專利名稱：一種基于功能基因多態(tài)性的分子標(biāo)記方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因組學(xué)、分子生物學(xué)和生物信息學(xué)領(lǐng)域，具體說是涉及一種基于PCR的功能基因擴增多態(tài)性(Function Gene Amplified Polymorphism, FGAP)標(biāo)記方法。用于gDNA單基因多態(tài)性、同源性基因家族多態(tài)性和mRNA 表達(dá)多態(tài)性分析。
技術(shù)背景分子標(biāo)記是生物DNA水平上遺傳變異的直接反映，具有數(shù)量豐富、信息 量大、檢測不受季節(jié)、環(huán)境和個體發(fā)育階段的影響等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于遺傳 作圖、基因定位、基因克隆、動植物育種、、遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系鑒定、 遺傳病鑒定、法醫(yī)學(xué)鑒定等許多領(lǐng)域。目前分子標(biāo)記技術(shù)主要有DNA限制性片段長度多態(tài)性(restrictiori fragment length polymorphism^RFLP)、 隨機擴增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphic DNA ，RAPD)、擴增片段長度多態(tài)性(Amplified Fragment Length Polymorphism ,AFLP)、簡單重復(fù)序歹ij(simple sequence repeat^ SSR)、特殊序列擴增(sequence characterized amplified regions,SCAR)和單 核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNP)、表達(dá)序歹U標(biāo)簽 (e鄰ressed sequence tags,EST)等。由于PCR技術(shù)的優(yōu)點，基于PCR的標(biāo)記體 系類型多樣，應(yīng)用廣泛，但各自的復(fù)雜性、可靠性與遺傳信息不同。RFLP基本原理是將基因組DNA用已知的限制性內(nèi)切酶消化，電泳經(jīng) Southern印跡后，用放射性同位素或非放射性物質(zhì)標(biāo)記探針，與轉(zhuǎn)移于支 持膜上的DNA雜交，經(jīng)放射自顯影顯示出基因組DNA中與探針同源的DNA 序列片段的大小。RFLP標(biāo)記呈共顯性，標(biāo)記準(zhǔn)確，不影響表型，數(shù)目也較 多，但其分析程序復(fù)雜，有放射性污染，技術(shù)難度大，費時，成本較高，需要的DNA量較大等。RAPD是用短的(通常為10bp)隨機序列DNA作為引物， 對目的基因組DNA進行PCR擴增而產(chǎn)生多態(tài)性。RAPD程序簡單、快速，所 需DNA量少，能分析大量樣品，且無需知道目的DNA片段序列信息。但是 RAPD受反應(yīng)條件影響較大，因而其檢測的重復(fù)性較差。(羅林廣等,分子標(biāo) 記及其在作物遺傳育種中的應(yīng)用.江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，1997， 9(1) :45-54)。 AFLP 標(biāo)記是RFLP與RAPD相結(jié)合的產(chǎn)物，該法先設(shè)計針對某種限制性內(nèi)切酶的 通用接頭以及可與接頭序列和限制性酶切位點的序列配對的專用引物，用上 述內(nèi)切酶消化基因組DNA，將通用接頭與限制性片段兩端連接，再用專用引 物擴增，最后電泳顯示結(jié)果。AFLP具有標(biāo)記多態(tài)性強、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性 好以及可用于沒有任何分子生物學(xué)研究基礎(chǔ)的物種等優(yōu)點，但AFLP成本較 髙、對技術(shù)要求苛刻等。