專利名稱：利用水稻蛋白激酶基因OsCIPK03提高植物耐冷能力的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及-種水稻DNA片段(基因)的分離克隆、功能驗證和應(yīng)用。所 述的基因與植物耐冷有關(guān)。將該基因的完整翻譯區(qū)(Coding sequence)與煙草花葉病毒的組成型啟動子 (CaMV35S)結(jié)合后直接轉(zhuǎn)入一般植物體，轉(zhuǎn)基因植株的耐冷能力顯著提高。
背景技術(shù)：
植物在生長的過程中會受到諸多環(huán)境因素的影響，千旱、鹽害和低溫往往導(dǎo)致農(nóng)作物的大規(guī)模減產(chǎn)，在 許多地區(qū)是農(nóng)業(yè)發(fā)展的瓶頸。為了抵抗或適應(yīng)環(huán)境不利因素，植物體感受細胞外環(huán)境條件的變化并通過多種 途徑將其傳遞到細胞內(nèi)，會誘導(dǎo)表達一些應(yīng)答基因，產(chǎn)生一些使細胞免受干早、高鹽、低溫等脅迫傷害的功 能蛋白、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以及傳遞信號和調(diào)控基因表達的轉(zhuǎn)錄因子，從而對外界的變化做出裙應(yīng)的反應(yīng)(Xiong 等Cell signaling during cold, drought and salt stress. Plant Cell. 14 (s,l), S165-S183， 2002)。 而那些功能基因的表達對植株對環(huán)境做出反應(yīng)，最終使其存活起著重要的作用。而目前在許多植物中發(fā)現(xiàn) CDPK、 CIPK、 MAPK等蛋白激酶家族在植株逆境信號的傳遞、逆境的適應(yīng)性方面起著重要的作用。這些蛋白激 酶基因在不同的逆境脅迫下，可誘導(dǎo)表達或被抑制，因而認為這些蛋白激酶基因在植物對逆境的應(yīng)答過稈中 起著非常重要的作用。因此分離和鑒定這類能提高植物應(yīng)對逆境的功能基因?qū)τ谧魑锟鼓婢车倪z傳改良，對 育種有著重要的意義。目前人們已在植物抗性改良方面作了嘗試，利用DREB1A和DREB2A培育的轉(zhuǎn)基因擬南 芥植株，其低溫耐性和干旱，高鹽耐性都比野生型強(LiuQ等Two transcription factors, DREB1 and DREB2， with an EREBP/AP2 DNA domains separate two cellular signal thansduction pathways in drought - and low-temperature-responsive gene expression, respectively, in Arabidopsis. Plant Cell. 1998, 10: 1391-1406.)。美國Michigan州立大學的Thomashow MF研究小組利用擬南芥627=7基因，進行遺傳轉(zhuǎn)化，也 培育出耐寒性增強的植株。
水稻是最重要的糧食作物之一，耐冷的水稻對我們來說具有重要的意義，因而找出與抗冷的功能基因， 培育耐冷和耐寒的品種對提高水稻產(chǎn)量具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是從水稻中分離克隆一個包含有耐冷相關(guān)基因完整編碼區(qū)段的DNA片段，利用這個基因改 良水稻或其它植物的抗逆性，特別是通過轉(zhuǎn)基因，提高轉(zhuǎn)基因植物的耐冷性。對這個基因進行結(jié)構(gòu)分析其屬 于植物CIPK蛋白激酶家族，而且是跟逆境相關(guān)的，將該克隆的基因被命名為&C/ rft 。
本發(fā)明涉及分離和應(yīng)用一種包含&C/尸,ft 基因的DNA片段，該片段賦予植物在低溫等逆境條件下，增強 耐受能力。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO: 1所不，或者基本上相當于SEQ ID NO: 1所不的高度同源 DNA序列，或者其功能相當于SEQ ID NO: 1所示序列的亞片段。
可以采用已經(jīng)克隆的te6Y尸AW 基因作探針，從cDNA和基因組文庫中篩選得到本發(fā)明的基因或同源某fel 。 同樣，也可以采用PCR(polymerase chain reaction)技術(shù)，從基因組、mRNA和cDNA中擴增得到本發(fā)明fls^/尸仰3 基因以及任何感興趣的一段DNA或與其同源的一段DNA。采用以上技術(shù)，可以分離得到包含^a7YO 基因的 序列，將這一序列與任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達的表達載體轉(zhuǎn)化植株，可獲得對低溫脅迫耐受
