專利名稱：：用于抑制和殺滅耐藥性細(xì)菌的雙鏈小分子干擾核酸及其組合的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及用于抑制和殺滅超級(jí)細(xì)菌如耐曱氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)為代表的各種耐藥性細(xì)菌的雙鏈小分子干擾核酸。
背景技術(shù)：
：自上世紀(jì)60年代初首次發(fā)現(xiàn)耐曱氧西林性金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus,MRSA)以來，這類細(xì)菌的感染至今已在環(huán)境中廣泛存在，幾乎遍及全球。到上世紀(jì)80年代后期，已成為引起全球性醫(yī)院內(nèi)感染的最主要的病原菌。有資料表明，20%的肺炎、40%的菌血癥和49%的傷口感染由MRSA引起。上述疾病的死亡率，一般在10-30%，有時(shí)可高達(dá)50%。估計(jì)全球有多達(dá)1/3的人帶有致命的超級(jí)細(xì)菌。隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，新的具有多重耐藥的MRSA不斷產(chǎn)生。過去一般用萬古霉素來治療MRSA,但現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)了具有多重耐藥性且又耐萬古霉素的MRSA。長此以往，如果仍沿當(dāng)前的臨床藥物的策略來治療，人類將有可能失去對(duì)MRSA感染的"最后一道防線"。因此，有人認(rèn)為MRSA是目前世界三大最難解決的感染性疾病之首，其次是乙肝和艾滋病。除MRSA以外，其他的多種細(xì)菌性病菌也發(fā)現(xiàn)耐藥性變異。細(xì)菌可對(duì)一種或多種抗生素或藥物產(chǎn)生耐藥性。這也開始成為世界范圍的一個(gè)十分重要的預(yù)防和臨床治療的難題。如在上世紀(jì)50-60年代，結(jié)核病耐藥菌的出現(xiàn)，就已致使結(jié)核病疫情在全球"死灰復(fù)燃"，而且有愈演愈烈的趨勢，其他的各種細(xì)菌性病害，如霍亂，傷寒，鼠疫等，也因其產(chǎn)生細(xì)菌基因的變異而獲得新的耐藥性或新的毒力，也存在著潛在性重新流行的威脅。對(duì)所有上述的細(xì)菌性病害重新發(fā)生的情況，人類雖有所警覺，但至今尚未有確切可靠的對(duì)付的辦法。1998年2月，F(xiàn)ireAetal.發(fā)現(xiàn)雙鏈RNA(dsRNA)在線蟲(Caencv^ajboW/se/egans)中能夠高效特異性阻斷相應(yīng)基因的表達(dá)。他們將這一現(xiàn)象稱為RNA千擾(RNAinterference,簡稱RNAi)。隨后在果蠅、真菌、昆蟲、植物等生物體及哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了RNAi現(xiàn)象。這種廣泛性的存在表明RNAi很可能出現(xiàn)在生命進(jìn)化的早期階段。隨著研究的不斷深入，RNAi的機(jī)制正逐步地被闡明，同時(shí)亦成為功能基因組研究領(lǐng)域中的有力工具，RNAi也越來越被重視，自2001年起連續(xù)三年被《Science》雜志評(píng)為十大科學(xué)成就之一。2006年，F(xiàn)ireAetal.因發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象而獲得生物醫(yī)學(xué)諾貝爾獎(jiǎng)。研究表明，RNAi具有較高的特異性，能夠非常特異地降解與其序列相應(yīng)的單個(gè)內(nèi)源基因的mRNA,且抑制基因表達(dá)的效率很高，相對(duì)少量的dsRNA就可以使表型達(dá)到缺失突變體程度，但dsRNA需要一個(gè)最小的長度才能產(chǎn)生有效地干擾效果。因此，用siRNA代替?zhèn)鹘y(tǒng)反義核酸進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后基因沉默，RNAi技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域已經(jīng)從基因組學(xué)研究逐步擴(kuò)展到醫(yī)學(xué)領(lǐng)域并作為基因治療手更有效地手段。利用RNAi不僅能提供一種經(jīng)濟(jì)、快捷、高效的抑制基因表達(dá)的技術(shù)手段，而且在基因功能測定和基因治療等方面開辟一條新的更有效地策略，因此具有非常廣闊的應(yīng)用前景。