專利名稱：用于細(xì)胞培養(yǎng)的經(jīng)細(xì)胞外基質(zhì)包被的表面的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，更具體而言，本發(fā)明涉及一種適合培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)組合物包被的基底(substrate)。
背景技術(shù)：
胚胎干細(xì)胞的特征是具有高端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性、無(wú)限自我更新能力和多潛能(分化成三個(gè)胚層，即，外胚層、內(nèi)胚層和中胚層，中的任何細(xì)胞類型的能力)的細(xì)胞。因此，對(duì)于人胚胎干(hES)細(xì)胞在基因/細(xì)胞治療和再生醫(yī)藥領(lǐng)域的潛在應(yīng)用，存在極大的希望。
人胚胎干(hES)細(xì)胞的首例成功衍生見Thomson，J.A.等的報(bào)道(Science(1998)2821145-1147)。在那項(xiàng)研究中，hES細(xì)胞從胚泡內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離出來(lái)，接種在有絲分裂滅活的鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)飼養(yǎng)細(xì)胞上。最初的hES細(xì)胞衍生和培養(yǎng)起源于在過(guò)去的25年中主要針對(duì)鼠ES(mES)細(xì)胞研發(fā)的培養(yǎng)實(shí)踐。雖然MEF飼養(yǎng)層被證明是一種對(duì)于hES細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)很有效的表面，但是這種方法有些局限性。首先，存在對(duì)可能轉(zhuǎn)移到hES細(xì)胞的潛在動(dòng)物病原體的擔(dān)心，這使得它們不適合臨床應(yīng)用。第二，生長(zhǎng)和維持兩種細(xì)胞類型既不方便又很繁重。而且，在飼養(yǎng)層上轉(zhuǎn)染和遺傳操作致密的hES細(xì)胞集落是很困難的?；谒羞@些原因，已經(jīng)開始為培養(yǎng)hES細(xì)胞嘗試發(fā)展無(wú)飼養(yǎng)層的條件。
小鼠ES細(xì)胞研究已經(jīng)為我們進(jìn)一步理解hES細(xì)胞的自我更新調(diào)節(jié)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。對(duì)特定的信號(hào)調(diào)節(jié)物的操作促進(jìn)了未分化hES細(xì)胞增殖所需要的無(wú)飼養(yǎng)層條件的開發(fā)。最近的研究清楚地描繪出hES細(xì)胞能在沒(méi)有飼養(yǎng)層的條件下生長(zhǎng)，只要將它們種在適宜的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)上，并且在于飼養(yǎng)細(xì)胞上得到的條件培養(yǎng)基中或在補(bǔ)充可溶因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)即可。
細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)是一種組成多變的三維分子復(fù)合物，可以包括諸如層粘連蛋白、纖連蛋白、膠原蛋白和其他糖蛋白、透明質(zhì)酸、蛋白聚糖和彈性蛋白等成分。市售的細(xì)胞外基質(zhì)的例子包括，例如Sigma-Aldrich的ECM凝膠或Becton，Dickinson & Company的MatrigelTM基質(zhì)。MatrigelTM基質(zhì)是一種從小鼠Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)腫瘤上分離的重建的基底膜。MatrigelTM基質(zhì)主要是由層粘連蛋白、膠原蛋白IV、巢蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖組成的。MatrigelTM基質(zhì)也包含大量的生長(zhǎng)因子，例如EGF、IGF-1、PDGF、TGF-β、VEGF和bFGF。
本發(fā)明以前，眾所周知的是在ECM表面上使用來(lái)自不同類型的飼養(yǎng)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，hES細(xì)胞可以在未分化狀態(tài)增殖。使用ECM作為無(wú)飼養(yǎng)層基底培養(yǎng)hES細(xì)胞有許多優(yōu)點(diǎn)。例如，在ECM表面分離DNA、RNA和蛋白由于沒(méi)有來(lái)自飼養(yǎng)細(xì)胞的潛在污染而更加容易。此外，hES細(xì)胞的遺傳操作需要有效的轉(zhuǎn)染能力。生長(zhǎng)在Matrigel表面的hES細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率相比較生長(zhǎng)在飼養(yǎng)細(xì)胞上的要高。當(dāng)在BD MatrigelTM基質(zhì)上培養(yǎng)時(shí)，早已證明hES細(xì)胞形成″單層樣″集落，這使得細(xì)胞個(gè)體更易接近以被DNA或SiRNA滲透。雖然其他ECM蛋白也成功地用于無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)，幾項(xiàng)先前的研究表明，為了和MatrigelTM具有一樣好的性能，需要ECM蛋白的組合。此外，純化蛋白一般更加昂貴，不能象MatrigelTM那樣作長(zhǎng)期性能檢測(cè)。
盡管MatrigelTM被廣泛接受為用于hES細(xì)胞的長(zhǎng)期無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)的可行基底，它存在一項(xiàng)有關(guān)鍵性的限制。因?yàn)镸atrigelTM來(lái)自EHS腫瘤，批次之間的蛋白濃度和組成的變異性是固有的。為了限制目前研究者花費(fèi)在以周為基礎(chǔ)預(yù)篩MatrigelTM批次和包被基底的時(shí)間，針對(duì)ES培養(yǎng)提供一種穩(wěn)定的、即用型、以最佳ECM組合物包被的基底是有益的。優(yōu)選地，本培養(yǎng)系統(tǒng)將提供批次之間的一致性，這是標(biāo)準(zhǔn)化ES培養(yǎng)所需要的。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供了培養(yǎng)裝置和使用該培養(yǎng)裝置在不利用培養(yǎng)層來(lái)支持細(xì)胞生長(zhǎng)的情況下穩(wěn)定、一致地增殖基本未分化狀態(tài)的多潛能胚胎干細(xì)胞的方法，其中干細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)包被的表面上增殖。令人驚訝的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)為了增殖和維持未分化狀態(tài)的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)物，提供足夠?yàn)檫@些細(xì)胞產(chǎn)生3D基質(zhì)的量的細(xì)胞外基質(zhì)包衣(coating)不是必需的。相反地，細(xì)胞外基質(zhì)包衣只需要以足以提供飽和水平的、正確構(gòu)象的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的最小溶液濃度被吸附或結(jié)合到細(xì)胞培養(yǎng)表面即可。此處所定義的術(shù)語(yǔ)″飽和水平″意思是在包衣溶液中加入更多ECM蛋白將不會(huì)增加洗滌后在表面上吸附的ECM蛋白的量。飽和水平可用不同的方法測(cè)量，包括ELISA和集落計(jì)數(shù)。
本發(fā)明提供一種改進(jìn)的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)包被的培養(yǎng)表面，用于增殖胚胎干細(xì)胞，包括hES細(xì)胞，并在培養(yǎng)中長(zhǎng)期地維持它們的自我更新和多能性特征。
特別地，本發(fā)明提供一種細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品，包括基底，和其上的細(xì)胞外基質(zhì)包衣，其中所述包衣以足夠在所述基底的至少一個(gè)表面上提供飽和水平的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的最小溶液濃度被吸附或結(jié)合到所述基底表面。在一些實(shí)施方式中，基質(zhì)表面吸附或結(jié)合的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的總量大約為200ng/cm2至650ng/cm2。
特別地，本發(fā)明提供一種細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品，包括基底，和其上的包衣。所述包衣包括至少一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，可以通過(guò)包括所述細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和含水溶劑的包衣溶液形成，其中在包衣溶液中的總蛋白組成是大約10μg/ml至大約1mg/ml或更高。在包衣溶液中總蛋白濃度超過(guò)1mg/ml時(shí)，總蛋白可能超過(guò)所述表面的蛋白結(jié)合容量。然而，在這種情況下，任何未結(jié)合蛋白可以從所述表面洗脫。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品，包括基底，和自包衣溶液沉積于其上的包衣。該包衣溶液包括細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和含水溶劑的混合物，在包衣溶液中的總蛋白濃度是大約10μg/ml至大約1mg/ml或更高。
本發(fā)明細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品可以通過(guò)吸附到包被的表面的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的密度相對(duì)于吸附到未包被的但其它方面相同的對(duì)照表面的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的密度來(lái)表征。尤其是，本發(fā)明提供一種細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品，包括規(guī)定出一個(gè)表面的基底材料，和沉積在所述基底表面的包衣，其中的包衣包括至少一種選自如下的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白膠原蛋白、層粘連蛋白、巢蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)，吸附到所述表面的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的密度是這樣的在包被的細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品上和在未包被的對(duì)照細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品上進(jìn)行ELISA試驗(yàn)得到的光密度(OD)的比率大于約4.0，其中所述OD通過(guò)ELISA獲得。在一些實(shí)施方式中，包被的細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品相比未包被的細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品，通過(guò)ELISA得到的OD的比率約為4至5。ELISA試驗(yàn)包括(a)洗滌所述表面除去未吸附的蛋白；(b)用過(guò)量的抗所述細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的一抗接觸所述表面；(c)洗滌所述表面除去未結(jié)合的抗所述細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的一抗；(d)用過(guò)量的綴合到辣根過(guò)氧化物酶上的抗一抗的二抗接觸所述表面；(e)洗滌所述表面除去未結(jié)合的二抗；(f)使用四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物溶液接觸所述表面形成反應(yīng)混合物；(g)TMB底物氧化后(由反應(yīng)混合物中顏色改變顯示)加入酸性終止溶液到反應(yīng)混合物中；(h)在450nm波長(zhǎng)處測(cè)量OD。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在包衣溶液中約0.6μg/cm2至約6.0μg/cm2的細(xì)胞外基質(zhì)成分足夠提供足以增殖胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)裝置。在一些實(shí)施方式中，結(jié)合到表面，例如聚苯乙烯表面的蛋白的量可以從約200ng/cm2至約650ng/cm2變化，這取決于所述表面的處理和ECM蛋白的性質(zhì)。細(xì)胞外基質(zhì)包衣可以被干燥，得到含有細(xì)胞外基質(zhì)成分的一致的表面。在一個(gè)實(shí)施方案中，裝置能夠在室溫下長(zhǎng)期儲(chǔ)存。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述裝置能夠在室溫下儲(chǔ)存至少兩周。
