專利名稱：：用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)腺苷蛋氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物發(fā)酵工程技術(shù)，具體涉及一種利用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)腺苷蛋氨酸的方法。
背景技術(shù)：
：S-腺苷蛋氨酸，又名S-腺苷-L-蛋氨酸，英文名S-adenosy卜L-methionine,化學(xué)名5'-{[3S-3-氨基-3-羧基-丙基]-曱基-S-砜)-5'-脫氧腺苷，常用縮寫SAM、SAMe、AdoMet，分子式C"H22N606S。SAM是蛋氨酸的活性形式,1952年由Cantoni所發(fā)現(xiàn)。它是生物體內(nèi)重要的中間代謝物質(zhì)，參與多種生化反應(yīng)。在生物體內(nèi)，由底物L(fēng)-蛋氨酸和ATP經(jīng)過(guò)SAM合成酶(S-adenosylmethioninesynthetase,即ATP:L-methionineS-adenosyltransferase，EC2.5.1.6)酶促合成的。SAM是雙手性物質(zhì)，有2種異構(gòu)體:(R，S)-SAM和(S，S)-SAM。只有(S,S)-SAM,即(-)-SAM才具有生物活性。作為一種重要的生理活性物質(zhì)，SAM在人體生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要的生理作用，對(duì)維護(hù)人體健康至關(guān)重要。目前已發(fā)現(xiàn)至少有35種不同的曱基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)需要SAM作為曱基供體。許多含氮物質(zhì)的生物合成都需要從SAM獲取曱基，如肌酸、松果素、腎上腺素、曱氧腎上腺素、肉堿、膽堿、曱基組胺等。而曱基化作用不僅僅限于這些物質(zhì)的合成，在核酸和蛋白質(zhì)的修飾加工方面也極為重要，如對(duì)RNA來(lái)說(shuō)，在rRNA、tRNA或mRNA中，核糖的羥基和堿基的氨基在曱基化時(shí)都需要SAM參與。SAM通過(guò)轉(zhuǎn)氨丙基參與生物胺的合成。亞精胺和精胺是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不可缺少的組分。SAM兩次脫羧后生成5-甲硫腺苷(MTA),接著將氨丙基轉(zhuǎn)移給腐胺和亞精胺而生成相應(yīng)的亞精胺和精胺。SAM的制備方法有化學(xué)合成、酶法合成和微生物發(fā)酵等。SAM可以通過(guò)S-腺苷高半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine，SAH)和曱基供體(CH3I)化學(xué)合成得到。但此法有產(chǎn)率低、反應(yīng)物S-腺苷高半胱氨酸價(jià)格昂貴、反應(yīng)產(chǎn)物為(士)-SAM的混旋物、少量非活性(+)-SAM難以分離等明顯缺點(diǎn)，因而很少在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用(MatosJRetal，BiotechnolApplBiochem,1987，9:39~52)。酶法合成利用SAM合成酶催化底物L(fēng)-蛋氨酸和ATP生成(-)型SAM。該法具有反應(yīng)產(chǎn)物純度高、分離提純?nèi)菀?、反?yīng)周期短以及無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)。但是，SAM合成酶在動(dòng)植物和微生物體內(nèi)含量少、酶活不高、分離純化困難，，用該法大規(guī)模制備SAM受到SAM合成酶活力的限制?？紤]到成本太高，所以一般只將其用于合成同位素標(biāo)記的SAM(ReedBRetal，1986,EP0189322)。某些微生物可以在細(xì)胞內(nèi)積累SAM,尤其是酵母Saccharomyces屬的一些菌抹，通過(guò)對(duì)這些孩支生物的發(fā)酵，在培養(yǎng)基中添加一定量蛋氨酸的情況下，可以獲得大量的SAM(ShiozakiSetai，AgricBoilChem,1984，48(9):2293~2300)。因此，通過(guò)微生物的發(fā)酵進(jìn)而提取SAM是目前SAM工業(yè)生產(chǎn)的主要途徑。