力得到增強的轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明的基因在構(gòu)建到植物表達載體中時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前加上任何-種 強啟動子或誘導(dǎo)型啟動于。本發(fā)明的基因在構(gòu)建到植物表達載體中時，也可使用增強子，這些增強子區(qū)域可 以是ATG起始密碼子和鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的翻譯。 攜帶有本發(fā)明&^/尸,0 基因的表達載體可通過使用Ti質(zhì)粒，植物病毒載體，直接DNA轉(zhuǎn)化，微注射， 電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細胞(Weissbach， 1998， Method for Plant Molecular Biology VIII， Academy Press, New York, pp. 411-463; Geiserson and Corey, 1998, Plant Molecular Biology (2"'1 Edition)。 可使用包括本發(fā)明的ttsC/尸,ft 基因的表達載體轉(zhuǎn)化宿主是包括水稻在內(nèi)多種植物，培育抗寒的植物品種。 本發(fā)明基因是受逆境誘導(dǎo)表達的，因此其啟動子是誘導(dǎo)型啟動子，將本發(fā)明的啟動子區(qū)段與任何感興趣 的基因同時連入合適的表達載體，并轉(zhuǎn)化植物宿主，在逆境條件下可誘導(dǎo)表達基因，提高植物對逆境的耐受 能力。
卜面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。


序列表SEQ ID NO: 1顯示的是本發(fā)明分離克隆的包含有fe"尸JO 基因編碼區(qū)DNA片段序列。 圖1: feCffift"基因分離和鑒定流程圖。
圖2:用Northern雜交檢測&^//￥03基因在干旱，高鹽，低溫，PEG和ABA等逆境脅迫不同時間點的表 達水平。
圖3:用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化的載體。將目標基因&0/^0 序列通過1^重組反應(yīng)替換圖屮attRl-attR2部 分即得到fl CT/^氾超量表達載體。
圖4:在水稻中超量表達基因能提高植株耐低溫的能力。A, ft C77Wtt 基因在轉(zhuǎn)基因植株中 的表達情況，最后一道為對照，其余為轉(zhuǎn)基因獨立轉(zhuǎn)基因植株。B，轉(zhuǎn)基因家系和野生型對照正常情況下的生 長情況；C,轉(zhuǎn)基因家系和野生型對照低溫脅迫(4'C脅迫5天，正常生長5天)后的生長情況；D，轉(zhuǎn)基因家 系和野生型對照低溫脅迫(4'C脅迫4天，止常生長7天)后的存活率統(tǒng)計。
圖5:超表達基因使得植株體內(nèi)的脯氨酸含量增加。待植株生K到四葉期吋對其進行4'C低溫 脅迫，分別在0、 1、 3、 6天的時候取樣用于脯氨酸含量的測定。
圖6:脯氨酸合成和轉(zhuǎn)運相關(guān)基因在to67/^Oy超表達植株中表達量的檢測。
具體實施例方式
本發(fā)明的前期丄作獲得了來源于水稻品種明恢63 (—種中國普遍推廣應(yīng)用的個水稻品種)的cDNA克 隆EI101L12。該cDNA是fls6YMH 基因的全長cDNA,是一個抗逆境相關(guān)基因。主要依據(jù)有以下幾個方面(1) 采用cDNA芯片技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)cDNA克隆EI101L12在水稻品祌"中旱5號"(由中國上海農(nóng)科院提供的 -個公 開使用的 一個水稻品種)干旱脅迫處理15天表達量增加2. 5倍。對其進行測序，分析發(fā)現(xiàn)該基因就是ft 乙'/尸Jft
(Genebank登錄號為AK111929)。鑒于該克隆表達量在千旱處理后的明顯差異和其功能特征，認為EI101L12 克隆所代表的基因在逆境下參與調(diào)控基因的表達。(2)對其進行逆境條件下的表達譜分析(圖2)，發(fā)現(xiàn)在脅 迫處理的過程中，表達量有明顯的提高。(3),將其全長基因在植株中超量表達，轉(zhuǎn)基因植株的耐冷性能力大 大增強(圖4)。這些結(jié)果都表明ttsd尸A"05基肉是-個逆境相關(guān)調(diào)控基岡，參與植物對逆境的調(diào)控。
以下實施例進一步定義本發(fā)明，并描述了本發(fā)明在上述前期工作基礎(chǔ)上分離克隆包含有feC/尸Att 基因完整編碼區(qū)段的DNA片段以及驗證flsC7尸,0 基因功能的方法(發(fā)明流程如圖l所示)。根據(jù)以下的描述和這些 實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對本 發(fā)明做出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。
實施例l :分離克隆包含有&C/Z^a 基因區(qū)段的DNA片段
