專利名稱：：一種分離棉花葉綠體dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于植物基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種分離棉花葉綠體DNA的方法。
背景技術(shù)：
：葉綠體是綠色植物進(jìn)行光合作用的主要細(xì)胞器，雖然其功能的表達(dá)存在著對細(xì)胞核的依賴性，但仍具有相對獨立的遺傳物質(zhì)，即葉綠體DNA(cpDNA)。高等植物的葉綠體基因組大小大多數(shù)在120-160kb之間，其DNA分子都是以共價、閉合、環(huán)狀雙鏈形式存在，分子內(nèi)基因排列緊密，內(nèi)元插入序列很少。葉綠體基因組編碼了許多與光合作用和葉綠體自身蛋白質(zhì)合成有關(guān)的重要組分，其中一些基因可以用于分子生物學(xué)研究以提高作物產(chǎn)量和賦予作物抗除草劑性狀等，因此引起了科學(xué)家廣泛的興趣(方玉達(dá)，劉大鈞，1999；馬永飛等，2003)。迄今為止，幾乎所有作物的葉綠體基因組已被詳細(xì)研究過，其中水稻、煙草等作物的葉綠體DNA的全序列已被分析出來。高等植物葉綠體基因組轉(zhuǎn)化研究雖然起步較晚，但與植物細(xì)胞核基因組轉(zhuǎn)化研究相比卻具有其突出的優(yōu)點，包括外源基因在葉綠體DNA上定點整合、高效表達(dá)、無花粉逃逸和母性遺傳等優(yōu)點(侯丙凱，陳正華，2001；張中林，2000)。高等植物的葉綠體轉(zhuǎn)化工作最早在煙草中獲得了成功(Svab，1990)，后來陸續(xù)在擬南芥(Sikdar等，1998)、水稻(KhanandMaliga，1999)、馬鈴薯(Sidorov等，1999)、番茄(Ruf.，2001)、油菜(Hou，2003；Skarjinskaia，2003)、大豆(Dufourmantel等，2004)、矮牽?；?Zubko.，2004)、胡蘿卜(Kumar等，2004a)、棉花(Kumar等，2004b)和萵苣(Lelivelt等，2005)中獲得成功，這些葉綠體轉(zhuǎn)化體系的建立，使得高等植物葉綠體轉(zhuǎn)化已經(jīng)成為植物基因工程研究中的新熱點(Gewolb，2002；Maliga，2003；GrevichandDaniell，2005)。葉綠體轉(zhuǎn)化通常利用兩段相鄰的目的植物葉綠體DNA序列作為同源重組片段，以葉綠體基因啟動子、終止子構(gòu)建葉綠體表達(dá)載體。psbA基因表達(dá)產(chǎn)物是光系統(tǒng)II作用中心蛋白D1，參與光誘導(dǎo)的電子轉(zhuǎn)移過程，該基因的啟動子和終止子的效率都非常高，因此，在許多植物葉綠體轉(zhuǎn)化載體中均采用煙草的psbA基因啟動子、終止子來調(diào)控目標(biāo)基因的表達(dá)(GrevichandDaniell，2005)。2006年，棉花葉綠體DNA序列測定完成，這一研究進(jìn)展將為棉花棉花葉綠體轉(zhuǎn)化提供有力的保障，使棉花葉綠體相關(guān)序列的克隆成為可能。但要進(jìn)行上述研究的必須前提就是得到足夠量的、高純度的、完整的cpDNA。目前，較常采用的方法是用差速離心和DNase消化純化葉綠體，然后通過CsCl密度梯度超速離心純化cpDNA。這類方法成本高、耗時長、產(chǎn)率低。同時由于對實驗設(shè)備的要求比較高，特別是需要價格昂貴超、高速離心機和勻漿機，限制了上述方法的廣泛應(yīng)用。棉花葉片具有很多豐富而特有的次生代謝物，如棉酚、單寧、多酚類等成分，棉酚和單寧，在分離純化葉綠體DNA過程中這些物質(zhì)很容易被氧化，與葉綠體DNA發(fā)生不可逆結(jié)合而污染分離的DNA，并且這類次生代謝產(chǎn)物還將大大降低蛋白酶K和RNaseA的活性。因此，針對棉花所具有的特有性質(zhì)，在cpDNA分離過程中必須采取獨特的工藝及試劑配方才能有效提高葉綠體DNA分離效率