Shiozaki篩選了不同種屬的微生物(主要為Saccharomyces和Candida屬的不同種的菌抹),分離到一抹Saccharomycessakek-6菌，在10ml培養(yǎng)基中小量發(fā)酵產(chǎn)出1.55g/L的SAM。進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)條件，該菌在IOL發(fā)酵罐中培養(yǎng)7天后，SAM產(chǎn)量高達(dá)10.8g/L(ShiozakiSetal.JournalofBiotechnology,1986，4:345-354)。這是目前從文獻(xiàn)中查到的最高產(chǎn)量。Angeles等通過(guò)在細(xì)菌中表達(dá)大鼠肝臟來(lái)源的SAM合成酶，使得細(xì)胞內(nèi)的SAM含量大大提高，但其單位發(fā)酵體積中的SAM產(chǎn)量仍較低，只有28nmol/L發(fā)酵液。這樣的發(fā)酵產(chǎn)量，一方面成本較高，另一方面后期的分離純化工作也有一定的困難。研究發(fā)現(xiàn)，在對(duì)細(xì)胞內(nèi)各代謝途徑清楚了解的基礎(chǔ)上，通過(guò)有目的地改造細(xì)胞的代謝途徑可以使細(xì)胞成為一個(gè)微型的反應(yīng)器，高效地產(chǎn)出一些代謝中間產(chǎn)物。主要的兩條工藝路線一是用含有蛋氨酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)酵母和絲狀菌，積累后提?。欢怯梦⑸锱囵B(yǎng)法制備SAM合成酶，利用微生物酶源，將ATP和L-蛋氨酸作為合成底物，酶催化反應(yīng)使ATP和蛋氨酸偶聯(lián)合成。但因生物細(xì)胞中SAM合成酶濃度較低、分離提取困難以及ATP的原料價(jià)格高等原因，酶法大規(guī)模生產(chǎn)存在著較多限制因素，酶法合成目前還只適合于制備供科學(xué)研究使用的材料。目前，發(fā)酵法是工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的主要方法，在底物L(fēng)-蛋氨酸存在的情況下，可以通過(guò)培養(yǎng)微生物細(xì)胞來(lái)獲得SAM。甲醇利用型酵母/Vc力/s，Wor"是一種可以利用曱醇做唯一碳源的酵母菌。它最早是用于生產(chǎn)飼料用單細(xì)胞蛋白的。其大規(guī)模發(fā)酵可得到極高的細(xì)胞密度(〉130g/L干細(xì)胞重)和生物轉(zhuǎn)化率(〉10g/Lh)。它有下列獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)強(qiáng)力而又嚴(yán)密調(diào)控的啟動(dòng)子，如醇氧化酶I(methanol-induciblealcoholoxidaseI,A0X1)啟動(dòng)子、甘油搭-3-碌酸脫氫酵(glyceraldehye-3-phosphatedehydrogenase,GAP)啟動(dòng)子，曱醛脫氬酶I(formaldehydedehydrogenasesFLDl)啟動(dòng)子，非常適合于控制外源基因的表達(dá)；能在確定配方的基本鹽培養(yǎng)基中高密度生長(zhǎng)。在90年代，畢赤酵母發(fā)展成為一種流行的真核表達(dá)系統(tǒng)，除了作為蛋白表達(dá)系統(tǒng)外，還被利用來(lái)作為過(guò)氧化物酶體裝配的模型生物以及一些生化物質(zhì)的工業(yè)生產(chǎn)。這種低成本、高密度的發(fā)酵特點(diǎn)，使得它具備以極低的價(jià)格生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)產(chǎn)品的潛力。用發(fā)酵法生產(chǎn)SAM在國(guó)內(nèi)尚處于起步階段，具體進(jìn)展情況未見(jiàn)報(bào)道，發(fā)酵生產(chǎn)以及提取精制技術(shù)是規(guī)?；a(chǎn)需要克服的主要難題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種利用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)腺苷蛋氨酸的方法，所述工程菌抹是巳斯德畢赤酵母GS115-samll-208,/7/c力/s/^"or"GS115—saml1—208;典藏號(hào)為CCTCCNO:M206106。本發(fā)明的技術(shù)方案為用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)腺苷蛋氨酸的方法，它是將工程菌林在YPD平板培養(yǎng)基上活化，在2532。