專利名稱：氟蟲腈半抗原化合物、合成方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及選擇一種具有-COOH的、又最大可能包含氟蟲腈原有結(jié)構(gòu)的化合物作為 氟蟲腈半抗原以及該半抗原的合成方法和用途。
背景技術(shù)：
本發(fā)明屬于農(nóng)藥小分子化合物(分子量小于1000道爾頓)免疫化學(xué)和殘留分析技術(shù)
領(lǐng)域，涉及有機(jī)合成，免疫化學(xué)及生物化學(xué)等，依靠免疫學(xué)、免疫化學(xué)基本原理和生物技
術(shù)手段；設(shè)計(jì)、合成小分子目標(biāo)分析物半抗原，并與載體蛋白質(zhì)偶聯(lián)，制備有效人工抗原， 免疫動(dòng)物制備對(duì)小分子分析物特異性抗體，利用抗原抗體的特異性免疫學(xué)反應(yīng)和易被檢測(cè) 識(shí)別的標(biāo)記物的放大作用，定量地檢測(cè)樣本中超微量小分子目標(biāo)分析物，具有特異、靈敏、 準(zhǔn)確、快速、方便、廉價(jià)等特點(diǎn)。該技術(shù)研究的關(guān)鍵是半抗原的分子設(shè)計(jì)、合成和人工全 抗原及抗體的制備，因此，目標(biāo)分析物分子免疫學(xué)特性以及如何通過(guò)化學(xué)或生化技術(shù)突出 和利用這些特性是該領(lǐng)域極為重要的研究?jī)?nèi)容，這一技術(shù)目前已成為農(nóng)藥殘留痕量分析研 究的一個(gè)嶄新領(lǐng)域，被列為當(dāng)前優(yōu)先研究、開發(fā)和利用的農(nóng)藥殘留分析技術(shù)；世界糧農(nóng)組 織(FAO)已向許多國(guó)家推薦此項(xiàng)技術(shù)，美國(guó)化學(xué)將免疫分析與氣相色譜，液相色譜共同 列為農(nóng)藥殘留分析的支柱技術(shù)。
影響免疫化學(xué)分析質(zhì)量的根本因素是抗體的選擇性(或特異性)與親和性，這些性質(zhì) 又決定于免疫半抗原分子的結(jié)構(gòu)，因此，免疫半抗原的分子設(shè)計(jì)與合成是建立小分子免疫 化學(xué)分析的關(guān)鍵步驟。分子是構(gòu)成物質(zhì)的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，化合物內(nèi)部分子結(jié)構(gòu)特征及分子間的 組合方式等結(jié)構(gòu)信息決定了化合物所表現(xiàn)的性質(zhì)，也就是說(shuō)，化合物的理化性質(zhì)，生物活 性及免疫原性等都是以分子為主體來(lái)表示和解釋的。
農(nóng)藥小分子必須與大分子物質(zhì)連接后才能刺激動(dòng)物產(chǎn)生特異性抗體，這已成為小分子 免疫分析的基本模式。因此，半抗原的合成與鑒定試驗(yàn)是產(chǎn)生特異性抗體和建立農(nóng)藥殘留 快速檢測(cè)技術(shù)研究最基礎(chǔ)和最關(guān)鍵的步驟。理想的半抗原一方面應(yīng)具備待測(cè)物的特征結(jié) 構(gòu)，特別是立體化學(xué)特征；另一方面半抗原與載體連接后應(yīng)保證待測(cè)物的特征結(jié)構(gòu)能最大 程度地為免疫活性細(xì)胞識(shí)別和結(jié)合，以制備出具有預(yù)期選擇性的抗體。①半抗原通常由待
