專利名稱：一種細(xì)菌耐藥性診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是涉及一種熒光檢測細(xì)菌耐藥性診斷試劑盒，更具體地說是涉及一種熒光檢測β內(nèi)酰胺類抗生素治療的細(xì)菌耐藥性診斷試劑盒。
技術(shù)背景 自從人類在上世紀(jì)20年代首次發(fā)現(xiàn)以青霉素為代表的β_內(nèi)酰胺類抗生素以來，它們已經(jīng)成為治療細(xì)菌感染的一線藥物，挽救了無數(shù)人的生命。同其它類別的抗生素相比，β -內(nèi)酰胺類抗生素具有療效高，毒性低的特性。但是，細(xì)菌也在不斷的進(jìn)化各種抗藥機(jī)制。目前，抗藥性細(xì)菌感染已經(jīng)成為全球性的問題。特別是在中國，印度，已經(jīng)其他一些國家，由于存在著濫用抗生素的現(xiàn)象，出現(xiàn)超級抗藥性細(xì)菌，從而導(dǎo)致無藥可治的可能性是不容忽視的。細(xì)菌對抗β -內(nèi)酰胺類抗生素的最主要機(jī)制是通過β -內(nèi)酰胺酶實(shí)現(xiàn)的。它們可以有效的分解內(nèi)酰胺類抗生素。為抵消這些酶的作用，在臨床上可以采取了兩種方法。第一，共同使用β_內(nèi)酰胺類藥物和β_內(nèi)酰胺酶抑制劑。一些處方藥利用這一策略，包括(氨芐青霉素+舒巴克坦)和(阿莫西林+克拉維酸鉀)。第二是開發(fā)不被普通β-內(nèi)酰胺酶降解的藥物，比如許多第三和第四代的廣譜頭孢菌素。然而，抗生素的發(fā)展和抗藥性細(xì)菌的出現(xiàn)是一個矛和盾的關(guān)系。目前，許多在臨床上檢測到的細(xì)菌已經(jīng)具有了分解第三和第四代的頭孢菌素的能力。這主要是由廣譜內(nèi)酰胺酶所造成的。由于細(xì)菌耐藥性的發(fā)展與誤用/濫用抗生素是緊密相關(guān)的，為延長廣譜抗生素的有效使用期，在臨床上治療細(xì)菌感染應(yīng)該盡可能的做到對癥下藥，避免使用無必要的廣譜抗生素。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，快速，靈敏，和準(zhǔn)確診斷細(xì)菌菌株對各種內(nèi)酰胺類藥物的藥敏程度是必須的步驟。在西方發(fā)達(dá)國家，抗生素的使用受到嚴(yán)格控制。但在中國，印度，以及發(fā)展中國家，抗生素被大大濫用和誤用，其后果是抗藥性細(xì)菌的不斷出現(xiàn)。2009年在印度出現(xiàn)的新德里金屬內(nèi)酰胺酶，NDM-1，是一個典型的例子。這個蛋白質(zhì)酶可以水解目前所有的β-內(nèi)酰胺類抗生素。換句話說，含有NDM-I的細(xì)菌可以抵御任何β-內(nèi)酰胺類抗生素。同時，由于全球的交通便利，在一地得到的抗藥性細(xì)菌可以很容易的傳播到世界各地，從而造成大規(guī)模的微生物感染。為盡可能的延緩抗藥性細(xì)菌的出現(xiàn)和延長現(xiàn)有抗生素的使用壽命，防止抗生素的濫用和誤用是一個有力的手段。這要求在臨床治療細(xì)菌感染過程中，能夠盡快確定細(xì)菌對不同抗生素的抗藥和敏感程度，以防止過分使用，或者無效使用抗生素。另外，在治療敗血癥病人時，由于及早使用正確的抗生素和病人的生存率直接掛鉤，這也需要盡快確定細(xì)菌對不同抗生素的抗藥和敏感程度。β -內(nèi)酰胺類抗生素被廣泛應(yīng)用在臨床和畜牧業(yè)中用來治療細(xì)菌感染。特別是第三四代頭孢菌素是一線抗生素藥物。