專利名稱：一種植物花器官特異性啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物啟動(dòng)子，特別是涉及一種植物花器官特異性啟動(dòng)子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
啟動(dòng)子是基因表達(dá)調(diào)控因子中最重要的因子，它基本決定一個(gè)基因是否表達(dá)、何時(shí)表達(dá)和何處表達(dá)。按作用方式和功能，啟動(dòng)子大體可以分為組成型啟動(dòng)子、特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子三大類[王關(guān)林，方宏筠，2002，植物基因工程原理與技術(shù)(第二版)，北京，科學(xué)技術(shù)出版社]。這種分類方式基本上反映了不同類型啟動(dòng)子各自的功能特點(diǎn)，但在某些情況下，一種類型的啟動(dòng)子往往兼有其它類型啟動(dòng)子的特性。
誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(inducible promoter)是指其控制的基因在某些特定的物理、化學(xué)和生物信號(hào)(統(tǒng)稱為“誘導(dǎo)子”或“誘導(dǎo)因子”)的刺激下，可以大幅度地增加轉(zhuǎn)錄水平。其特征為，該類型啟動(dòng)子控制的基因在沒有誘導(dǎo)因子存在的條件下不表達(dá)或者只有非常低的表達(dá)(也稱為“本底表達(dá)”)，但一旦受到誘導(dǎo)因子的誘導(dǎo)，基因的表達(dá)量迅速并且大幅度增加。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子常常根據(jù)其誘導(dǎo)信號(hào)來分類和命名，例如激素誘導(dǎo)啟動(dòng)子[Xu D等，1993，Plant Mol Biol，22(4)573-588；TaylorJE等，1995，Plant J，7(1)129-134]、化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子(Williams S等，1992，Biol/Technol，10540-543；綜述見Padidam M，2003，Curr Opinion in PlantBiol，6 169-177)、光誘導(dǎo)啟動(dòng)子[Sheen JY等，1987，Plant Mol Biol，8(3)227-238；Matsuoka M等，1994，Plant J，6(3)311-319]、熱誘導(dǎo)啟動(dòng)子[SchofflF等，1989，Mol Gen Genet，217(2-3)246-53]、創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動(dòng)子[Farmer EE等，1992，Plant Cell，4129-134；Carrera E等，1998，Plant J，15(6)765-771]、真菌誘導(dǎo)啟動(dòng)子(Fukuda Y等，1994，Plant Mol Biol，24(3)485-493)和共生細(xì)菌誘導(dǎo)啟動(dòng)子(Miao GH等，1993，Plant Cell，5781-786)等。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子往往也多少具有器官和/或組織特異性，例如煙草水楊酸誘導(dǎo)啟動(dòng)子PR-1a主要驅(qū)動(dòng)基因在葉片中表達(dá)(Uknes S等，1993，Plant Cell，5159-169)。
組成型啟動(dòng)子(constitutive promoter)是指在該類型啟動(dòng)子控制下，結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)大體恒定在一定水平上，在不同器官和/或組織的表達(dá)水平也沒有明顯差異。其特點(diǎn)是受其控制的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)具有持續(xù)性，但不具有時(shí)空特異性；RNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量相對(duì)恒定，不受外界因素的誘導(dǎo)，例如玉米Ubiqultin啟動(dòng)子，水稻的Actinl啟動(dòng)子(Wang等，Molecular and Cellular Biology，12(8)3399-3406(1992))，美國專利第5641876)和花椰菜菜葉病毒(CaMV35SRNA)(Odell等，Nature，313810-812(1985))等。
器官或組織特異性啟動(dòng)子(organ-and/or tissue-specific promoter)，是指其調(diào)控基因的表達(dá)往往只發(fā)生在植物體的某一或某些特定的器官和/或組織，或者往往只發(fā)生在植物生長發(fā)育的某一或某些特定階段。其特征是受其控制或調(diào)節(jié)的基因表達(dá)具有明顯的時(shí)空性，并往往表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性。例如，根特異性啟動(dòng)子(Yamamoto YT等，1991，Plant Cell，3371-382)、葉片特異性啟動(dòng)子[Taylor，WC，2001，Plant Mol Biol，46(3)325-333)、果實(shí)特異性啟動(dòng)子(Pear JR等，1989，Plant Mol Biol，13639-651)、花特異性啟動(dòng)子(Van tunen等，1988，EMBO J.，71257)、胚乳特異性啟動(dòng)子[Colot V等，1987，EMBO J，6(12)3559-3564]、棉花纖維特異性啟動(dòng)子(Ma DP等，1997，Biochem Biophys Acta，1344111-114)和韌皮部特異性啟動(dòng)子[Bostwick DE等，1994，Plant Mol Biol，26887-897]等等。