測(cè)物衍生化制備，或由原料合成，待測(cè)物的代謝或降解產(chǎn)物往往是有用的半抗原；②除待 測(cè)物特征結(jié)構(gòu)外，在半抗原的未端需有可直接或間接與載體蛋白質(zhì)偶聯(lián)的活性基團(tuán)；③在 活性基團(tuán)與載體之間，必須有一定長(zhǎng)度的間隔臂，以便使半抗原突出于載體表面，易為有 機(jī)免疫系統(tǒng)識(shí)別；④間隔臂應(yīng)遠(yuǎn)離待測(cè)物的特征結(jié)構(gòu)部分和官能團(tuán)；⑤半抗原的設(shè)計(jì)應(yīng)考 慮到農(nóng)藥原藥和有毒理學(xué)意義的代謝物，以及測(cè)定對(duì)象是單一的農(nóng)藥或某一類農(nóng)藥；⑥機(jī) 體的免疫應(yīng)答是個(gè)十分復(fù)雜的生化過(guò)程，半抗原誘導(dǎo)的抗體的選擇性和親合性尚難預(yù)測(cè)， 多數(shù)情況下宜合成幾種結(jié)構(gòu)的半抗原進(jìn)行研究。
氟蟲腈，商品名銳勁特，是拜耳作物科學(xué)公司(原羅納普朗克農(nóng)化公司)于1987年 開發(fā)出來(lái)的一種苯基吡唑類殺蟲劑，其殺蟲譜廣，對(duì)害蟲以胃毒作用為主，兼有觸殺和一 定的內(nèi)吸作用，對(duì)蚜蟲、葉蟬、飛虱、鱗翅目幼蟲、蠅類和鞘翅目等重要害蟲有很高的殺 蟲活性，對(duì)作物無(wú)藥害，與常規(guī)農(nóng)藥無(wú)交互抗性。適用于水稻、蔬菜、棉花、煙草、馬鈴 薯、甜菜、大豆、油菜、茶葉、苜蓿、甘蔗、高粱、玉米、果樹、森林、觀賞植物、公共 衛(wèi)生、畜牧業(yè)、貯存產(chǎn)品及地面建筑等防除各類作物害蟲和衛(wèi)生害蟲。該品種同時(shí)獲得多 國(guó)專利，全球銷售額突破l億美元，成為農(nóng)藥殺蟲劑中支柱產(chǎn)品之一，在90個(gè)國(guó)家銷售。
氟蟲腈對(duì)水稻二化螟、稻飛虱、蝗蟲、小菜娥等害蟲有較好的防治效果。隨著該農(nóng)藥 在全球的銷量不斷上升，以及人們對(duì)農(nóng)藥的誤用、濫用，環(huán)境樣品中氟蟲腈的殘留情況曰 趨嚴(yán)重。而且該農(nóng)藥具有慢性神經(jīng)毒性作用，300mg/kg的經(jīng)口劑量可致小鼠甲狀腺癌，被 定為C類致癌物質(zhì)。尤其是該農(nóng)藥對(duì)水生甲殼類動(dòng)物魚、蝦、蟹的毒性特高(劇毒)，對(duì) 蜜蜂的毒性也相當(dāng)高(高毒)，并且在環(huán)境中代謝緩慢，其中有兩種代謝產(chǎn)物的毒性高出 母體農(nóng)藥對(duì)哺乳動(dòng)物毒性的10倍以上，且在生物體脂肪內(nèi)有富集作用，是一種生態(tài)環(huán)境 毒副作用較大的農(nóng)藥，需要對(duì)其進(jìn)行嚴(yán)格的監(jiān)控。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種氟蟲腈人工半抗原及其半抗原的合成方法和用途。
為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種氟蟲腈人工半抗原，其分子結(jié)構(gòu)式為

發(fā)明內(nèi)容
其中n=l 5。此種半抗原化合物是從氟蟲腈-CN活性基團(tuán)出發(fā)最大程度保留氟蟲腈的 結(jié)構(gòu)，在腈基水解為羧酸的基礎(chǔ)上再接入不同長(zhǎng)度的連接臂，并具有可以與氨基酸偶聯(lián)的 基團(tuán)-COOH。
其中優(yōu)選的是當(dāng)n二3時(shí)，分子結(jié)構(gòu)式為
本發(fā)明還提供了上述氟蟲腈人工半抗原的合成方法，包括下列步驟
1) 克分子比為1: 6的氟蟲腈原藥與硫酸在乙二醇溶劑中，138 142QC下回流反應(yīng) 48小時(shí)，生成5-氨基-1- (2， 6-二氯-4-(三氟甲基)苯基)-4-(三氟甲基亞磺?；?-1H-吡唑-3-羧酸；