但是，廣譜內(nèi)酰胺酶的出現(xiàn)使得三四代頭孢菌素不再是治療細(xì)菌感染的萬能妙藥。在臨床上迫切需要一種快速的能夠確定細(xì)菌是否對三四代頭孢菌素具有抗藥性的分析方法。利用β-內(nèi)酰胺酶的熒光底物來檢測β-內(nèi)酰胺酶的存在是一個普遍的分析方法。事實(shí)上，目前許多現(xiàn)有的熒光β-內(nèi)酰胺酶的底物可以做到高靈敏度和實(shí)時的對β-內(nèi)酰胺酶進(jìn)行檢測。然而，所以這些分子都不具有選擇性，即不可能區(qū)分普通和廣譜β-內(nèi)酰胺酶。由于含有普通內(nèi)酰胺酶的細(xì)菌對第三四代廣譜頭孢菌素敏感，而含有廣譜β_內(nèi)酰胺酶的細(xì)菌對第三 代廣譜頭孢菌素具有抗藥性。我們希望能夠有一種快捷的方法來區(qū)分這兩類細(xì)菌，從而可以盡快確定臨床細(xì)菌感染是否可以用第三四代廣譜頭孢菌素來治療。目前，國內(nèi)外用來檢測細(xì)菌抗藥性的方法可以分成3大類。第一類是基于傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)技術(shù)，又可以分為液體培養(yǎng)基和固態(tài)培養(yǎng)基的方法。液體培養(yǎng)基方法可以準(zhǔn)確測定一種抗生素的最低抑菌濃度。但是，當(dāng)待測抗生素品種較多時，此方法工作量大，所以已經(jīng)逐漸被固態(tài)培養(yǎng)基方法所取代。固態(tài)培養(yǎng)基方法又可以分為若干類，主要有紙片擴(kuò)散法，E-test，等等。比如，在紙片擴(kuò)散中，不同的抗生素藥片被放置在固態(tài)培養(yǎng)基表面。當(dāng)細(xì)菌在培養(yǎng)基表面生長時，如果對某種抗生素敏感，這在此藥片周圍形成一個清晰的環(huán)狀無菌帶。其大小受細(xì)菌對抗生素的敏感程度所決定。如果細(xì)菌對此抗生素有抗藥性，這不會形成此無菌帶。這類基于微生物培養(yǎng)技術(shù)的方法目前是細(xì)菌抗藥性檢測的主流方法。但是，由于細(xì)菌生長需要時間，此類方法至少需要48-72小時。對于生長緩慢的細(xì)菌，比如結(jié)核分支桿菌，需要的時間更長，因此對于需要盡快知道細(xì)菌抗藥性的情況，例如敗血癥病人的治療，這類方法無法及時提供選擇抗生素的必要信息。第二類方法是基于聚合酶鏈反應(yīng)的基因方法。病人樣品可以用針對β -內(nèi)酰胺酶基因的特定探針進(jìn)行基因擴(kuò)增，然后來檢測得到抗藥性的基因變異。此類方法快速，靈敏。但是，由于此類方法不是功能性測定，所以只能用來檢測已知的耐藥機(jī)制，而不能確定以往未知的全新抗藥機(jī)理。第三類方法是直接測定β -內(nèi)酰胺酶的降解β -內(nèi)酰胺類抗生素的功能。目前有多種內(nèi)酰胺酶的熒光底物可以選擇。這類底物本身沒有熒光，但是，當(dāng)它們被內(nèi)酰胺酶分解后，會有熒光產(chǎn)品出現(xiàn)。通過觀測熒光強(qiáng)度變化，可以確定內(nèi)酰胺酶的存在。但是，現(xiàn)有內(nèi)酰胺酶底物無法區(qū)分普通和廣譜內(nèi)酰胺酶。所以并不能夠起到指導(dǎo)抗生素選擇的作用。概括而言，雖然目前的相關(guān)技術(shù)在它們的適用領(lǐng)域中有無可取代的位置，但在特定的應(yīng)用中，特別是在處理治療敗血癥病人的過程中，它們也有著種種局限。所以，一種可以快速區(qū)分普通和廣譜β_內(nèi)酰胺酶的檢驗(yàn)方法是迫切需要的。在國內(nèi)外尚無同類產(chǎn)品。