并將為人類創(chuàng)造億萬價(jià)值的新藥。現(xiàn)已證明應(yīng)用siRNA策略可以預(yù)防和治療病毒病的藥物。(FischelL.TAN,JemesQ.Yin.RNAi,anewtherapeuticstategyagainstviralinfection.Cellresearch.2004.14(6):460-466.GreGory丄Hannon.Insigntnewarticles:RNAinterference.Nature.2002.418:244-250.)但是RNAi策略是否對(duì)細(xì)菌病有作用，至今尚未能確定。雖然在僅有的文獻(xiàn)中，Yanagihara等(2005)使用一個(gè)MRSA菌抹發(fā)現(xiàn)了靶向的siRNA可以在體內(nèi)(invivo)有效地抑制MRSA凝固酶基因的表達(dá)。但在他們進(jìn)行的體外(invitro)實(shí)驗(yàn)中沒有發(fā)現(xiàn)siRNA實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在細(xì)菌數(shù)量上的差別。僅在他們的動(dòng)物模型(MurineinfectionModel)中，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組與siRNA組MRSA的細(xì)菌數(shù)量分別為7.64e0.42和6.29e0.23Logcfu/ml。雖然有這種差別，但不足證明siRNA可有效抑制和殺滅MRSA。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是應(yīng)用RNAi策略的基本原理，提供一種雙鏈小分子干擾核酸(siNA)及其配套技術(shù)，能有效抑制和殺滅包括耐曱氧西林性金黃色葡萄球菌(MRSA)在內(nèi)的各種耐藥性細(xì)菌，可用于預(yù)防與治療由以MRSA為代表的具多重耐藥性基因變異細(xì)菌引起的疾病。本發(fā)明所述的用于抑制和殺滅各種耐藥性細(xì)菌的雙鏈小分子干擾核酸即siNA為雙鏈分子，有19個(gè)堿基配對(duì)，正義鏈和反義鏈各自在5，末端有兩個(gè)突出堿基dT,GC含量為40-55%,包括雙鏈RNA、雙鏈DNA、RNA/DNA、DNA/RNA;所針對(duì)的乾序列選自金黃色葡萄球菌基因組中與復(fù)制，轉(zhuǎn)錄，翻譯等生命關(guān)鍵性活動(dòng)的有關(guān)基因，以及與耐藥性相關(guān)的mecA基因；所述把序列在90%以上的金黃色葡萄球菌林中保守的且與人體基因組中的所有基因序列不同源的序列區(qū)域；所述的siNA雙鏈分子的扭序列選自SEQIDNO.1-325,正義鏈?zhǔn)桥c靶序列——對(duì)應(yīng)的DNA或RNA序列，反義鏈?zhǔn)歉鶕?jù)堿基互補(bǔ)原則與正義鏈序列——相應(yīng)的RNA或DNA。所述的與復(fù)制，轉(zhuǎn)錄，翻譯等生命活動(dòng)的有關(guān)基因優(yōu)選是rpoA基因、ftsZ基因、in氾基因、murA基因、dnaA基因；所述的與耐藥性相關(guān)的基因優(yōu)選是mecA基因；優(yōu)選的耙序列中，SEQIDN0.1-56是來自rpoA基因，SEQIDNO.57-107是來自ftsZ基因，SEQIDNO.108-176是來自infB基因，SEQIDNO.177-234是來自murA基因，SEQIDNO.235-298是來自dnaA基因，SEQIDNO.299-325是來自mecA基因。本發(fā)明還提供了所述的雙鏈小分子干擾核酸的組合，該組合是與靶序列SEQIDNO.1-325——對(duì)應(yīng)的siNA雙鏈分子的兩條或兩條以上的相互組合。所述的雙鏈小分子干擾核酸的優(yōu)選組合，是所述的siNA雙鏈分子根據(jù)針對(duì)的靶序列所在基因分為以下各組(1)所述的耙序列中SEQIDNO.1-56是來自rpoA基因；(2)所述的耙序列中SEQIDNO.57-107是來自ftsZ基因；(3)所述的把序列中SEQIDNO.108-176是來自in氾基因；(4)所述的耙序列中SEQIDN0.177-234是來自murA基因；(5)所述的耙序列中SEQIDNO.235-298是來自dnaA基因；以及(6)所述的把序列中SEQIDNO.299-325是來自mecA基因；上述同組siNA雙鏈分子的兩條或兩條以上相互組合，或者是上述不同組siNA雙鏈分子的兩條或兩條以上相互組合。