通過水稻品種"屮旱5號"(由中國上海農(nóng)科院提供的一個公開使用的一個水稻品種)的干旱誘導(dǎo)基因 表達譜分析，發(fā)現(xiàn)了--個受干旱強烈誘導(dǎo)(干旱脅迫后期表達量提高2.5倍以上)的EST (表達序列簽)，經(jīng) 序列分析發(fā)現(xiàn)，該基因為CIPK蛋白激酶家族的一個成員，并且是全長序列，其對應(yīng)日本水稻全長數(shù)據(jù)庫 (http:〃cdna01. dna. affrc. go. jp)中的cDNA克隆001-015-H02。根據(jù)該克隆序列，設(shè)計引物OsCIPK03F (5' -CACCATGTATAGGGCTMGAGGGCT-3'， 序列特異引物外加接頭CACC位點)和 0sCIPK03R (5'-TTGMACTCACAAACTGTCA-3')，將該克隆的l-1653bp序列從"中旱5號"品種中反轉(zhuǎn)錄擴增出來。擴增產(chǎn) 物就是本發(fā)明的序列l(wèi)-1653bp (圖3)。具體步驟為采用TRIZ0L試劑(購自Invitrogen公司)從干旱脅迫 處理的水稻品種"中旱5號"中提取葉片總RNA (提取方法根據(jù)上述TRIZOL試劑說明書)，利用反轉(zhuǎn)錄酶(購 自Invitrogen公司)將其反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。根據(jù)cDNA克隆001-015-H02的序列設(shè)計的巢式引物將其 從反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物屮擴增出來，反應(yīng)條件為94'C預(yù)變性2min; 94°C 30sec， 55'C 30sec， 72°C 2min， 30個循 環(huán)；72°C延伸5min。將擴增獲得的PCR產(chǎn)物連入pGEM-T載體(購自Promega公司)，篩選陽性克隆并測序， 獲得所需的全長基因。該克隆命名為PGEM-0sCIPK03。
實施例2:檢測水稻內(nèi)源基因^(7//Yft 的誘導(dǎo)表達
以水稻品種"中旱5號"為材料，在3葉期分別進行干旱、冷害和高鹽脅迫以及脫落酸(ABA)，聚乙二 醇(PEG)處理。干旱處理是將水稻幼苗斷水，并在0 h， 3 h， 6 h， 12 h， 24 h后取樣。冷害處理是將水稻 幼苗置于4°C生長箱，O h， 3 h, 6 h, 12 h， 24h后取樣。高鹽脅迫是將幼苗根部浸泡在200 mM/L NaCl溶 液中并在0h， 5h, 14h, 24h后取樣。ABA處理是將幼苗根部浸泡在100 W/L ABA溶液巾并在0 h, 3h, 6h， 12h和24h后取樣。PEG處理是將幼苗根部浸泡在20X的PEG6000溶液中并在0 h， 3h, 5h, 12h后取樣。提 取葉片的總RNA (Trizol試劑，購自InvUrogen公司)后按《分子克隆》(J.薩姆布魯克，科學出版社，北 京，1999年版)有關(guān)實驗操作方法進行RNA轉(zhuǎn)膜，并以toC/^ra 為探針做Northern雜交。結(jié)果表明，本發(fā) 明克隆的基因flsa7^0 能被干旱、冷害、高鹽和ABA、 PEG誘導(dǎo)表達(如圖2所示)，是一個與逆境相關(guān)的蛋 白激酶。
實施例3， fl C7fiKU基因超量表達載體的構(gòu)建，轉(zhuǎn)化
根據(jù)實施例2的結(jié)果，知道本發(fā)明基因foCJ/m J是能被干旱、冷害、高鹽，脫落酸(ABA)和聚乙二醇 (PEG)誘導(dǎo)表達的，為了能更好地闡明此基丙的功能，申請人將其在水稻中超量表達，從轉(zhuǎn)基因植株的表型 來驗證。方法是旨先以實施例1屮得到的陽性克隆pGEM-0sCIPK03質(zhì)粒為模板，以實施例1中的引物和條 件做PCR擴增外源片段，并將外源片段導(dǎo)入中間載體pENTR/D-T0P0 (載體購向Invitrogen公司，具體步驟見 試劑盒說明書)，進一步通過LR重組反應(yīng)(參照Invitrogen公司的LR反應(yīng)重組試劑盒使用說明書)將目標 基因重組到攜帶煙草花葉病毒啟動子(CaM35S)的遺傳轉(zhuǎn)化載體pCB2004H。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10P (菌株購 自Invitrogen公司)。篩選陽性克隆，獲得轉(zhuǎn)化載體。
通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系將其導(dǎo)入到水稻品種中花11 (中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所提供 的-個公開使用的一個水稻品種)中，經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)、篩選具有潮霉素抗性的愈傷、分化、生 根、練苗移栽，得到轉(zhuǎn)基因植株。將獲得的轉(zhuǎn)基因水稻植株命名為T35。本發(fā)明總共獲得獨立轉(zhuǎn)基因水稻植株 23株。
農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻(粳稻業(yè)種)遺傳轉(zhuǎn)化體系采用申請人所在的作物遺傳改良國家重點實驗室建立的轉(zhuǎn)化 體系。該體系的具體步驟如下