2) 克分子比為1: 2 6的5-氨基-1- (2， 6-二氯-4-(三氟甲基)苯基)-4-(三氟甲基 亞磺?；?-1H-吡唑-3-羧酸與二氯亞砜，即SOCl2反應(yīng)生成5-氨基-l- (2， 6-二氯-4-(三 氟甲基)苯基)-4-(三氟甲基亞磺酰基)-但-吡唑-3-酰氯；
3) 克分子比為1: 1 3的5-氨基-1- (2， 6-二氯-4-(三氟甲基)苯基)-4-(三氟甲基 亞磺?；?-lH-吡唑-3-酰氯與n=l 5時(shí)的直鏈氨基酸在堿性條件下發(fā)生取代反應(yīng)，得氟 蟲腈人工半抗原。
上述n^l 5時(shí)的直鏈氨基酸即指氨基乙酸、3-氨基丙酸、Y-氨基丁酸、5-氨基戊酸、 6-氨基己酸。
作為本發(fā)明的氟蟲腈人工半抗原的合成方法的改進(jìn)在步驟3)中5-氨基-1- (2， 6-二氯-4-(三氟甲基)苯基)-4-(三氟甲基亞磺?；?-111-吡唑-3-酰氯與氨基丁酸在堿性條 件下發(fā)生取代反應(yīng)，生成4- (5-氨基-1- (2， 6-二氯-4-(三氟甲基)苯基)-4-(三氟甲基 亞磺?；?-1&吡唑-3-甲酰胺基)丁酸，即下述反應(yīng)路線中的化合物5。
當(dāng)11=5時(shí)，分子結(jié)構(gòu)式為:
作為本發(fā)明的氟蟲腈人工半抗原的合成方法的另一種改進(jìn)在步驟3)中5-氨基-1-(2， 6-二氯-4-(三氟甲基)苯基)-4-(三氟甲基亞磺?；?-1&吡唑-3-酰氯與6-氨基己酸在堿 性條件下發(fā)生取代反應(yīng)，生成6- (5-氨基-1- (2， 6-二氯-4-(三氟甲基)苯基)-4-(三氟 甲基亞磺酰基)-111-吡唑-3-甲酰胺基)己酸，即下述反應(yīng)路線中的化合物6。
本發(fā)明還提供了上述半抗原化合物的用途是用作動(dòng)物免疫的抗原體系的原料。
本發(fā)明的氟蟲腈人工半抗原的合成方法，是通過(guò)這樣的技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的
以氟蟲腈原藥1為原料，通過(guò)與硫酸反應(yīng)使腈基水解成羧基得到5-氨基-1- (2， 6-二 氯-4-(三氟甲基)苯基)-4-(三氟甲基亞磺?；?-1H-吡唑-3-羧酸，即化合物3;化合物 3與30<:12反應(yīng)生成5-氨基-1- (2， 6-二氯-4-(三氟甲基)苯基)-4-(三氟甲基亞磺?；? 4H-吡唑-3-酰氯，即化合物4;化合物4在堿性條件下與Y-氨基丁酸(或6-氨基己酸)反 應(yīng)，生成4- (5-氨基-1- (2， 6-二氯-4-(三氟甲基)苯基)-4-(三氟甲基亞磺?；?-1H-吡唑-3-甲酰胺基)丁酸(或6- (5-氨基-1- (2， 6-二氯-4-(三氟甲基)苯基)-4-(三氟甲 基亞磺?；?-111-吡唑-3-甲酰胺基)己酸)，即生成化合物5或化合物6，反應(yīng)路線如下所
示
本發(fā)明的氟蟲腈半抗原化合物的合成方法進(jìn)一步描述如下
氟蟲腈原藥與硫酸(克分子比為1: 6)在乙二醇溶劑中，138 142GC下回流反應(yīng)48 小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后加水、乙酸乙酯和乙醚，分層后乙酸乙酯層用飽和NaHC03溶液提取， NaHC03水層調(diào)酸后用乙酸乙酯提取水層；該乙酸乙酯層經(jīng)無(wú)水NaSCU干燥，濃縮，硅膠 板分離(乙酸乙酯石油醚甲酸二5:12:0.1)，得白色固體物質(zhì)5-氨基-1- (2， 6-二氯-4-(三氟甲基)苯基)-4-(三氟甲基亞磺?；?-1&吡唑-3-羧酸，即化合物3。