本發(fā)明還提供了所述的雙鏈小分子干擾核酸的篩選方法，其包括以下步驟1)對(duì)所有金黃色葡萄球菌林基因組進(jìn)行同源性比對(duì)后，選取在90%以上的金黃色葡萄球菌林中保守的序列區(qū)域作為把序列；2)剔除容易形成二級(jí)結(jié)構(gòu)而使siNA分子難以接近的乾序列；3)剔除與人體基因組中的所有基因序列同源的把序列；4)在上述耙序列中選取長度為19bp的序列；5)計(jì)算GC含量，選取GC含量為40-55%左右的序列；6)經(jīng)上述篩選得到候選siNA的把位點(diǎn)，設(shè)計(jì)出相應(yīng)的siNA，然后通過抑制金黃色葡萄球菌生長實(shí)驗(yàn)進(jìn)行篩選，得到有效抑制或殺滅金黃色葡萄球菌的siNA序列。本發(fā)明還提供了所述的雙鏈小分子干擾核酸用于制備預(yù)防與治療以耐曱氧西林性金黃色葡萄球菌MRSA為代表的具多重耐藥性基因變異的細(xì)菌引起的疾病的藥物的用途。本發(fā)明還提供了所述雙鏈小分子干擾核酸的組合用于制備預(yù)防與治療以耐曱氧西林性金黃色葡萄球菌MRSA為代表的具多重耐藥性基因變異細(xì)菌引起的疾病的藥物的用途。圍繞RNAi策略能否成功地十分有效地抑制甚至殺滅以MRSA為代表的具多重耐藥性基因變異的突變菌這一中心議題，本發(fā)明進(jìn)行了以下問題的研究并建立和發(fā)明了一套較系統(tǒng)的能真正應(yīng)用的siNA，以及其組合與篩選方法。這一套技術(shù)由于同時(shí)在MRSA的標(biāo)準(zhǔn)林及三個(gè)臨床分離林上獲得成功，故可認(rèn)為具有廣泛應(yīng)用的前景。1.參照當(dāng)前國內(nèi)外已有的設(shè)計(jì)siNA的原理和先進(jìn)經(jīng)驗(yàn)，針對(duì)MRSA基因組中，對(duì)細(xì)菌中涉及如復(fù)制，轉(zhuǎn)錄，翻譯等重要生命活動(dòng)的有關(guān)基因，如rpoA基因，ftsZ基因，in氾基因，murA基因，dnaA基因等，設(shè)計(jì)出系列的小分子核酸并找出十分有效地抑制和殺死MRSA的siNA。2.參照當(dāng)前國內(nèi)外已有的設(shè)計(jì)siNA的原理和先進(jìn)經(jīng)驗(yàn)，針對(duì)選擇導(dǎo)致金黃色葡萄球菌產(chǎn)生甲氧西林耐藥性突變的mecA基因作為耙基因，設(shè)計(jì)并找出能沉默該耐藥性基因的siNA，這樣便可以應(yīng)用這些siNA于耐藥性靶基因，從而可逆轉(zhuǎn)該病菌的耐藥性，使藥物恢復(fù)原有的對(duì)病菌的有效抑制或殺滅作用。3.在上述基礎(chǔ)上，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)并證實(shí)在不同形式但內(nèi)容相同的四種雙鏈小分子核酸siNA(包括+RNA/-RNA(雙鏈RNA)，+DNA/-DNA(雙鏈DNA)，+RNAADNA(正義鏈為RNA，負(fù)義鏈為DNA),+DNA/-RNA(正義鏈為DNA，負(fù)義鏈為RNA))中，-RNA/+DNA抑菌和殺菌效果最好。4.通過研究發(fā)現(xiàn)并確定在抑制或殺滅MRSA的過程中所使用的siNA的濃度是有效性的一個(gè)十分重要因素。發(fā)明人通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在細(xì)菌體內(nèi)能沉默基因的相關(guān)靶向siNA的有效濃度(不小于2.3nmol/ml)，比在許多生物體如哺乳動(dòng)物，甚至病毒的濃度要明顯偏高。5.發(fā)現(xiàn)應(yīng)用上述兩大類的siNA作用于不同的MRSA菌林(包括標(biāo)準(zhǔn)林ATCC25923、談延娥林、關(guān)沃林、姚貴順林、何杰昌林)均有類似的抑菌和殺菌作用，從而證明了這一發(fā)明具有一定的普遍意義。6.綜上所述的
發(fā)明內(nèi)容，我們可看出本專利發(fā)明的技術(shù)不僅可以十分有效地通過沉默對(duì)MRSA生命活動(dòng)的關(guān)鍵基因，從而有效地抑制或甚至殺滅MRSA。另外，通過成功地控制MRSA的耐藥性突變，可以成功地使能不斷發(fā)生的耐藥性突變基因沉默，從而使耐藥菌株重新失去耐藥性性質(zhì)，使原來本已失去藥效的抗生素重新恢復(fù)抑菌或殺菌的功能。使用上述任7一條技術(shù)路線，或者將兩條技術(shù)路線結(jié)合起來應(yīng)用于新藥的研制和開發(fā)，人類肯定將能控制好現(xiàn)有的及不斷產(chǎn)生的新的超級(jí)細(xì)菌的危害。7.