本發(fā)明培養(yǎng)裝置與其他方法中的所見相比，在所述包被的表面上有更少的蛋白復(fù)合物聚集，且吸附到所述培養(yǎng)裝置表面的蛋白量更高。加上可以洗滌結(jié)合的細(xì)胞外基質(zhì)成分以除去未結(jié)合的蛋白，以及可以對(duì)其進(jìn)行干燥，本發(fā)明培養(yǎng)裝置可以為增殖胚胎干細(xì)胞提供在批次間更加一致的表面。
本發(fā)明也提供用于培養(yǎng)多能胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)裝置，包括i)適于培養(yǎng)細(xì)胞的容器；ii)固定濃度的細(xì)胞外基質(zhì)成分，其中所述細(xì)胞外基質(zhì)以干燥狀態(tài)存在于所述容器的至少一個(gè)表面上；和任選的，iii)適于穩(wěn)定干燥狀態(tài)的所述細(xì)胞外基質(zhì)的試劑。
本發(fā)明也提供制備本發(fā)明細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品/裝置的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括將細(xì)胞外基質(zhì)包衣溶液施加到基底表面，其中在包衣溶液中的總蛋白濃度是約10μg/ml至約1mg/ml。所述方法也包括在基底表面孵育包衣溶液；從基底上去除孵育的包衣溶液；該去除步驟后洗滌基底。最后，所述方法包括干燥洗滌后的基底；將干燥的基底滅菌。
在其它實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)方法包括步驟a)將含有固定濃度的細(xì)胞外基質(zhì)的第一液體溶液加到適于細(xì)胞培養(yǎng)的容器中，其中細(xì)胞外基質(zhì)至少包括層粘連蛋白；b)孵育容器足夠的時(shí)間以允許細(xì)胞外基質(zhì)和容器結(jié)合；c)從容器中除去所述的第一溶液；d)洗滌容器除去任何殘留在容器中的第一溶液；和e)干燥所述容器。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞外基質(zhì)包括層粘連蛋白的混合物。例如，已經(jīng)提出十一種層粘連蛋白同種型，適宜的混合物可以包括這些同種型中的兩種或更多種。在另一些實(shí)施方式中，細(xì)胞外基質(zhì)包括層粘連蛋白和巢蛋白的混合物。在再一些實(shí)施方案中，細(xì)胞外基質(zhì)包括層粘連蛋白和膠原蛋白IV的混合物。
此外，本發(fā)明提供了培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括提供一種細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品，該產(chǎn)品包括基底；和在上面沉積的來(lái)自包衣溶液的包衣。所述的包衣溶液包括細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和含水溶劑的混合物，在包衣溶液中的總蛋白濃度是約10μg/ml至約1mg/ml。所述的培養(yǎng)方法也包括將胚胎干細(xì)胞和培養(yǎng)基的懸浮液加到所述細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品中；在5％CO2、潮濕空氣、37℃下孵育胚胎干細(xì)胞，以產(chǎn)生用于胚胎干細(xì)胞擴(kuò)增的未分化的集落。
在其他一些實(shí)施方案中，增殖胚胎干細(xì)胞的方法包括步驟a)提供一種增殖多能胚胎干細(xì)胞的裝置，所述裝置包括適于培養(yǎng)細(xì)胞的容器，和固定濃度的細(xì)胞外基質(zhì)；其中所述細(xì)胞外基質(zhì)至少包括層粘連蛋白；其中細(xì)胞外基質(zhì)以干燥狀態(tài)存在于所述容器的至少一個(gè)表面上。本方法進(jìn)一步包括步驟b)將事先通過(guò)適宜的飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)而條件化的細(xì)胞培養(yǎng)基加到所述容器中；c)將未分化的多能胚胎干細(xì)胞加到所述容器中。此外，所述方法包括步驟d)在允許多能胚胎干細(xì)胞增殖的合適條件下孵育所述含有多能胚胎干細(xì)胞的容器。
圖1是膠原蛋白IV的ELISA數(shù)據(jù)的曲線圖。該圖比較自不同的ECM-包被的表面獲得的吸光度信號(hào)。
圖2是比較在不同封閉條件和溫度下在本發(fā)明ECM-包被的表面獲得的％OD信號(hào)(y軸)的柱形圖。對(duì)于x軸上所示的每一條件，第一、第二和第三個(gè)柱形(從左到右)分別代表在-20℃、4℃和室溫下獲得的信號(hào)。在該試驗(yàn)中，蔗糖以1.25％w/v濃度存在于封閉組合物中。
發(fā)明詳述 培養(yǎng)裝置
此處為增殖細(xì)胞，包括胚胎干細(xì)胞，尤其是hES細(xì)胞，和在培養(yǎng)中長(zhǎng)時(shí)間保持它們的自我更新和多能特征，提供改進(jìn)的包被的培養(yǎng)表面。因?yàn)镸atrigelTM源于EHS腫瘤，批次之間在蛋白濃度和組成上的變異性是固有的。本發(fā)明使研究者無(wú)需花費(fèi)以周為基礎(chǔ)的大量時(shí)間來(lái)預(yù)篩選MatrigelTM批次和包被基底。特別是，本發(fā)明為ES培養(yǎng)提供了一種穩(wěn)定的、即用型、使用改進(jìn)的ECM組合物包被的基底。該細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品提供批次之間的一致性，這對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)化ES培養(yǎng)是需要的。值得注意的是術(shù)語(yǔ)″細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品″、″培養(yǎng)裝置″及類似術(shù)語(yǔ)這里可以交換使用。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品，該產(chǎn)品包括基底；和由包衣溶液沉積在上面的包衣。所述包衣溶液包括細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和含水溶劑的混合物，其中在包衣溶液中總蛋白濃度為大約10μg/ml至大約1mg/ml。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在包衣溶液中總蛋白濃度為大約30μg/ml至大約300μg/ml。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，在包衣溶液中總蛋白濃度為大約30μg/ml至大約200μg/ml。
所述包衣優(yōu)選包括細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的混合物。在一些實(shí)施方案中，所述包衣包括層粘連蛋白和至少一種其它的細(xì)胞外基質(zhì)成分的混合物。在一些實(shí)施方案中，所述混合物包括多于一種的層粘連蛋白同種型。在一些其他的實(shí)施方案中，混合物包括至少一種層粘連蛋白和巢蛋白。在另一些實(shí)施方案中，混合物包括至少一種層粘連蛋白和膠原蛋白IV。
在本發(fā)明中有用的細(xì)胞外基質(zhì)分子的非限制性的例子包括纖連蛋白、玻連蛋白、膠原蛋白、層粘連蛋白、彈性蛋白、各種蛋白聚糖、糖胺聚糖等等。所述的細(xì)胞外基質(zhì)成分懸浮在液體溶液中，用于適合培養(yǎng)細(xì)胞的容器。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞外基質(zhì)成分由形成基底膜的分子組成。
如上所述，在一些實(shí)施方案中，所述包衣包括層粘連蛋白和至少一種其它的細(xì)胞外基質(zhì)成分的混合物。在一些實(shí)施方案中，所述包衣包括層粘連蛋白的混合物。
在一些其他的實(shí)施方案中，所述包衣包括層粘連蛋白/膠原蛋白IV混合物。對(duì)于層粘連蛋白/IV型膠原蛋白混合物，一種適宜的重量比是大約1.5至大約2.5。在一個(gè)實(shí)施方案中，該包衣進(jìn)一步包括一種或多種以下成分巢蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)和生長(zhǎng)因子。在一些實(shí)施方案中，所述包衣包括層粘連蛋白/巢蛋白的混合物。
在另一些實(shí)施方案中，所述包衣包括層粘連蛋白/巢蛋白的混合物。例如，適宜的包衣溶液可以通過(guò)稀釋BD層粘連蛋白/巢蛋白復(fù)合物(Becton，Dickinson & Co.；目錄號(hào)第354259號(hào))來(lái)制備。對(duì)于層粘連蛋白/巢蛋白復(fù)合物，一種合適的重量比是大約5至大約9。在一個(gè)實(shí)施方案中，該包衣可以進(jìn)一步包括選自以下的成分IV型膠原蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)、生長(zhǎng)因子和它們的組合。
在其它實(shí)施方案中，所述細(xì)胞外基質(zhì)包衣包括至少層粘連蛋白、膠原蛋白IV和巢蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，層粘連蛋白成分大約占細(xì)胞外基質(zhì)成分的40％至70％。在一個(gè)實(shí)施方案中，膠原蛋白IV成分大約占細(xì)胞外基質(zhì)成分的20％至40％。在一個(gè)實(shí)施方案中，巢蛋白成分包括或占細(xì)胞外基質(zhì)成分的大約3％至大約15％。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞外基質(zhì)成分進(jìn)一步包括硫酸肝素蛋白聚糖或硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、生長(zhǎng)因子，例如PDGF、EGF和TGF-β以及基質(zhì)金屬蛋白酶，或它們的組合。
在一些實(shí)施方案中，所述包衣至少包括層粘連蛋白、膠原蛋白IV、巢蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖。例如，包衣溶液可以通過(guò)稀釋基底膜蛋白提取物，例如BD MatrigelTM基底膜基質(zhì)(Becton，Dickinson & Co.，Bedford，MA)來(lái)制備。對(duì)于MatrigelTM，一種合適的重量比是大約5至大約9。該蛋白提取物包含以重量計(jì)，大約50-85％層粘連蛋白、5-30％膠原蛋白IV、1-10％巢蛋白(觸覺(jué)蛋白)和1-10％硫酸乙酰肝素蛋白聚糖。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述包衣溶液可以通過(guò)稀釋BD MatrigelTM基質(zhì)來(lái)制備，所述基質(zhì)包括約56％層粘連蛋白、約31％膠原蛋白IV和約8％巢蛋白，以及硫酸肝素蛋白聚糖或硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、生長(zhǎng)因子和基質(zhì)金屬蛋白酶。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞外基質(zhì)包衣包括大約61％層粘連蛋白、約30％膠原蛋白IV和約7％巢蛋白，以及硫酸肝素蛋白聚糖或硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、生長(zhǎng)因子和基質(zhì)金屬蛋白酶。例如，所述包衣溶液可以通過(guò)市售的產(chǎn)品Growth Factor Reduced BD MatrigelTM(Becton，Dickinson & Co.，Bedford，MA)來(lái)制備，所述MatrigelTM包括層粘連蛋白、膠原蛋白IV和巢蛋白，它們的量分別為大約61％、30％和7％。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞外基質(zhì)包括來(lái)自哺乳動(dòng)物胎盤膜的細(xì)胞外基質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述胎盤膜是人胎盤膜。