類似產(chǎn)品有日本Kanto Chemical公司生產(chǎn)的Cica-β-test試劑。Cica-β-test試劑也可以用來檢測細(xì)菌是否對三四代頭孢菌素具有抗藥性。但是，由于Cica-β-test試劑檢測依賴于顏色變化(陽性樣品的顏色從黃色變到紅色)，靈敏度至少要比本產(chǎn)品的熒光檢測法低一個數(shù)量級，同時也不能直接用于血液檢測。另外一個類似產(chǎn)品是美國LifeTechnologies公司生產(chǎn)的GeneBLAze試劑。GeneBLAze試劑也是基于突光檢測，但是，此試劑只能用來無差別的檢測所有的β_內(nèi)酰胺酶的存在，而不能特異性的檢測能夠降解三四代頭孢菌的廣譜內(nèi)酰胺酶。此外，GeneBLAze試劑只是一個研究用產(chǎn)品，用來進(jìn)行一些真核細(xì)胞的光學(xué)顯像實(shí)驗(yàn)，而不是在臨床上用于檢測細(xì)菌抗藥性。發(fā)明內(nèi)容本實(shí)用新型所需要解決的技術(shù)問題是提供了新的廣譜內(nèi)酰胺酶耐藥性診斷試劑，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本實(shí)用新型提供如下技術(shù)方案一種細(xì)菌耐藥性診斷試劑盒，包括長方形盒體(I)及與其一側(cè)邊彎折連體的盒蓋(2),而在盒體內(nèi)放置有試劑架(3),試劑架上形成有分別放置熒光底物瓶(4)、雙蒸懼水瓶(5)、非變性細(xì)胞裂解緩沖液瓶(6)、樣品瓶(7)和空白對照瓶(8)以及相應(yīng)的5個長方體插孔(9)。優(yōu)選地，所述的熒光底物包含以下化合物(I)或其對映體、消旋體或非對映異構(gòu)體
H3CO2C^Y、
K
I0優(yōu)選地，所述的非變性細(xì)胞緩沖液包括pH值7. 5的磷酸鈉緩沖液、氯化鈉、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)。優(yōu)選地，所述的非變性細(xì)胞緩沖液包括20毫摩爾/升pH值7. 5的磷酸鈉緩沖液、150毫摩爾/升的氯化鈉、1%的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本實(shí)用新型具有如下技術(shù)特長本實(shí)用新型為醫(yī)藥等行業(yè)提供了一種新的細(xì)菌耐藥性熒光檢測試劑盒及其制備方法，從而拓展了臨床抗生素用藥新指導(dǎo)的應(yīng)用。本實(shí)用新型細(xì)菌耐藥性熒光檢測試劑盒是安全的，能夠用于醫(yī)療、診斷等工業(yè)和行業(yè)的大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用。與現(xiàn)有的細(xì)菌耐藥性診斷產(chǎn)品相比，本實(shí)用新型細(xì)菌耐藥性熒光檢測試劑盒在實(shí)際應(yīng)用等方面，具有以下顯著特點(diǎn)I)檢測具有廣譜β -內(nèi)酰胺酶的感染細(xì)菌，區(qū)別與以往僅檢測普通β -內(nèi)酰胺酶的感染細(xì)菌，臨床上用于三、四代頭孢菌素耐藥性檢驗(yàn)，提高治療成功率；不受細(xì)菌類別的限制。革氏陽性和陰性細(xì)菌均可以被檢測，如陰溝腸桿菌，肺炎克雷伯氏菌和大腸桿菌等。2)可以直接檢驗(yàn)血液中的抗藥性細(xì)菌的存在，所以可以直接用于檢測敗血癥病人的血樣。