生殖生長是高等植物生活史中的重要階段，而作為執(zhí)行生殖過程的重要器官—花器官的形成與發(fā)育一直受到生物學(xué)家和農(nóng)學(xué)家的廣泛關(guān)注。植物的花發(fā)育過程可分為4個(gè)階段(Koornneefm et al；Ann.Rev.Plant Physiol Plant MolBiol；1998，49345-370)成花誘導(dǎo)、花分生組織形成、花器官原基產(chǎn)生和花器官成熟。因此，花器官的發(fā)育過程是一個(gè)高度復(fù)雜的、有序的生理生化和形態(tài)發(fā)生的過程。在這一過程中，有大量的特異性基因的表達(dá)。
目前世界上已經(jīng)鑒定、分離和功能研究了一些花器官特異性的啟動(dòng)子。一些花器官特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)外源基因在花器官的多個(gè)相對(duì)獨(dú)立的單位表達(dá)，例如，PAL家族的zb8啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因GUS在轉(zhuǎn)基因水稻的花藥、花芽、花托和花絲中都表達(dá)(Zhu Q et al，1995，Plant Mol.Biol.，29535-550)，而另一些花器官特異性啟動(dòng)子則具有花器官某一特定單位的特異性，例如，水稻花藥特異性啟動(dòng)子(Tsuchiya T等，1994，Plant Mol Biol，201189-1193；吳孝槐等，2003，科學(xué)通報(bào)，482154-2161)、番茄花粉特異性啟動(dòng)子LAT52(Twell D等，1989，Mol GenGenet，217240-245)、TomA108(Xu XS and Chen RD，2006，Physiol and Biochem，25231-240)和煙草花藥絨氈層特異性啟動(dòng)子TA29(Koltunow AM等，1990，PlantCell，21201-1224)等等。人們研究還發(fā)現(xiàn)，花色素代謝途徑和花香的揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)的代謝的基因中的很多基因都具有花器官特異性。例如，矮牽牛查爾酮(CHS)基因啟動(dòng)子具有很強(qiáng)的花瓣特異性表達(dá)特性(Van tunen等，1988，EMBO J.，71257)。
花器官特異性基因及其啟動(dòng)子的研究，不僅對(duì)了解花器官分化、形成、生長和發(fā)育的控制基因及其網(wǎng)絡(luò)具有重要的理論意義，而且對(duì)利用基因工程技術(shù)改良植物具有重要的應(yīng)用價(jià)值，特別是在作物人工雄性不育基因工程(Mariani等，1990，Nature，347737-741；肖等，2004，中國發(fā)明專利，ZL00109108.5)、花卉的花形、花色與花期調(diào)控等基因工程(李等，2003，中國生物工程雜志，2342-46)和果樹的縮短童期以及通過提前花期調(diào)整果品上市時(shí)間等基因工程方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
甘藍(lán)(Brassica oleracea L.)是十字花科蕓薹屬重要的蔬菜作物，在世界許多國家作為主要蔬菜栽培。此外，它與油菜等十字花科其它植物的有限雜交親和性為油菜等的品種改良作出了很大的貢獻(xiàn)。例如，甘藍(lán)型油菜已經(jīng)是包括我國在內(nèi)的許多國家和地區(qū)的主要油菜種類之一。
甘藍(lán)花器官相關(guān)基因及其啟動(dòng)子的克隆取得明顯的進(jìn)展，已經(jīng)克隆出自交不親和相關(guān)基因Thl1、Thl2、ARC1基因和雄性不育等相關(guān)基因。這些特異性基因，特別是其啟動(dòng)子，已經(jīng)開始應(yīng)用于基因工程育種(Bhalla等，1998，Mol Breeding，4(12)531-541)。同時(shí)，利用其它植物花特異性啟動(dòng)子改良甘藍(lán)的工作也取得一些進(jìn)展，如，朱育英等(Acta Agriculture Ahanghai，2001，17(1)79-82)將TA29與Barnase基因融合導(dǎo)入甘藍(lán)，觀察到轉(zhuǎn)基因植株有雄蕊退化的雄性不育和不育植株出現(xiàn)。隨著對(duì)環(huán)境保護(hù)意識(shí)的提高和對(duì)食品品質(zhì)要求的提高，人們對(duì)利用源自植物的基因來改良植物或作物的要求也越來越強(qiáng)烈。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種植物花器官特異性啟動(dòng)子及其應(yīng)用。
本發(fā)明所提供的植物花器官特異性啟動(dòng)子，它的核苷酸序列是(1)、序列表中序列1所述的核苷酸序列；或(2)、與(1)所述的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列；或(3)、與(1)或(2)所述的核苷酸序列具有60％或60％以上同源性的核苷酸序列；或(4)、與(1)、(2)或(3)所述的核苷酸序列在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下能夠雜交的核苷酸序列。
上述嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件可為在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次5min；或者在0.5X SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次15min。
序列表中序列1由1244個(gè)脫氧核苷酸組成；自5′端的第1156-1167位脫氧核苷酸為TATA盒(TATA box)。自5′端的第1197位脫氧核苷酸為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。
含有上述花特異性啟動(dòng)子的表達(dá)盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