C培養(yǎng)4055h,直到單菌落出現(xiàn)；然后，接種到Y(jié)PD種子培養(yǎng)基，2532X:培養(yǎng)20~30h,再將經(jīng)種子培養(yǎng)基接種培養(yǎng)的物質(zhì)進(jìn)行至少一級(jí)接種到發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，即按發(fā)酵培養(yǎng)基重量的1.0~20.0%的上一級(jí)接種物接入到發(fā)酵培養(yǎng)基，在25~32。C培養(yǎng)30-50h后，補(bǔ)充發(fā)酵培養(yǎng)基重量5.0~35.0%的甘油做碳源，培養(yǎng)至高密度300~350g/L濕菌體，再補(bǔ)充發(fā)酵培養(yǎng)基量5.0~25.0%的曱醇、發(fā)酵培養(yǎng)基量1.0~5.5%的L-蛋氨酸在25~32°C進(jìn)行誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)24~96h得到腺苷蛋氨酸；所述工程菌林是巴斯德畢赤酵母GS115-samll-208,p/c力/a;a"o".sGS115-sam11-208;典藏號(hào)為CCTCCNO:M206106。所述平板培養(yǎng)基由10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，20g/L甘油，20g/L瓊脂組成;YPD種子培養(yǎng)基由10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，20g/L甘油組成；發(fā)酵培養(yǎng)基由磷酸25mL/L，硫酸鈣1.Og/L，硫酸鉀15.Og/L,硫酸鎂18.Og/L,氫氧化鉀3.0/L,甘油6.Og/L組成。對(duì)得到的腺苷蛋氨酸進(jìn)行純化對(duì)發(fā)酵液在18'C進(jìn)行離心分離，收集菌體后，加入1.0~3.O倍菌體重量的去離子水，0.1~0.5倍菌體重量的乙酸乙酯，0.2~0.7倍菌體重量的0.5mol/L硫酸，攪拌l4h，再在18。C進(jìn)行離心分離，收集上清液；上清液通過(guò)離子交換樹(shù)脂分離純化，用5.0~8.0%g/v丁二磺酸溶液洗脫，洗脫液通過(guò)反滲透濃縮設(shè)備進(jìn)行濃縮到1/10體積，-4(TC~4(TC冷凍干燥，得到腺苷蛋氨酸丁二磺酸鹽的白色結(jié)晶粉末。本發(fā)明成功地建立了在畢赤酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)SAM合成酶基因的技術(shù)路線，通過(guò)將外源SAM合成酶基因置于強(qiáng)啟動(dòng)子FLD1的調(diào)控下，通過(guò)強(qiáng)化表達(dá)SAM合成酶，使工程菌在培養(yǎng)基中蛋氨酸的存在下，在細(xì)胞內(nèi)合成并大量積累SAM。利用甘油為碳源培養(yǎng)畢赤酵母至高密度，到培養(yǎng)物菌體密度達(dá)到一定程度時(shí)，改用曱醇為單一碳源誘導(dǎo)SAM合成酶表達(dá)。當(dāng)酶活最高時(shí)，開(kāi)始添加蛋氨酸，通過(guò)具有高酶活的酵母在胞內(nèi)將蛋氨酸轉(zhuǎn)化為SAM。發(fā)酵培養(yǎng)基選擇比較廉價(jià)的高鹽培養(yǎng)基，主要成分硫酸鉀、硫酸釣、硫酸鎂、磷酸、氫氧化鉀、甘油及微量元素等，具有價(jià)格便宜、不易污染的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單、周期短、高產(chǎn)、低成本。附圖雙酶切示意圖。具體實(shí)施例方式本發(fā)明根據(jù)Genebank中的S.cerevisiae來(lái)源的SAM合成酶2基因(登錄M23368)，設(shè)計(jì)兩條專一引物，PCR擴(kuò)增得到此酶基因。將克隆得到的來(lái)源于釀酒酵母的SAM合成酶2基因裝配到甲醇酵母的表達(dá)載體pPIC9k中,得到表達(dá)質(zhì)粒pPIC9k-SAM2,使S認(rèn)合成酶2基因置于啟動(dòng)子FLD1的控制下。以上得到質(zhì)粒經(jīng)過(guò)線性化后，通過(guò)原生質(zhì)體或電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入曱醇酵母？/c力/s"Wor/s宿主細(xì)胞C57i乂該表達(dá)質(zhì)粒中的啟動(dòng)子系列或3'末端序列提高與尸/c力//^Wor/s染色體DNA同源重組，使得外源的SAM合成酶2基因整合入酵母染色體中，并在重組細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定地得到表達(dá)。