在化合物3的基礎(chǔ)上，使其與S0C12卯。C回流反應(yīng)3小時(shí)，使Cl原子取代一COOH 中的羥基生成酰氯(即化合物4);酰氯與等當(dāng)量的，氨基丁酸(或6-氨基己酸)在堿性條 件下發(fā)生取代反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，加水，用6N鹽酸調(diào)酸，酸水用乙酸乙酯提取， 乙酸乙酯層用飽和鹽水洗滌至中性后用7 8^NaHC03溶液提取，NaHC03水層調(diào)酸后用 乙酸乙酯提取水層；該乙酸乙酯層經(jīng)無(wú)水NaS04干燥，濃縮，硅膠板分離(乙酸乙酯石 油醚甲酸=25: 75: 1.0)，得白色固體物質(zhì)氟蟲腈半抗原，即化合物5或化合物6。
本發(fā)明的氟蟲腈半抗原的設(shè)計(jì)位點(diǎn)在氟蟲腈分子結(jié)構(gòu)中一CN和一NH2位置，而分子 的特征集團(tuán)(決定簇)是苯環(huán)和咪唑，在不改變這兩個(gè)基團(tuán)的前提下，以氨基作為活性基 團(tuán)可直接與載體蛋白偶聯(lián)，本發(fā)明將該活性氨基與琥珀酸酐反應(yīng)使其變成一個(gè)有臂長(zhǎng)的羧 基；以腈基作為活性基團(tuán)可在酸性條件下使腈基水解成羧基，然后接上不同長(zhǎng)度的連接臂。 這一系列的半抗原可用來(lái)篩選提高氟蟲腈抗體的特異性，進(jìn)而為ELISA方法的建立和優(yōu)化 提供有力條件。
本發(fā)明的半抗原化合物，不僅合成方法簡(jiǎn)便、純度較高，而且能應(yīng)用于合成適于動(dòng)物 免疫的抗原體系。所得抗體用于ELISA方法檢測(cè)氟蟲腈時(shí)，最低檢測(cè)限可達(dá)4.8ug/L，與 其他乙硫氟蟲腈、氟蟲脲、伏蟲隆、氟樂(lè)靈、三氟氯氰菊酯、定蟲隆農(nóng)藥的交叉反應(yīng) 率都很低。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、5-氨基-1- (2， 6-二氯-4-(三氟甲基)苯基)-4-(三氟甲基亞磺?；?
一!H-吡唑-3-羧酸，分子結(jié)構(gòu)式為:
<formula>formula see original document page 9</formula>
，即化合物3的合成方
法如下:
1)、 250ml三口燒瓶中加入4.51g96.7^的氟蟲腈原藥(O.Olmol)， 50ml乙二醇，緩慢 加熱并攪拌使其溶解，待完全溶解后，緩慢滴加6.92g85X的濃硫酸，繼續(xù)加熱攪拌138 142QC下回流反應(yīng)48小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后加入乙酸乙酯30ml，乙醚10ml再加100ml水,轉(zhuǎn)入 250ml分液漏斗分層，再用30ml乙酸乙酯和10ml乙醚提取乙二醇與水層2次；合并乙酸 乙酯和乙醚層，用飽和NaHC03溶液提取乙酸乙酯乙醚層4次，30ml/次；NaHC03水層用 濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至3-4，有白色固體物質(zhì)析出，再用乙酸乙酯提取水層3次，30ml欣；合 并乙酸乙酯層，用無(wú)水NaS04干燥，減壓濃縮，得淡黃色油狀物1.00g (化合物3)，收率 22.1%。
化合物3的結(jié)構(gòu)鑒定
5-氨基-1- (2， 6-二氯-4-(三氟甲基)苯基)-4-(三氟甲基亞磺酰基)—1H-吡唑-3-羧 酸，即C12H5N3C12F6S03。
取上述合成的產(chǎn)物分別經(jīng)ESI-MS和'H-NMR測(cè)定其分子結(jié)構(gòu)。質(zhì)譜(MS， +c ESI) 測(cè)定結(jié)果m/z為454 (M-H)+(100%), 456 (M+2-H) + (66.7%)，可以看出化合物3的分子量 為455，分子中含有兩個(gè)C1。
核磁共振氫譜數(shù)據(jù)^ NMR (400MHz, CDC13, S ppm):