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提出一種不需要超高速離心機，也不需要通過蔗糖密度梯度離心分離棉花葉綠體DNA的方法。本發(fā)明的方法分離的棉花葉綠體DNA具有高質(zhì)量和高產(chǎn)率等顯著優(yōu)點，適合于棉花葉綠體基因工程等分子生物學(xué)操作的需要。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的1、一種分離棉花葉綠體DNA的方法，其特征在于，從棉花葉片的葉肉中分離出完整的葉綠體；對所述的葉綠體進(jìn)行裂解，得到葉綠體DNA粗品，對該葉綠體DNA粗品進(jìn)行純化，得到葉綠體DNA純品，按照以下步驟制備1)取幼嫩棉花葉片作為分離葉綠體的材料，將葉片置于4℃冰箱中黑暗處理24h，然后用于分離葉綠體或?qū)⒃撊~片轉(zhuǎn)入到-70℃冰箱保存?zhèn)溆?，取適量葉片，用冰塊預(yù)先使榨汁機冷卻，然后加入樣品4倍體積預(yù)冷的4℃緩沖液A于榨汁機的容器中，迅速將樣品投入緩沖液A中，啟動榨汁機，勻漿約1min，然后用醫(yī)用紗布過濾該勻漿，得到濾液；2)將步驟1)的濾液分裝到離心管中，于4℃下2500rpm離心10min，棄上清，得到沉淀；3)向步驟2)的沉淀中加入緩沖液B，用移液槍吸打使沉淀懸浮，然后將懸浮液分裝到的塑料離心管中，在4℃下2500rpm離心10min，棄上清；4)用緩沖液C將沉淀重新懸浮，并將懸浮液轉(zhuǎn)移到塑料離心管中，加入緩沖液C，4℃下2500rpm離心10min，棄上清，沉淀即為棉花葉綠體；5)向步驟4)得到的葉綠體沉淀中加入緩沖液D，充分懸浮，得到懸浮液；6)向步驟5)的懸浮液中依次加入終濃度為0.5％的十六烷基磺酸鈉，終濃度為2％的十二烷基肌胺酸鈉和濃度為10mg/ml的125μl蛋白酶K，充分搖勻，于37℃，保溫3h，在保溫期間間隔半小時輕輕搖動該懸浮液，得到含有cpDNA的消化液；7)向步驟6)得到的消化液中加入體積比為25∶24∶1的酚∶氯仿∶異戊醇，抽提2-3次；8)取上清液加入終濃度為0.02mol/l醋酸鈉和2.5倍體積的預(yù)冷無水乙醇，-20℃放置過夜，1000rpm離心30min，收集沉淀，用70％乙醇沖洗一遍，室溫放置15min，12000rpm離心5min，風(fēng)干葉綠體DNA，將葉綠體DNA溶于400μl的pH為8.0的TE溶液中，然后加入30ul的RNA酶(5mg/ml)，37℃，保溫2h.；9)再向步驟8)得到的經(jīng)RNA酶消化的溶液中加入等體積氯仿，抽提2-3次，上清液加入終濃度為0.02mol/l醋酸鈉和2.5倍體積的預(yù)冷無水乙醇，挑出葉綠體DNA，用70％乙醇浸泡2-3小時，浸泡期間用70％乙醇洗滌2-3次，棄去乙醇，風(fēng)干，加TE溶液溶解，用分光光度計測定DNA濃度和純度，得到提純的葉綠體DNA；其中，緩沖液的組分及配比如下緩沖液A按重量體積計Tris6.1g/L，EDTA9.3g/L，Nacl73.1g/L，抗壞血酸44.0g/L，聚乙烯吡咯烷酮，15.0g/L，補充水分至1L，調(diào)pH至3.6；緩沖液B按重量體積計Tris6.1g/L，EDTA9.3g/L，Nacl73.1g/L，β-巰基乙醇0.78g/L，牛血清蛋白1.0g/L，補充水分至1L，調(diào)pH至8.0；緩沖液C按重量體積計150mmol/LNacl8.8g/L，100NaclEDTA37.2g/L，補充水分至1L，調(diào)pH至8.0；緩沖液D按重量體積計Tris6.1g/L，EDTA9.3g/L，二乙基二硫代氨基甲酸鈉1.0g/L，補充水分至1L，調(diào)pH至8.0。本發(fā)明的效果是1、本發(fā)明的效果之一是獲取的cpDNA質(zhì)量高，能夠保持DNA完整，產(chǎn)率高。本發(fā)明抽提的cpDNA可以用來進(jìn)行酶切、PCR、RAPD及目標(biāo)序列的克隆，說明cpDNA的質(zhì)量完全可以滿足分子生物學(xué)實驗的要求；每克鮮重棉花葉片可以分離1-10μgcpDNA，與報道的棉花核DNA的分離產(chǎn)率相當(dāng)。2、本發(fā)明的效果之三是經(jīng)濟(jì)，高效。本發(fā)明使用的藥品大都為普通的生化試劑，價格低廉，沒有利用試劑盒或昂貴的藥品。使用家用的榨汁機代替昂貴的勻漿器，利用普通離心機代替高速離心機，所使用的儀器為普通分子生物學(xué)實驗常用的儀器，無需添加新設(shè)備，大大節(jié)約了實驗成本。從時間上來看，一個工作日即可完成全部實驗。因此本方法在推廣和應(yīng)用上有較大的優(yōu)勢。圖1是本發(fā)明的棉花cpDNA電泳檢測結(jié)果，圖中1-6，分別是不同批次分離的cpDNA樣品。