懸浮在包衣溶液中和施加在適于培養(yǎng)細(xì)胞的表面的細(xì)胞外基質(zhì)成分的濃度，在所述表面上提供了允許所述細(xì)胞培養(yǎng)表面在維持未分化狀態(tài)的胚胎細(xì)胞方面的性能表現(xiàn)一致的最佳細(xì)胞外基質(zhì)層。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，如果在所述表面上細(xì)胞外基質(zhì)成分的濃度太低，則胚胎干細(xì)胞增殖集落數(shù)目將會(huì)減少。如果在所述溶液中的細(xì)胞外基質(zhì)成分濃度太高，則細(xì)胞外基質(zhì)成分可以在溶液中沉淀，產(chǎn)生在所述表面具有小于飽和水平的蛋白的不均一基質(zhì)，并潛在影響胚胎干細(xì)胞增殖的能力。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞培養(yǎng)裝置包括位于其表面的一薄層細(xì)胞外基質(zhì)成分。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞外基質(zhì)成分以干燥狀態(tài)存在于容器的至少一個(gè)表面。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞外基質(zhì)成分以大約10μg/mL至約500μg/mL濃度應(yīng)用于容器。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞外成分以約30μg/mL至約300μg/mL濃度應(yīng)用于容器。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，細(xì)胞外成分以濃度約100μg/mL應(yīng)用于容器。
包含固定濃度的細(xì)胞外基質(zhì)成分的液體溶液應(yīng)用于所述容器的量可以根據(jù)所述容器的類型和大小以及在液體溶液中的細(xì)胞外成分的濃度而變化。在一個(gè)實(shí)施方案中，大約0.05mL至大約0.5mL的液體溶液應(yīng)用于每cm2容器面積(mL/cm2)。在一個(gè)實(shí)施方案中，約0.1mL/cm2至約0.2mL/cm2被應(yīng)用于所述容器。
在一個(gè)實(shí)施方案中，施加所述溶液以提供大約0.1μg細(xì)胞外基質(zhì)成分每cm2容器面積至約10μg細(xì)胞外基質(zhì)成分每cm2容器面積(μg/cm2)。在一個(gè)實(shí)施方案中，向容器施加所述溶液以提供大約0.6μg/cm2至6.0μg/cm2。
在一些實(shí)施方案中，包衣以干燥狀態(tài)存在于基底上。如果所述包衣被干燥，則得到的產(chǎn)品更加穩(wěn)定。此外，優(yōu)選的是細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品通過(guò)包被方法制備，所述方法包括洗去未結(jié)合的蛋白。因?yàn)閿?shù)量不受控制的未結(jié)合蛋白被洗掉，這即允許批次之間具有更大的一致性。最終的包被的基底時(shí)于培養(yǎng)細(xì)胞，包括ES細(xì)胞，以及在細(xì)胞擴(kuò)增期間維持它們?cè)谖捶只癄顟B(tài)是有用的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，基底上的包衣還可以由封閉溶液形成。所述封閉溶液包括至少一種封閉劑和含水溶劑，例如緩沖液或細(xì)胞培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方案中，所述封閉劑可以是明膠、蔗糖、海藻糖或它們的組合。值得注意的是術(shù)語(yǔ)″封閉劑″在這里可以和術(shù)語(yǔ)″穩(wěn)定劑″互換使用。優(yōu)選地，在封閉溶液中封閉劑以大約0.1至大約5.0％w/v的量存在。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，例如，使用包括至少一種封閉劑，例如蔗糖的封閉溶液來(lái)封閉基底表面，增加了干燥后的包衣在高溫加速老化試驗(yàn)過(guò)程中的穩(wěn)定性。例如，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)封閉劑/穩(wěn)定劑，例如蔗糖，擴(kuò)展了細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品/培養(yǎng)裝置在室溫下長(zhǎng)期儲(chǔ)存的能力，而沒(méi)有顯著的細(xì)胞外基質(zhì)成分的降解。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品可以在室溫下儲(chǔ)存至少兩個(gè)星期。這樣就節(jié)省了例如冷藏機(jī)、冰箱或冷藏室空間。進(jìn)一步地，因?yàn)榧?xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品可以在室溫下儲(chǔ)存，細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品不需要在使用前先融化，從而節(jié)省了時(shí)間。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，包含干燥狀態(tài)的細(xì)胞外基質(zhì)包衣的細(xì)胞培養(yǎng)裝置也可以包含穩(wěn)定劑，使得細(xì)胞培養(yǎng)裝置可以在室溫下長(zhǎng)期儲(chǔ)存。特別是，本發(fā)明提供用于培養(yǎng)多能胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)裝置，包括i)適于培養(yǎng)細(xì)胞的容器；ii)固定濃度的細(xì)胞外基質(zhì)成分，其中細(xì)胞外基質(zhì)以干燥狀態(tài)存在于容器的至少一個(gè)表面；和任選的，ii)適于穩(wěn)定處于干燥狀態(tài)的細(xì)胞外基質(zhì)的試劑。添加穩(wěn)定劑被認(rèn)為可以阻止包衣中細(xì)胞外基質(zhì)成分的顯著降解。
所述穩(wěn)定劑可以以適于阻止或抑制包衣中的細(xì)胞外基質(zhì)成分降解的濃度，施加于容器，例如，細(xì)胞培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶的至少一個(gè)表面。在一個(gè)實(shí)施方案中，穩(wěn)定劑以大約0.1％至約5.0％w/v濃度施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，穩(wěn)定劑以大約1.25％w/v濃度施用。所述濃度可以按每單位體積的液體溶液中穩(wěn)定劑的重量來(lái)計(jì)量。在示例性實(shí)施方案中，所述穩(wěn)定劑的重量可以以克計(jì)量，液體溶液的體積可以以毫升計(jì)量。
本發(fā)明可以使用任何能夠阻止細(xì)胞外基質(zhì)降解而不妨礙胚胎干細(xì)胞增殖的穩(wěn)定劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述穩(wěn)定劑選自蔗糖、海藻糖和它們的組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，穩(wěn)定劑是蔗糖。
用于制備包衣溶液和封閉溶液的含水溶劑可以是緩沖液，例如PBS，或細(xì)胞培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方案中，DMEM、KO/DMEM、RPMI或其它本領(lǐng)域公知的細(xì)胞培養(yǎng)基適于用作用于制備包衣溶液的含水溶劑。適宜的含水溶劑稀釋劑可以包括能提供與細(xì)胞培養(yǎng)相容的條件，并優(yōu)選地可以在ES細(xì)胞體外定向培養(yǎng)成特定的細(xì)胞類型之前使ES細(xì)胞維持在自我更新和未分化狀態(tài)的任何細(xì)胞培養(yǎng)基。這樣的培養(yǎng)基可以通過(guò)商業(yè)上獲得，例如來(lái)自InvitrogenCorporation(Carlsbad，CA)或Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。
在一些實(shí)施方案中，所述包衣溶液的pH為約7.0至8.5。pH可以通過(guò)任何能夠維持包衣溶液在約7.0至8.5的pH范圍的緩沖成分來(lái)維持。在此范圍的潛在緩沖體系包括但不限于，二乙醇胺、三乙醇胺、(1，3-雙(三[羥甲基]甲氨基)丙烷)；3-[N，N-雙(2-羥乙基)氨基]-2-羥基丙磺酸DIPSO；(N-[2-羥乙基]哌嗪-N′-[-4-丁磺酸]HEPBS)；(N-(4-(2-羥乙基-1-哌嗪乙磺酸HEPES)；3-(N-嗎啉代)丁磺酸MOBS)；(哌嗪-N，N′-雙[2-羥基丙磺酸POPSO)；(N-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙磺酸TAPS；3-(N-三[羥甲基]甲氨基)-2-羥基丙磺酸TAPSO)；(N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺酸TES；(N-三(羥甲基)甲基甘氨酸Tricine；N-乙基嗎啉，二甲基亮氨酰甘氨酸，5，5-二乙基巴比妥酸鈉和2氨基，2甲基-1，3丙二醇。
在另一些實(shí)施方案中，所述包衣溶液可以具有酸性pH。例如，膠原蛋白典型地在低pH的酸性酸中包被。所述酸性酸將在包衣的干燥期間蒸發(fā)。對(duì)于膠原蛋白，包衣溶液優(yōu)選具有酸性pH，因?yàn)槟z原蛋白在較高的pH下會(huì)形成凝膠。
在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品的ECM包衣是從稀釋的基底膜蛋白提取物形成的。這里定義的″細(xì)胞外基質(zhì)″(基底膜是其一種具體類型)，是由細(xì)胞產(chǎn)生并且分泌到周圍環(huán)境中的物質(zhì)。值得注意的是術(shù)語(yǔ)″細(xì)胞外基質(zhì)″在本文中有可能和術(shù)語(yǔ)″基底膜″互換使用。所述細(xì)胞外基質(zhì)可以由細(xì)胞分泌，形成間質(zhì)基底膜，該膜形成細(xì)胞所附著的構(gòu)架。所述基底膜把細(xì)胞與間充質(zhì)結(jié)締組織分開，提供細(xì)胞生長(zhǎng)和分化所必需的空間取向和穩(wěn)定性。細(xì)胞外基質(zhì)分子或基底膜也已被提示參與生長(zhǎng)因子的隔離、儲(chǔ)存以及向組織的呈遞。
基底膜包括各種成分?；啄な羌?xì)胞外基質(zhì)的一種具體類型，主要由層粘連蛋白和IV型膠原蛋白組成。它的主要成分是層粘連蛋白，其次是膠原蛋白IV、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和巢蛋白。
細(xì)胞外基質(zhì)分子或基底膜是本領(lǐng)域公知的，市售可得。例如，可以得到來(lái)自EHS小鼠肉瘤的細(xì)胞外基質(zhì)，如Matrigel(Becton，Dickinson &Co.，Medford，MA)、ECM凝膠(Sigma-Aldrich Co.，St.Louis，MO)，和CultrexTM(Trevigen，Gaithersburg，MD)。其它適宜的ECM分子包括，例如，層粘連蛋白/巢蛋白復(fù)合物(Becton，Dickinson & Co.)。