根據(jù)所有的細(xì)菌生物體具有基本共同的生物學(xué)規(guī)律，因此本發(fā)明專利所發(fā)現(xiàn)和確定的技術(shù)和原則，基本適應(yīng)于所有的細(xì)菌，包括肺結(jié)核菌，傷寒沙門菌，血喉棒狀桿菌，破傷風(fēng)桿菌等的預(yù)防和治療藥物的研制與開發(fā)。綜上所述，本發(fā)明所述的用于抑制和殺滅超級(jí)細(xì)菌__耐曱氧西林金黃色葡萄球菌(簡稱MRSA)以及各種耐藥性細(xì)菌的雙鏈小分子干擾核酸，可有效地解決超級(jí)細(xì)菌以及其他各種耐藥性細(xì)菌病對(duì)人類健康造成的巨大的現(xiàn)實(shí)的以及潛在的威脅，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)的一個(gè)十分重要的、至今尚未有解決苗頭的全新的突破。圖1為siNA1對(duì)MRSA的抑制效果。圖2為siNA60對(duì)MRSA的抑制效果。圖3為siNA108對(duì)MRSA的抑制效果。圖4為siNA177對(duì)MRSA的抑制效果。圖5為siNA235對(duì)MRSA的抑制效果。圖6為siNA305對(duì)MRSA的抑制效果。具體實(shí)施例方式實(shí)施例一把位點(diǎn)的設(shè)計(jì)本發(fā)明采取以下全部或大多數(shù)原則來選擇耙序列，進(jìn)行設(shè)計(jì)siNA:1、選取長度為18-25bp的序列；2、計(jì)算GC含量，選取GC含量為40-55%左右的序列；3、在90%以上的金黃色葡萄菌林中，同一基因的把序列的大部分堿基都是保守的；從NCBI(美國國立生物技術(shù)信息中心)，EMBL(歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室核酸序列數(shù)據(jù)庫)，DDBJ(日本DNA數(shù)據(jù)庫)中下載所有金黃色葡萄球菌的靶基因序列，并進(jìn)行同源性比對(duì)后，選取在90%以上的菌林中保守的序列區(qū)域作為靶序列。4、在金黃色葡萄菌林乾基因中的靶序列所在的區(qū)域不會(huì)因形成二級(jí)結(jié)構(gòu)而使siNA分子難以接近；siRNA發(fā)生作用是通過堿基互補(bǔ)原則識(shí)別與其互補(bǔ)的mRNA,在同源序列的中部8剪切mRNA;如果在該序列區(qū)域存在二級(jí)結(jié)構(gòu)而難以使siNA接近，就會(huì)導(dǎo)致siNA難以識(shí)別該互補(bǔ)序列，從而不能抑制或降解mRNA。5、本發(fā)明中的siNA所針對(duì)金黃色葡萄菌林靶基因中的扭序列是與人體基因組中的所有基因序列不同源。將siNA分子的耙序列在GenBank進(jìn)行Blast。如與耙序列相比，在人類基因中不存在等于或多于16個(gè)連續(xù)相同堿基，則選取該靶序列用來設(shè)計(jì)siNA。這樣避免siNA分子在人體內(nèi)降解其他不相關(guān)基因，引起人體細(xì)胞功能失調(diào)，從而有可能導(dǎo)致產(chǎn)生副作用。根據(jù)上述原則，得到了候選siNA的靶位點(diǎn)，從而設(shè)計(jì)出相應(yīng)的siNA，然后通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)行篩選，得到了325條siNA(見最后所附的表8)。實(shí)施例二針對(duì)dnaA基因所設(shè)計(jì)的siNA的抑菌或殺菌有效性的確定1.siNA的合成根據(jù)附表1中的把序列SEQIDN0.1，得到——對(duì)應(yīng)的正義鏈和反義鏈序列，合成如下結(jié)構(gòu)的siNA1:5'CUUGGUAGAGAGCAAUUCAdTdT3'iiiiiiiiiiiiiiimi3'dTdTGAACCATCTCTCGTTAAGT5'無關(guān)siNA為5'GACCCGCAUUGAGCAUCAAdTdT3'iiiimimiiii11ii3，dTdTCTGGGCGTAACTCGTAGTT5'2.在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(36|jg/ml苯唑西林，0.125mMEDTA)中接種MRSA談延娥林(由中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室分離并鑒定，保存于廣州市疾病預(yù)防控制中心；該菌林對(duì)苯唑西林的最小抑菌濃度為72|jg/ml)。3.在2個(gè)玻璃管中，各取0.8ml菌液，并加入150ijI2x肉湯；一管加入150iJl無關(guān)siNA(500|jg/ml)，一管加入150|jIsiNA1母液(500|jg/ml);4.于37度中搖床培養(yǎng)11.5小時(shí)；5.