圖2是本發(fā)明設(shè)計的引物S-170的RAPD擴(kuò)增圖譜，圖中M分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-6分別是不同的批次分離的cpDNA樣品。圖3是包含psbA基因啟動子、終止子片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，圖中M分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-5分別是樣品擴(kuò)增出的預(yù)期為312bp的psbA基因啟動子序列；C陰性對照；6-10分別是樣品擴(kuò)增出的預(yù)期為383bp的psbA基因終止子序列。圖4是本發(fā)明克隆得到的psbA基因啟動子全長312bp序列(方框內(nèi)為該基因的調(diào)控序列)。圖5是本發(fā)明克隆得到的psbA基因終止子序列(方框內(nèi)粗體表示調(diào)控序列元件)。圖6.是本發(fā)明其中實施例中的棉花品種“TM-1”與已經(jīng)測序的棉花品種“珂字312”的葉綠體psbA基因啟動子序列的比較，圖中Query為TM-1的序列；Sbjct為珂字312的序列圖7.是本發(fā)明其中實施例中的棉花品種“TM-1”與已經(jīng)測序的棉花品種“珂字312”的葉綠體psbA基因終止子序列比較，圖中Query為TM-1的序列；Sbjct為珂字312的序列具體實施例方式實施例1本實施例的實驗材料為陸地棉標(biāo)準(zhǔn)系Tm-1(Linetal.，2003)。取田間或盤栽的幼嫩棉花葉片50g，蒸餾水沖洗后稍晾干，置于保鮮袋內(nèi)于黑暗處饑餓處理過夜，或置于-70℃保存?zhèn)溆谩?、完整葉綠體的分離(1)取田間棉花植株新展開的幼嫩葉片作為分離棉花葉綠體的材料，將葉片放置于冰箱中(4℃)黑暗處理24h，然后轉(zhuǎn)入到超低溫(-70)℃冰箱保存(或者直接用于分離葉綠體)稱取葉片50克左右。用冰塊預(yù)先使榨汁機冷卻，然后加入樣品4倍體積預(yù)冷的4℃緩沖液A于榨汁機中，迅速將樣品加入到容器中，啟動榨汁機，勻漿約1min，然后用醫(yī)用紗布過濾勻漿。(2)將濾液分裝到250ml離心管中，4℃下2500rpm離心10min，棄上消。(3)往沉淀中加入200ml緩沖液B(使用前加入10mm/l的β-巰基乙醇)，用移液槍輕輕吸打使沉淀充分懸浮，然后將懸浮液分裝到50ml的塑料離心管中，然后在4℃下2500rpm離心10min，棄上清。(4)用5ml緩沖液C將沉淀重新懸浮，并將懸浮液轉(zhuǎn)移到50ml的塑料離心管中，補加30ml緩沖液C，4℃下2500rpm離心10min，棄上清，沉淀即為純化的葉綠體，在顯微鏡下檢查葉綠體的完整性。2、葉綠體的裂解(1)往上述分離的葉綠體沉淀中加入10ml緩沖液D充分懸浮。(2)再往懸浮液中依次加入1/20體積的10％的十六烷基磺酸鈉(SDS)，1/5體積10％十二烷基肌胺酸鈉(Sarkosyl)以及125μl蛋白酶K(10mg/ml)，充分搖勻，37℃，保溫3h，期間間隔半小時輕輕搖動。在此過程中，葉綠體雙層膜被消化，cpDNA被釋放到消化液中。3、及葉綠體DNA(cpDNA)分離純化(1)向消化液中加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提數(shù)次，至界面干凈，(2)取上清液加1/10體積的0.2mol/l醋酸鈉和2.5倍體積的預(yù)冷無水乙醇，-20℃放置過夜。1000rpm離心30min，收集沉淀，用70％乙醇沖洗一遍，室溫放置15min，12000rpm離心5min，風(fēng)干，溶于400μlTE(pH＝8.0)，然后加入30ul的RNA酶(5mg/ml)。37℃，保溫2h.。(3)再按上述方法加入等體積氯仿抽提2-3次，上清液加1/10體積的0.2mol/l醋酸鈉和2.5倍體積的預(yù)冷無水乙醇(不要混勻)，在界面上看到透明絮狀沉淀，用彎溝針頭挑出，用70％乙醇浸泡1天，中間換2-3次乙醇，最后倒掉乙醇，風(fēng)干，加TE溶解，在分光光度計測定DNA濃度及質(zhì)量。