術(shù)語(yǔ)″細(xì)胞外基質(zhì)″是本領(lǐng)域公認(rèn)的。它的成分包括一種或多種下列蛋白纖連蛋白、層粘連蛋白、玻連蛋白、腱生蛋白、巢蛋白、血小板反應(yīng)蛋白、彈性蛋白、明膠、膠原蛋白、原纖蛋白、分區(qū)蛋白，錨定蛋白，軟骨粘連蛋白，連接蛋白、骨唾液蛋白、骨鈣蛋白、骨橋蛋白、epinectin、hyaluronectin、undulin、表皮整聯(lián)配體蛋白和韁蛋白。其他細(xì)胞外基質(zhì)分子見Kleinman等，J.Biometer.Sci.Polymer Edn，51-11，(1993)的描述，該文獻(xiàn)引入這里作為參考。術(shù)語(yǔ)″細(xì)胞外基質(zhì)″旨在包括目前未知的但在將來(lái)可能發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞外基質(zhì)，因?yàn)槠渥鳛榧?xì)胞外基質(zhì)的特征是本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易確定的。
公知的從Englelbreth-Holm-Swarm小鼠腫瘤提取的基底膜基質(zhì)(Basement Membrane Matrix)以商品名MatrigelTM出售。該小鼠腫瘤富含基底膜蛋白。主要基質(zhì)成分是層粘連蛋白、膠原蛋白IV、巢蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，也包括生長(zhǎng)因子、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs[膠原酶])和其他蛋白酶(纖溶酶原激活物)，以及幾種未定義的化合物。在室溫下，MatrigelTM基質(zhì)凝膠化形成重構(gòu)的基底膜，并在其結(jié)構(gòu)、組成、物理性質(zhì)和保持體內(nèi)基底膜典型的功能性特征的能力上是相似的。
如上所述，用于制備本發(fā)明細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品的包衣溶液可以包括細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的混合物。在一個(gè)期望的實(shí)施方案中，所述包衣溶液是通過(guò)稀釋細(xì)胞外基質(zhì)得到的，該基質(zhì)是以基底膜蛋白提取物形式提供的，如美國(guó)專利第4,829,000號(hào)所公開的，該專利的內(nèi)容整體加以引用作為參考。該蛋白提取物包括以重量計(jì)約50-85％層粘連蛋白、5-30％膠原蛋白IV、1-10％巢蛋白(觸覺(jué)蛋白)和1-10％硫酸乙酰肝素蛋白聚糖。該蛋白提取物在加熱下能夠聚合成堅(jiān)硬穩(wěn)定的凝膠(即，三維基質(zhì))。特別是，當(dāng)在約15-40℃，優(yōu)選約22-37℃的溫度下孵育足夠時(shí)間時(shí)，所述細(xì)胞外基質(zhì)蛋白聚合。這些蛋白可以通過(guò)維持組合物的溫度低于所述范圍而保持在可溶形態(tài)。優(yōu)選地，所述細(xì)胞外基質(zhì)貯備組合物維持在-20℃，在為制備包衣溶液而用含水溶劑稀釋之前融化并保持在4℃。
用于制備本發(fā)明細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品的包衣溶液可以包括各種成分，這些成分能影響包衣中的生長(zhǎng)因子對(duì)細(xì)胞的可接近性，和/或參與細(xì)胞粘著，和/或影響在包衣中的蛋白的結(jié)構(gòu)。這些成分可以包括但不限于，鹽、稀釋劑、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和/或中和抗體。
適宜的中和抗體包括那些通過(guò)滴定除去生長(zhǎng)因子或阻斷它們的效力來(lái)影響細(xì)胞外基質(zhì)中固有的生長(zhǎng)因子的化合物。合適的中和抗體可以包括但不限于，針對(duì)以下物質(zhì)之一的抗體TGF-β、EGF、VEGF、PDGF、bFGF和IGF-1。
有種類繁多的其它物質(zhì)可以包含在基底上的包衣中。它們包括但不限于細(xì)胞、抗體、酶、受體、生長(zhǎng)因子、其它的細(xì)胞外基質(zhì)成分、細(xì)胞因子、激素和藥物。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞外基質(zhì)蛋白可以與這些物質(zhì)結(jié)合。這些生物活性物質(zhì)，如果存在的話，可以很容易地為培養(yǎng)細(xì)胞所利用以調(diào)整或調(diào)節(jié)它們的性質(zhì)或行為。
用于常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)研究的基底包括塑料、玻璃和微型多孔濾器(例如纖維素、尼龍、玻璃纖維、聚苯乙烯、聚酯和聚碳酸酯)。用于在分批或連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)中或在基因工程中使用的生物反應(yīng)器的基底包括中空纖維管或微載體珠。用于血管或骨移植的基底包括諸如聚四氟乙烯(Teflon)、陶瓷和相關(guān)的聚合材料等材料。這些基底均適用于本發(fā)明。
在一些實(shí)施方案中，所述基底/容器可以由能夠允許細(xì)胞外基質(zhì)成分吸附或結(jié)合到所述基底或容器的至少一個(gè)表面的任何適宜材料制成。這樣的材料可以包括纖維素、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚四氟乙烯、尼龍、玻璃、聚對(duì)苯二甲酸乙二酯、聚甲基戊烷、聚丙烯、聚乙烯和它們的組合。其他可運(yùn)用的材料包括Permanox、聚酯、聚酰胺、聚酰亞胺和硅基材料，包括玻璃容器等等。也可以使用任何上述材料的組合。這些材料可以是多孔的或無(wú)孔的。
本發(fā)明所考慮的優(yōu)選基底構(gòu)造/容器包括多孔板(例如6孔和24孔板)、皿(例如培養(yǎng)皿)、培養(yǎng)瓶、滾瓶，包括轉(zhuǎn)瓶、管、生物反應(yīng)器等等。
制備方法
本發(fā)明提供制備穩(wěn)定的、即用型細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品的方法。該方法包括將細(xì)胞外基質(zhì)包衣溶液施加到基底表面，其中在包衣溶液中的總蛋白濃度是約10μg/ml至約1mg/ml。該方法也包括在基底表面上孵育包衣溶液從基底上去除孵育的包衣溶液；此去除步驟后洗滌基底。最后，該方法包括干燥洗過(guò)的基底；將干燥基底滅菌。施加包衣的合適的基底可以選自例如上述材料。
在一些實(shí)施方案中，所述洗滌步驟包括用蒸餾水、緩沖液或培養(yǎng)基洗滌基底。在其他實(shí)施方案中，洗滌步驟包括用封閉溶液洗滌基底，例如，用于制備細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品的洗滌步驟可以應(yīng)用封閉溶液，借此所述產(chǎn)品的孔被同時(shí)有效地洗滌和封閉。
如上所述，制備細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品/細(xì)胞培養(yǎng)裝置的方法可以進(jìn)一步包括在去除步驟后在洗滌步驟之前或期間，用包括至少一種封閉劑和含水溶劑的封閉溶液封閉基底表面。所述封閉劑可以選自但不限于明膠、蔗糖、海藻糖和它們的組合。發(fā)現(xiàn)所述的封閉步驟能在高溫加速老化試驗(yàn)期間增加所述表面的穩(wěn)定性，見以下內(nèi)容中的進(jìn)一步詳細(xì)描述?？梢栽谌コ襟E前執(zhí)行封閉步驟和/或?qū)⒃摲忾]步驟分解為多個(gè)步驟在去除步驟之前和之后實(shí)施。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供制備細(xì)胞培養(yǎng)裝置的方法，包括步驟 i)將含有固定濃度的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分的第一液體溶液施加于適于細(xì)胞培養(yǎng)的容器， ii)孵育含有第一液體溶液的容器足夠的時(shí)間，以允許細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分吸附或結(jié)合容器； iii)從容器中除去第一液體溶液； iv)洗滌該容器除去任何殘留的第一液體溶液； v)任選地施加含有適于穩(wěn)定細(xì)胞外基質(zhì)的組合物的第二液體溶液； vi)任選地除去含有適于穩(wěn)定細(xì)胞外基質(zhì)的組合物的第二液體溶液， vii)任選地洗滌該容器除去任何殘留的第二液體溶液；和 viii)干燥容器。
含有細(xì)胞外基質(zhì)成分的液體溶液可以在至少一個(gè)容器，例如培養(yǎng)瓶或細(xì)胞培養(yǎng)板的表面孵育，孵育所用的溫度和時(shí)間應(yīng)足以允許細(xì)胞外基質(zhì)成分吸附到容器表面。例如，所述容器可以在室溫下孵育約1至約4小時(shí)以確保吸附。備選地，所述容器可以在4℃下孵育過(guò)夜。
容器可以用任何合適的方式干燥適當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述容器在干燥箱中室溫下真空干燥。在一個(gè)實(shí)施方案中，容器在干燥箱中室溫下干燥至少16小時(shí)。
所述細(xì)胞培養(yǎng)裝置干燥后，可以任選地滅菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述裝置使用紫外線(UV)滅菌。
包被步驟一般按照以下方法進(jìn)行。在6孔多孔板的孔中加入約0.5-至2.0ml包衣溶液(理想的是在4℃下)；在24孔多孔板的孔中加入約0.25至1.0ml；在96孔板的孔中加入約50μl至100μl。此外，向35mm培養(yǎng)皿加入約0.5至2.0ml，向60mm培養(yǎng)皿加入0.5至4.0ml，向100mm培養(yǎng)皿加入2.0至12.0ml。
施加包衣溶液后，孵育包衣溶液以允許在溶液中的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白吸附到基底表面。尤其是，包被的基底理想的是在約22℃至約30℃溫度下孵育大約30分鐘至約4小時(shí)，以允許所述蛋白吸附到基底表面。隨后除去包衣溶液(例如通過(guò)抽吸)，使用含水溶劑(例如緩沖液、ddH2O、培養(yǎng)基)洗滌包被的基底以除去未結(jié)合的蛋白。如上文所述，使用封閉溶液，可以增加包被約基底的穩(wěn)定性。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，允許所述包衣在基底上干燥。這可以通過(guò)在約22℃至30℃的溫度和理想地40-60％相對(duì)濕度下干燥來(lái)實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)這樣的干燥可以提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性。干燥的基底可以滅菌，例如通過(guò)UV滅菌。此后，滅菌的、干燥的基底可以包裝在防潮包裝中。如果想要的話，包裝的、干燥的基底可以在-20℃下儲(chǔ)存，使用前融化。
干燥基底可以任選地在加入細(xì)胞前使用細(xì)胞培養(yǎng)基或其它無(wú)菌的介質(zhì)(例如無(wú)菌水)再水合。例如，干燥基底可以使用再水合溶液，例如細(xì)胞培養(yǎng)基，室溫下再水合大約2分鐘至約2小時(shí)。再水合溶液可以在臨使用前除去。備選地，為再水合干燥的基底，可以加入培養(yǎng)基，然后在約2分鐘至約2小時(shí)后把細(xì)胞懸液加入該培養(yǎng)基中。
使用方法
本發(fā)明使得胚胎干細(xì)胞可以在無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)中生長(zhǎng)?？梢允褂猛ㄟ^(guò)培養(yǎng)飼養(yǎng)細(xì)胞如mEFs而條件化的培養(yǎng)基，或其他的培養(yǎng)基配方和細(xì)胞外基質(zhì)包衣支持該細(xì)胞生長(zhǎng)。
如上所述，在來(lái)源于EHS腫瘤的基質(zhì)凝膠如MatrigelTM中批次之間在蛋白濃度和組成上的變異性是固有的。本發(fā)明為ES培養(yǎng)提供了一種使用最佳ECM組合物包被的、穩(wěn)定的、即用型基底。該細(xì)胞培養(yǎng)裝置/產(chǎn)品提供批次之間的一致性，這是標(biāo)準(zhǔn)化ES培養(yǎng)所需要的。