在所述表達(dá)盒中，所述花器官特異性啟動(dòng)子的下游連接結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因、結(jié)構(gòu)基因的反義基因、調(diào)節(jié)基因的反義基因或者能夠干擾內(nèi)源基因表達(dá)的小RNA，用于驅(qū)動(dòng)結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因、結(jié)構(gòu)基因的反義基因、調(diào)節(jié)基因的反義基因、天然小RNA或人工合成的小RNA的表達(dá)。
含有上述花器官特異性啟動(dòng)子的重組表達(dá)載體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，所述重組表達(dá)載體是含有上述表達(dá)盒與質(zhì)粒、病毒或運(yùn)載體表達(dá)載體所構(gòu)建的重組載體；所述重組表達(dá)載體為重組植物表達(dá)載體；所述重組植物表達(dá)載體包含上述表達(dá)盒并且能夠?qū)⑺龅谋磉_(dá)盒轉(zhuǎn)送進(jìn)入植物宿主細(xì)胞、組織或器官及其后代并且能夠或者至少方便所述的表達(dá)盒整合到宿主的基因組中，它包括但不限于雙元載體、共合載體。
上述重組表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)或基因槍等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織或器官，得到轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或組織或器官及由此分化、再生的完整植株及其無性系或其后代。
本發(fā)明還提供了一種上述花器官特異性啟動(dòng)子的獲得方法，是以甘藍(lán)的基因組DNA為模板，用核苷酸序列是序列表中序列2和核苷酸序列是序列表中序列3的一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到花器官啟動(dòng)子。
實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明花特異性啟動(dòng)子Bofs能夠啟動(dòng)報(bào)告基因GUS在轉(zhuǎn)基因煙草的花器官的花瓣、花藥、柱頭和花粉中特異表達(dá)，而在營養(yǎng)器官都沒有檢測到表達(dá)，并且其后代表現(xiàn)了相同的特點(diǎn)；說明本發(fā)明所提供的啟動(dòng)子Bofs不僅具有強(qiáng)驅(qū)動(dòng)性，而且還具有良好的花器官特異性，并且這種強(qiáng)驅(qū)動(dòng)性和特異性能夠穩(wěn)定地傳遞給后代。因此，本發(fā)明所提供的分離自甘藍(lán)(Brassica oleracea L)的啟動(dòng)子Bofs是一個(gè)穩(wěn)定、驅(qū)動(dòng)力強(qiáng)和特異性高的花器官特異性啟動(dòng)子。
本發(fā)明的植物花器官特異性啟動(dòng)子可在不同植物或作物中表達(dá)并穩(wěn)定遺傳，所述的植物或作物是指顯花植物，根據(jù)不同的植物分類方法，所述的植物或作物可包括但不限于被子植物和裸子植物、單子葉植物和雙子葉植物、草本植物、藤本植物和木本植物、一年生植物和多年生植物、水生和陸生植物以及有性和無性繁殖植物，其中按照水生和陸生植物的分類，所述植物或作物優(yōu)選為陸生植物。
將本發(fā)明的啟動(dòng)子下游銜接內(nèi)源基因的反義基因、能夠干擾內(nèi)源基因表達(dá)的小RNA(包括天然的和人工合成的小RNA)或外源基因，構(gòu)建表達(dá)盒并與不同的表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)化到植物中，利用其花異性表達(dá)活性，在花器官中特異性表達(dá)其控制或指導(dǎo)的所述的反義基因、外源基因或小RNA。在轉(zhuǎn)基因植株中使其內(nèi)源基因的反義基因、能夠干擾內(nèi)源基因表達(dá)的小RNA(包括天然的和人工合成的小RNA)或外源基因的表達(dá)局限于花中，排除了這些基因在植物體其它部位的表達(dá)。
本發(fā)明的花器官特異性啟動(dòng)子，不僅為花器官的分化、形成、生長和發(fā)育的分子機(jī)理等理論研究提供了重要的分子元件，還為植物基因工程育種，特別是花卉植物花形、花色、香味和花期調(diào)控等基因工程育種提供了關(guān)鍵的分子元件。利用該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)內(nèi)源基因的反義基因、能夠干擾內(nèi)源基因表達(dá)的小RNA或外源基因轉(zhuǎn)化植物的細(xì)胞或組織及其后代細(xì)胞后，可以培育花形、花色、花香和育性等不同于受體野生型的花卉作物新品種、培育雄性不育作物品種和培育消除或大幅度減少“飛絮”的園林綠化植物等。


圖1為花器官特異性啟動(dòng)子Bofs克隆的電泳圖。
圖2為花器官特異性啟動(dòng)子Bofs的DNA序列。圖中，下劃線者為引物序列，斜體者為外加的限制性內(nèi)切酶所識(shí)位點(diǎn)，5’端為Hind III位點(diǎn)，3’端為Bam HI位點(diǎn)。
圖3為花器官特異性啟動(dòng)子Bofs驅(qū)動(dòng)GUS基因(即Bofs::GUS融合基因)的植物表達(dá)載體pRDBofsG的構(gòu)建流程圖。
圖4為含有花器官特異性啟動(dòng)子Bofs驅(qū)動(dòng)GUS基因(即Bofs::GUS融合基因)的植物表達(dá)載體pRDBofsG的酶切鑒定圖。
圖5為轉(zhuǎn)pRDBofsG煙草T0代植株的PCR鑒定圖。
圖6為轉(zhuǎn)pRDBofsG煙草T0代植株與未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓昊ò甑腉US染色照片。
圖7為轉(zhuǎn)pRDBofsG煙草T0代植株與未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓曛^的GUS染色照片。
圖8為轉(zhuǎn)pRDBofsG煙草T0代植株與未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓昊ㄋ幍腉US染色照片。