其中，緩沖液的組分及配比如下緩沖液A按重量體積計Tris6.1g/LEDTA9.3g/LNacl73.1g/L抗壞血酸44.0g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，15.0g/L補充水分至1L，調(diào)pH至3.6；緩沖液B按重量體積計Tris6.1g/LEDTA9.3g/LNacl73.1g/Lβ-巰基乙醇0.78g/L牛血清蛋白1.0g/L補充水分至1L，調(diào)pH至8.0；緩沖液C按重量體積計150mmol/LNacl8.8g/L100NaclEDTA37.2g/L補充水分至1L，調(diào)pH至8.0；緩沖液D按重量體積計Tris6.1g/LEDTA9.3g/L二乙基二硫代氨基甲酸鈉1.0g/L補充水分至1L，調(diào)pH至8.0。實施例2凝膠電泳及紫外分光光度計檢測cpDNA質(zhì)量取5μL提取的葉綠體DNA在0.8％的瓊脂糖凝膠上用90V×60mA電泳30min后，置于BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并成像。取4μLcpDNA稀釋50倍后，在Beckman-DU800型紫外分光光度計上測定D260nm及D280nm。從圖1可以看出，所提取的cpDNA片段大小在20000bp左右，帶型整齊一致，表明cpDNA純度較高，沒有明顯拖尾及彌散現(xiàn)象，表明提取的DNA完整性比較好。采用紫外分光光度檢測的結(jié)果也可以看出大部分樣品的D260/D280在1.6-1.8之間，表明cpDNA的純度較高(表1)。表1棉花cpDNAD260及D280測定結(jié)果試驗品種為陸地棉標(biāo)準(zhǔn)系Tm-1。實施例2棉花cpDNA為模板進(jìn)行的RAPD反應(yīng)RAPD擴(kuò)增程序參照本申請人所在的作物遺傳改良國家重點實驗室報道的方法(Linetal.，2003)，所用隨機引物及PCR試劑均購買自上海生工(http://www.sangon.com/)公司。該引物序列為ACCGGTTCCC，PCR反應(yīng)在GeneAmpPCRSystem9700熱循環(huán)儀上進(jìn)行，PCR反應(yīng)體積為20μl，其中含1xbuffer、0.2mMdNTPs、1.5mMMg2+、0.5mMprimer、1UTaq酶和25ngDNA模板，剩余部分由ddH2O補足。熱循環(huán)參數(shù)設(shè)置為94℃預(yù)變性2min，94℃變性1min，36℃復(fù)性1min，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；72℃延伸10min，然后于4℃冰箱中保存。產(chǎn)物在1.4％的瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，紫外透射儀觀察并照相。以所提取的cpDNA為模板進(jìn)行RAPD反應(yīng)，擴(kuò)增圖譜如圖2所示。所有樣品均擴(kuò)增出較多且清晰的條帶，沒有拖尾的現(xiàn)象，表明所提取的cpDNA的質(zhì)量足以進(jìn)行后續(xù)的PCR擴(kuò)增反應(yīng)。實施例3PCR檢測DNA提取和純化效果psbA基因的啟動子、終止子引物設(shè)計如下啟動子引物正向引物5’-CCCGGGCAACCCATTTTTAGTATC-3’；反向引物5’-TTAATCATCAGGGACTCCCAAGCG-3’。終止子引物正向引物5′AGACTTTGGTTTTAGTGTATACGAG3′；反向引物5’-TGCCTTGATCCACTTGGCTACA-3’。預(yù)期的擴(kuò)增片段分別為310、380bp的psbA基因啟動子和終止子片段。20ul體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增程序Taqpolymerase1mol/L，25mmol/LMgCl21.5μL，10mmol/LdNTP0.5μL，10×Buffer2.5μL，10μmol/L正、反向引物各0.25μL，模板DNA40ng，總體積25μL。PCR反應(yīng)程序94℃預(yù)變性5min，接著94℃變性1min、58℃退火30s、72℃連接1min循環(huán)38次，最后72℃延伸5min。以提取的cpDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，其擴(kuò)增圖譜如圖2所示。