這種整合于染色體的重組表達(dá)方式比單獨(dú)復(fù)制的質(zhì)粒表達(dá)形式的穩(wěn)定性強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)表明此類重組菌即使經(jīng)過(guò)100代的連續(xù)傳代后，染色體組型和蛋白表達(dá)量都沒(méi)有明顯的變化(H0hi，yeast，1998,14:895~903)。由于整合如酵母中的表達(dá)質(zhì)粒含有卡那霉素抗性基因，使得重組酵母細(xì)胞能夠在含有一定卡那霉素濃度的抗性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。這樣就很方便的利用抗性篩選得到陽(yáng)性克隆細(xì)胞。為了得到高產(chǎn)SAM的工程菌抹，將利用抗性篩選得到的不同菌株在含有L-蛋氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，同時(shí)補(bǔ)充一定量的碳源(甘油和曱醇)，菌抹利用培養(yǎng)基中的L-蛋氨酸作為底屋，在SAM合成酶的催化下，可以在細(xì)胞內(nèi)合成并積累SAM。根據(jù)積累量的高低篩選得到一抹高產(chǎn)SAM的菌抹。該菌抹已經(jīng)于2006年10月在典型培養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行了典藏，典藏號(hào)為CCTCCNO:M206106，分類命名號(hào)為//c力/s戸"。r"。利用此工程菌抹進(jìn)行擴(kuò)大發(fā)酵培養(yǎng)，對(duì)溫度、pH、溶解氧等發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化控制，同時(shí)在發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)充一定量的甘油、曱醇、蛋氨酸和微量元素，SAM產(chǎn)量達(dá)到4.0~7.Og/L。具體實(shí)施工程為1、菌抹和試劑/c力/，"oW^宿主菌C57i乂抗性標(biāo)記為氨千青霉素和卡那霉素，酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC9k，均為Invitrogen公司產(chǎn)品。載體為Ppic9k，宿主菌為E.coliDH5a用于進(jìn)行克隆步驟。T4DNAPolymase，T4DNALigase，和限制性內(nèi)切酶均來(lái)源于寶生物公司。膠回收試劑盒購(gòu)于上海正谷生物公司。其它試劑為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純?cè)噭?、培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基YPD(10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，20g/L甘油)；平板培養(yǎng)基YPD(10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，20g/L甘油，20g/L瓊脂)；大腸桿菌LB培養(yǎng)基LB(10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，10g/L氯化鈉，pH7，0);LB固體培養(yǎng)基(10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，10g/L氯化鈉，20g/L瓊脂粉，pH7.0);選擇培養(yǎng)基MD(1.34%YNB，0.00004%生物素，2°/。葡萄糖,1.5%瓊脂);誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMGY(10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，13.4g/LYNB,0.0004g/L生物素，10g/L甘油，0.lmol/L磷酸緩沖液，pH6.0);轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基BMMY(10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨,13.4g/LYNB，0.0004g/L生物素，10g/L曱醇，O.lmol/L磷酸緩沖液，pH6.0)。發(fā)酵培養(yǎng)基(磷酸25mL/L,硫酸鈣1.0g/L，疏酸鉀15.Og/L,硫酸鎂18.Og/L，氫氧化鉀3.0/L，甘油6.Og/L)。