(相寧，洪焰.擴增片段長度多態(tài)性技術(shù)及其在植物 研究中的應(yīng)用.植物生理學(xué)通訊,2000， 36(3) :236-240;周曉梅，沈晉良.擴 增片段長度多態(tài)性的研究進展.棉花學(xué)報,2003, 15 (3): 185-190)。 SSR是根 據(jù)微衛(wèi)星DNA兩端的單拷貝序列設(shè)計一對特異引物，利用PCR技術(shù)，擴增每 個位點的微衛(wèi)星DNA序列，通過電泳分析核心序列的長度多態(tài)性。但要獲得 SSR引物需要進行大量克隆、測序和雜交驗證工作。(王長有,吉萬全，薛秀 莊.分子標(biāo)記技術(shù)在小麥遺傳育種中的應(yīng)用現(xiàn)狀.麥類作物學(xué) 報,2000, 20(4) :75-80)。 SCAR標(biāo)記十分穩(wěn)定,在應(yīng)用上具有迅速、簡便、低 成本的特點，非常適合于樣品的大量分析。SCAR標(biāo)記一般是由RFLP、 RAPD、 AFLP等標(biāo)記轉(zhuǎn)換而來。如王斌等"紫菜序列鑒定擴增區(qū)標(biāo)記的建立方法"(發(fā) 明申請?zhí)?00310105267):楊劍波等"鑒別水稻苯達(dá)松敏感致死基因的分 子標(biāo)記方法"(發(fā)明申請?zhí)?2138080)。但通常情況下,SCAR標(biāo)記轉(zhuǎn)換的成 功率是很低的，這也是目前發(fā)展SCAR標(biāo)記的一個主要困難。SNP是指在基因 水平上由于單個核苷酸位置上存在轉(zhuǎn)換、顛換、插入、缺失等變異而引起的 DNA序列多態(tài)性，與RFLP及微衛(wèi)星等DNA標(biāo)記不同，不再以長度的差異作 為檢測手段，而是直接對序列的變異作為標(biāo)記。但大多數(shù)普通類型的SNP 信息量不大，且大規(guī)模地篩選SNP，費用極其昂貴等。EST標(biāo)記是根據(jù)EST本身的差異而建立的分子標(biāo)記。根據(jù)開發(fā)的方法不 同，EST標(biāo)記可分為4類(1) EST-PCR和EST-SSR(微衛(wèi)星)。這一類以PCR技術(shù)為核心，操作簡便、經(jīng)濟，是目前研究和應(yīng)用最多的一類；(2)EST-SNP (單核苷酸多態(tài)性)。它是以特定EST區(qū)段內(nèi)單個核苷酸差異為基礎(chǔ)的標(biāo)記， 可依托雜交、PCR等較多種手段進行檢測；(3) EST-AFLP。它是以限制性內(nèi) 切酶技術(shù)和PCR相結(jié)合為基礎(chǔ)的標(biāo)記；(4) EST-RFLP。它是以限制性內(nèi)切酶 和分子雜交為依托，以EST本身作為探針，與經(jīng)過不同限制性內(nèi)切酶消化 后的基因組DNA雜交而產(chǎn)生的。但EST分子標(biāo)記存在著一些問題，如基于 PCR的EST分子標(biāo)記是以長度多態(tài)性為基礎(chǔ)的，其分辨取決于高分辨率的凝 膠，然而由于高頻率非長度變異的等位基因的存在，這些信息檢測存在一 定難度；EST的保守性在一定程度上也限制了 EST標(biāo)記的多態(tài)性等。最近發(fā)展的新型分子標(biāo)記相關(guān)序列擴增多態(tài)性(sequence-related amplified polymorphism^ SRAP)和耙位區(qū)域擴增多態(tài)性(tai^et region amplified polymorphism, TRAP)是一種新型的基于PCR標(biāo)記。引物設(shè)計是 SRAP與TRAP分析的關(guān)鍵，SRAP-PCR反應(yīng)體系中使用兩個引物正向引物含 有一段14堿基的核心序列:5'端前10個堿基為"填充"序列，無任何特異 組成，接著為CCGG序列；隨后為3'端的3個選擇性堿基，選擇性堿基的變化與相同核心序列組合成一套正向引物。