(1) 試劑和溶液縮寫
本發(fā)明中培養(yǎng)基所用到的植物激素的縮寫表示如下6-BA(6-BenzylaminoPurine, 6-芐基腺嘌呤)； CN (Carbenicillin，羧節(jié)青霉素)；KT (Kinetin，激動素)；NAA (Napthalene acetic acid，萘 乙酸)；IAA (Indole-3-acetic acid， B引哚乙酸)；2, 4-D (2， 4-Dichlorophenoxyacetic acid， 2,4-二氯苯氧乙酸);AS (Acetosringone，乙酰丁香酮);CH (Casein Enzymatic Hydrolysate, 水解酪蛋白)；HN (Hygromycin B，潮霉素)；DMS0 (Dimethyl Sulfoxide, 二甲基亞砜)；N6max (N6大量成分溶液)；N6mix (N6微量成分溶液)；MSmax (MS大量成分溶液)；MSraix (MS微量成分 溶液)
(2) 主要溶液配方
1) N6培養(yǎng)基大量元素母液[IO倍濃縮液(10X)]的配制 硝酸鉀(KNO:i) 28.3 g 磷酸二氫鉀(KH2P04) 4. 0 g
硫酸銨((NH4)2S04 ) 4.63 g
硫酸鎂'(MgSO,7H20) 1. 85 g
氯化鈣(CaCh2H20) 1. 6fi g
逐'溶解，然后室溫下定容至1000 ml。
2) N6培養(yǎng)基微量元素母液[100倍濃縮液(100X)]的配制 碘化鉀(KI) 0. 08 g
硼酸(H3B03) 0. 16 g
硫酸錳(MnS04 4H刀) 0. 44 g
硫酸鋅(ZnS04 7H刀) 0. 15 g
室溫下溶解并定容至IOOO ml。
3) 鐵鹽(Fe2EDTA)貯存液(100X)的配制
準備800 ml雙蒸水并加熱至70'C，加入乙二銨四乙酸二鈉(Na必DTA 2H20) 3.73克，充分溶 解后在70'C水浴中保持2小時，定容至1000 ml， 4'C保存?zhèn)溆谩?br> 4) 維生素貯存液(100X)配制
煙酸(Nicotinic acid) 0. 1 g
維生素Bl (Thiamine HQ) 0. 1 g
維生素B6 (Pyridoxine HC1) 0. 1 g
甘氨酸(Glycine) 0. 2 g
肌醇(Inositol) 10 g
加水定容至1000 ml, 4"C保存?zhèn)溆谩?br> 5) MS培養(yǎng)基大量元素母液(IOX)的配制
硝酸銨(NH4N03) 16. 5 g
硝酸鉀 19.0 g
磷酸二氫鉀 1.7 g
硫酸鎂 3. 7 g
氯化鈣 4. 4 g
室溫下溶解并定容至1000 ml。 6) MS培養(yǎng)基微量元素母液(IOOX)的配制
碘化鉀 0.083 g
硼酸 0.62 g
硫酸錳 0. 86 g
鉬酸鈉(Na2Mo04 2H20) 0. 025 g
硫酸銅(CuS04 5H20) 0. 0025 g
室溫卜—溶解并定容至IOOO ml。
7) 2,4-D貯存液(1 mg/ml)的配制
秤取2,4-D 100 mg，用l nil 1 N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IO ml蒸餾水溶解完全后定容 至IOO ml,于室溫下保存。
8) 6-BA貯存液(1 mg/ml)的配制
秤取6-BA100 mg,用l ml 1 N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IO ml蒸餾水溶解完全后 定容至100 ml,室溫保存。
9) 萘乙酸(NAA)貯存液(1 mg/ml)的配制
秤取NAA100 mg,用l ml 1 N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IO ml蒸餾水溶解完全后定容至 100 ml, 4'C保存?zhèn)溆谩?br> 10) 吲哚乙酸(IAA )貯存液(1 mg/ml)的配制
秤取IAA 100 mg，用l tnl 1 N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IO nil蒸餾水溶解完全后定容至 100 ml, 4'C保存?zhèn)湓谝粋€大二角瓶中加入300 ml蒸餾水和硫酸鐵(FeSO, 7H20) 2. 78g。在另一 個大三角瓶中加入300 ml蒸餾水用。
11) 葡萄糖IC存液(0.5 g/ml)的配制
秤取葡萄糖125 g，然后用蒸餾水溶解定容至250 ml,滅菌后4'C保存?zhèn)溆谩?br> 12) AS貯存液的配制
秤取AS 0.392 g , DMSO 10 ml,分裝至l. 5 ml離心管內(nèi)，4'C保存?zhèn)溆谩?br> 13) IN氫氧化鉀貯存液
秤取氫氧化鉀5.6 g，并用蒸餾水溶解定容至100 ml,室溫保存?zhèn)溆谩?(3)用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基配方 1)誘導(dǎo)培養(yǎng)基
N6max母液〔IOX〕 100 ml
N6mix母液(100X)10 ml
Fe"EDTA貯存液(100X)10 ral
維生素貯存液(100X)10 ml