實施例4psbA基因啟動子克隆對回收的psbA基因啟動子、終止子目標(biāo)片段，進(jìn)行克隆測序，測序載體為PUCm-T，具體操作參照試劑盒上的說明書進(jìn)行。用DNAMAN分析軟件進(jìn)行分析，確定所獲片段的DNA序列情況，克隆到的psbA基因啟動子全長312bp(圖3)，所含的調(diào)控序列元件包括-35區(qū)(TTGACA)、-10區(qū)(TATACT)以及轉(zhuǎn)錄起始位點(AATAACAAGC)，還包含翻譯調(diào)控序列RBS2(TGATGAT)。實施例5psbA基因終止子克隆對回收的psbA基因終止子目標(biāo)片段，進(jìn)行克隆測序，測序載體為PUCm-T，具體操作參照試劑盒上的說明書進(jìn)行，測序結(jié)果進(jìn)行blastn分析，將獲得的序列與公布棉花的葉綠體DNA序列進(jìn)行同源性比較。用DNAMAN分析軟件進(jìn)行分析，確定所獲片段的DNA序列情況克隆到的psbA基因終止子全長為383bp(圖5)。其中推測的轉(zhuǎn)錄終止子調(diào)控序列“AGGAGCAAT....N32...ATTGCTCCT”可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，以終止轉(zhuǎn)錄。實施例6TM-1與珂字312的葉綠體psbA基因啟動子序列比較對測序結(jié)果進(jìn)行blastn分析，將獲得的本發(fā)明中所用材料TM-1的葉綠體psbA基因啟動子序列與已報道的棉花品種珂字312的葉綠體DNApsbA基因啟動子序列(GENEBANK登陸號NC-007944)進(jìn)行同源性比較，結(jié)果表明，本發(fā)明獲得的DNA片段與上述報道的棉花品種葉綠體DNA片段序列為100％同源，說明本發(fā)明制備分離的DNA確實為棉花葉綠體DNA，該DNA樣品完全可以用于棉花葉綠體目標(biāo)序列的克隆和分子生物學(xué)操作。實施例7TM-1與珂字312的葉綠體psbA基因終止子序列比較測序結(jié)果進(jìn)行blastn分析，將獲得的本發(fā)明中所用材料TM-1的葉綠體psbA基因終止子序列與已經(jīng)公布測序結(jié)果的棉花品種珂字312的葉綠體DNApsbA基因終止子序列(GENEBANK登陸號NC-007944)進(jìn)行同源性比較，結(jié)果表明，獲得的DNA片段與已經(jīng)測序的葉綠體DNA片段，為100％同源，分離的DNA確實為棉花葉綠體DNA，且能夠用于目標(biāo)序列的克隆，為棉花葉綠體基因工程的進(jìn)一步開展奠定了良好基礎(chǔ)。主要參考文獻(xiàn)1、方玉達(dá)等.植物可轉(zhuǎn)化基因組文庫的發(fā)展和應(yīng)用。生物技術(shù)通報，1999，15(5)12-15。2、王永飛等.高等植物葉綠體基因組轉(zhuǎn)化的應(yīng)用.遺傳，2004，18(3)288-2943、蘇濤.葉綠體基因工程一種植物生物技術(shù)的新方法，生物工程學(xué)報，2005，21(4)674-6804、侯丙凱等.蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白基因克隆及油菜葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化研究.遺傳，2001，23(1)39-40.5、張中林等.蘇云金芽孢桿菌(Bt)晶體毒蛋白基因在煙草葉綠體中的表達(dá).遺傳學(xué)報，2000，27(3)270-277.6、LinZXetal.ConstructionofageneticlinkagemapforcottonbasedonSRAP.ChineseScienceBulletin，2003，482063-20677、SvabZetal.High-frequencyplastidtransformationintabaccobyselectionforachimericaadAgene.ProcNatlAcadUSA，1993.90913-9178、SikdarSR.PlastidtransformationinArabidopsisthaliana.PlantCellRep，1998.1820-249、SidorovVA.Stablechloroplasttransformationinpotatouseofgreenfluorescentproteinasaplastidmarker.PlantJ.1999.19(2)209-21610、KumarSetal.Manipulationofgeneexpressionfacilitatescottonplastidtransformationofcottonbysomaticembryogenesisandmaternalinheritanceoftransgenes.PlantMolecularBiology，2004.56，203-21611、DaniellHetal.Chloroplastgeneticengineeringtoimproveagronomictraits.MethodsinMolecularBiology，2005，286111-13712、DufourmantelN.Generationoffertiletransplastomicsoybean.PlantMolecularBiology，2004，55(4)479-48913、FernandezAetal.Achloroplasttransgenicapproachtohyper-expressandpurifyhumanserumalbumin，aproteinhighlysusceptibletoproteolyticdegradation.PlantBiotechnologyJ，2003，171-7914、Gewolb.Bioengineering.Plantscientistsseebigpotentialintinyplastids.Science，2002，295258-25915、GrevichJJandDaniellH.ChloroplastgeneticengineeringRecentadvancesandfutureperspectives.CriticalReviewinPlantScience，2005，2483-10716、HouBKetal.Chloroplasttransformationinoilseedrape.TransgenicResearch，2003，12111-11417、KhanMSandMaligaP.Fluorescentantibioticresistancemarkerfortrackingplastidtransformationinhigherplants.NatureBiotechnology，1999，17910-91518、KumarS，DhingraAandDaniellH.Manipulationofgeneexpressionfacilitatescottonplastidtransformationofcottonbysomaticembryogenesisandmaternalinheritanceoftransgenes.PlantPhysiology，2004，56(2)203-21619、LeliveltCLetal.Stableplastidtransformationinlettuce(L.).PlantMolecularBiology，2005，58(6)763-77420、MaligaP.CurrentOpinioninPlantBiology，2002，5(2)164-17221、RufSetal.Stablegenetictransformationoftomatoplastidsandexpressionofaforeignproteininfruit.NatureBiotechnology，2001，19870-87522、SkarjinskaiaMetal.Plastidtransformationin，anoilseedBrassicaeae.TransgenicResearch，2003，12115-12223、ZubkoMKetal.Stabletransformationofpetuniaplastids.TransgenicResearch，2004，13523-530權(quán)利要求1.一種分離棉花葉綠體DNA的方法，其特征在于，從棉花葉片的葉肉中分離出完整的葉綠體；對所述的葉綠體進(jìn)行裂解，得到葉綠體DNA粗品，對該葉綠體DNA粗品進(jìn)行純化，得到葉綠體DNA純品，按照以下步驟制備1)取幼嫩棉花葉片作為分離葉綠體的材料，將葉片置于4℃冰箱中黑暗處理24h，然后用于分離葉綠體或?qū)⒃撊~片轉(zhuǎn)入到-70℃冰箱保存?zhèn)溆?