反向引物的組成與正向引物類 似，但"填充"序列后連接的為MTT; AATT序列后為3個選擇性可變堿基， 位于引物3'端。SRAP標(biāo)記測序顯示多數(shù)標(biāo)記為外顯子區(qū)域，其多態(tài)性產(chǎn)生 于兩個方面小片段插入與缺失導(dǎo)致片段大小改變而產(chǎn)生共顯性標(biāo)記；核苷 酸改變影響引物的結(jié)合位點，導(dǎo)致顯性標(biāo)記產(chǎn)生。與SRAP、 RAPD和AFLP 等標(biāo)記技術(shù)無須任何序列信息即可直接PCR擴增不同，TRAP技術(shù)是基于已 知的cDNA或EST序列信息。使用長度為16-20核苷的固定引物與任意引物， 固定引物以公用數(shù)據(jù)庫中的靶EST序列設(shè)計而來，但固定引物是否為特異性 未能檢測；任意引物與SRAP所用的一樣，為一段以富含AT或GC為核心、 可與內(nèi)含子或外顯子區(qū)配對的隨機序列，因而未能針對某類基因序列的特點 設(shè)計引物，固定引物與任意引物不易配合和協(xié)調(diào)。SRAP和TRAP的PCR條件 采用復(fù)性變溫法，前5個循環(huán)復(fù)性溫度為35t:,第5至第30-35個循環(huán)為 50'C;擴增產(chǎn)物可在聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠上電泳。但假若一對固定引物 在退火溫度為5CTC時出現(xiàn)多個條帶或無條帶，則該固定引物與任意引物組合擴增的多態(tài)性很難與其cDNA或EST信息相聯(lián)系，也即固定引物可能起不 到固定作用。吳為人等也開發(fā)了一種基于內(nèi)含子長度多態(tài)性的擴增共有序列 的通用型分子標(biāo)記方法(發(fā)明申請?zhí)?00510060852)。以上基于PCR的各類分子標(biāo)記方法，主要是區(qū)別于采用的引物特點及退 火溫度。目前對功能基因的研究成為熱點之一，功能基因序列由于插入與缺 失導(dǎo)致片段大小改變和核苷酸改變影響引物的結(jié)合位點等產(chǎn)生多態(tài)性，基于 PCR的功能基因多態(tài)性分子標(biāo)記技來將對功能基因的深入研究有著廣闊的 應(yīng)用前景。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明針對現(xiàn)有分子標(biāo)記技術(shù)尤其是TRAP和SNP標(biāo)記技術(shù)的不足之處， 利用已知物種的公用數(shù)據(jù)庫中的gDNA、 cDNA或EST序列信息，設(shè)計不同基 因的特異引物和高頻序列引物并配合其相應(yīng)的退火溫度，作為基于PCR的功 能基因擴增多態(tài)性(FGAP)標(biāo)記方法。本發(fā)明方法通過下述步驟進行1、 根據(jù)公用數(shù)據(jù)庫目的基因的cDNA或EST序列設(shè)計多對候選特異引物， 經(jīng)電子PCR后，選擇只有一個PCR產(chǎn)物、擴增片段位于基因易變的中心區(qū)域 及引物長度最短的一對特異引物，進一步實際PCR驗證其特異性并確定所需 退火溫度。'2、 根據(jù)公用數(shù)據(jù)庫目的基因的gDNA序列，分別按2個、3個和4個不 同堿基可能的排列組合，査找在目的基因gDNA序列中出現(xiàn)頻率高的序列為 高頻序列引物的3、端選擇性堿基，然后在5、端填充不同堿基以合符一般引 物設(shè)計要求。3、 根據(jù)目的基因序列同源性分析，在公用數(shù)據(jù)庫已知的同源性基因家 族各序列中，分別按2個、3個和4個不同堿基可能的排列組合，查找共同 出現(xiàn)頻率高的序列為高頻序列引物的3、端選擇性堿基，然后在5、端填充不同堿基以合符一般引物設(shè)計要求。4、 以上游特異引物與不同的下游高頻序列引物組合、下游特異引物與 不同的上游高頻序列引物組合；以前4-8個循環(huán)采用低退火溫度、循環(huán)次數(shù) 在第4-8到第34-42次采用高退火溫度,進行PCR、凝膠電泳后篩選基因多態(tài)性引物組合。