3)重感染細(xì)菌癥的早期診斷，如敗血癥感染細(xì)菌的早期檢測，便于臨床及早治療；4)重感染細(xì)菌癥的快速診斷，最大可能爭取治療時間，挽救病人生命；[0029]5)判斷重感染細(xì)菌廣譜P -內(nèi)酰胺酶的亞屬，幫助醫(yī)生制訂有效的治療方案；6)能檢測各種廣譜P -內(nèi)酰胺酶(即ESBLs)，而常規(guī)PCR僅僅能夠檢測一個基因是否存在，而不能確定基因的序列，所以常規(guī)PCR不能用于臨床診斷ESBLs ；7)目前的DNA芯片僅可以用于診斷已知的ESBLs，但 是不能診斷新出現(xiàn)的廣譜 內(nèi)酰胺酶變異，本實(shí)用新型提供的診斷試劑盒不僅能檢測目前已知的“超級細(xì)菌”如
鮑氏不動桿菌(ABA)、銅綠假單胞菌(PA)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、肺炎克雷伯菌(CRPK)、大腸埃希菌(CRE)，還可以檢測目前未知的和未來可能出現(xiàn)的新型“超級細(xì)菌”。此外，加上本實(shí)用新型提供的產(chǎn)品，市場上將出現(xiàn)兩個個等級的產(chǎn)品，I)現(xiàn)有的以(nitoocefin，頭孢硝噻吩)為代表的檢測普通P -內(nèi)酰胺抗藥性，或者 K1025 ；2)本實(shí)用新型提供的診斷試劑盒(CEP-R)用于檢測廣譜P -內(nèi)酰胺抗藥性。三種產(chǎn)品聯(lián)合使用，構(gòu)成了對臨床指導(dǎo)意義。三種產(chǎn)品檢測結(jié)果的臨床意義見下表
K1025 (或如他CEP-R 感染稃度治療方窠 K護(hù)人員市場現(xiàn)打產(chǎn)品)防護(hù)程度
患存1--輕度否裕素?zé)o
S #2+-中度 3、4代頭孢輕度
患教3++ 中..IL度碳n 婦等標(biāo)準(zhǔn)
5、6代藥核I因此，本實(shí)用新型所述方法的成功開發(fā)對于臨床抗生素用藥有著重要的意義。在臨床上，醫(yī)生會根據(jù)病人的癥狀，憑經(jīng)驗(yàn)直接跳過普通3 -內(nèi)酰胺抗藥性的檢測，因?yàn)槟鼙黄胀ㄇ嗝顾刂斡牟“Y往往很輕。再加上三、四代頭孢菌素已經(jīng)是目前市場的主流，所以這也直接導(dǎo)致現(xiàn)有的K1025藥性檢驗(yàn)臨床意義不大的原因。Cica-b-test是通過顏色變化來檢測廣譜內(nèi)酰胺酶(從黃色到紅色)，不但靈敏度低，而且不和血液檢測兼容。CEP-R，使得合理指導(dǎo)抗生素用藥變得切實(shí)可行。所以，我們的發(fā)明在合理指導(dǎo)抗生素用藥上具有里程碑的作用。總之，本實(shí)用新型積極適應(yīng)了現(xiàn)代生物、預(yù)防保健、臨床診斷等領(lǐng)域的工作需要和人性化服務(wù)的需要，本實(shí)用新型為研究開發(fā)該細(xì)菌耐藥性熒光檢測試劑盒，對改進(jìn)和提高現(xiàn)有的該細(xì)菌耐藥性熒光檢測試劑盒具有重要價值。

圖I為本實(shí)用新型提供的細(xì)菌耐藥性診斷試劑盒的示意圖。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本實(shí)用新型。應(yīng)理解，下述實(shí)施例僅用于說明本實(shí)用新型而不用于限制本實(shí)用新型的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。比例和百分比基于重量，除非特別說明。本實(shí)用新型研究了現(xiàn)有的熒光檢測技術(shù)，提供了一種新的細(xì)菌耐藥性熒光檢測試劑盒，便于現(xiàn)代生物、預(yù)防保健、臨床診斷等領(lǐng)域的安全使用。