，取適量葉片，用冰塊預(yù)先使榨汁機冷卻，然后加入樣品4倍體積預(yù)冷的4℃緩沖液A于榨汁機的容器中，迅速將樣品投入緩沖液A中，啟動榨汁機，勻漿約1min，然后用醫(yī)用紗布過濾該勻漿，得到濾液；2)將步驟1)的濾液分裝到離心管中，于4℃下2500rpm離心10min，棄上清，得到沉淀；3)向步驟2)的沉淀中加入緩沖液B，用移液槍吸打使沉淀懸浮，然后將懸浮液分裝到的塑料離心管中，在4℃下2500rpm離心10min，棄上清；4)用緩沖液C將沉淀重新懸浮，并將懸浮液轉(zhuǎn)移到塑料離心管中，加入緩沖液C，4℃下2500rpm離心10min，棄上清，沉淀即為棉花葉綠體；5)向步驟4)得到的葉綠體沉淀中加入緩沖液D，充分懸浮，得到懸浮液；6)向步驟5)的懸浮液中依次加入終濃度為0.5％的十六烷基磺酸鈉，終濃度為2％的十二烷基肌胺酸鈉和濃度為10mg/ml的125μl蛋白酶K，充分搖勻，于37℃，保溫3h，在保溫期間間隔半小時輕輕搖動該懸浮液，得到含有cpDNA的消化液；7)向步驟6)得到的消化液中加入體積比為25∶24∶1的酚∶氯仿∶異戊醇，抽提2-3次；8)取上清液加入終濃度為0.02mol/l醋酸鈉和2.5倍體積的預(yù)冷無水乙醇，-20℃放置過夜，1000rpm離心30min，收集沉淀，用70％乙醇沖洗一遍，室溫放置15min，12000rpm離心5min，風(fēng)干葉綠體DNA，將葉綠體DNA溶于400μl的pH為8.0的TE溶液中，然后加入30ul的RNA酶(5mg/ml)，37℃，保溫2h.；9)再向步驟8)得到的經(jīng)RNA酶消化的溶液中加入等體積氯仿，抽提2-3次，上清液加入終濃度為0.02mol/l醋酸鈉和2.5倍體積的預(yù)冷無水乙醇，挑出葉綠體DNA，用70％乙醇浸泡2-3小時，浸泡期間用70％乙醇洗滌2-3次，棄去乙醇，風(fēng)干，加TE溶液溶解，用分光光度計測定DNA濃度和純度，得到提純的葉綠體DNA；其中，緩沖液的組分及配比如下緩沖液A按重量體積計Tris6.1g/L，EDTA9.3g/L，Nacl73.1g/L，抗壞血酸44.0g/L，聚乙烯吡咯烷酮，15.0g/L，補充水分至1L，調(diào)pH至3.6；緩沖液B按重量體積計Tris6.1g/L，EDTA9.3g/L，Nacl73.1g/L，β-巰基乙醇0.78g/L，牛血清蛋白1.0g/L，補充水分至1L，調(diào)pH至8.0；緩沖液C按重量體積計150mmol/LNacl8.8g/L，100NaclEDTA37.2g/L，補充水分至1L，調(diào)pH至8.0；緩沖液D按重量體積計Tris6.1g/L，EDTA9.3g/L，二乙基二硫代氨基甲酸鈉1.0g/L，補充水分至1L，調(diào)pH至8.0。全文摘要本發(fā)明屬于棉花基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種分離棉花葉綠體DNA的新方法。包括以幼嫩的葉片為材料，用普通家用榨汁機將葉片充分勻漿，利用A、B、C、D四種緩沖溶液，常規(guī)速度離心，依次通過完整葉綠體的分離，裂解及葉綠體DNA(cpDNA)分離純化三個連續(xù)步驟，最終獲得棉花葉綠體DNA純品。本發(fā)明制備分離的葉綠體DNA質(zhì)量較高，紫外分光光度計檢測表明，本發(fā)明制備的DNA樣品的D260nm/D280nm在1.6-1.8之間；產(chǎn)率高達(dá)1-10μgcpDNA/g葉片樣品。經(jīng)過驗證，以分離的cpDNA為模板完全能夠滿足特異性酶切、RAPD、PCR和目標(biāo)基因序列的克隆等常規(guī)分子生物學(xué)操作的需要。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明不需要超高速離心機，也不需要通過蔗糖密度梯度離心分離等設(shè)備和步驟。文檔編號C12N15/29GK101117634SQ20071005266公開日2008年2月6日申請日期2007年7月9日優(yōu)先權(quán)日2007年7月9日發(fā)明者張獻(xiàn)龍,金雙俠,劉小云,劉冠澤,唐文鑫,聶以春,郭小平申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)