5、進一步地，從生體提取RNA后，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA， 以目的基因下游特異引物與上游高頻序列引物組合以前4-8個循環(huán)采用低 退火溫度、循環(huán)次數(shù)在第4-8到第34-42次采用高退火溫度，進行PCR、凝 膠電泳后檢測基因表達(dá)多態(tài)性。 《所述特異引物是指在gDNA中僅能擴增出一條帶的一對引物，引物長度 為能擴增出特異帶所需的最少堿基數(shù)，且某一基因上游特異引物能與下游不 同高頻序列引物組合、下游特異引物能與上游不同高頻序列引物組合，形成 該基因以特異帶區(qū)段為中心向一側(cè)或兩側(cè)延伸至PCR所能擴增范圍的檢測方 法。所述高頻序列引物是指某一基因和/或同源性基因家族中，利用公用數(shù) 據(jù)庫中的cDNA或EST序列信息作同源性分析，根據(jù)gDNA序列片段(包括外 顯子的編碼區(qū)、非編碼區(qū)；內(nèi)含子及在特異引物上、下游PCR可能擴增的范 圍)內(nèi)查找具有2-4個堿基排序出現(xiàn)頻率高、分布較均勻的或具有SNP位點 的堿基序列作為高頻序列引物3、端的選擇性堿基。設(shè)計高頻序列引物為3' 端的2-4個選擇性堿基，5'端的填充堿基可以是隨機序列或限制性內(nèi)切酶位 點序列，但要配合特異引物的退火溫度要求，并要符合引物不形成發(fā)夾結(jié)構(gòu) 及其他二級結(jié)構(gòu)、CG含量為4W-60%等引物設(shè)計原則，在此前題下，對高頻 序列引物長度的要求盡可能短，以降低PCR時低退火溫度的錯配機率。同時， 高頻序列引物設(shè)計為正向引物和反向引物，以不同的正向髙頻序列引物與反 向特異引物組合、不同的反向高頻序列引物與正向特異引物組合，形成以基 因特異序列區(qū)段為中心、對特異序列區(qū)段正反交叉檢測并可在該區(qū)段兩側(cè)延 伸的適當(dāng)范圍內(nèi)檢測。所述退火溫度的確定，F(xiàn)GAP采用退火溫度前4-8個循環(huán)采用低退火 溫度33-39C:。 PCR反應(yīng)中可被擴增的DNA片段數(shù)由"選擇性"堿基的數(shù)目來調(diào)節(jié)，數(shù)目越少，可擴增的片段多，反之則少；"選擇性"堿基的數(shù)目 則由退火溫度的高低所調(diào)節(jié)，退火溫度高，"選擇性"堿基的數(shù)目增多，反 之則少。循環(huán)次數(shù)和退火溫度可根據(jù)高頻序列引物的選擇性堿基數(shù)及降低錯 配條帶率，以利于結(jié)果的重復(fù)性和穩(wěn)定性而定；循環(huán)次數(shù)在第4-8到第34-42次采用高退火溫度，其退火溫度高低根據(jù)該對特異引物能擴增特異帶所需的 最低溫度。所述基于功能基因多態(tài)性的分子標(biāo)記方法，應(yīng)用于對單基因多態(tài)性分子檢測，對同源性基因家族多態(tài)性分子檢測或?qū)RNA表達(dá)多態(tài)性的分子檢測。所述對單基因多態(tài)性分子檢測，包括基因編碼序列、非編碼序列、內(nèi)含 子序列及基因兩側(cè)PCR所能擴增范圍的序列長度多態(tài)性和選擇性堿基結(jié)合 位點的檢測。所述對同源性基因家族多態(tài)性分子檢測，包括利用已知物種同源性基因 家族的序列，設(shè)計通用高頻序列(選擇性堿基序列)引物，對已知物種或未 知物種同源性基因家族多態(tài)性檢測。所述對mRNA表達(dá)多態(tài)性的分子檢測，主要是提取RNA并經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn) 錄為cDNA后，使用基因下游特異引物與上游高頻序列引物組合對cDNA擴增 多態(tài)性檢測。通過本發(fā)聽的FGAP標(biāo)記方法，可實現(xiàn)gDNA單基因多態(tài)性、同源性基因 家族多態(tài)性和mRNA表達(dá)多態(tài)性分析，易于與生物形態(tài)性狀、生理生化特征或某個特定的環(huán)境適應(yīng)型相聯(lián)系。