2， 4-D貯存液2. 5 ml
脯氨酸(Proline)0.3 g
CH0. 6 g
蔗糖(Sucrose)30 g
Phytagel3 g
加蒸餾水至900 ml， IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9,煮沸并定容至1000 ml，分裝到50 ml三角瓶(25 ml /瓶)，封口滅菌。 2)繼代培養(yǎng)基 N6隨母液(服) N6raix母液(100X) Fe2'EDTA貯存液(100X) 維生素貯存液(100X) 2, 4-D貯存液
100 ml 10 ml 10 ml 10 ml 2. 0 ml 0. 5 g
0. 6 g 30 g
3 g
加蒸餾水至900ml， 1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 9，煮沸并定容至1000 ml,分裝到50ml 二角瓶(25 ml /瓶)，封口滅菌。3)預(yù)培養(yǎng)基
12. 5 ml
1. 25 ml
2. 5 ml 2. 5 ml 0. 75 ral 0. 15 g
5 g
1. " g
加蒸餾水至250 ml, IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.6，封口滅菌。
使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5 ml葡萄糖貯存液和250 W AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25 ml/ 皿)。
4)共培養(yǎng)基
N6max母液(10X) 12. 5 m丄
N6mix母液(100X) 1.25ml Fe"EDTA貯存液(1Q0X) 2.5 ml
CH
蔗糖
Phytagel
N6max母液(雨) N6mix母液(100X) Fe2'EDTA貝上存液(100X) 維生素貯存液(100X) 2， 4-D貯存液 CH
蔗糖
瓊脂粉(Agarose)
維生素貯存液(100X)
2, 4-D貯存液
CH
蔗糖
瓊脂粉
2.5 ml 0. 75 ml 0.2 g
5 g 1.75 g
加蒸餾水全250 ml, IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.6，封口滅菌。
使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5 ml葡萄糖貯存液和250 W AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25 ml 每皿)。
5)懸浮培養(yǎng)基 恥max母液(10X) N6mix母液(100X) Fe2+EDTA歸液(100X) 維生素貯存液(100)0 2, 4-D貯存液 CH
蔗糖
5 ml 0. 5 ml 0. 5 nil 1 ml 0.2 ml 0.08 g
加蒸餾水至IOO ml，調(diào)節(jié)pH值到5.4，分裝到兩個IOO ml的三角瓶中，封口滅菌。 使用前加入l ml葡萄糖貯存液和IOO W AS貯存液。
6) 選擇培養(yǎng)基
25 ml 2.5ml 2. 5 ml 2.5 ml 0. 625 ml
0. 15 g 7. .5 g
1. 巧g
加蒸餾水至250 ml，調(diào)節(jié)pH值到6.0，封U滅菌。
使用前溶解培養(yǎng)基，加入250 W麗和400 ppm CN，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25 ml /皿)
7) 預(yù)分化培養(yǎng)基
25 ml
2. 5 ml 2. 5 ml 2. 5 ml 0. 5 ml 0. 5 ml 50 W
N6raax母液(10X)
N6mix母液(100X)
Fe2—EDTA Pt存液(100X)
維生素貯存液(100X)
2, 4-D貯存液
CH
蔗糖
瓊脂粉
N6max母液(10X) N6mix母液(100X) Fe2'EDTA IC存液(100X) 維生素貯存液(100X) 6-BA貯存液 KT貯存液 NAA C存液IAA貯存液
CH
蔗糖
瓊脂粉
50 W 0. 15 g
7.5 g 1,75 g
加蒸餾水至250 ml， 1 N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，封U滅菌。
使用前溶解培養(yǎng)基，加入250 W HN和200 ppm CN，分裝倒入培養(yǎng)肌中(25 ml /皿)。
8) 分化培養(yǎng)基
N6max母液(10X) 100 ml
N6mix母液(100X) 10 ml
Fe2'EDTA貯存液(100X) 10 ml
維生素貯存液(100X) 10 ml
6-BA IC存液 2 ml
KT貯存液 2 ml
NAA貯存液 0. 2 ml
IAA lt存液 0. 2 ml
C H 1 g
蔗糖 30 g
Phytagel 3 g
加蒸餾水至900 ml, 1 N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到6. 0。