圖9為轉(zhuǎn)pRDBofsG煙草T0代植株與未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓昊ǚ鄣腉US染色照片。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明中所述的啟動(dòng)子核苷酸序列可以是其中一個(gè)或多個(gè)核苷酸發(fā)生取代、缺失、插入或倒位的核苷酸序列，即所分離的核苷酸序列的人工突變體或“天然”突變體，它保留其啟動(dòng)子功能；還可以是所述的核苷酸序列與其它啟動(dòng)子序列或啟動(dòng)子區(qū)保守調(diào)控序列(“motif”或“box”)的融合序列。本發(fā)明中所述的“啟動(dòng)子”錄起始位點(diǎn)(+1)上游并且具有指導(dǎo)RNA聚合酶在正確位置上啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的功能，但不限于該區(qū)域附近的部分；此外，它還含有與除RNA聚合酶以外的蛋白質(zhì)相關(guān)聯(lián)的用于調(diào)節(jié)表達(dá)的另一個(gè)必須區(qū)域。本發(fā)明中所述的“啟動(dòng)子區(qū)域”定義為含有上文中定義的啟動(dòng)子的區(qū)域。本發(fā)明中所述的“啟動(dòng)子活性”是指當(dāng)以某種基因的可表達(dá)方式將其連接到啟動(dòng)子的下游，并導(dǎo)入到宿主中，該宿主顯示具有在宿主內(nèi)或宿主外生產(chǎn)該基因產(chǎn)物的能力和功能時(shí)，該啟動(dòng)子具有啟動(dòng)活性。通常，是將編碼容易定性或定量檢測的蛋白質(zhì)的基因(報(bào)告基因)連接到該啟動(dòng)子的下游，將該基因?qū)胨拗鲀?nèi)，并檢測所表達(dá)的蛋白質(zhì)，可確定特定啟動(dòng)子的活性或是否存在該啟動(dòng)子或者該啟動(dòng)子的效力。本發(fā)明中所述的結(jié)構(gòu)基因是指能夠編碼某種蛋白質(zhì)或其它活性物質(zhì)功能的一段核苷酸序列，包括RNA或DNA序列。所述的調(diào)節(jié)基因是指其編碼的某種RNA或蛋白質(zhì)或其它活性物質(zhì)能夠?qū)ζ渌Y(jié)構(gòu)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)或調(diào)控的一段核苷酸序列，包括RNA或DNA序列。所述的正義基因包括上述的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因。所述的反義基因是指與上述結(jié)構(gòu)基因或調(diào)節(jié)基因編碼的RNA互補(bǔ)的RNA或DNA序列。所述的內(nèi)源基因是指來自宿主自身的基因，包括RNA或DNA序列。所述外源基因是指任何一段核酸序列，并具有編碼某種蛋白質(zhì)或其它活性物質(zhì)功能，包括天然的和人工合成的RNA或DNA序列，該序列與花藥特異性啟動(dòng)子在正常情況不相結(jié)合。所述的小RNA是指分離自生物體的或人工合成的RNA序列片段，其長度通常為20-26個(gè)脫氧核苷酸或者在導(dǎo)入宿舍細(xì)胞后能夠被剪切成20-26個(gè)脫氧核苷酸的RNA片段，它本身對(duì)生物體無毒或毒性極低。
本發(fā)明中所述的表達(dá)載體是指現(xiàn)有技術(shù)中已知的、能夠在植物中進(jìn)行表達(dá)的任何一種植物載體，例如pBin19、pBI121(美國ClonTech公司產(chǎn)品)和pCAMBIA系列(澳大利亞CAMBIA中心產(chǎn)品)等。
本發(fā)明中所述的轉(zhuǎn)化是指現(xiàn)有技術(shù)中已知的、能夠?qū)⑼庠椿驅(qū)胫参锛?xì)胞或植物組織的任何一種植物轉(zhuǎn)化方法，如農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍等。
本發(fā)明中所述的宿主細(xì)胞或宿主組織或宿主器官及其后代細(xì)胞是指所有植物細(xì)胞或植物組織或植物器官或由這些細(xì)胞、組織或器官通過組織分化或無性胚再生并且發(fā)育成熟的整體植株(包括種子)。
術(shù)語“核酸序列”或“核苷酸序列”指含有天然存在的核苷酸或核苷單體的序列。該序列也包括具有相似功能的非天然存在的單體或其部分的修飾的或取代的序列。
術(shù)語“花器官特異性啟動(dòng)子”是指在啟動(dòng)子控制下表達(dá)的基因在沒有或有基礎(chǔ)表達(dá)的植物的花器官表達(dá)而在植物體的其他器官不表達(dá)的啟動(dòng)字。
術(shù)語“具有60％或60％以上同源性的序列”是指與(1)或(2)中的序列相比有60％或60％以上的核苷酸序列相同或相似的那些核酸序列或核苷酸序列，這些序列以基本相同的方式發(fā)揮作用并且能夠驅(qū)動(dòng)其下游基因的花藥特異性表達(dá)，它們與(1)或(2)中序列的差異可能是由于局部結(jié)構(gòu)上的修飾或突變，包括人工突變和非人工突變。
術(shù)語“雜交的序列”是指可以在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下與(1)、(2)、(3)或(4)的序列雜交的核酸序列。“嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件”是指本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，或者可以在分子生物學(xué)或基因工程實(shí)驗(yàn)指南，例如《Molecular Cloning》(3rdEd)(Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，2001)(以下簡稱“《分子克隆》第三版”)中的通用方案中找到，具體為在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次。每次5min.0.5X SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次。每次15min.