6.3 (s, 2H,-麗2); 7.1 (s, 2H,-Ar//)。
元素分析(％，計(jì)算值)C: 31.71 (31.60); H: 1.20 (1.11); N: 9.29 (9.21)。 實(shí)施例2、一種氟蟲腈人工半抗原FH1，分子結(jié)構(gòu)式為
<formula>formula see original document page 9</formula>
是用作動(dòng)物免疫的抗原體系的原料。
上述氟蟲腈人工半抗原合成方法如下:
1) 稱取化合物3 (實(shí)施例l所得)0.64g置100ml三口燒瓶中，恒壓漏斗滴加10ml 重蒸二氯亞砜(S0Cl2劇毒，操作在通風(fēng)柜進(jìn)行，并帶防毒面具)，在卯"油浴上攪拌回流 反應(yīng)3小時(shí)，待反應(yīng)物冷卻后，減壓脫去過(guò)量的二氯亞砜，得棕色油狀物(化合物4)，用 10ml二噁烷(1， 4一二氧六環(huán))溶解后，成二噁垸溶液備用。
2) 稱取Y—氨基丁酸0.3g，溶解于2mlNaOH(4mol/L)溶液中，將此溶液置于100ml 三口燒瓶中，燒瓶置于冰浴，開動(dòng)攪拌；分5次加入上述二噁烷溶液，間隔5 10分鐘， 后四次同時(shí)加入lmlNaOH(4mol/L)溶液，加液完畢后繼續(xù)攪拌反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后， 反應(yīng)液中加50ml水，用6N鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值為4，將此混合液轉(zhuǎn)移到250ml分液漏斗 中，用乙酸乙酯提取3次，30ml/次；合并乙酸乙酯層，用飽和鹽水洗滌至中性后用7 8 %NaHC03溶液提取4次，30ml/次；30ml乙醚去雜，NaHC03水層用濃鹽酸調(diào)至pH至3-4， 然后用乙酸乙酯提取水層3次，30ml/次；該乙酸乙酯層經(jīng)無(wú)水NaS04干燥，濃縮得淡黃
色固體，硅膠板分離(乙酸乙酯石油醚甲酸二25: 75: 1.0)，得白色固體物質(zhì)氟蟲
腈半抗原FH1，即化合物5。
氟蟲腈半抗原FH1 (化合物5)的結(jié)構(gòu)鑒定-
4- (5-氨基-1- (2， 6-二氯陽(yáng)4-(三氟甲基)苯基)-4-(三氟甲基亞磺酰基)-111-吡唑-3-甲酰胺基)丁酸，即C16H12N4C12F6S04。
取上述合成的產(chǎn)物分別經(jīng)ESI-MS和iH-NMR測(cè)定其分子結(jié)構(gòu)。質(zhì)譜(MS， +cESI) 測(cè)定結(jié)果m/z為539 (M-H)+(100%),541 (M+2-H) + (66.7%)，可以看出化合物5的分子量 為540，分子中含有兩個(gè)C1。
核磁共振氫譜數(shù)據(jù)& NMR (400MHz, CDC13, S ppm):
1.96 (m， 2H， -CH2C//2CH2) 2,42 (t， 2H,-C//2COOH); 3.24 (t， 2H, -NHC//2); 6.4 (s, 2H, -N玩)；7.2 (s， 2H,-ArZ/); 8.03 (s， 1H, -KH)。
元素分析(％，計(jì)算值)C: 35.61 (35.51); H: 2.29 (2.23); N: 10.96 (10.35)。
實(shí)施例3、 一種氟蟲腈人工半抗原FH2，分子結(jié)構(gòu)式為<formula>formula see original document page 10</formula>O稱取化合物3 (實(shí)施例l所得)0.64g置100ml三口燒瓶中，恒壓漏斗滴加10ml 重蒸二氯亞砜(S0Cl2劇毒，操作在通風(fēng)柜進(jìn)行，并帶防毒面具)，在卯。C油浴上攪拌回流 反應(yīng)3小時(shí)，待反應(yīng)物冷卻后，減壓脫去過(guò)量的二氯亞砜，得棕色油狀物(化合物4)，用 10ml二噁垸(1， 4一二氧六環(huán))溶解后，成二噁烷溶液備用。