使用酶標(biāo)儀(LALJYVRAMMKIH)于630mm波長處測量2次吸光度，取平均值，結(jié)果見圖1;如圖1所示，siNA11號(hào)孔OD值比對(duì)應(yīng)無關(guān)siNA孔OD值小超過20倍，表明siNA1能夠極大的抑制MRSA的生長。6.根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)，表明通過實(shí)施例1的方法設(shè)計(jì)的針對(duì)dnaA基因的siNA(附表SEQIDN0.1-SEQIDN0.56)能夠有效地抑制MRSA的生長。實(shí)施例三針對(duì)ftsZ基因所設(shè)計(jì)的siNA的抑菌或殺菌有效性的確定1.siNA的合成根據(jù)附表1中的靶序列SEQIDNO.60,得到——對(duì)應(yīng)的正義鏈和反義鏈序列，合成如下結(jié)構(gòu)的siNA:siNA60:53無關(guān)siNA為5'GACCCGCAUUGAGCAUCAAdTdTiiimiiim11mii3'dTdTCTGGGCGTAACTCGTAGTT2.在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中接種MRSA標(biāo)準(zhǔn)林ATCC25923(購自美國ATCC;對(duì)苯唑西林的最小抑菌濃度為1.2|jg/ml);3.在2個(gè)玻璃管中，各取0.5ml菌液，加入50|jl2x肉湯；一管加入30|jl無關(guān)siNA(500|jg/ml)，一管加入30|jlsiNA60母液(500|jg/ml);4.于37度中搖床培養(yǎng)8.5小時(shí)；5.使用酶標(biāo)儀(LALJYVRAMMKIII)于630mm波長處測量2次吸光度，取平均值，結(jié)果見圖2;如圖2所示，siNA60孔OD值比對(duì)應(yīng)無關(guān)siNA孔OD值小近百倍，表明siNA60能夠極大的抑制MRSA的生長。6.根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)，表明通過實(shí)施例1的方法設(shè)計(jì)的針對(duì)ftsZ基因的siNA(附表SEQIDN0.57-NO.107)能夠有效地抑制MRSA的生長。GUUACGCCAAGGUGUACAAdTdT3IIIIIIIIIIIIIIIIIIIdTdTCAATGCGGTTCCACATGTT535實(shí)施例四針對(duì)in氾基因所設(shè)計(jì)的siNA的抑菌或殺菌有效性的確定1.siNA的合成根據(jù)附表1中的耙序列SEQIDNO.108,得到——對(duì)應(yīng)的正義鏈和反義鏈序列，合成如下結(jié)構(gòu)的siNA108:5'CCAGCUGCUCCAAAAGAAAdTdT3'IIIIIIIIIIIIIIIIIII3'dTdTGGTCGACGAGGTTTTCTTT5'無關(guān)siNA為5'GACCCGCAUUGAGCAUCAAdTdT3'iiiiimmi11i11ii3'dTdTCTGGGCGTAACTCGTAGTT5'2.在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中接種MRSA標(biāo)準(zhǔn)林ATCC25923(購自美國ATCC;對(duì)苯唑西林10的最小抑菌濃度為1.2|jg/ml);3.在2個(gè)玻璃管中，各取0.5ml菌液，加入50yl2x肉湯；一管加入30|jl無關(guān)siNA(500叩/ml)，一管加入30|jlsiNA108母液(500|jg/ml);4.于37度中搖床培養(yǎng)8.5小時(shí)；5.使用酶標(biāo)儀(LALJYVRAMMK川)于630mm波長處測量2次吸光度，取平均值，結(jié)果見圖3;如圖3所示，siNA108孔的OD值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于對(duì)應(yīng)無關(guān)siNA孑L，表明siNA108能夠極大的抑制MRSA的生長。6.根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)，表明通過實(shí)施例1的方法設(shè)計(jì)的針對(duì)in氾基因的siNA(附表SEQIDNO.108-NO.176)能夠有效地抑制MRSA的生長。