3、常規(guī)分子生物學(xué)操作S.cerevisiae基因組DNA抽提，基因克隆按照奧斯伯等的方法(奧斯伯等，1995，精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南，第三版)進(jìn)行。工程菌抹巴斯德畢赤酵母GS115-samII-208，//c力/a聲"o"、GS115-samll-208的制備曱醇酵母重組表達(dá)SAM合成酶2基因質(zhì)粒pPIC9k-SAM2的構(gòu)建1、引物設(shè)計(jì)和PCR反應(yīng)根據(jù)Genebank中的S.cerevisiae來(lái)源的SAM合成酶2基因(登錄M23368)，設(shè)計(jì)兩條專一引物primer1:5'-gCggCgAATTCATgTCCAAgAgCAAAACTTTC-3'primer2:5'-ATTgCggCCgCTggTTTTTCCCATgAgTACTC-3'在設(shè)計(jì)時(shí)，基因5，-端引物引入了一個(gè)EcoRI酶切位點(diǎn)，3，端引物引入了一個(gè)NotI酶切位點(diǎn)。如附圖所示。抽提釀酒酵母基因組染色體總DNA,以釀酒酵母染色DNA為模板，加入25微克的引物、TaqDNA聚合酶及dNTP混合物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件如下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>2、PCR產(chǎn)物的克隆PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳后，采用DNAM^回收試劑盒回收1.2kb大小的PCR擴(kuò)增片段。將回收的PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)EcoRI和NotI雙酶切后與經(jīng)過(guò)EcoRI和NotI雙酶切的pPIC9k質(zhì)粒連接，裝配得到表達(dá)質(zhì)粒pPIC9k-SAM2。將獲得的表達(dá)質(zhì)粒pPIC9k-SAM2經(jīng)過(guò)EcoRI和NotI雙酶切與PCR擴(kuò)增均能夠得到1.2kb左右的片段，與理論SAM合成酶2基因一致。測(cè)定序列后表明其與Genebank中發(fā)表的SAM合成酶2基因序列完全相同。表達(dá)外源SAM合成酶2基因的重組細(xì)胞的構(gòu)建1、電轉(zhuǎn)化曱醇酵母細(xì)胞的制備接種6"i7W于50mLYPD培養(yǎng)基，30。C培養(yǎng)，A,關(guān)為1.5,4。C4000rpmx10min離心，菌體沉淀分別用50mL、25mL冷凍無(wú)菌水和2mL冷凍山梨醇各洗一次，每次洗后均4。C4000rpmxlOmin離心，并收集菌體，最后將離心的菌體細(xì)胞用100uLlmol/L水凍的山梨醇懸浮，即獲得電擊感受態(tài)細(xì)胞。2、重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9k-SAM2電轉(zhuǎn)化感受態(tài)酵母細(xì)胞。將構(gòu)建好的重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9k-SAM2約20ug用BglII酶切線性化，乙醇沉淀回收線性DNA并溶解于10uL無(wú)菌水中，同時(shí)將空載體pPIC9k用相同BglII的酶切線性化，并回收作為對(duì)照。將上述線性化DNA分別與100ul感受態(tài)細(xì)胞混合，采用電轉(zhuǎn)化儀電擊轉(zhuǎn)化。電轉(zhuǎn)化條件為電壓1600V,電擊時(shí)間5ms。立即向電轉(zhuǎn)化杯中加入lmLlmol/L冰浴預(yù)冷的山梨醇，并將電轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)移到無(wú)菌管中，3(TC保溫lh，加入0.5mLYPD培養(yǎng)基，30。C保溫1.5h，4。C4000rpmx5min離心，取200uL菌液涂布于MD平板上。3(TC培養(yǎng)直到出現(xiàn)單菌落。3、抗性菌4朱篩選挑取平板上的生長(zhǎng)菌落于細(xì)胞培養(yǎng)板的孔中培養(yǎng)，取10ul孔中液體加入含O.5~4.Omg/mL的G418濃度的YPD平板上以篩選多拷貝陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。