2)稱取6-氨基己酸0.5g，溶解于2mlNaOH(4mol/L)溶液中，將此溶液置于100ml三 口燒瓶中，燒瓶置于冰浴，開動(dòng)攪拌；分5次加入上述二噁烷溶液，間隔5 10分鐘，后 四次同時(shí)加入lmlNaOH(4mol/L)溶液，加液完畢后繼續(xù)攪拌反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，反 應(yīng)液中加50ml水，用6N鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值為4，將此混合液轉(zhuǎn)移到250ml分液漏斗中， 用乙酸乙酯提取3次，30ml/次；合并乙酸乙酯層，用飽和鹽水洗滌至中性后用7 8% NaHC03溶液提取4次，30ml/次；30ml乙醚去雜，NaHC03水層用濃鹽酸調(diào)至pH至3-4， 然后用乙酸乙酯提取水層3次，30ml欣；該乙酸乙酯層經(jīng)無(wú)水Na2S04干燥，濃縮得淡黃
色固體，硅膠板分離(乙酸乙酯石油醚甲酸二25: 75: 1)，得白色固體物質(zhì)氟蟲腈
半抗原FH2，即化合物6。
氟蟲腈半抗原FH2 (化合物6)的結(jié)構(gòu)鑒定
6- (5-氨基-1- (2， 6-二氯-4-(三氟甲基)苯基)-4-(三氟甲基亞磺?；?-111-吡唑-3-甲酰胺基)己酸，即C18H16N4C12F6S04。
取上述合成的產(chǎn)物分別經(jīng)ESI-MS和^-NMR測(cè)定其分子結(jié)構(gòu)。質(zhì)譜(MS， +cESI) 測(cè)定結(jié)果m/z為567 (M-H)+(100%), 569 (M+2-H) + (66.7%)，可以看出化合物6的分子量 為568，分子中含有兩個(gè)C1。
核磁共振氫譜數(shù)據(jù)^ NMR (400MHz, CDC13, S ppm):
1.36 (m, 2H, -CH2C//2CH2); 1.65,1.67(m, 4H, -Of2CH2C//2)， 2.32 (t, 2H，-C玩COOH); 3.14 (t, 2H, -NHC坊)；6.21 (s， 2H,-跳)；7.10 (s, 2H,-Ar/Z); 7.93 (s， 1H,-,。
元素分析(％，計(jì)算值)C: 38.16 (37.97); H: 2.92 (2.83); N: 9.93 (9.84)。
實(shí)施例4 、免疫原的制備(以FH1為例)
免疫原的合成利用碳二亞胺法。將化合物5 (50 80微摩爾)，溶解在1 2mL 的N， N-二甲基甲酰胺中，然后在該溶液中加入等當(dāng)量的二環(huán)已基碳二亞胺和N —羥 基琥珀酰亞胺，讓其在室溫下反應(yīng)過(guò)夜后，離心，取上清液500 800nL加入到4 8mL15 20mg/mL的牛血清蛋白碳酸鹽緩沖溶液中，加入時(shí)應(yīng)緩慢，然后在伴有磁 力攪拌情況下反應(yīng)4 6小時(shí)，待反應(yīng)完成后，裝入透析袋，先用蒸餾水透析2 4 次，然后用0.8 0.9%生理鹽水透析，分裝保存于一2(TC的冰箱中。
人工抗原的鑒定
按合成氟蟲腈免疫抗原反應(yīng)所用半抗原、載體蛋白與偶聯(lián)產(chǎn)物的比例，分別進(jìn)行紫外 (200nm 400mn)掃描測(cè)定，通過(guò)比較三者分別在260nm和280nm的吸光值計(jì)算其結(jié)合 比。經(jīng)計(jì)算結(jié)果如下半抗原FH1與BSA的結(jié)合比為11: 1。
實(shí)施例5、動(dòng)物免疫制備單克隆抗體與多克隆抗體