特別是，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)裝置允許胚胎干細(xì)胞在未分化狀態(tài)一致地增殖。在細(xì)胞培養(yǎng)裝置上的細(xì)胞外基質(zhì)包衣優(yōu)選處于干燥狀態(tài)，由此使得所得產(chǎn)品更加穩(wěn)定。并且，細(xì)胞外基質(zhì)包衣優(yōu)選包括穩(wěn)定劑/封閉劑，例如蔗糖。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在包衣中包括穩(wěn)定劑/封閉劑可以增加干燥的包衣的穩(wěn)定性。此外，優(yōu)選的是細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品洗除了未結(jié)合的蛋白。因?yàn)橄闯藬?shù)量不受控制的未結(jié)合蛋白這使得批次之間更加一致。
本發(fā)明的組合物和細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品/裝置可用于不同的應(yīng)用，包括培養(yǎng)ES細(xì)胞。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)此改進(jìn)的ECM包被的細(xì)胞培養(yǎng)表面對(duì)于長(zhǎng)期維持ES細(xì)胞的自我更新和多能特征是有用的。此外，使用本發(fā)明組合物可以研究ES細(xì)胞向特定的細(xì)胞類型的分化，所述分化可以通過(guò)特定的方式，例如通過(guò)將生長(zhǎng)因子加入正在培養(yǎng)ES細(xì)胞的培養(yǎng)基中，進(jìn)行定向。
根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品能夠維持和增殖處于未分化狀態(tài)的胚胎干細(xì)胞，包括靈長(zhǎng)類胚胎干細(xì)胞，例如人類胚胎干細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，ES細(xì)胞是人類ES細(xì)胞。例如，人類ES細(xì)胞包括但不限于以下細(xì)胞系例如H1、H7、H9和H14。這些細(xì)胞系是可獲得的，例如，獲自WiCell ResearchInstitute，Madison，WI和美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，Manassas，VA。在其它的實(shí)施方案中，ES細(xì)胞是小鼠ES細(xì)胞，其例子和供給者是本領(lǐng)域公知的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞的方法包括提供本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品，所述產(chǎn)品包括基底及其上沉積的來(lái)自包衣溶液的包衣。所述包衣溶液包括細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和含水溶劑的混合物，在包衣溶液中的總蛋白濃度是約10μg/ml至約1mg/ml。所述培養(yǎng)方法也包括將胚胎干細(xì)胞懸浮液和培養(yǎng)基加入細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品；并在5％CO2、潮濕空氣中、37℃下孵育胚胎干細(xì)胞，以產(chǎn)生用于胚胎干細(xì)胞擴(kuò)增的未分化集落。
在一些實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)方法進(jìn)一步包括在使用前融化細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品的步驟，該細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品可以儲(chǔ)存在-20℃。在其他實(shí)施方案中，培養(yǎng)方法可以包括在加入胚胎干細(xì)胞懸浮液前，使用細(xì)胞培養(yǎng)基水合細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品的步驟。
在一個(gè)實(shí)施方案中，增殖處于未分化狀態(tài)的多能胚胎干細(xì)胞的方法包括以下步驟 a)通過(guò)以下步驟提供培養(yǎng)裝置，所述步驟包括 i)將含有固定濃度的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分的第一液體溶液施加于適于細(xì)胞培養(yǎng)的容器， ii)孵育含有第一液體溶液的容器足夠的時(shí)間，以允許細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分吸附或結(jié)合容器； iii)從容器中除去第一液體溶液； iv)洗滌該容器除去任何殘留的第一液體溶液； v)任選地施加含有適于穩(wěn)定細(xì)胞外基質(zhì)的組合物的第二液體溶液； vi)任選地除去含有適于穩(wěn)定細(xì)胞外基質(zhì)的組合物的第二液體溶液， vii)任選地洗滌該容器除去任何殘留的第二液體溶液；和 viii)干燥容器； b)將合適的細(xì)胞培養(yǎng)基加入上述容器，所述細(xì)胞培養(yǎng)基是先前已通過(guò)適當(dāng)?shù)娘曫B(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)而條件化的培養(yǎng)基； c)將適宜濃度的未分化多能胚胎干細(xì)胞加入容器；和 d)在適宜的條件下孵育，以允許所述多能胚胎干細(xì)胞增殖。
在一個(gè)實(shí)施方案中，以上步驟b)和c)可以顛倒，其中步驟c)在步驟b)前進(jìn)行。
在一些實(shí)施方案中，用于培養(yǎng)ES細(xì)胞的培養(yǎng)基是條件培養(yǎng)基或已知成分的細(xì)胞培養(yǎng)基。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基是補(bǔ)充了堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的MEF條件培養(yǎng)基。bFGF可以以約4-20ng/ml的量存在于所述培養(yǎng)基中。然而，需要指出的是該培養(yǎng)方法不限于該培養(yǎng)基。例如，大量培養(yǎng)基早已經(jīng)被證實(shí)與在MatrigelTM-包被的表面上培養(yǎng)ES細(xì)胞是相容的。例如，HEF1條件培養(yǎng)基(Xu，等(2004)Stem Cells，22972-980)，HES-df條件培養(yǎng)基(Stjkovic，等(2005)Stem Cells，23306-314)，K-VitroHES培養(yǎng)基(Sjogren-Jansson，等(2005)Developmental Dynamics，233；1304-1314)和包含100ng/ml bFGF的TesSR1培養(yǎng)基(Ludwig等(2006)NatureBiotechnology，Brief Communicat ions，January 2006)，先前都被發(fā)現(xiàn)可能用于此方面。
舉例來(lái)說(shuō)，條件培養(yǎng)基可以通過(guò)在包含4ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的血清置換培養(yǎng)基，例如DMEM、K/O DMEM或DMEM/F12中培養(yǎng)輻射過(guò)的或絲裂霉素C-滅活的原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞而制備。一般在37℃下1天后收集培養(yǎng)上清液，補(bǔ)充其它生長(zhǎng)因子，包括βFGF。更特別地，對(duì)于無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)，適宜的基礎(chǔ)培養(yǎng)基可以由以下成分制成Dulbecco氏改良的Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)，Gibco#11965-092；Knockout Dulbecco氏改良的Eagle氏培養(yǎng)基(KO DMEM)，Gibco #10829-018；Ham′s F12/50％DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基；200mM L-谷氨酰胺，Gibco # 15039-027；非必需氨基酸溶液，Gibco 11140-050；β-巰基乙醇，Sigma # M7522；人重組堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)，Gibco#13256-029。示例性含血清的ES培養(yǎng)基是由80％ DMEM(典型地KO DMEM)、20％未加熱滅活的成分確定的胎牛血清(FBS)、1％非必需氨基酸、1mM L-谷氨酰胺和0.1mM β-巰基乙醇制成的。所述培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)過(guò)濾，4℃下儲(chǔ)存不超過(guò)2周。無(wú)血清ES培養(yǎng)基是由80％KO DMEM、20％血清置換物、1％非必需氨基酸、1mM L-谷氨酰胺和0.1mMβ-巰基乙醇制成的。不是所有的血清置換物都可行；有效的血清置換物是Gibco # 10828-028(專利配方；產(chǎn)品可獲自廠商)。所述培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)過(guò)濾，4℃下儲(chǔ)存不超過(guò)2周。臨在和用于條件化的細(xì)胞混合前，可以加入人bFGF到4ng/mL的終濃度。
在允許用于實(shí)施條件化的細(xì)胞向培養(yǎng)基釋放支持胚胎干細(xì)胞的成分的環(huán)境中，將所述培養(yǎng)基和所述細(xì)胞混合。任選地，細(xì)胞可以通過(guò)輻射(例如約4,000rads)、通過(guò)使用化學(xué)滅活劑如絲裂霉素C處理或通過(guò)其他任何有效的方法而滅活(即，失去實(shí)質(zhì)的復(fù)制能力)。如培養(yǎng)基在用于支持干細(xì)胞培養(yǎng)之前與條件細(xì)胞分離，則在這種情況下細(xì)胞滅活不是必需的。
細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)充足的時(shí)間以便釋放的因子(或培養(yǎng)基成分的消耗)達(dá)到足夠的濃度以產(chǎn)生能支持未分化的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基。典型地，通過(guò)37℃下培養(yǎng)24小時(shí)而條件化的培養(yǎng)基可以產(chǎn)生支持胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)的培養(yǎng)基。但是，所述培養(yǎng)期可以向上或向下調(diào)整，從而經(jīng)驗(yàn)地(或通過(guò)測(cè)定必需因子的濃度)決定何為足夠的時(shí)間。收集一批條件培養(yǎng)基后，細(xì)胞可用于另一批培養(yǎng)基并經(jīng)過(guò)另一個(gè)培養(yǎng)期而使該培養(yǎng)基條件化，只要細(xì)胞保持它們充分條件化培養(yǎng)基的能力，該細(xì)胞使用循環(huán)可以持續(xù)期望多的次數(shù)。例如，由胚胎干細(xì)胞分化得到的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞可持續(xù)1-2周用于經(jīng)1天期限對(duì)培養(yǎng)基的條件化。
小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mEF)可用于獲得條件培養(yǎng)基。mEF細(xì)胞可由遠(yuǎn)交繁殖的CF1小鼠(SASCO)或其他合適的株系獲得。在一個(gè)舉例說(shuō)明性的方法中，用70％乙醇擦洗懷孕第13天的小鼠的腹部，將蛻膜取出放磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中。收獲胚胎，除去胎盤、胎膜和軟組織，胎體在PBS中洗滌兩次。然后轉(zhuǎn)移到新鮮的包含2mL胰蛋白酶/EDTA的10cm細(xì)菌培養(yǎng)皿，并切碎。37℃下孵育5分鐘后，用含有10％FBS的5mL DMEM滅活胰蛋白酶，混合物轉(zhuǎn)移到15mL錐形管。使碎屑沉淀2分鐘，將上清液補(bǔ)至終體積10mL，種入10cm組織培養(yǎng)板或T75培養(yǎng)瓶中。在不擾動(dòng)的狀態(tài)下孵育培養(yǎng)瓶24小時(shí)，之后更換培養(yǎng)基。當(dāng)培養(yǎng)瓶中細(xì)胞匯合時(shí)(大約2-3天)，按1∶2在新的培養(yǎng)瓶中傳代。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞可以在mEF培養(yǎng)基中增殖，該培養(yǎng)基含有90％DMEM(Gibco#11965-092)、10％ FBS(Hyclone#30071-03)和2mM L-谷氨酰胺。使用T150培養(yǎng)瓶(Corning#430825)，每隔一天用胰蛋白酶按1∶2傳代細(xì)胞，使細(xì)胞保持在亞匯合狀態(tài)。