由于Ppic9k載體含有一個(gè)卡那霉素的抗性基因，它能使酵母細(xì)胞對(duì)卡那霉素產(chǎn)生抗性，如果轉(zhuǎn)入的外源基因拷貝數(shù)越多，轉(zhuǎn)化的酵母菌耐受卡那霉素的濃度就越高，其分泌的蛋白量也會(huì)增加。細(xì)胞SAM快速抽提將上述發(fā)酵液4。C4000rpmx5min離心收集，加入等體積的20°/。高氯酸于4'C抽提lh,4'C12000rpmx5min離心，將上清液用0.2um濾膜過(guò)濾，取20uL用HPLC測(cè)定SAM含量。SAM的HPLC含量測(cè)定色i普柱為C,8反相柱(250mmx4.6mm);流動(dòng)相為2mmol/L庚坑磺酸鈉，40mmol/L磷酸二氫銨，20°/。曱醇；流速為1.Oml/min;枱r測(cè)波長(zhǎng)254nm;進(jìn)樣體積20uL。采用外標(biāo)方法，根據(jù)樣品峰面積與已知濃度SAM標(biāo)準(zhǔn)品峰面積的比值來(lái)定量。發(fā)酵液SAM含量達(dá)到4.0~7.Og/L。SAM酶活力測(cè)定發(fā)酵液離心(5000rpmxlOmin)收集菌體加入裂解緩沖液，清洗1次。去上清后加入與菌體等量的玻璃珠和4倍的裂解緩沖液，0~4'C超聲處理10min裂解細(xì)胞。離心(10000rpmx5min)除去玻璃珠和細(xì)胞殘片，上清再離心(12000rpmx60min)，得到上清粗酶液。反應(yīng)體系20mmol/LL-蛋氨酸，20mmol/LATP,8mmol/L還原性谷胱甘肽，2Gmmol/L氯化鎂，10Gmmol/L氯化鉀，150mmol/LTris-HCl(pH7.4),適量的細(xì)胞裂解液。37。C恒溫60min，加入20°/。高氯酸終止反應(yīng)，離心去除沉淀，上清過(guò)濾后用HPLC測(cè)定含量。每活力達(dá)到3.5~4.8mg/L.h。上述得到的工程菌抹巴斯德畢赤酵母GS115-samll-208，;/c力/a/a"or/sGS115-samII-208的藏號(hào)為CCTCCN0:M206106。用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)腺苷蛋氨酸將工程菌抹在YPD平板培養(yǎng)基上活化，在(25-32。C如25°C、27°C、28°C、29°C)培養(yǎng)40~55h(如40h、42h、45h、48h、53h)，直到單菌落出現(xiàn)；然后，接種到Y(jié)PD種子培養(yǎng)基，25~32°C(如25。C、27。C、28°C、29°C)培養(yǎng)20~30h(如20h、22h、24h、28h、30h)，再將經(jīng)種子培養(yǎng)基接種培養(yǎng)的物質(zhì)進(jìn)行至少一級(jí)接種到發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，即按發(fā)酵培養(yǎng)基重量的1.0~20.0°/。(如1%、5%、10%、15%、20%)的上一級(jí)接種物接入到發(fā)酵培養(yǎng)基，在2532。C(如25。C、27°C、28°C、29°C、32°C)培養(yǎng)30~50h(如30h、36h、48h、50h)后，補(bǔ)充發(fā)酵培養(yǎng)基重量5.0~35.0%的甘油做碳源，培養(yǎng)至高密度300~350g/L濕菌體，再補(bǔ)充發(fā)酵培養(yǎng)基量5.0~25.0%的曱醇、發(fā)酵培養(yǎng)基量1.0~5.5%的L-蛋氨酸在25~32°C(如25°C、27。C、28°C、29°C、32°C)進(jìn)行誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)24~96h得到腺苷蛋氨酸；在上述發(fā)酵過(guò)程中利用氨水控制PH在4.0-7.0,同時(shí)溶解氧不低于25%，通過(guò)對(duì)發(fā)酵容器中補(bǔ)充壓縮空氣來(lái)實(shí)現(xiàn)。經(jīng)過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)工程菌抹SAM產(chǎn)量達(dá)到4.0~7.0g/L。與宿主菌抹相比SAM產(chǎn)量提高了100倍。SAM的分離純化發(fā)酵液，4。C3000rpmx10min離心，收集菌體，加入1.0~3.0倍菌體量的去離子水，0.1-0.5倍菌體量的乙酸乙酯，0.2-0.7倍菌體量的0.5mol/L石克酸，攪拌l-4h,4°C3000rpmx1Omin離心，收集上清液。