實(shí)施例五針對(duì)murA基因所設(shè)計(jì)的siNA的抑菌或殺菌有效性的確定1.siNA的合成根據(jù)附表1中的乾序列SEQIDNO.177，得到--對(duì)應(yīng)的正義鏈和反義鏈序列，合成如下結(jié)構(gòu)的siNA177:5'GUCGUUGAUGCAACAAAGAdTdT3'2.3.4.5.6.3，無關(guān)siNA為:5，3，dTdTCAGCAACTACGTTGTTTCT5'GACCCGCAUUGAGCAUCAAdTdT3，dTdTCTGGGCGTAACTCGTAGTT5'在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中接種MRSA何杰昌林(由中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室分離并鑒定，保存于廣州市疾病預(yù)防控制中心；該菌林對(duì)笨唑西林的最小抑菌濃度為90pg/ml);取12[jl菌液，加入6ml2x肉湯，混勻，在96孔板兩孔中加入50pl菌液；一孔加入50|jl無關(guān)siNA(1|jg/|jl),—孔加入50|jlsiNA108母液(1|jg/|jl);混勻；于37度中搖床培養(yǎng)22小時(shí)；使用酶標(biāo)儀(LALJYVRAMMKIII)于630mm波長處測量3次吸光度，取平均值，結(jié)果見圖4;如圖4所示，siNA177孔OD值比無關(guān)siNA孔OD值小差不多十倍，表明siNA177可以極大抑制MRSA的生長。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)，表明通過實(shí)施例1的方法設(shè)計(jì)的針對(duì)murA基因的siNA(附表SEQIDNO.177-N0.234)能夠有效地抑制MRSA的生長。11實(shí)施例六針對(duì)rpoA基因所設(shè)計(jì)的siNA的抑菌或殺菌有效性的確定1.siNA的合成根據(jù)附表1中的耙序列SEQIDNO.235，得到——對(duì)應(yīng)的正義鏈和反義鏈序列，合成如下結(jié)構(gòu)的siNA235:5'CUGUUGAACGUGUGAACUAdTdT3'II111IIIIIIIIIIIIII3'dTdTGACAACTTGCACACTTGAT5'無關(guān)siNA為5'GACCCGCAUUGAGCAUCAAdTdT3'iiiiiiiiiimiiiiii3'dTdTCTGGGCGTAACTCGTAGTT5'2.在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中接種MRSA標(biāo)準(zhǔn)林ATCC25923(購自美國ATCC;對(duì)苯唑西林的最小抑菌濃度為1.2|jg/ml);3.在2個(gè)玻璃管中，各取0.5ml菌液，加入50|J|2x肉湯；一管加入30|jl無關(guān)siNA(500|jg/ml)，一管加入30plsiNA235母液(500|jg/ml);4.于37度中搖床培養(yǎng)8.5小時(shí)；5.使用酶標(biāo)儀(LALJYVRAMMK川)于630mm波長處測量2次吸光度，取平均值，結(jié)果見圖5;如圖5所示，siNA235孔的OD值比無關(guān)siNA孔OD值小近百倍，表明siNA235能夠極大的抑制MRSA的生長。6.根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)，表明通過實(shí)施例1的方法設(shè)計(jì)的針對(duì)in氾基因的siNA(附表SEQIDNO.235-NO.298)能夠有效地抑制MRSA的生長。實(shí)施例七以MRSA產(chǎn)生耐藥性的mecA基因?yàn)榘悬c(diǎn)所設(shè)計(jì)的siNA及其抑菌或殺菌有效性的確定1.siNA的合成根據(jù)附表1中的把序列SEQIDNO.302與SEQIDNO.303,得到一一對(duì)應(yīng)的正義鏈和反義鏈序列，合成如下結(jié)構(gòu)的siNA:siNA305:5，UUCAAUCUAUAGCGCAUUAdTdT3'IIIIIIIIIIIIIIIIIII3，dTdTAAGTTAGATATCGCGTAAT5'無關(guān)siNA為5'GACCCGCAUUGAGCAUCAAdTdT3'3'dTdTCTGGGCGTAACTCGTAGTT5'2.接種MRSA關(guān)沃林(由中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室分離并鑒定，保存于廣州市疾病預(yù)防控制中心；該菌林對(duì)苯唑西林的最小抑菌濃度為54|jg/ml)至3ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，加入9pl18mg/ml苯唑西林溶液；3.