煮沸并定容至IOOO ml,分裝到50 ml三角瓶(50 ml /瓶)，封n滅菌。
9) 生根培養(yǎng)基
MSmax母液(10X) 50 ml
MSmJx母液(100X) 5 ml
Fe2EDTA !C存液(100X) 5 ml
維生素貯存液(100X) 5 ml
蔗糖 30 g
Phytagel 3 g
加蒸餾水至900 ml， 1 N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 8。 煮沸并定容至IOOO ml,分裝到生根管中(25 ml /管)，封口滅菌。 (4)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化步驟 4. 1愈傷誘導(dǎo)
(1) 將成熟的水稻種子(中花ll，中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所)去殼，然后依次用70%的乙 醇處理1分鐘，0. 15%氯化汞(HgCl2)種子表面消毒15分鐘
(2) 用滅菌水洗種子4-5次；
(3) 將種子放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；
(4) 將接種后的培養(yǎng)基置于黑暗處培養(yǎng)4周，溫度25士rC。
4.2愈傷繼代挑選亮黃色、緊實艮相對干燥的肝性愈傷，放于繼代培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度25± 1 'C 。 4. 3預(yù)培養(yǎng)
挑選緊實且相對干燥的胚性愈傷，放于預(yù)培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度25土rc。 4. 4農(nóng)桿菌培養(yǎng)
(1) 在帶有對應(yīng)抗性選擇的LA培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)農(nóng)桿菌EHA105(來源于CAMBIA,商用菌株)兩天， 溫度28'C;
(2) 將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至懸浮培養(yǎng)基里，28'C搖床上培養(yǎng)2-3小時。 4. 5農(nóng)桿菌侵染
(1) 將預(yù)培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至滅菌好的瓶子內(nèi)；
(2) 調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌的懸浮液辛0D 0. 8-1. 0:
(3) 將愈傷在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；
(4) 轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；然后放置在共培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天，溫度19-20'C。 4. 6愈傷洗滌和選擇培養(yǎng)
(1) 滅菌水洗滌愈傷至看不見農(nóng)桿菌；
(2) 浸泡在含400 ppm羧芐青霉素(CN)的滅菌水中30分鐘；
(3) 轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；
(4) 轉(zhuǎn)移愈傷至選擇培養(yǎng)基上選擇2-3次，每次2周。(第一次潮霉素篩選濃度為400 ppm，第 二次以后為250 ppm)
4.7分化
(1) 將抗性愈傷轉(zhuǎn)移至預(yù)分化培養(yǎng)基上黑暗處培養(yǎng)5-7周；
(2) 轉(zhuǎn)移預(yù)分化培養(yǎng)的愈傷至分化培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)室溫度26"C下每天光照培養(yǎng)14小時(光照強度 1000-15001x)，暗培養(yǎng)10小時。
4.8生根
(1) 剪掉分化時產(chǎn)生的根；
(2) 然后將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中光照下培養(yǎng)2-3周，培養(yǎng)條件同4. 7的步驟(2)所述。 4.9移栽
洗掉根上的殘留培養(yǎng)基，將具有良好根系的幼苗轉(zhuǎn)入溫室，同時在最初的幾天保持水分濕潤。 實施例4: flsCZ7^ft 基因轉(zhuǎn)基因T2家系苗期耐冷篩選