1) 多抗制備
實(shí)驗(yàn)選用半周歲左右，體重為2 3公斤，健康的雄性家兔。每種免疫原免疫三 只兔子(由浙江省中醫(yī)學(xué)院負(fù)責(zé)兔子的飼養(yǎng)工作)，分別編號(hào)為兔子1 3。
實(shí)驗(yàn)免疫劑量基礎(chǔ)免疫為0.5 ~ 1.0mg/kg，加強(qiáng)免疫劑量為1.0 ~ 1.5mg/kg，用 生理鹽水稀釋適量FH1-BSA與FH2-BSA，加入等體積弗氏完全佐劑(加強(qiáng)免疫時(shí) 采用弗氏不完全佐劑)，充分乳化，直至滴入水中乳滴不分散。采用背部皮下多點(diǎn) 注射與大腿肌肉注射相結(jié)合的方法。背部皮下免疫6點(diǎn)，大腿肌肉注射2點(diǎn)，3周 后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，以后每隔2周再次加強(qiáng)免疫。從第三次免疫開始，每次免疫后第 8天，從兔子耳緣靜脈采血，測(cè)定效價(jià)和特異性。
待免疫血清效價(jià)上去后，就可進(jìn)行采血。本實(shí)驗(yàn)采用頸動(dòng)脈取血法。采血后， 將采血瓶放置于37'C溫箱中半小時(shí)，待瓶中的血液凝固，然后用接種針沿瓶?jī)?nèi)壁將 血塊與玻璃脫離，再放到4。C冰箱中3 4小時(shí)，待血塊收縮后，用毛細(xì)吸管將血清 吸入試管中，離心，分離出血清。
2) 單抗制備
實(shí)驗(yàn)選用6-10周齡的BALB/C小鼠，20-22g，免疫5-10只小鼠。取6—8周齡 體重18-20gBALB/C雌性小鼠，將制備的FH1-BSA與FH2-BSA分別與等體積弗氏完全 佐劑混合，充分乳化后，經(jīng)背腹部皮下多點(diǎn)注射，劑量為50pg/每只，以后每隔3周，取 抗原(與一免等劑量)和等體積的弗氏不完全佐劑充分乳化后腹腔和皮下注射加強(qiáng)免疫， 加強(qiáng)免疫共4次，末免以加倍劑量的抗原進(jìn)行腹腔注射，3天后取脾細(xì)胞進(jìn)行融合。后經(jīng) 3-4次有限稀釋法克隆篩選得到一株細(xì)胞株5B6，經(jīng)多次體外傳代和多次凍存復(fù)蘇后，細(xì) 胞株均能良好生長(zhǎng)，并穩(wěn)定分泌抗體。經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后，用于抗體制備和液氮保存。
抗體的純化
辛酸-硫酸銨鹽析法是一個(gè)經(jīng)典的方法。辛酸在偏酸性的條件下能將血清中除IgG以外 的蛋白質(zhì)都沉淀下來(lái)，上清液中只有IgG。辛酸加入因抗體的來(lái)源不同而不同，人血清為 70ul/ml，兔血清為75ul/ml，小鼠血清為40ul/ml，小鼠腹水為33ul/ml。這種方法IgG的回收
率達(dá)90%以上。最后將抗體制成凍干粉，分裝，-20°0保存。 抗血清效價(jià)測(cè)定(以FH1-BSA免疫為例)
免疫原復(fù)合物按常規(guī)方法免疫了三只兔子。從加強(qiáng)免疫第二次開始，在每次免 疫后第8天于兔子耳緣靜脈采血，血清經(jīng)適當(dāng)稀釋后用間接ELISA測(cè)定效價(jià)。第5
次免疫后，兔子獲得了高效價(jià)的抗體，抗血清的效價(jià)為l: 1.28x105 (指OD490nm值
等于l.O時(shí)的稀釋倍數(shù))。