胚胎干細(xì)胞可以在有條件培養(yǎng)基的情況下，以合適的分布狀態(tài)接種在容器上。小鼠胚胎干細(xì)胞的增殖涉及將細(xì)胞分散成單細(xì)胞懸浮液(Robinson，Meth.Mol.Biol.75173，1997，177頁(yè))。相反地，在沒(méi)有飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下靈長(zhǎng)類胚胎干細(xì)胞的傳代將得益于制備靈長(zhǎng)類胚胎干細(xì)胞小團(tuán)塊。
一種方便的確定胚胎干細(xì)胞是否分化的方法是跟蹤集落的形態(tài)學(xué)特征。例如，未分化的hES細(xì)胞的特征性形態(tài)學(xué)特點(diǎn)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，包括高細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)比率、顯著的核仁和致密的集落形成及不易辨別的細(xì)胞連接。在傳代期間，一些細(xì)胞可能分化(特別是當(dāng)以單細(xì)胞重復(fù)接種時(shí)，或當(dāng)允許形成大的團(tuán)塊時(shí))。但是，典型地在培養(yǎng)期間培養(yǎng)物可以重建較大比例的未分化細(xì)胞。理想的是，增殖的細(xì)胞將有不大于約20-40小時(shí)的倍增時(shí)間。
根據(jù)本發(fā)明增殖的多能干細(xì)胞可以在大約70天達(dá)到接近五十(50)次的群體倍增。
本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)裝置可用于測(cè)試各種抑制劑或刺激物，以確定它們?cè)诩?xì)胞研究中的效力。刺激物可以包括生長(zhǎng)因子，生長(zhǎng)因子是本領(lǐng)域公知的。例如，這些刺激物可以包括一種或多種血小板衍生的生長(zhǎng)因子(PDGF)，例如PDGF AA，PDGF BB；胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)，例如IGF-I，IGF-II；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)，例如酸性FGF，堿性FGF，β-內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，F(xiàn)GF4，F(xiàn)GF 5，F(xiàn)GF 6，F(xiàn)GF 7，F(xiàn)GF 8，和FGF 9；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)，例如TGF-P1，TGF β1.2，TGF-β2，TGF-β3，TGF-β5；骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)(BMP)，例如BMP 1，BMP 2，BMP 3，BMP 4；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，例如VEGF，胎盤生長(zhǎng)因子；表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，例如EGF，雙調(diào)蛋白，β動(dòng)物纖維素，肝素結(jié)合EGF；白介素，例如IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-14；集落刺激因子(CSF)，例如CSF-G，CSF-GM，CSF-M；神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)；干細(xì)胞因子；肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，和睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。另外的生長(zhǎng)因子見Sporn和Roberts，Peptide Growth Factors and TheirReceptors I，Springer-Verlag，New York(1990)，該文獻(xiàn)引入此處作為參考。術(shù)語(yǔ)″生長(zhǎng)因子″旨在包括目前未知但可能將來(lái)會(huì)發(fā)現(xiàn)的生長(zhǎng)因子，因?yàn)樗鼈冏鳛樯L(zhǎng)因子的特征很容易被本領(lǐng)域的技術(shù)人員確定。
很多生長(zhǎng)因子可以通過(guò)市售得到，例如Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO.；Collaborative Research，Los Altos，CA；Genzyme，Cambridge，MA；Boehringer，Germany；R&D Systems，Minneapolis，MN；Genetech，San Francisco，CA；和GIBCO，Grand Island，NY。這些市售的生長(zhǎng)因子可以以自然和重組形式得到。
因此，在多種實(shí)施方案中，本發(fā)明允許基本未分化狀態(tài)的多能胚胎干細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定的、一致的增殖，而不用利用飼養(yǎng)層來(lái)支持這些細(xì)胞生長(zhǎng)。本發(fā)明的這些和其它的實(shí)施方式、方面、目的和特點(diǎn)通過(guò)結(jié)合及參考附圖來(lái)閱讀以下示例性實(shí)施方式的詳細(xì)描述，而是清楚的。以下實(shí)施例用于舉例說(shuō)明目的，而不是意圖以任何方式限制本發(fā)明的實(shí)施方式和應(yīng)用。
實(shí)施例 實(shí)施例1對(duì)ECM-包被的表面的優(yōu)化
在制備穩(wěn)定的、即用型ECM-包被的基底的嘗試中，首先將BD MatrigelTM基質(zhì)(Cat.No.354234；Becton，Dickinson&Co.)在4℃冰上融化過(guò)夜。使用冷的(4℃)DMEM(Cat.No.10313-021；Invitrogen)或K/O-DMEM(Cat.No，10829-018；Invitrogen)制備一系列的MatrigelTM(10mg/ml貯存液)稀釋物(例如1∶30，1∶100，1∶300，1∶3000，1∶30,000)。將上述五種稀釋的Matrigel溶液和對(duì)照溶液之每一種的等分試樣(2mls/孔)加入到6孔板(Cat.No.353046；Becton，Dickinson & Co.)的孔中，輕輕搖晃以覆蓋孔的整個(gè)底部表面，在室溫下孵育大約2小時(shí)。每一6孔板包括至少一個(gè)對(duì)照孔，用于接受對(duì)照溶液。對(duì)照溶液是不含MatrigelTM的培養(yǎng)基。
孵育后，MatrigelTM稀釋液和對(duì)照溶液通過(guò)抽吸從孔中除去，加入6ml ddH2O以洗滌板孔并除去未結(jié)合的物質(zhì)。在加入洗滌溶液的大約5分鐘內(nèi)，通過(guò)抽吸除去該溶液，板加蓋在干燥箱中室溫下干燥過(guò)夜至少約16小時(shí)。干燥周期后，從干燥箱取出板子，通過(guò)UV管道滅菌。然后，滅過(guò)菌的板分別包裝在防潮真空密封錫箔袋中，立即在-20℃下儲(chǔ)存。
在用MatrigelTM稀釋液包被的板上培養(yǎng)hES細(xì)胞所得到的結(jié)果總結(jié)在以下實(shí)施例6中。這些結(jié)果表明合適的包衣包括那些從包衣溶液沉積的包衣，其中在包衣溶液中的總蛋白濃度是約10μg/ml至約1mg/ml。在一些實(shí)施方案中，在包衣溶液中的總蛋白濃度是約30μg/ml至約300μg/ml。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，在包衣溶液中的總蛋白濃度是約30μg/ml至約200μg/ml。包被的表面的性能由集落的數(shù)量和細(xì)胞分化標(biāo)記的缺乏以及未分化標(biāo)記的存在來(lái)確定的。
包括層粘連蛋白/巢蛋白或?qū)诱尺B蛋白/膠原蛋白IV的混合物的ECM-包衣溶液，可以通過(guò)將貯存濃度的該ECM混合物在培養(yǎng)基或其他合適的含水溶劑中稀釋至約30μg/ml至約300μg/ml最終總蛋白濃度來(lái)制備。包被過(guò)程和上述用于MatrigelTM稀釋液的包被過(guò)程是相同的。通過(guò)在層粘連蛋白/巢蛋白混合物包被的板上培養(yǎng)hES細(xì)胞得到的樣本結(jié)果總結(jié)在下面實(shí)施例6中。這些結(jié)果表明層粘連蛋白/巢蛋白包被的表面和用MatrigelTM稀釋液包被的試驗(yàn)表面以及飼養(yǎng)細(xì)胞對(duì)照表面具有一樣好的性能。
需要指出的是，任選地，上述用于制備本發(fā)明細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品的洗滌步驟可以通過(guò)使用封閉溶液來(lái)完成，由此板孔得以同時(shí)被有效地洗滌和封閉。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，例如，使用含有至少一種封閉劑，例如蔗糖的封閉溶液來(lái)封閉孔表面，增加了在高溫加速老化試驗(yàn)期間該表面的穩(wěn)定性。特別是，發(fā)現(xiàn)儲(chǔ)存在室溫或4℃下的蔗糖封閉的孔比相同溫度下未封閉的孔，信號(hào)動(dòng)力學(xué)范圍增加。這顯示在例如，圖2中，其中1.25％w/v的蔗糖存在于封閉溶液中。在一些實(shí)施方案中，約0.1-5％w/v的蔗糖存在于封閉溶液中。本發(fā)明也考慮到其他的糖，例如，海藻糖或蛋白質(zhì)，例如明膠，在這方面也將是有用的。
包被的表面的性能進(jìn)一步由ELISA方法測(cè)定主要ECM成分的結(jié)果來(lái)確定。這些結(jié)果見實(shí)施例2的描述。
實(shí)施例2測(cè)定在包被的板上吸附的蛋白數(shù)量
本實(shí)施例旨在利用ELISA方法，檢測(cè)和定量吸附到包被的表面上的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。通過(guò)設(shè)計(jì)，所述ELISA方法使用抗小鼠膠原IV抗體檢測(cè)在板的包衣中的膠原蛋白IV。膠原蛋白IV是一種主要的ECM成分。通過(guò)使用特異于包衣組合物中的其他蛋白的抗體也可以檢測(cè)在板包衣中的其他蛋白，該檢測(cè)是在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)的。
將如實(shí)施例1所述包被的板子(100μg/mL)和未包被的對(duì)照板平衡至室溫。向包被的板的每孔加入2mL的洗滌緩沖液(0.2mL Tween-20(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，Product#1379)在1L 1X PBS(不含鈣鎂離子)中)洗滌板子，除去洗滌緩沖液，在紙巾上吸干每一塊板以除去孔邊多余的液體。洗滌步驟再重復(fù)兩次。將1mL封閉溶液(1∶20(v/v)稀釋在1XDulbecco氏PBS中的KPL 10％BSA稀釋劑/封閉緩沖液(Cat.No.50-61-10))加入每孔，在室溫下孵育板子1小時(shí)。孵育期結(jié)束后從板上除去封閉溶液，重復(fù)洗滌步驟3次。
將抗小鼠膠原蛋白IV一抗工作溶液加入到每一孔(1ml/孔)。一抗工作溶液通過(guò)1∶80(v/v)稀釋貯備的抗體溶液(0.5mL貯備液加入40mL封閉溶液中)來(lái)制備。貯備抗體溶液(大約1∶100稀釋)通過(guò)在封閉溶液(同上)中稀釋兔抗小鼠膠原蛋白IV抗體(Chemicon Cat.#AB756P)來(lái)制備。對(duì)于新批次的抗小鼠膠原蛋白IV抗體，通過(guò)比較使用新抗體批次的各種稀釋物和第一批抗體的相同稀釋物繪制的劑量反應(yīng)曲線來(lái)定量。新抗體批次的等價(jià)稀釋物通過(guò)檢查劑量反應(yīng)曲線的線性區(qū)域來(lái)確定。加入一抗工作溶液后，板在室溫下孵育2小時(shí)。孵育期結(jié)束后，一抗工作溶液從板上除去，重復(fù)洗滌步驟3次。