沉淀?xiàng)壢ァＩ锨逡和ㄟ^(guò)D113弱酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和D201弱堿型陰離子交換樹(shù)脂分離純化，用5.0-8.0%(g/v)丁二磺酸溶液洗脫，洗脫液通過(guò)反滲透濃縮設(shè)備進(jìn)行濃縮到1/10體積，-40°C4(TC冷凍干燥，得到腺苷蛋氨酸丁二磺酸鹽的白色結(jié)晶粉末。收率40-60%。本發(fā)明純化方法狄用絮凝方法除去部分雜質(zhì)，通過(guò)弱酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂吸附和弱堿性陰離子交換樹(shù)脂脫鹽后，再經(jīng)過(guò)樹(shù)脂脫色、反滲透濃縮及冷凍干燥等步驟得到符合質(zhì)量要求的產(chǎn)品。與傳統(tǒng)方法比較，該生產(chǎn)工藝具有IM乍簡(jiǎn)單、^M詠肯M毛低等優(yōu)點(diǎn)。權(quán)利要求1、一種用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)腺苷蛋氨酸的方法，它是將工程菌株在YPD平板培養(yǎng)基上活化，在25～32℃培養(yǎng)40～55h，直到單菌落出現(xiàn)；然后，接種到Y(jié)PD種子培養(yǎng)基，25～32℃培養(yǎng)20～30h，再將經(jīng)種子培養(yǎng)基接種培養(yǎng)的物質(zhì)進(jìn)行至少一級(jí)接種到發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，即按發(fā)酵培養(yǎng)基重量的1.0～20.0％的上一級(jí)接種物接入到發(fā)酵培養(yǎng)基，在25～32℃培養(yǎng)30～50h后，補(bǔ)充發(fā)酵培養(yǎng)基重量5.0～35.0％的甘油做碳源，培養(yǎng)至高密度300～350g/L濕菌體，再補(bǔ)充發(fā)酵培養(yǎng)基量5.0～25.0％的甲醇、發(fā)酵培養(yǎng)基量1.0～5.5％的L-蛋氨酸在25～32℃進(jìn)行誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)24～96h得到腺苷蛋氨酸；所述工程菌株是巴斯德畢赤酵母GS115-samII-208，pichiapastorisGS115-samII-208；典藏號(hào)為CCTCCN0M206106。2、如權(quán)利要求1所述用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)腺苦蛋氨酸的方法，其特征在于發(fā)酵過(guò)程中利用氨水控制PH在4.0-7.0,同時(shí)溶解氧不低于25%。3、如權(quán)利要求1所述用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)腺苷蛋氨酸的方法，其特征在于對(duì)得到的腺苷蛋氨酸進(jìn)行純化對(duì)發(fā)酵液在1~8"C進(jìn)行離心分離，收集菌體后，加入1.0~3.O倍菌體重量的去離子水，0.1~0.5倍菌體重量的乙酸乙酯，0.2~0.7倍菌體重量的0.5mol/L疏酸，攪拌l~4h,再在l-8。C進(jìn)行離心分離，收集上清液；上清液通過(guò)離子交換樹(shù)脂分離純化，用5.0~8.0%g/v丁二磺酸溶液洗脫，洗脫液通過(guò)反滲透濃縮設(shè)備進(jìn)行濃縮到1/10體積，-40°C~40。C冷凍干燥，得到腺苷蛋氨酸丁二磺酸鹽的白色結(jié)晶粉末。4、如權(quán)利要求1所述用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)腺苷蛋氨酸的方法，其特征在于所述平板培養(yǎng)基由10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，20g/L甘油，20g/L瓊脂組成；YPD種子培養(yǎng)基由10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，20g/L甘油組成；發(fā)酵培養(yǎng)基由磷酸25mL/L，硫酸鉀l.0g/L，石危酸鉀15.0g/L，硫酸鎂18.0g/L，氳氧化鉀3.0/L，甘油6.Og/L組成。