下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
T0代表示由愈傷組織得到的轉(zhuǎn)基因植株及其無性系，T1表示T0代自交產(chǎn)生的種子及由它所長成的植株和無性系。
實(shí)施例1、甘藍(lán)(Brassica oleracea L)花器官特異啟動(dòng)子Bofs的克隆與分離1、甘藍(lán)(Brassica oleracea L)總DNA的提取取溫室盆栽的甘藍(lán)品種“黑葉小平頭”(購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所)嫩葉片1-2g，用CTAB法(《分子克隆》第三版)提取總DNA。取1-5ul DNA樣品，用紫外分光光度計(jì)測量其濃度和純度，用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度和完整性。將提取的DNA于-20℃保存。
2、PCR擴(kuò)增與擴(kuò)增片段的回收設(shè)計(jì)并合成如下兩條引物(引物1和引物2)擴(kuò)增甘藍(lán)花器官特異啟動(dòng)子，為了方便以后的克隆和構(gòu)建，在兩條引物的5’端分別加入了限制性內(nèi)切酶HindIII和Bam HI的識(shí)別序列位點(diǎn)(下列引物序列中的下劃線序列)引物15’-AAGCTTAGCAGCACGAATGAAGTTC-3’(Hind III)引物25’-GGATCCTTGTAGTGAGAAAACTCGGGGAA-3’(Bam HI)以步驟1提取的甘藍(lán)基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)
反應(yīng)體系為模板DNA800ng；10X Exbuffer 2ul；dNTP混合物(2.5mM) 2ul；ExTaq DNA Polymerase(5U/u1)0.5ul；引物1(10uM)2ul；引物2(10uM)2ul；無菌重蒸餾水(sddH2O) 補(bǔ)足至20ul。
PCR反應(yīng)程序先預(yù)變性94℃5min；再94℃30sec，50℃30sec，72℃1min 30sec，35個(gè)循環(huán)；最后72℃10min。
PCR反應(yīng)完成后，取15ul擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下快速用一次性刀片切下位于1200bp左右的特異片段，用DNA片段回收試劑盒回收并純化(Easy-NA Gel Extraction Kit，德國Omeg-Bio/TEK產(chǎn)品)，溶于50ulddH2O中，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 3、回收片段的亞克隆與測序?qū)⒉襟E2回收的片段連接到質(zhì)粒載體pUCm-T(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品)，將所得到的重組質(zhì)粒通過“凍融法”(《分子克隆》第三版)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含氨芐青霉素100mg/L的LB固體培養(yǎng)基上于37℃過夜培養(yǎng)，挑取平板上生長的白色菌落，接入含氨芐青霉素100mg/L的LB液體培養(yǎng)基中于37℃過夜培養(yǎng)。當(dāng)菌液濃度達(dá)到OD600為0.6時(shí)，離心收集菌體，按小量堿裂解法(《分子克隆》第三版)提取質(zhì)粒，用限制性酶HindIII和BamHI雙酶切后，用1.0％瓊脂糖凝膠電泳，正確的重組載體應(yīng)在紫外燈下可見分子大小大約分別為2800bp(載體帶)和1200bp(目標(biāo)帶)的兩條帶(圖1，圖中，泳道1為DNA大小分子標(biāo)準(zhǔn)I---Marker I；泳道2為插入上述PCR擴(kuò)增片段的克隆載體的HindIII+BamHI酶切圖)。將通過上述酶切鑒定含有1200bp插入片段的質(zhì)粒(pUBofs)或含有該質(zhì)粒的DH5α送交商業(yè)測序公司測序(原上海博雅生物技術(shù)服務(wù)有限公司，現(xiàn)已并入Introgen公司)，將經(jīng)測序表明正確的重組載體命名為pUBofs。測序結(jié)果表明上述PCR擴(kuò)增得到的片段為甘藍(lán)花器官特異啟動(dòng)子，序列如圖2所示，甘藍(lán)花器官特異啟動(dòng)子具有序列表中序列1的核苷酸序列，將具有序列表中序列1的核苷酸序列的甘藍(lán)花器官特異啟動(dòng)子命名為Bofs。圖2中，下劃線者為所用的引物序列(上述引物1和引物2)，斜體為外加的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(HindIII和BamHI)。
實(shí)施例2、花器官特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因(Bofs::GUS)植物表達(dá)載體pRDBofsG的構(gòu)建花器官特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS融合基因(Bofs::GUS)植物表達(dá)載體pRDBofsG的構(gòu)建流程如圖3所示，具體方法如下將pUBofs經(jīng)限制性內(nèi)切酶HindIII和BamHI雙酶切后，Bofs片段(大約1200bp)，用凍融法(《分子克隆》第三版)或DNA片段回收試劑盒(Easy-NAGel Extraction Kit，德國Omeg-Bio/TEK產(chǎn)品)回收并純化花器官特異啟動(dòng)子Bofs片段，與經(jīng)過HindIII和BamHI雙酶切的植物表達(dá)載體pRD410(加拿大PBI產(chǎn)品)的大片段(大約為13.6kb)相連，得到重組質(zhì)粒。將所得到重組質(zhì)粒用“凍融法”(《分子克隆》第三版)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株DH5a。轉(zhuǎn)化的DH5α在含卡那霉素50mg/L的LB固體培養(yǎng)基上于37℃過夜培養(yǎng)，挑取平板上生長的單菌落，接入含卡那霉素50mg/L的LB液體培養(yǎng)基中于37℃振蕩過夜培養(yǎng)。當(dāng)菌液濃度達(dá)到OD600值0.5-0.6時(shí)，離心收集菌體，按上述小量堿裂解法提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶Hindll和BamHI雙酶切后，在1.0％瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下可見分子大小分別約為13.5kb(pRD410載體帶)和1200bp(Bofs)兩條帶，并且進(jìn)行了測序驗(yàn)證，將酶切和測序表明含有花器官特異啟動(dòng)子Bofs片段和pRD410酶切得到的大片段的重組表達(dá)載體命名為pRDBofsG。pRDBofsG中GUS基因需要花器官特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)。