(0101)將綴合辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的山羊抗兔IgG二抗的工作溶液加入到每一孔(1ml/孔)。二抗工作溶液通過(guò)1∶100(v/v)稀釋貯備的抗體溶液(0.4mL貯備液加入到40mL封閉溶液中)來(lái)制備。貯備的抗體溶液(大約1∶100稀釋)通過(guò)在封閉溶液(同上)中稀釋二抗(BD Pharmingen，Cat.#554021)來(lái)制備。新批次的二抗通過(guò)比較使用此新抗體批次的各種稀釋物和第一批抗體的相同稀釋物所繪制的劑量反應(yīng)曲線來(lái)定量。新抗體批次的等價(jià)稀釋物通過(guò)檢查劑量反應(yīng)曲線的線性區(qū)域來(lái)確定。加入二抗工作溶液后，板在室溫下孵育1小時(shí)。孵育期結(jié)束后，從板上除去二抗工作溶液，重復(fù)洗滌步驟3次。
平衡到室溫后，加入1mL辣根過(guò)氧化物酶底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB)(SureBlue Reserve(1-Component)TMB Microwell Peroxidase(KPL，Inc.，Cat.#53-00-02)到每一孔中。板在室溫下孵育8分鐘，以顯色。8分鐘后，加入1mL酸性終止溶液(來(lái)自KPL，Inc.Cat#50-85-05的TMB終止液)到每孔中。每孔轉(zhuǎn)移200μL的反應(yīng)混合物到96孔板，在450nm處室溫下測(cè)量吸光度(Spectramax Plus板讀數(shù)器)。停止反應(yīng)后5分鐘內(nèi)讀板。讀取含有相同反應(yīng)混合物的孔的O.D.，計(jì)算平均值。用未包被對(duì)照孔的O.D.平均數(shù)除樣本孔的O.D.平均數(shù)來(lái)計(jì)算本底。
使用本實(shí)施例所述的試劑和方法，包被的板的孔具有至少約0.5的光密度。這些結(jié)果見圖1的描述。包被的板的孔和未包被板的孔兩者間的光密度比值大于約4.0。
實(shí)施例3制備成纖維細(xì)胞(MEF)飼養(yǎng)層
本實(shí)施例涉及制備用于收獲MEF條件培養(yǎng)基的MEF飼養(yǎng)層的方法。此外，根據(jù)本領(lǐng)域的公知的方法，將MEF飼養(yǎng)層用作培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞的對(duì)照表面。
制備用于飼養(yǎng)細(xì)胞的基底
滅活的MEF飼養(yǎng)細(xì)胞(經(jīng)輻射或絲裂霉素-C處理的CF-1細(xì)胞系，來(lái)自ATCC，Manassas，VA)接種在明膠化的細(xì)胞培養(yǎng)皿上，以為長(zhǎng)期培養(yǎng)提供更好的支持。具體地，培養(yǎng)皿用0.1％明膠溶液包被，然后室溫下孵育約1小時(shí)至過(guò)夜。隨后，除去明膠，在臨接種滅活的飼養(yǎng)細(xì)胞之前，用無(wú)鈣鎂的磷酸鹽緩沖鹽水(PBs)洗明膠包被的培養(yǎng)皿。
融化和培養(yǎng)飼養(yǎng)細(xì)胞
首先在37℃水浴下輕輕搖晃一小瓶細(xì)胞(來(lái)自CF-1的經(jīng)輻射的MEFs；Catalog No.SCRC 1040.1，來(lái)自ATTCC)，使之融化。細(xì)胞一旦融化，從水浴中拿出瓶子，用70％乙醇處理瓶外壁。然后，將瓶子移入組織培養(yǎng)罩，在此無(wú)菌操作該方法的剩余步驟。將瓶中的細(xì)胞內(nèi)容物無(wú)菌轉(zhuǎn)移到10mls預(yù)熱的MEF培養(yǎng)基中。隨后，細(xì)胞在1000rpm離心，棄除上清液。細(xì)胞沉淀在48mlMEF培養(yǎng)基中重懸，向上述制備的明膠化的6孔板的每孔分配2.5ml該細(xì)胞懸浮液。在5％CO2，潮濕空氣中，37℃下孵育板。大約24小時(shí)后，用2.5-3.0ml成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基或hES培養(yǎng)基(如果細(xì)胞第二天要使用的話)更換每孔中的培養(yǎng)基，然后將板送回培養(yǎng)箱。
實(shí)施例4無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞
本實(shí)施例描述在用上述實(shí)施例1所述方法制備的ECM包被的表面上培養(yǎng)人胚胎干(hES)細(xì)胞。hES細(xì)胞在MEF條件培養(yǎng)基存在下培養(yǎng)，MEF條件培養(yǎng)基的制備方法如下所述。但是，需要指出的是，本發(fā)明的培養(yǎng)方法不限于該培養(yǎng)基，因?yàn)橐郧暗难芯恳呀?jīng)確立，胚胎干細(xì)胞可以在ECM表面上使用本文描述的不同的條件培養(yǎng)基和成分確定的培養(yǎng)基成功培養(yǎng)。
制備MEF條件培養(yǎng)基
如上文實(shí)施例3所述，培養(yǎng)和滅活MEF飼養(yǎng)細(xì)胞。MEF飼養(yǎng)細(xì)胞以56,000個(gè)細(xì)胞/cm2平鋪在MEF培養(yǎng)基中。采用下列體積對(duì)于6孔板為3ml/孔；對(duì)于75ml組織培養(yǎng)瓶是10ml；對(duì)于150ml組織培養(yǎng)瓶是20ml。培養(yǎng)MEFs過(guò)夜。在收集條件培養(yǎng)基前夜，MEFs上的培養(yǎng)基用補(bǔ)充了4-10ng/mlhbFGF的hES細(xì)胞培養(yǎng)基更換。MEFs在hES培養(yǎng)基中孵育過(guò)夜后，收集飼養(yǎng)板或飼養(yǎng)瓶中的條件培養(yǎng)基。將新鮮的含有4-10ng/ml hbFGF的hESC培養(yǎng)基加入MEFs，重復(fù)培養(yǎng)細(xì)胞過(guò)夜然后收集條件培養(yǎng)基的上述過(guò)程。發(fā)現(xiàn)如果每天收集條件培養(yǎng)基一次，MEFs可以使用大約7天。在用于培養(yǎng)hES細(xì)胞前，再將8ng/ml hbFGF加入到條件培養(yǎng)基中。
在ECM包被的表面上使用MEF條件培養(yǎng)基培養(yǎng)hES細(xì)胞
在室溫下融化實(shí)施例1中所制備的ECM包被的板。接著，將補(bǔ)充了8ng/ml hbFGF的2mlMEF條件培養(yǎng)基加入到6孔板的每孔中，把板放置在CO2培養(yǎng)箱中達(dá)2小時(shí)。任選地以此方式將該板水合后，向每孔中加入0.5ml于補(bǔ)充了8ng/ml hbFGF(Becton，Dickinson&Co.)的MEF條件培養(yǎng)基中的hES細(xì)胞懸浮液，將板放回CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)過(guò)夜。此時(shí)相應(yīng)于第0天。在第3天，更換新鮮的培養(yǎng)基。此后，一直到第7天，每天更換新鮮的培養(yǎng)基。在顯微鏡下可觀察到hES細(xì)胞集落。這些hES細(xì)胞可以傳代，或用于免疫組織化學(xué)研究來(lái)檢查分化和未分化的hES細(xì)胞，如實(shí)施例5所描述。
實(shí)施例5-免疫組織化學(xué)方法
本實(shí)施例描述用于檢查分化和未分化的hES細(xì)胞的免疫組織化學(xué)方法。具體而言，用來(lái)自R&D Systems(cat#SC008)的hES標(biāo)記抗體測(cè)定來(lái)自實(shí)施例4的增殖的hES細(xì)胞的分化狀態(tài)。本方法針對(duì)生長(zhǎng)在6孔組織培養(yǎng)板中的細(xì)胞。
用2ml PBS洗滌實(shí)施例4培養(yǎng)的hES細(xì)胞。然后，用1ml 4％多聚甲醛將細(xì)胞在室溫下固定20分鐘。固定的細(xì)胞用2ml PBS洗滌，每次5分鐘，共兩次。隨后，用1ml 0.1％BSA、10％正常山羊血清封閉細(xì)胞。根據(jù)廠家的推薦在封閉期間，一抗工作溶液用含有1％BSA和10％正常山羊血清的PBS制備，達(dá)到最終期望的抗體濃度。需要指出的是，對(duì)于封閉溶液和一抗溶液兩者，所述正常血清可以用來(lái)自其它物種的正常血清替代，這取決于二抗的宿主物種。
封閉后，用1ml/孔稀釋的抗體工作溶液在2-8℃孵育細(xì)胞過(guò)夜。然后，用2ml含有1％BSA的PBS洗細(xì)胞3次，每次5分鐘。
二抗在含有1％BSA的PBS中稀釋。有用的熒光二抗包括Alex488或594綴合的合適的二抗(Invitrogen-Molecular Probes)。根據(jù)廠家的推薦使用這些二抗。用二抗以1ml/孔，在黑暗中室溫下孵育這些細(xì)胞60分鐘。隨后，用2ml含有1％BSA的PBS洗細(xì)胞3次，每次5分鐘。隨后用2ml PBS覆蓋這些細(xì)胞，用熒光顯微鏡觀察。
這些免疫組織化學(xué)結(jié)果見以下實(shí)施例6的描述和表1的總結(jié)。
實(shí)施例6-結(jié)果
將如上文實(shí)施例1所述制備的培養(yǎng)系統(tǒng)用于在MEF-CM中培養(yǎng)hES細(xì)胞。然而，該培養(yǎng)方法不限于此培養(yǎng)基。培養(yǎng)的成功至少部分取決于用于得到、分散和冷凍保存ES細(xì)胞的方法。此外，優(yōu)選已經(jīng)經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期驗(yàn)證的培養(yǎng)方法，例如本發(fā)明的那些方法。
本發(fā)明人優(yōu)化了，例如，使用BD BioCoat MatrigelTM-包被的6孔板，以及用層粘連蛋白/巢蛋白混合物包被的6孔板的培養(yǎng)方法。但是，這些僅是示例性的包衣，本發(fā)明不限于這里描述的這些。該培養(yǎng)方法使用預(yù)先被證明合格的試劑，例如BDTM人bFGF用作培養(yǎng)基補(bǔ)充物，以及BDTMDispase用來(lái)分散hES集落。
采用該方法，使用補(bǔ)充了8ng/ml bFGF的MEF-CM，來(lái)自WiCell的H9和/或H1細(xì)胞系在優(yōu)化的BD BioCoatTM MatrigelTM表面上已培養(yǎng)超過(guò)40次群體倍增。顯微鏡影像顯示這些hES細(xì)胞，和在MEF飼養(yǎng)層上培養(yǎng)的那些hES細(xì)胞相比，典型地在BioCoatTM MatrigelTM表面鋪展更開，形成更大的集落(數(shù)據(jù)未顯示)。
在此新近優(yōu)化的BioCoatTM MatrigelTM表面生長(zhǎng)的細(xì)胞，對(duì)于良好表征的未分化標(biāo)記Oct-3/4和SSEA-4的表達(dá)進(jìn)行的染色為陽(yáng)性，而對(duì)于分化標(biāo)志SSEA1則為陰性。在層粘連蛋白/巢蛋白表面培養(yǎng)的hES細(xì)胞具有相似的細(xì)胞形態(tài)，且細(xì)胞為分化細(xì)胞標(biāo)記SSEA1染色陰性。結(jié)果見下面表1的總結(jié)。
表1 *未分化細(xì)胞標(biāo)記；**分化細(xì)胞標(biāo)記
細(xì)胞形態(tài)和在新鮮包被的BD MatrigelTM板上培養(yǎng)的集落類似，并與以前的報(bào)道一致(Xu等(2001)Nature Biotechnology 9971-974；Carpenter等(2004)Developmental Dynamics 229243-258)。根據(jù)顯微鏡圖像，在此新的BD BioCoatTM MatrigelTM表面于補(bǔ)充FBS但不含bFGF的培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)10代的H9細(xì)胞保留形成胚狀體的能力，這表明這些細(xì)胞的分化能力沒(méi)有被改變。初步的數(shù)據(jù)表明，該表面將很可能與這里描述的成功用于BDMatrigelTM的大量培養(yǎng)基相容，而且該表面也可以用于培養(yǎng)其他ES細(xì)胞，如Greenlee等在2005年所提出的(Toxicology In Vitro 19389-397)。
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品，包括
基底；和在基底上面的自包衣溶液沉積的包衣，所述包衣溶液包含細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和含水溶劑的混合物，其中在所述包衣溶液中總蛋白濃度為大約10μg/ml至約1mg/ml。