5、如權(quán)利要求1所述用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)腺苷蛋氨酸的方法，其特征在于所述工程菌抹它是這樣得到的(1)PCR反應(yīng)抽提釀酒酵母基因組染色體總DNA，以釀酒酵母染色DNA為模板，加入2~5微克的引物、TaqDM聚合酶及dNTP混合物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述引物為引物l:5'-gCggCgAATTCATgTCCAAgAgCAAAACTTTC-3'引物2:5'-ATTgCggCCgCTggTTTTTCCCATgAgTACTC-3'基因5'-端引物引入了一個(gè)EcoRI酶切位點(diǎn)，3'端引物引入了一個(gè)NotI酶切位點(diǎn)；(2)PCR產(chǎn)物的克隆PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳后，采用DNA膠回收試劑盒回收1.2kb大小的PCR擴(kuò)增片段；將回收的PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)EcoRI和NotI雙酶切后與經(jīng)過(guò)EcoRI和NotI雙酶切的pPIC9k質(zhì)粒連接，裝配得到表達(dá)質(zhì)粒pPIC9k-SAM2;將獲得的表達(dá)質(zhì)粒pPIC9k-SAM2經(jīng)過(guò)EcoRI和NotI雙酶切與PCR擴(kuò)增均能夠得到1.2kb的片段；(3)電轉(zhuǎn)化曱醇酵母細(xì)胞的制備接種C57"于50mLYPD培養(yǎng)基，30匸培養(yǎng)，A,詣為1.5，1~8'C離心分離，菌體沉淀分別用50mL、25mL冷凍無(wú)菌水和2mL冷凍山梨醇各洗一次，每次洗后均1-8。C離心分離，并收集菌體，最后將離心的菌體細(xì)胞用100uLlmol/L水凍的山梨醇懸浮，即獲得電擊感受態(tài)細(xì)胞；(4)重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9k-SAM2電轉(zhuǎn)化感受態(tài)酵母細(xì)胞將構(gòu)建好的重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9k-SAM2約20ug用BglII酶切線性化，乙醇沉淀回收線性DNA并溶解于10uL無(wú)菌水中，同時(shí)將空載體pPIC9k用相同Bgin的酶切線性化，并回收作為對(duì)照；將上述線性化DNA分別與100ul感受態(tài)細(xì)胞混合，采用電轉(zhuǎn)化儀電擊轉(zhuǎn)化；轉(zhuǎn)化后立即向電轉(zhuǎn)化杯中加入lmLlmol/L冰浴預(yù)冷的山梨醇，并將電轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)移到無(wú)菌管中，30。C保溫lh,加入0.5mLYPD培養(yǎng)基，30。C保溫1.5h，18。C離心分離，取200uL菌液涂布于MD平板上，30。C培養(yǎng)直到出現(xiàn)單菌落；(5)抗性菌抹篩選挑取平板上的生長(zhǎng)菌落于細(xì)胞培養(yǎng)板的孔中培養(yǎng)，取10ul孔中液體加入含0.5~4.Omg/mL的G418濃度的YPD平板上以篩選多拷貝陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子；(6)細(xì)胞SAM快速抽提將經(jīng)篩選的發(fā)酵液離心分離，加入等體積的20%高氯酸于418XTC抽提后，再離心分離，將上清液過(guò)濾得到工程菌株。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)腺苷蛋氨酸的方法，它是將工程菌株在平板培養(yǎng)基上活化后，接種到種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，再將經(jīng)種子培養(yǎng)基接種培養(yǎng)的物質(zhì)進(jìn)行至少一級(jí)接種到發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，補(bǔ)充甘油做碳源，培養(yǎng)至高密度300～350g/L濕菌體，再補(bǔ)充甲醇和L-蛋氨酸進(jìn)行誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)，得到腺苷蛋氨酸；所述工程菌株是巴斯德畢赤酵母GS115-samII-208，pichiapastorisGS115-samII-208；典藏號(hào)為CCTCCNOM206106。方法簡(jiǎn)單、周期短、高產(chǎn)、低成本。文檔編號(hào)C12P19/00GK101173308SQ200710052338公開(kāi)日2008年5月7日申請(qǐng)日期2007年5月31日優(yōu)先權(quán)日2007年5月31日發(fā)明者劉勝祥申請(qǐng)人:武漢武大弘元股份有限公司