實(shí)施例3、轉(zhuǎn)Bofs融合基因(Bofs::GUS)煙草的鑒定1、農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)化子的鑒定用CaCl2法(《分子克隆》第三版)制備根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404(美國LifeTechnology公司產(chǎn)品)的感受態(tài)細(xì)胞。利用凍融法(《分子克隆》第三版)將含有Bofs融合基因(Bofs::GUS)的植物表達(dá)載體pRDBofsG轉(zhuǎn)入制備的LBA4404的感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化的LBA4404細(xì)胞接種到含有鏈霉素(Str)100mg/L和卡那霉素(Kan)50mg/L的YEB固體培養(yǎng)基，置于28℃在暗處培養(yǎng)48-72h，挑取平板上的單菌落，接入含有鏈霉素100mg/L和卡那霉素50mg/L的YEB液體培養(yǎng)基，在28℃振蕩過夜培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)物的濃度達(dá)到OD600值0.4-0.6時(shí)，取少量菌液(1.5-2ml)，按上述小量堿裂解法提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶HindIII和BamHI雙酶切鑒定，在1.0％瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下可見分子大小大約分別為13.6kb(載體帶)和1200bp(Bofs)兩條帶(圖4，圖4中，泳道1為pRDBofsG的Hind III+Bam HI雙酶切圖譜；泳道2為雙切λDNA大小分子標(biāo)準(zhǔn)---λDNA/HindIII+EcoRI)，并測序鑒定。結(jié)果表明，植物表達(dá)載體pRDBofsG已經(jīng)成功地轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404。將酶切和測序鑒定表明含有植物表達(dá)載體pRDBofsG的農(nóng)桿菌LBA4404克隆命名為pRDBofsG/LBA4404。
2、轉(zhuǎn)Bofs融合基因(轉(zhuǎn)pRDBofsG)煙草的獲得1)農(nóng)桿菌的準(zhǔn)備挑取攜帶植物表達(dá)載體pRDBofsG的農(nóng)桿菌LBA4404(pRDBofsG/LBA4404)單菌落，接種于5ml含鏈霉素(Str)100mg/L和卡那霉素(Kan)50mg/L的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)過夜培養(yǎng)(大約12h)以活化。取活化的農(nóng)桿菌液，按1∶100的比例加入到含Str 100mg/L和Kan 50mg/L的YEB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600值為0.4-0.6；5000rpm離心5min，收集菌體；用1/2 MS0液體培養(yǎng)基(MS無機(jī)鹽+B5維生素+肌醇0.1g/L+蔗糖30g/L，pH 5.80)洗滌菌體一次，并將其稀釋到離心前菌液3倍體積的1/2 MS液體培養(yǎng)基中，準(zhǔn)備侵染用。
2)煙草的轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)化植株的再生煙草的轉(zhuǎn)化根據(jù)葉盤法(Horsch RB等，1985，Science，2271229-1231)進(jìn)行。選取約30天苗齡的煙草(品種“NC89”，種子購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院)無菌苗，切下鮮嫩濃綠的葉片，用直徑9mm的打孔器制取葉盤外植體；將新制備的外植體投入已準(zhǔn)備好的農(nóng)桿菌(LBA4404/pRDBofsG)菌液中，侵染15min；取出葉盤，用高壓滅菌的吸水紙吸除葉盤表面殘余的農(nóng)桿菌菌液，置于固體再生培養(yǎng)基(MS無機(jī)鹽+B5維生素+肌醇0.1g/L+BA 2.0mg/L+IAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉0.7％，pH 5.8)上暗處共培養(yǎng)2天；然后將共培養(yǎng)的葉盤轉(zhuǎn)到含有羧芐青霉素(Carb)500mg/L和Kan 50mg/L的固體再生培養(yǎng)基在光下(1500-2500Lx，光16h暗8h)進(jìn)行篩選培養(yǎng)，每隔2-3周更換一次培養(yǎng)基，并逐漸降低Carb至200mg/L。待Kan抗性芽長到1-1.5cm時(shí)，將其切下?lián)Q到含有Carb 200mg/L和Kan 50mg/L的固體生根培養(yǎng)基(MS無機(jī)鹽+B5維生素+肌醇0.1g/L+IAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉0.7％，pH 5.80)上誘導(dǎo)生根。所獲得58株完整的卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)pRDBofsG煙草植株用于分子鑒定。
3)轉(zhuǎn)pRDBofsG煙草的分子鑒定首先對(duì)步驟2)得到的Kan抗性轉(zhuǎn)pRDBofsG煙草植株進(jìn)行PCR鑒定。根據(jù)上述的CTAB法提取轉(zhuǎn)pRDBofsG煙草(Kan抗性株)和未轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)照株的葉片基因組DNA，用花器官特異性啟動(dòng)子Bofs兩端的特異性引物對(duì)(引物15’-AAG CTT AGC AGC ACG AAT GAA GTT C-3’；引物25’-GGA TCC TTG TAG5’-AAG CTT AGC AGC ACG AAT GAA GTT C-3’；引物25’-GGA TCC TTG TAGTGA GAA AAC TCG GGG AA-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，轉(zhuǎn)pRDBofsG煙草均擴(kuò)增得到大小為1200bp的目標(biāo)帶，而未轉(zhuǎn)化的對(duì)照煙草在相應(yīng)位置則沒有擴(kuò)增出此目標(biāo)片段(部分PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖5所示，圖5中，泳道1-7為不同的轉(zhuǎn)pRDBofsG煙草(Kan抗性株)T0代植株；泳道NC89為未轉(zhuǎn)基因植株對(duì)照(陰性對(duì)照)；泳道Bofs為載體質(zhì)粒對(duì)照(陽性對(duì)照)；泳道M為DNA大小分子標(biāo)準(zhǔn)(marker))。這一結(jié)果初步表明目標(biāo)基因(Bofs::GUS)已整合到煙草基因組中。
實(shí)施例4、轉(zhuǎn)pRDBofsG煙草GUS基因表達(dá)的組織化學(xué)檢測將同時(shí)具有卡那霉素抗性和PCR呈陽性的轉(zhuǎn)pRDBofsG煙草T0代株系(株系2、6、7、9、11、12、14)和未轉(zhuǎn)基因的煙草NC89對(duì)照植株(CK)試管苗在三角瓶中開口煉苗一周，然后移入裝有普通花卉營養(yǎng)土的花盆，在溫室中培養(yǎng)，套袋保濕一周后去袋，進(jìn)行常規(guī)管理。
轉(zhuǎn)pRDBofsG煙草GUS基因表達(dá)的組織化學(xué)檢測按照J(rèn)efferson RA[1987，PlantMol Biol Rep，5(4)387-405]的方法進(jìn)行。在花器官的不同發(fā)育時(shí)期(按照文獻(xiàn)(曹克浩，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，水稻Osg6B啟動(dòng)子的序列和功能分析及大腸桿菌argE基因的克隆和對(duì)煙草的轉(zhuǎn)化，2003年)方法劃分花器官發(fā)育時(shí)期)，將轉(zhuǎn)pRDBofsG煙草及其對(duì)照(煙草品種“NC89”，種子購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院)的新鮮的根、莖、葉、花萼、花瓣、花絲、子房、柱頭和花藥在X-GLuc溶液中溫育24-48h進(jìn)行染色，然后將染色的植物材料分別用70％和100％的乙醇徹底漂洗脫色和固定，在顯微鏡下觀測樣品并拍照。
花器官GUS染色的結(jié)果如表1所示，結(jié)果表明，未轉(zhuǎn)基因的煙草NC89對(duì)照植株(CK)的各個(gè)器官都不能染色，而在在檢測的轉(zhuǎn)pRDBofsG煙草的7個(gè)PCR陽性T0代株系中，所有株系的花藥都能不同程度地被染色(圖8，圖8中A為未轉(zhuǎn)基因的煙草NC89對(duì)照植株，B為轉(zhuǎn)pRDBofsG煙草T0植株)。5個(gè)株系(除2和12)在花瓣、柱頭中不同程度地被染色(圖6，圖7，圖6和圖7中A均為未轉(zhuǎn)基因的煙草NC89對(duì)照植株，B均為轉(zhuǎn)pRDBofsG煙草T0植株)。在株系6和11中花粉不同程度的被染色(圖9，圖9中A為未轉(zhuǎn)基因的煙草NC89對(duì)照植株，B為轉(zhuǎn)pRDBofsG煙草T0植株)。在所有株系中花絲、子房等均未染出藍(lán)色。這些結(jié)果顯示出GUS染色的花器官特異性，即表明啟動(dòng)子Bofs具有花器官特異性驅(qū)動(dòng)活性。圖6為未轉(zhuǎn)基因?qū)φ?A)與轉(zhuǎn)pRDBofsG煙草(B)的花瓣GUS染色；圖7為對(duì)照(A)與轉(zhuǎn)pRDBofsG煙草(B)的柱頭GUS染色。圖8為未轉(zhuǎn)基因的對(duì)照(A)與轉(zhuǎn)pRDBofsG煙草(B)的花藥GUS染色。圖9為未轉(zhuǎn)基因的對(duì)照(A)與轉(zhuǎn)pRDBofsG煙草(B)的花粉GUS染色。轉(zhuǎn)pRDBofsG煙草的營養(yǎng)器官如根、莖、葉未見GUS活性。
表1、轉(zhuǎn)pRDBofsG煙草T0代的GUS染色

注表中“+”表示GUS染色陽性；“+++”表示染色最強(qiáng)；“-”表示GUS染色陰性，實(shí)施例5轉(zhuǎn)pRDBofsG煙草T1代GUS表達(dá)將轉(zhuǎn)pRDBofsG煙草T0代株系6、11和14所結(jié)的種子(T1代)及其未轉(zhuǎn)基因的對(duì)照種子(NC89)表面消毒后接種到含有和不含Kan的種子萌發(fā)培養(yǎng)基(1/2MS)，暗培養(yǎng)7天，后置于光下于25±1℃培養(yǎng)。在不含Kan的培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)pRDBofsG煙草和未轉(zhuǎn)基因的對(duì)照種子都能夠發(fā)芽(發(fā)芽率95％以上)，并且小苗呈綠色。在含100mg/L Kan的培養(yǎng)基上，未轉(zhuǎn)基因的對(duì)照種子的有部分雖然也能夠發(fā)芽，小苗都白化而死亡；但轉(zhuǎn)pRDBofsG煙草的種子苗有近70％呈綠色，且生長正常。培養(yǎng)30天左右，將轉(zhuǎn)pRDBofsG煙草T0代株系6、11和14的T1代Kan抗性苗各隨機(jī)選其中一株進(jìn)行試管培養(yǎng)，得到旺盛生長的大苗后取其營養(yǎng)器官進(jìn)行GUS染色。T1苗長到有2-3片真葉時(shí)取葉盤進(jìn)行體外抗Kan試驗(yàn)，每個(gè)株系隨機(jī)選留3株發(fā)育到成熟，發(fā)育過程中，取不同的器官和組織按照前文已述的方法進(jìn)行GUS染色，以確定轉(zhuǎn)pRDBofsG煙草中Bofs::GUS在T1代表達(dá)的穩(wěn)定性和特異性。結(jié)果如表2所示。
表2、轉(zhuǎn)pRDBofsG煙草T1代Kan抗性苗的GUS染色

注表中“+”表示GUS染色陽性；“+++”表示染色最強(qiáng)；“-”表示GUS染色陰性，由表2可以看出，由Bofs驅(qū)動(dòng)的GUS基因在轉(zhuǎn)pRDBofsG煙草中能夠穩(wěn)定地傳遞給后代，并且GUS基因在所有檢測的后代植株試管苗和溫室苗的營養(yǎng)器官都不表達(dá)，只特異性地在花器官中表達(dá)。
上述的實(shí)施例結(jié)果表明并且確證，本發(fā)明所提供的甘藍(lán)(Brassica oleracea L)啟動(dòng)子Bofs不僅具有強(qiáng)驅(qū)動(dòng)性，而且還具有良好的花器官特異性，并且這種強(qiáng)驅(qū)動(dòng)性和特異性能夠穩(wěn)定地傳遞給后代。因此，本發(fā)明所提供的分離自甘藍(lán)(Brassicaoleracea L)的啟動(dòng)子Bofs是一個(gè)穩(wěn)定、驅(qū)動(dòng)力強(qiáng)和特異性高的花器官特異性啟動(dòng)子。
序列表<160>1<210>1<211>1244<212>DNA<213>十字花科蕓薹屬甘藍(lán)(Brassicia.oleracea L.)<400>1aagcttagca gcacgaatga agttcgtcaa gtttttaatt aggcttcgct tcttgtgatt 60catcgaaaat ttatatcatt tcatacgttc attcttgttt tcatgtgact ttcctcttct120ctaccgtgag tctcatcaat ttcgtagatc gctatgttaa cgatccacgt atcatatata180caccttcttt ctatagccgt acgtatacca cacattacct catcccactt cctaacttat240ataattttac tactcagatc acaagtgtac gtatatcatg aagtcatttc ttctccttgt300cctactcctc tctttctttg tcggctctat cttcgctagt aggaattttc cgacgcaccc360ctatccaagt atgtatgctc ttcaattctc tctcactctc cttaatttta cccacctctt420tcactatctt