2.權(quán)利要求1的細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品，其中所述包衣以干燥狀態(tài)存在于所述基底上。
3.權(quán)利要求1的細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品，其中在所述包衣溶液中總蛋白濃度為大約30μg/ml至約300μg/ml。
4.權(quán)利要求1的細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品，其中在所述包衣溶液中總蛋白濃度為大約30μg/ml至約200μg/ml。
5.權(quán)利要求1的細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品，其中所述包衣包含至少層粘連蛋白和巢蛋白的混合物。
6.權(quán)利要求5的細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品，其中所述包衣進(jìn)一步包括選自以下的成分IV型膠原蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)、生長(zhǎng)因子和它們的組合。
7.權(quán)利要求1的細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品，其中所述包衣包含至少層粘連蛋白和IV型膠原蛋白的混合物。
8.權(quán)利要求7的細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品，其中所述包衣進(jìn)一步包括選自以下的成分巢蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)、生長(zhǎng)因子和它們的組合。
9.權(quán)利要求1的細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品，其中所述包衣包含多種層粘連蛋白的混合物。
10.權(quán)利要求9的細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品，其中所述包衣進(jìn)一步包括選自以下的成分巢蛋白、膠原蛋白IV、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)、生長(zhǎng)因子和它們的組合。
11.權(quán)利要求1的細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品，其中所述含水溶劑是緩沖液或細(xì)胞培養(yǎng)基。
12.權(quán)利要求1的細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品，其中所述基底上的包衣還具有封閉組合物，所述組合物包含至少一種封閉劑和含水溶劑。
13.權(quán)利要求12的細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品，其中所述封閉劑選自明膠、蔗糖和海藻糖。
14.權(quán)利要求12的細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品，其中在所述封閉組合物中封閉劑以大約0.1至大約5.0％w/v的量存在。
15.一種細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品，包括基底；和在基底上的細(xì)胞外基質(zhì)包衣，其中所述包衣以足夠在基底表面上提供飽和水平的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的最小溶液濃度吸附或結(jié)合到所述基底的至少一個(gè)表面上。
16.權(quán)利更求15的細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品，其中所述基底表面吸附或結(jié)合的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的總量為大約200ng/cm2至約650ng/cm2。
17.一種用于增殖多能胚胎干細(xì)胞的裝置，包括
a)適于培養(yǎng)細(xì)胞的容器；以及
b)固定濃度的細(xì)胞外基質(zhì)；
其中所述的細(xì)胞外基質(zhì)包含層粘連蛋白和至少一種其它的細(xì)胞外基質(zhì)成分的混合物；并且其中所述的細(xì)胞外基質(zhì)以干燥狀態(tài)存在于所述容器的至少一個(gè)表面上。
18.權(quán)利要求17的裝置，其中所述細(xì)胞外基質(zhì)包含多種層粘連蛋白的混合物。
19.權(quán)利要求17的裝置，其中所述細(xì)胞外基質(zhì)包含層粘連蛋白和巢蛋白的混合物。
20.權(quán)利要求17的裝置，其中所述細(xì)胞外基質(zhì)包含層粘連蛋白和膠原蛋白IV的混合物。
21.一種用于使培養(yǎng)中的細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品，包括
規(guī)定一表面的基底材料；和
沉積在所述基底表面上的包衣，所述包衣包含至少一種選自膠原蛋白、層粘連蛋白、巢蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白；
其中吸附到所述表面的所述細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的密度是由在所述細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品上和在未包被的對(duì)照細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品上進(jìn)行的ELISA方法得到的光密度(OD)的比率大于約4.0，其中每一OD通過(guò)包括以下步驟的ELISA方法獲得
(a)洗滌所述表面，以除去未吸附的蛋白；
(b)用過(guò)量的抗所述細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的一抗接觸所述表面；
(c)洗滌所述表面，以除去未結(jié)合的抗所述細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的一抗；
(d)用過(guò)量的抗所述一抗并綴合了辣根過(guò)氧化物酶的二抗接觸所述表面；
(e)洗滌所述表面以除去未結(jié)合的二抗；
(f)用一定體積的四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物接觸所述表面以形成反應(yīng)混合物；
(g)在如反應(yīng)混合物的顏色改變所顯示的TMB底物氧化后，將酸性終止溶液加到反應(yīng)混合物中；
(h)在450nm波長(zhǎng)處測(cè)量OD。
22.一種穩(wěn)定的、即用型細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的制備方法，包括
向基底表面施加細(xì)胞外基質(zhì)包衣溶液，其中所述包衣溶液中總蛋白濃度為約10μg/ml至約1mg/ml；
在基底表面上孵育包衣溶液；
從基底上除去孵育的包衣溶液；
在此除去步驟后洗滌基底；和
干燥洗滌后的基底。
23.權(quán)利要求22的方法，進(jìn)一步包括將經(jīng)干燥的基底滅菌。
24.權(quán)利要求22的方法，進(jìn)一步包括在除去步驟后并且在洗滌步驟前或期間，用包括至少一種封閉劑和含水溶劑的封閉細(xì)合物封閉基底的表面。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述封閉劑選自明膠、蔗糖和海藻糖。
26.權(quán)利要求24的方法，其中所述洗滌包括用封閉組合物洗滌基底。
27.權(quán)利要求22的方法，其中所述洗滌包括用蒸餾水或緩沖液洗滌基底。
28.權(quán)利要求23的方法，其中所述滅菌包括UV滅菌。
29.權(quán)利要求23的方法，進(jìn)一步包括在防潮包裝中包裝經(jīng)滅菌、干燥的基底。
30.權(quán)利要求29的方法，進(jìn)一步包括在使用前在-20℃下儲(chǔ)存包裝的、干燥的基底。
31.權(quán)利要求22的方法，包括步驟
a.將含有固定濃度的細(xì)胞外基質(zhì)的第一液體溶液施加給適合于細(xì)胞培養(yǎng)的容器，其中所述細(xì)胞外基質(zhì)包含層粘連蛋白和至少一種其它的細(xì)胞外基質(zhì)成分的混合物；
b.孵育所述容器足夠的時(shí)間以使得細(xì)胞外基質(zhì)和所述容器結(jié)合；
c.從所述容器中抽吸出所述的第一溶液；
d.洗滌所述容器以除去任何殘留在所述容器中的所述第一溶液；和
e.干燥所述容器。
32.一種培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞的方法，包括
提供根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品；
將胚胎干細(xì)胞和培養(yǎng)基的懸浮液加入到所述細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品中；和
在5％CO2、潮濕空氣、37℃下孵育胚胎干細(xì)胞，得到用于胚胎干細(xì)胞擴(kuò)增的未分化的集落。
33.權(quán)利要求32的方法，進(jìn)一步包括在加入胚胎干細(xì)胞懸浮液之前用細(xì)胞培養(yǎng)基水合所述細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品。
34.權(quán)利要求32的方法，其中所述的提供步驟包括在使用細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品前將其融化。
35.權(quán)利要求32的方法，其中所述干細(xì)胞是哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞。
36.權(quán)利要求32的方法，其中所述干細(xì)胞是人胚胎干細(xì)胞。
37.權(quán)利要求32的方法，其中所述培養(yǎng)基是條件細(xì)胞培養(yǎng)基或成分明確的細(xì)胞培養(yǎng)基。
38.權(quán)利要求32的方法，其中所述培養(yǎng)基是補(bǔ)充了堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的MEF條件培養(yǎng)基。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子在培養(yǎng)基中以約4至約20ng/ml的量存在。
40.權(quán)利要求32的方法，包括步驟
a)提供用于增殖多能胚胎干細(xì)胞的裝置，所述裝置包括
i.適于培養(yǎng)細(xì)胞的容器，和
ii.固定濃度的細(xì)胞外基質(zhì)；
其中所述細(xì)胞外基質(zhì)包含層粘連蛋白和至少一種其它的細(xì)胞外基質(zhì)成分的混合物；并且其中所述細(xì)胞外基質(zhì)以干燥狀態(tài)存在于所述容器的至少一個(gè)表面上；
b)將適宜的事先經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)娘曫B(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)而條件化的細(xì)胞培養(yǎng)基加入所述容器中；
c)將適宜濃度的未分化多能胚胎干細(xì)胞加入到所述容器中；和
d)在適宜條件下孵育，使得多能胚胎干細(xì)胞增殖。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于胚胎干細(xì)胞增殖以及在培養(yǎng)中長(zhǎng)時(shí)間地保持該細(xì)胞的自我更新和多能特征的細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品。該細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品包括基底；和在上面自包衣溶液沉積的包衣。所述包衣溶液包括細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和含水溶劑的混合物，其中在包衣溶液中總蛋白濃度為大約10μg/ml至約1mg/ml。
文檔編號(hào)C12M3/04GK101182464SQ20071015963
公開日2008年5月21日 申請(qǐng)日期2007年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月16日
發(fā)明者S·X·錢, S·桑揚(yáng) 申請(qǐng)人:貝克頓·迪金森公司