為了驗證轉(zhuǎn)基因水稻植株的耐冷性是否增強以及其增強是否與轉(zhuǎn)入的ftr(7i7^("基因有關(guān)，本發(fā)明采用 Northern雜交技術(shù)對轉(zhuǎn)基因水稻植株屮fl C77^0 基因的表達進行檢測(圖4A為Northern雜交(方法同實施 例2)的結(jié)果，并對本發(fā)明T2代楨株的部分家系進行了耐冷性篩選。具體步驟如下T2代家系的種子在含有 50mg/ml潮霉素的生根培養(yǎng)基發(fā)芽5天后，將發(fā)芽一致的幼苗移栽到小紅桶中，并種植野生型對照植株，發(fā)現(xiàn) 轉(zhuǎn)基因家系和野生型對照的生長發(fā)育并沒有明顯的差別(圖4B〕。在植株長到4葉期時，對K.進行4'C低溫處 理(每天處理24小時)，處理5天后，觀察了轉(zhuǎn)基因和對照植株的表型，似乎沒有顯著性差異.但將它們轉(zhuǎn) 到正常條件恢復(fù)生長5天后，發(fā)現(xiàn)大部分對照植株已經(jīng)死亡，而轉(zhuǎn)基因株系大部分都能存活(圖4C)。另外一 組實驗中，4葉期的植株4'C低溫處理5天(每天處理時間為24小時)后再恢復(fù)生長7天后，統(tǒng)計植株的存 活率發(fā)現(xiàn)，0sCIPK03的超表達家系的植株存活率(68.2 / -90.4%)同對照的(18.5%)差異極其顯著(圖4D)。該結(jié)果說明0 67/^ft 基因的確與耐冷相關(guān)，其超量表達能提高轉(zhuǎn)基因植物的耐冷性，轉(zhuǎn)基丙水稻植株的抗性增 強確實與轉(zhuǎn)入的《^//^氾基因有關(guān)。
實施例5: fe"7^ft 基因轉(zhuǎn)基因T2家系脯氨酸含量的測定
在逆境條件下，植物體內(nèi)的脯氨酸含量顯著增加。植物體內(nèi)的脯氨酸含量在一定程度上反應(yīng)了植物的抗 逆性。在低溫條件下，植物組織中的脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性。在實驗時待本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因水稻植 株生長到四葉期時對其進行4'C低溫脅迫，分別在0、 1、 3、 6天的時候取樣用于脯氨酸含暈的測定。實驗結(jié) 果顯小如圖5。表明0sCIPK03超表達家系在受到冷脅迫吋積累的脯氨酸量是野生型對照的2 — 4倍。結(jié)果說明 本發(fā)明克隆的&^7/￥^ 基因的超表達引起了脯氨酸含量的增加，因向'顯著提高了轉(zhuǎn)基因水稻植株對低溫的耐 受能力。
脯氨酸含量測定的主要原理是用磺基水楊酸提取植物樣品時，脯氨酸便游離于磺基水楊酸的溶液中， 然后用酸性茚二酮加熱處理后，溶液即成紅色，再用甲苯處理，則色素全部轉(zhuǎn)移至甲苯中，色素的深淺即表 示脯氨酸含量的高低。在520nm波長下比色，從標準曲線上査出(或用回歸方程計算)脯氨酸的含量。
脯氨酸含量測定的具體步驟如下如下 一、材料、儀器設(shè)備及試劑
( )材料待測植物為本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因水稻植株葉片和未轉(zhuǎn)基因水稻植株的葉片。
(二) 儀器設(shè)備1. 722型分光光度計；2'.研缽；3. 100ml小燒杯；4.容量瓶；5.大試管；6.普通
試管；7.移液管；8.注射器；9.水浴鍋；10.漏斗；11.漏斗架；12.濾紙；13剪刀。
(三) 試劑l.酸性幼-三酮溶液將1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol/L磷酸中，攪拌加熱(70 'C)溶解，貯于冰箱中；2. 3%磺基水楊酸3g磺基水楊酸加蒸餾水溶解后定容至100ml; 3.冰醋酸；4.甲 苯。
一、實驗步驟
1. 標準曲線的繪制(1)在分析天平上精確稱取25mg脯氨酸，倒入小燒杯內(nèi)，用少量蒸餾水溶解，然后 倒入250ml容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，此標準液中每ml含脯氨酸100iig。 (2)系列脯氨酸濃度的配制 取6個50ml容量瓶，分別盛入脯氨酸原液0.5， 1.0， 1.5， 2.0， 2.5及3.0ml，用蒸餾水定容至刻度，搖勻， 各瓶的脯氨酸濃度分別為1, 2, 3， 4, 5及6ug/ml。 (3)取6支試管，分別吸取2ml系列標準濃度的脯氨酸 溶液及2ml冰醋酸和2ral酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加熱30min。 (4)冷卻后各試管準確加入4ml甲苯， 振蕩30S，靜置片刻，使色素全部轉(zhuǎn)至甲苯溶液。(5)用注射器輕輕吸取各管上層脯氨酸甲苯溶液至比色杯中， 以甲苯溶液為空A對照，于520nra波長處進行比色。(6)標準曲線的繪制先求出吸光度值(Y)依脯氨酸濃 度(X)而變的回歸方程式，再按回歸方程式繪制標準曲線，計算2ml測定液中脯氨酸的含量(ug/加l)。
2. 樣品的測定(1)脯氨酸的提取準確稱取不同處理的待測植物葉片各0.5g，分別置大管中，然后向 各管分別加入5ml3X的磺基水楊酸溶液，在沸水浴中提取10min，(提取過程中要經(jīng)常搖動)，冷卻后過濾于 十凈的試管中，濾液即為脯氨酸的提取液。(2)吸取2ml提取液于另.千凈的帶玻塞試管中，加入2ml冰醋 酸及2mi酸性茚三酮試劑，在沸水浴中加熱30min，溶液即呈紅色。(3)冷卻后加入4ml甲苯，搖蕩30S，靜 置片刻，取上層液至10ml離心管中，在3000rpm下離心5min。 (4)用吸管輕輕吸取上層脯氨酸紅色甲苯溶液 于比色杯中，以甲苯為空白對照，在分光光度計上520nm波L〈處比色，求得吸光度值。