在2個(gè)10ml離心管中，各管分別加入1ml菌液；4.兩管分別加入75piIpg/ylsiNA305，75|jl1|jg/pl無關(guān)siNA;5.37度搖床中培養(yǎng)；6.11h后，將菌液稀釋10倍，使用酶標(biāo)儀(LALJYVRAMMKIII)于630mm波長處測量2次吸光度，取平均值，結(jié)果見圖6;如圖6所示，siNA305孔的OD值都與無關(guān)siNA孔的OD值小60倍以上，表明siNA305可以極大抑制MRSA的生長。7.根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)，表明通過實(shí)施例1的方法設(shè)計(jì)的針對(duì)mecA基因的siNA(附表SEQIDNO.299-NO.325)能夠有效地抑制MRSA的生長。實(shí)施例八以MRSA產(chǎn)生耐藥性的mecA基因?yàn)榘悬c(diǎn)所設(shè)計(jì)不同成分的siNA及其抑菌或殺菌有效性的確定1.siNA的合成根據(jù)附表1中的靶序列SEQIDNO.302得到——對(duì)應(yīng)的正義鏈和反義鏈序列，合成如下結(jié)構(gòu)的不同成分的siNA:siNA302a(dsDNA):5'TACAAGATATGAAGTGGTAdTdT3'3，dTdTATGTTCTATACTTCACCAT5'siNA302b(亂序dsDNA):5，GGTGAAGTATATAGAACATdTdT3，3，dTdTCCACTTCATATATCTTCTA5'siNA302c(dsRNA):5'UACAAGAUAUGAAGUGGUAdTdT3'IIIIIIIIIIIIIIIIIII3'dTdTAUGUUCUAUACUUCACCAU5,siNA302d(亂序dsRNA):5,GGUGAAGUAUAUAGAACAUdTdT3'3'dTdTCCACUUCAUAUAUCUUGUA13siNA302e(正義鏈為RNA,反義鏈為DNA，筒稱為RNA:DNA):5'UACAAGAUAUGAAGUGGUAdTdT3，IIIIIIIIIIIIIIIIIII3'dTdTATGTTCTATACTTCACCAT5'siNA302f(正義鏈為RNA，反義鏈為DNA，簡稱為亂序RNA:DNA):5，GGUGAAGUAUAUAGAACAUdTdT3'IIIIIIIIIIIIIIIIIII3'dTdTCCACTTCATATATCTTGTA5'siNA302g(正義鏈為DNA，反義鏈為RNA,簡稱為DNA:RNA):5，TACAAGATATGAAGTGGTAdTdT3'3'dTdTAUGUUCUAUAC而CACCAU5'siNA302h(正義鏈為DNA,反義鏈為RNA，簡稱為亂序DNA:RNA):5'GGTGAAGTATATAGAACATdTdT3'3'dTdTAUGUUCUAUACUUCACCAU5，2.在96孔板1-8號(hào)孔各加入50W相應(yīng)250|jg/mlsiNA;3.接種MRSA談延娥林(由中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室分離并鑒定，保存于廣州市疾病預(yù)防控制中心；該菌林對(duì)苯唑西林的最小抑菌濃度為72|jg/ml)至15ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，加入36p|18mg/ml苯唑西林溶液，120|jlEDTA溶液(0.5mM);4.在毎個(gè)孔中各加入50ijImrsa菌液，混勻。5.用封口膠封口，并放入保鮮袋中，37。C孵育；6.培養(yǎng)36h后，統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，結(jié)果見下表7:表7目標(biāo)dsDNA亂序dsDNA目標(biāo)dsRNA亂序dsRNA目標(biāo)RNA:DNA亂序RNA:DNA目標(biāo)DNA:RNA亂序DNA:RNA極多極多極多>500極多>5002多(>300)無115由表7可見，目標(biāo)RNA:DNA和目標(biāo)DNA:RNAsiNA分子在一定濃度時(shí)能特異性的殺滅MRSA。與對(duì)照相比，在應(yīng)用250|jg/ml目標(biāo)RNA:DNA或DNA:RNAsiNA分子時(shí)，可以取得殺滅MRSA的效果。