本實(shí)用新型最終需要制備成細(xì)菌耐藥性熒光檢測試劑盒進(jìn)行應(yīng)用，下面將列舉實(shí)施例進(jìn)行進(jìn)一步說明。如有問題，可以與發(fā)明人直接聯(lián)系。上述提供的一些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以及下列實(shí)施例中按前述發(fā)明內(nèi)容給出幾種細(xì)菌耐藥性熒光檢測試劑盒及其使用方法及一些試驗(yàn)研究內(nèi)容，但應(yīng)該理解本實(shí)用新型并不僅限于此處所列出的研究內(nèi)容，還應(yīng)該理解此處所使用的術(shù)語僅用于描述特定的實(shí)施例，而并不是對本實(shí)用新型的限定。也就是說，在本實(shí)用新型中，以上所述的具體實(shí)施方式
和以下所述的實(shí)施例均是為了更好地闡述本實(shí)用新型，特別是這些實(shí)施例僅僅是對本實(shí)用新型的示例性描述，不能解釋為了對本申請的限制或者用來限制本實(shí)用新型的保護(hù)范圍。為了更清楚地說明本實(shí)用新型，下面結(jié)合如下實(shí)施例對本實(shí)用新型作詳細(xì)描述。實(shí)施例I、熒光底物C-I的制備合成路線
權(quán)利要求1.一種細(xì)菌耐藥性診斷試劑盒，其特征在于，它包括長方形盒體(I)及與其一側(cè)邊彎折連體的盒蓋(2)，而在盒體內(nèi)放置有試劑架(3)，試劑架上形成有分別放置熒光底物瓶(4)、雙蒸餾水瓶(5)、非變性細(xì)胞裂解緩沖液瓶(6)、樣品瓶(7)和空白對照瓶(8)以及相應(yīng)的5個長方體插孔(9)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的細(xì)菌耐藥性診斷試劑盒，其特征在于所述的熒光底物包含以下化合物(I)或其對映體、消旋體或非對映異構(gòu)體
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的細(xì)菌耐藥性診斷試劑盒，其特征在于所述的非變性細(xì)胞緩沖液包括20毫摩爾/升pH值7. 5的磷酸鈉緩沖液、150毫摩爾/升的氯化鈉、1%的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)。
專利摘要本實(shí)用新型提供了一種細(xì)菌耐藥性診斷試劑盒，其特征在于，它包括長方形盒體(1)及與其一側(cè)邊彎折連體的盒蓋(2)，而在盒體內(nèi)放置有試劑架(3)，試劑架上形成有分別放置熒光底物瓶(4)、雙蒸餾水瓶(5)、非變性細(xì)胞裂解緩沖液瓶(6)、樣品瓶(7)和空白對照瓶(8)以及相應(yīng)的5個長方體插孔(9)。本實(shí)用新型提供細(xì)菌耐藥性診斷試劑盒可以檢測出市售產(chǎn)品所不能檢測的頭孢3、4代耐藥菌，且可達(dá)到105～108個耐藥菌的檢測值，填補(bǔ)了市場空白，為臨床中抗生素的使用提供了更有效的監(jiān)測方法和使用向?qū)В哂袠O大的實(shí)用價值。
文檔編號G01N21/64GK202794036SQ201220309170
公開日2013年3月13日 申請日期2012年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月28日
發(fā)明者王郁生 申請人:上海百可生物科技有限公司