三、結(jié)果計算根據(jù)回歸方程計算出(或從標準曲線上査出)2ml測定液中脯氨酸的含量(Xyg/2ml)，然后計
算樣品中脯氨酸含量的百分數(shù)。計算公式如下
脯氨酸含量(Ug/g) 二[XX5/2]/樣重(g)。 本實施例的效果如附圖5所示。
實施例6:脯氨酸合成、轉(zhuǎn)運相關(guān)基因在野生型與tt C7/Yft 基因轉(zhuǎn)基因家系中的表達量檢測
脯氨酸含量增加可能是由于脯氨酸合成、轉(zhuǎn)運相關(guān)基因的表達量發(fā)生了變化，我們用RealUrae-PCR方法 檢測了兩個脯氨酸合成和兩個脯氨酸轉(zhuǎn)運基因在野生型與OsC7P/TOJ基因轉(zhuǎn)基因家系中的表達量。實驗結(jié)果顯 示這四個基因的表達量在0sCIPK03超表達植株中都有不同程度的升高(5—10倍)。實驗結(jié)果(圖6)說明 OsCIPK03的超表達提高了脯氨酸合成與轉(zhuǎn)運相關(guān)基閃的表達，引起脯氨酸含量的增加，從而提高了轉(zhuǎn)基因植 株的耐冷性。實驗是在ABI7500 Realtime—PCR儀上進行的。反應(yīng)體系為10 u 1 2X SYBR Green Master Mix Reagent (Applied Biosystems) ， 1.0 ul cDNA模板、200 nM基因特異性引物，總體積20 ul。反應(yīng)條件 為第'步95°C， 3分鐘；第步(40個循環(huán))95°C， 30秒，6(TC, 30秒，72°C， 1分鐘。這四個基閃的 GenBank編號分別是:AK102633、 AK101230、 AK067U8、 AK0666298。用于Realtime--PCR檢測的引物分別是 AK102633(5'-CTCAMTCMGGCGTCMCTAAGA- 和 5'-TTTGTCAATATATACGTGGCATATACCA-3') ， AK101230 (5'-CGCCCCTCCCCGTATCT-3' 和 5'-AGGAATGCGGCAACAAGTG-3')， AK067118
(5'-AGGGACGATGGAGTTCTAAAGCT-3' 和 5'-GGGATTCCAAAGGCAMAAGA-3') ， AK0666298
(5'-GAGGAGGCTACCTGACTGTCAAC-3'禾口 5'- GCTCATGMGTCGCCAAGGA -3')。水稻的看家基因Actinel (GenBank 編號為 XI6280)用于 PCR 時的內(nèi)對照，其引物為 5'-TGGCATCTCTCAGCACATTCC-3 和 5' -TGCACAATGGATGGGTCAGA-3'。 本實施例的效果如附圖6所示。
序歹'J 表
<110〉華中農(nóng)業(yè)大學
<120〉利用水稻蛋白激酶基因0sCIPK03提高植物耐冷能力 <130>
<丄41〉 2007-05-31
〈160〉 1
<170〉 Patentln version 3. 1
<210〉 1
〈211〉 1707
<212> DNA
<213> 水稻(0ryza sativa) <220〉
<221〉 gene
<222〉 (1). . (1707)
<223〉
<400〉 1
atgtatagggctaagagggctgcattatctcca肌ggtgaagcgccgtgt鄉(xiāng)gaagtat60
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ccgtcaactataggcgg兆tttgattc170權(quán)利要求
1、OsCIPK03基因介導(dǎo)的賦予植物對低溫脅迫耐受能力的DNA序列，它是(a)SEQ ID NO1中第1-1707位所示的DNA序列，或(b)編碼與(a)編碼的蛋白質(zhì)相同的蛋白質(zhì)的DNA序列。
2、 合適啟動子連接的權(quán)利要求1所述的DNA序列。
3、 權(quán)利要求2所述的DNA序列，它是SEQ ID NO: 1所示的DNA序列。
4、 權(quán)利要求1-3任一項所述的DNA序列在增加水稻對低溫脅迫耐受能力中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及耐冷有關(guān)的水稻DNA片段OsCIPK03的分離克隆、功能驗證及應(yīng)用。具體步驟是，將該基因的完整翻譯區(qū)(Coding sequence)與煙草花葉病毒的組成型啟動子(CaM 35S)結(jié)合后直接轉(zhuǎn)入水稻，使轉(zhuǎn)基因水稻植株的耐冷能力顯著提高?？寺〉腛sCIPK03基因具有如序列表SEQ ID NO1中第1-1707位所示的DNA序列，或者編碼與SEQ ID NO1編碼的蛋白質(zhì)相同的蛋白質(zhì)的DNA序列。
文檔編號C12N15/29GK101200724SQ20071005235
公開日2008年6月18日 申請日期2007年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月1日
發(fā)明者勇 向, 熊立仲, 黃越敏 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學