caacgtcttt taacttgttc aattatgttc gtgtgggtgg gcaggtcata480atcatcatca tgtcggaatg atgggtagga aaatgaagcg tcagaggagg ccggacacgg540tgcaggtggc agggtctagg ctgccggact gctcacacgc gtgtggctca tgctccccat600gccgtcttgt gatggttagc ttcgtgtgtg catcgctaga ggaggctgag acttgtccca660tggcttataa gtgcatgtgc aagaacaaat cctaccccgt cccatgatga attagcctct720ctcacactta actctgtgca ttcagacgtt ttgtttcttt ccttttgctt cttcggataa780atgaccatgt gtatgtataa aatgcatctt ttcctttttt taattctgtt tgtctttttg840atatcttaaa cacagtttta cgaaacaaga ataagattag ttgagccact caaaagcgtg900gtcgactaaa ttgaaacaga aagccacaca actcattggg ctcttgttta tggcccatga960caccgcattt cagactgcaa caaccaaagt tgtagaaaga ataatattta aagggcacgt 1020acatacgttg ttggcttcca ccaaactttg gaggctctct aataattagc acactccatt 1080ctatgcattt gttacacacc ttctattttc aaccatttca tctcaccttt tttaaatgtt 1140tccacagtta gctcagtaaa ttcactatat acagacatac accttccctc cacaagacca 1200aacaaccaca ctaccttccc cgagttttct cactacaagg atcc1244<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2aagcttagca gcacgaatga agttc25<210>3<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3ggatccttgt agtgagaaaa ctcggggaa29
權(quán)利要求
1.一種植物花器官特異性啟動(dòng)子，其特征在于它的核苷酸序列是(1)、序列表中序列1所述的核苷酸序列；或(2)、與(1)所述的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列；或(3)、與(1)或(2)所述的核苷酸序列具有60％或60％以上同源性的核苷酸序列；或(4)、與(1)、(2)或(3)所述的核苷酸序列在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下能夠雜交的核苷酸序列。
2.含有權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子的表達(dá)盒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的表達(dá)盒，其特征在于所述啟動(dòng)子的下游連接所述花器官特異性啟動(dòng)子的下游連接結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因、結(jié)構(gòu)基因的反義基因、調(diào)節(jié)基因的反義基因或者能夠干擾內(nèi)源基因表達(dá)的小RNA。
4.含有權(quán)利要求1所述啟動(dòng)子的重組表達(dá)載體。
5.含有權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)盒的重組表達(dá)載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體是由權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)盒與質(zhì)粒、病毒或運(yùn)載體表達(dá)載體所構(gòu)建的重組載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體為雙元載體或共合載體。
8.由權(quán)利要求4-7任一所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物組織或植物器官得到的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或組織或器官。
9.權(quán)利要求1所述的花器官特異性啟動(dòng)子在培育不同花形、花色、花香和/或長貨架壽命花卉植物或作物品種和/或品系、培育“飛絮”消除或大幅度減少的飛絮園林綠化植物或作物品種和/或品系、培育授粉受精能力增強(qiáng)或者減弱的植物或作物品種和/或品系或者是培育能夠防止通過花粉漂移而污染其野生種和近緣種的轉(zhuǎn)基因植物或作物品種和/或品系中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物是顯花植物；優(yōu)選為陸生植物。
11.一種權(quán)利要求1所述的花藥特異性啟動(dòng)子的獲得方法，是以甘藍(lán)的基因組DNA為模板，用核苷酸序列是序列表中序列2和核苷酸序列是序列表中序列3的一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到啟動(dòng)子。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種植物花器官特異性啟動(dòng)子及其應(yīng)用。該啟動(dòng)子的核苷酸序列是(1)序列表中序列1所述的核苷酸序列；或(2)，與(1)所述的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列；或(3)，與(1)或(2)所述的核苷酸序列具有60％或60％以上同源性的核苷酸序列；或(4)，與(1)，(2)或(3)所述的核苷酸序列在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下能夠雜交的核苷酸序列。本發(fā)明的啟動(dòng)子是一個(gè)穩(wěn)定、驅(qū)動(dòng)力強(qiáng)和特異性高的花器官特異性啟動(dòng)子。利用本發(fā)明的啟動(dòng)子可以培育花形、花色、花香和育性等不同于受體野生型的花卉作物新品種、培育雄性不育作物品種和培育消除或大幅度減少的“飛絮”的園林綠化植物等。
文檔編號(hào)C12N15/10GK101063138SQ200710098728
公開日2007年10月31日 申請日期2007年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月25日
發(fā)明者肖興國, 耿安奇, 趙占軍, 聶絢麗 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 被以下專利引用 (1),