14<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>43GGAAATTGCACMTTAGAA44GTAATATCGACGTCTTATT45CATCCAAGATATTCAAAM46CTGAAGAATTAGCAMTTA47GAAGAAAATTGMGAAGAA48GATTTCTCATTACCTAAM49GT嵐ACCTCACTTTATTA50CAAATCAAATTCAATCTAA51CMGAAGMTTTTTCTATA52CCAAGATATTCMAAMTT53CTATAATGTTAGAATTGAA54GAAAATTGAAGMGAAAAA55GAAGAATTAGCMATTATA56GAATCTTGAAAMGAMTA57GCACAAGGTGTGCTTATGA58CTGGAGTAGAAGCTATGAA59CTGCAGATGAAGACGTTM60GTTACGCCAAGGTGTACAA61CCAAGATGCTGCAGATGM62CGGTAGAAGCTGCTAAAAA63GAAAGCTGCAGTAGATACA64GGCGAGTCATTGTCATTAT65CACAAGGTGTGCTTATGM66CGCTGTTTCTGGTGAAGTA67CACCAGTCGTTGCTMAAT68CAGACGGTCMGCTTTAAA69GCACCAGTCGTTGCTMAA70CACAGACGGTCMGCTTTA71GCGGTAGAAGCTGCTAAAA72GTGCAGACATGGTATTTGT73CAGCACCAGTCGTTGCTM74CC嵐TCGGTGAAAAATTA75GAAAGACGTTCAAGAAGAA76GGTAGAAGCTGCT嵐AAA77GCAGACGTTAAGACMTTA78CAATGATGGAAGCATTTAA79GGAATCTCGTGAACMATT80GMGAAAGACGTTCAAGM81CCTAGCTTCATTAGAAATA82GAACACATACAACTAAAGA83GAAAGAACACATACAACTA84GTAAGTGAAAGAACACATA85CAAGCMCTGATAGTGTAA86GATGAATCATTCACTTCAA87CMTGCMCTTCTAMGAT88GCAATGCMCTTCTAMGAdnaAGGAAAUUGCAC細(xì)UAGMTTCTMTTGTGCAATTTCCdnaAGUAAUAUCGACGUCUUAUUAATAAGACGTCGATATTACdnaACAUCCMGAUAUUCAAMATTTTTGAATATCTTGGATGdnaACUGAAGMUUAGCAAAUUATAATTTGCTAATTCTTCAGdnaAGAAGAAAAUUGAAGMGMTTCTTCTTCAATTTTCTTCdnaAGAUUUCUCAUUACCUAMATTTTAGGTAATGAGAAATCdnaAGUAAAACCUCACUUUAUUATAATAAAGTGAGGTTTTACdnaACAAAUCAMUUCAAUCUAATTAGATTGAATTTGATTTGdnaACAAGAAGAAU腳UC腳A窗AGAAMATTCTTCTTGdnaACCAAGAUAUUCAAAAMUUAATTTTTTGAATATCTTGGdnaACUAUAAUGUUAGMUUGMTTCMTTCTAACATTATAGdnaAGAAAAUUGAAGAAGAAMATTTTTCTTCTTCMTTTTCdnaAGMGAAUUAGCMAU細(xì)ATATAATTTGCTAATTCTTCdnaAGAAUCUUGAMAAGAAAUATATTTCTTTTTCAAGATTCftsZGCACAAGGUGUGC腿UGATCATAAGCACACCTTGTGCftsZCUGGAGUAGAAGC翻GAATTCATAGCTTCTACTCCAGftsZCUGCAGAUGMGACGUUAATTAACGTCTTCATCTGCAGftsZGUUACGCCAAGGUGUACAATTGTACACCTTGGCGTAACftsZCCAAGAUGCUGCAGAUGAATTCATCTGCAGCATCTTGGftsZCGGUAGAAGCUGCUAAAMTTTTTAGCAGCTTCTACCGftsZGAAAGCUGCAGUAGAUACATGTATCTACTGCAGCTTTCftsZGGCGAGUCAUUGUCAU廳ATMTGACMTGACTCGCCftsZCACAAGGUGUGCUUAUGAATTCATAAGCACACCTTGTGftsZCGCUGUUUCUGGUGAAGUATACTTCACCAGAMCAGCGftsZCACCAGUCGUUGCUAAAAUATTTTAGCAACGACTGGTGftsZCAGACGGUCAAGC腳AMTTTAAAGCTTGACCGTCTGftsZGCACCAGUCGUUGCUMMTTTTAGCAACGACTGGTGCftsZCACAGACGGUCAAGCUUUATAAAGCTTGACCGTCTGTGftsZGCGGUAGMGCUGC磁AATTTTAGCAGCT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