BALB/C小鼠腹腔注射降植烷0.3ml/只，7— 10天后同法注射單克隆細(xì)胞(5B6) 1><106 2><106個(gè)(0.4ml/只)，待小鼠腹腔明顯脹大后抽取腹水，離心除去油脂沉淀 后，即得小鼠腹水McAb,腹水采用辛酸-硫酸銨法純化，腹水效價(jià)為l: 5.12x105。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明 不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直 接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1、一種氟蟲腈人工半抗原，其特征在于它的分子結(jié)構(gòu)式為其中n＝1～5。
2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的氟蟲腈人工半抗原，其特征在于11 = 3，分子結(jié)構(gòu)式為:
3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的氟蟲腈人工半抗原，其特征在于n二5，分子結(jié)構(gòu)式為:
4、 如權(quán)利要求1所述的氟蟲腈人工半抗原的合成方法，其特征在于包括下列步驟1) 克分子比為1: 6的氟蟲腈原藥與硫酸在乙二醇溶劑中，138 142QC下回流反應(yīng)48 小時(shí)，生成5-氨基-1- (2， 6-二氯-4-(三氟甲基)苯基)-4-(三氟甲基亞磺酰基)-11 比唑-3-羧酸；2) 克分子比為1: 2 6的5-氨基-1- (2， 6-二氯-4-(三氟甲基)苯基)-4-(三氟甲基亞 磺?；?-111-吡唑-3-羧酸與二氯亞砜反應(yīng)生成5-氨基-1- (2， 6-二氯-4-(三氟甲基)苯基)-4-(三氟甲基亞磺?；?-111-吡唑-3-酰氯；3) 克分子比為1: 1 3的5-氨基-1- (2， 6-二氯-4-(三氟甲基)苯基)-4-(三氟甲基亞 磺?；?-111-吡哇-3-酰氯與n=l 5時(shí)的直鏈氨基酸在堿性條件下發(fā)生取代反應(yīng)，得氟蟲腈 人工半抗原。
5、 如權(quán)利要求4所述的氟蟲腈人工半抗原的合成方法，其特征在于在步驟3)中5-氨 基-l- (2， 6-二氯-4-(三氟甲基)苯基)-4-(三氟甲基亞磺酰基)-1H-吡唑-3-酰氯與，氨基 丁酸在堿性條件下發(fā)生取代反應(yīng)，生成4- (5-氨基-1- (2， 6-二氯-4-(三氟甲基)苯基)-4-(三氟甲基亞磺?；?-出-吡唑-3-甲酰胺基)丁酸。
6、 如權(quán)利要求4所述的氟蟲腈人工半抗原的合成方法，其特征在于在步驟3)中5-氨 基-l- (2， 6-二氯-4-(三氟甲基)苯基)-4-(三氟甲基亞磺?；?-1^吡唑-3-酰氯與6-氨基 己酸在堿性條件下發(fā)生取代反應(yīng)，生成6- (5-氨基-1- (2， 6-二氯-4-(三氟甲基)苯基)-4-(三氟甲基亞磺酰基)-111-吡唑-3-甲酰胺基)己酸。
7、 如權(quán)利要求1 3中任意一種氟蟲腈半抗原的用途，其特征在于是用作動(dòng)物免疫的 抗原體系的原料。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種氟蟲腈人工半抗原，其分子結(jié)構(gòu)式為，其中n＝1～5。本發(fā)明還公開了上述氟蟲腈人工半抗原的合成方法。本發(fā)明的半抗原化合物，能應(yīng)用于合成適于動(dòng)物免疫的抗原體系。采用本發(fā)明的氟蟲腈人工半抗原最終制得的抗體用ELISA方法檢測(cè)氟蟲腈時(shí)，最低檢測(cè)限可達(dá)4.8ug/L。
文檔編號(hào)G01N33/53GK101100457SQ200710070229
公開日2008年1月9日 申請(qǐng)日期2007年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月26日
發(fā)明者朱國(guó)念, 王春梅, 程敬麗, 金茂俊 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)