttagat3ccctggtsigtccacgccgtaa3Cggtgggts780ctaggtgtgggtcccttccacggggtccgtgccgtagctaacgcattaagtaccccgcct840ggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaaggaattgacggggccccgcacaagcggcg900gagcatgcggattaattcgatgc肌cgcgaagaaccttacctgggtttgacatgtactgg960卿cgttcagagatgggcgtgcctttUggctggtacacaggtggtgcatggctgtcgtc1020agctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgc犯cgagcgcaaccctcgtccaatgtt1080gccagcagttcggctggggactcattgg.agaccgccggggccaactcggagga鄉(xiāng)tggg1140gatgaggtcaagtcatcatgccccttatgtccagggcttcacgcatgctacaatggccgg1200tacaaagagttgcgagcctgtgagggtgagcgaatctcagaaagccggtctcagttcgga1260ttggggtctgcaactcgaccccatgaagtcggagtcgctagtaatcgcagatcagcaacg1320ctgcggtgaatacgttcccggggcttgtacacaccgcccgtcaagtcatgaaagtcggta1380acacccgaagccggtggccc犯ccttttggggggagccgtc,ggtgggactggtgatt1440aggactaagtcgtaacaaggtagccgtaccggaaggtgcgg148權(quán)利要求1.用于檢測傳染性疾病病原性細(xì)菌丙酸桿菌(屬)(Propionibacterium)的基因的探針，所述探針具有下述(1)到(2)中的任一個堿基序列(1)GCTTTCGATACGGGTTGACTTGAGGAA(SEQIDNO.94)或它的互補(bǔ)序列；(2)修飾的序列，所述修飾的序列是在SEQIDNO.94的序列和它的互補(bǔ)序列中的任一個上在所述修飾的序列保持作為探針的功能的范圍內(nèi)發(fā)生堿基缺失、置換或添加而制備的。2.固定有探針的載體，其中至少一個根據(jù)權(quán)利要求1的第一探針被排列在固相載體上。3.根據(jù)權(quán)利要求2的固定有探針的載體，其中固定有探針的載體包含至少一個具有在說明書中提到的SEQIDNO.35到94中任一個的堿基序列的、固定在與第一探針相分開的位置上的第二探針。4.用于檢測丙酸桿菌(屬)的基因的試劑盒，包含根據(jù)權(quán)利要求1的探針；和用于檢測探針和目標(biāo)核酸之間的反應(yīng)的試劑。5.根據(jù)權(quán)利要求4的試劑盒，其中所述試劑含有用于擴(kuò)增丙酸桿菌(屬)的基因的引物，并且該引物包括(5)具有5，gcggcgtgcttaacacatgcaag3，(SEQIDNO:5)的堿基序列的寡核苷酸；和(25)具有5，atccagccgcaccttccggtac3,(SEQIDNO:25)的堿基序列的寡核苷酸。6.基因檢測試劑盒，包含根據(jù)權(quán)利要求3的固定有探針的栽體；和用于檢測探針和目標(biāo)核酸之間的反應(yīng)的試劑，其中該試劑含有引物，所述引物包括選自下述(1)到(21)中的至少一個寡核苷酸和選自下述(22)到(28)中的至少一個寡核苷酸(1)具有5，gcggcgtgcctaatacatgcaag3，堿基序列的寡核苷酸；(2)具有5，gcggcaggcctaacacatgcaag3，堿基序列的寡核苷酸；(3)具有5，gcggcaggcttaacacatgcaag3，堿基序列的寡核苷酸；(4)具有5，gcggtaggcctaacacatgcaag3，堿基序列的寡核苷酸；(5)具有5，gcggcgtgcttaacacatgcaag3，堿基序列的寡核苷酸；(6)具有5，gcgggatgccttacacatgcaag3，堿基序列的寡核苷酸；(7)具有5，gcggcatgcctUcacatgcaag3，堿基序列的寡核苷酸；(8)具有5，gcggcatgcttaacacatgcaag3，堿基序列的寡核苷酸；(9)具有5，gcggcgtgcttaatacatgcaag3，堿基序列的寡核苷酸；(10)具有5，gcggcaggcctaatacatgcaag3，堿基序列的寡核苷酸；(11)具有5，gcgggatgcttUcacatgcaag3，堿基序列的寡核苷酸；Q2)具有5，gcggcgtgcctaacacatgcaag3，堿基序列的寡核苷酸；(13)具有5，gcggcgtgcataacacatgcaag3，堿基序列的寡核苷酸；(14)具有5，gcggc"gccU￡icac￡itgc￡L￡ig3，堿基序列的寡核苷酸；(15)具有5，gcggcgcgcctaacacatgcaag3，(SEQIDNO:1)的(SEQIDNO:2)的(SEQIDNO:3)的(SEQIDNO:4)的(SEQIDNO:5)的(SEQIDNO:6)的卿IDNO:7)的(SEQIDNO:8)的(SEQIDNO:9)的(SEQIDNO:10)的卿IDNO:11)的(SEQIDNO:12)的(SEQIDNO:13)的(SEQIDNO:14)的(SEQIDNO:15)的堿基序列的寡核苷酸；Q6)具有5，gcggcgcgcttaacacatgcaag3，堿基序列的寡核苷酸；(17)具有5，gcgtcatgccUacacatgcaag3，堿基序列的寡核苷酸；(18)具有5，gcgaUggcttaacacatgcaag3，堿基序列的寡核苷酸；Q9)具有5，gcgacaggcttaacacatgcaag3，堿基序列的寡核苷酸；(20)具有5，gcUcaggcttaacacatgcaag3，堿基序列的寡核苷酸；(21)具有5，acagaatgcttaacacatgcaag3，堿基序列的寡核苷酸；(22)具有5，atccagccgcaccttccgatac3，堿基序列的寡核苷酸；(23)具有5，atccaaccgcaggttcccctac3，堿基序列的寡核苷酸；(24)具有5，atccagccgcaggttcccctac3，堿基序列的寡核苷酸；(25)具有5，atccagccgcaccttccggtac3，堿基序列的寡核苷酸；(26)具有5，atccagcgccaggttcccctag3，堿基序列的寡核苷酸；(27)具有5，atccagccgcaggttctcctac3，堿基序列的寡核苷酸；和(28)具有5，"ccagccgcacgttcccgtac3，堿基序列的寡核苷酸。7.用于檢測傳染性疾病病原性細(xì)菌丙酸桿菌(屬)的基罔的探針組，包括選自下述(A)到(D)的至少兩個探針(SEQIDNO:(SEQIDNO:(SEQIDNO:(SEQIDNO:(SEQIDNO:(SEQIDNO:(SEQIDNO:(SEQIDNO:(SEQIDNO:(SEQIDNO:(SEQIDNO:(SEQIDNO:(SEQIDNO:16)的17)的18)的19)的20)的21)的22)的23)的24)的25)的26)的27)的28)的(A)具有GCTTTCGATACGGGTTGACTTGAGGAA(SEQIDNO.94)所表示的堿基序列的探針；(B)具有SEQIDNO.94所表示的堿基序列的互補(bǔ)序列的探針；(C)具有修飾的序列的探針，所述修飾的序列是在SEQIDNO.94所表示的堿基序列上在使它保持用于檢測丙酸桿菌(屬)的基因的探針功能的范圍內(nèi)進(jìn)行堿基缺失、置換或添加而獲得的；和(D)具有修飾的序列的探針，所述的修飾的序列是在SEQIDNO.94所表示的堿基序列的互補(bǔ)序列上在使它保持用于檢測丙酸桿菌(屬)的基因的探針功能的范圍內(nèi)進(jìn)行堿基缺失、置換或添加而獲得的。8.固定有探針的載體，包含組成根據(jù)權(quán)利要求7的探針組的多個第一探針，其中所述多個第一探針互相間隔地排列在固相載體上。9.根據(jù)權(quán)利要求8的固定有探針的載體，其中該固定有探針的載體包含至少一個具有在說明書中提到的SEQIDNO.35到94中任一個的堿基序列的、固定在與所述多個第一探針相分開的位置上的第二探針。10.使用固定有探針的載體檢測分析物中的丙酸桿菌(屬)的基因的方法，包括步驟(i)使分析物和根據(jù)權(quán)利要求2的固定有探針的載體反應(yīng)；和(ii)檢測固定有探針的載體上的探針和分析物中的核酸之間的反應(yīng)是否存在，或檢測固定有探針的載體上的探針和分析物中的核酸之間的雜交反應(yīng)的強(qiáng)度。11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，進(jìn)一步包括通過使用包括下述寡核苷酸的引物進(jìn)行分析物中的目標(biāo)核酸的PCR擴(kuò)增的步驟(5)具有5，gcggcgtgcttaacacatgcaag3，(SEQIDNO:5)的堿基序列的寡核苷酸；和(25)具有5，atccagccgcaccttccggtac3，(SEQIDNO:25)的堿基序列的寡核苷酸。全文摘要本發(fā)明提供用于病原性細(xì)菌菌種分類的、能匯總性地檢測相同菌種的菌株和將它們從其它細(xì)菌菌種中區(qū)別性地檢測出來的核酸探針。使用SEQIDNO.94所示的堿基序列、和其互補(bǔ)序列或其修飾的序列中的任意一個，或它們中的至少兩個的組合來檢測傳染性疾病病原性細(xì)菌的基因。文檔編號C12Q1/68GK101177703SQ200710170039公開日2008年5月14日申請日期2007年11月9日優(yōu)先權(quán)日2006年11月10日發(fā)明者吉井裕人,栗林英人,福井壽文申請人:佳能株式會社