gDNA的單基因多態(tài)性檢測。根據(jù)該基因的cDNA或EST序列設(shè)計一對特 異引物，經(jīng)PCR可擴增一條特異帶；根據(jù)該基因的gDNA序列査找出髙頻的 2-4個堿基序列為引物選擇性堿基設(shè)計高頻序列引物，與特異引物組合檢測 基因多態(tài)性，可作個體間基因差異分析。gDNA的同源性基因家族多態(tài)性檢測。同源性高的基因家族，可根據(jù)共有 保守序列設(shè)計一對特異引物；同源性較低的基因家族，可根據(jù)各個基因保守 序列設(shè)計特異引物。要求是每對特異引物僅能擴增出一條特異帶。確保特異 引物在同 一功能基因序列內(nèi)。高頻序列弓I物的選擇性堿基序列在已知的同源 性基因家族中查找，因而高頻序列引物在該同源性基因家族中具有通用性， 也可對未知的物種同源性基因家族多態(tài)性檢測，。mRNA表達(dá)多態(tài)性檢測。 一般的RT-PCR是利用逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄(RT) 成cDNA，然后以cDNA為模板,使用一對特異引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 擴增目的片段。而提取的RNA易降解，因而RT-PCR難度較大。利用該cDNA的下游特異引物與上游高頻序列引物PCR擴增，在一定程度上克服RNA降解 的影響，并能檢測功能基因是否表達(dá)以及RNA降解的情況；若RM不降解， 則可檢測轉(zhuǎn)錄后的mRNA多態(tài)性。


圖1是本發(fā)明的水稻單基因擴增多態(tài)性實例圖，泳道1-12分別為水稻 品種R6，湛A， N仏博A; R6雜交種R31f， R02f; R6單株R6-731, R6-6B3, R6-7A12, R6-331;陰性對照；R6。圖2是本發(fā)明的不同物種基因家族多態(tài)性實例圖,泳道1-6分別為水稻， 辣椒，柑橙，大豆，蓖麻，富貴竹。
具體實施例方式實施例一、水稻細(xì)胞色素P450單基因多態(tài)性分子標(biāo)記。經(jīng)誘抗劑惡霉靈對水稻122個品種的誘導(dǎo)后，只有品種R6的誘導(dǎo)效果 好，能在l%NaCl的鹽脅迫下完成生育期。惡霉靈需在植物體內(nèi)經(jīng)細(xì)胞色素 P450酶代謝后才具有誘導(dǎo)作用，因而需要對細(xì)胞色素P450基因多態(tài)性分析。1、 根據(jù)基因(GenBank accession no: NM—190973)序列，設(shè)計并篩選出一對特異引物上游MGMGCCTCGCACCCAT 下游CCGCTGCCATAGCCACTG用退火溫度50'C擴增到只有一個309BP長度片段的PCR產(chǎn)物。2、 根據(jù)基因(GenBank accession no: NM—190973)序列和基因組(GenBank accession no: AP008207)同源序列1536BP中，4個堿基排列組合有CGGC、 CATG、 CCGG、 GGAG的序列頻率高，設(shè)計高頻序列引物。3、 用特異引物分別與高頻序列引物組合，前6個循環(huán)采用低退火溫度 35'C、后35個循環(huán)采用髙退火溫度5(TC，進行PCR、凝膠電泳后，結(jié)果得 到由上游特異引物AAGMGCCTCGCACCCAT與髙頻序列引物CATGGTGAGGCTCA 的PCR塞因擴增多態(tài)性如圖l。實施例二、水稻細(xì)胞色素P450基因家族多態(tài)性分子標(biāo)記。 1、根據(jù)同源性分析，細(xì)胞色素P450基因都具有高度保守的結(jié)構(gòu) FX XGXRXCXG氣基酸序歹ij。對accession no: XM_190966、 XM—477684、XM—475110、 XM—190973、 XM—195080、 XM_194828、 XM—482839、 AK 103088 等8個基囟序列分別査找2-4個堿基所有排列組合的序列出現(xiàn)的頻率，選取 4個堿基的部分序列列于表1。選擇平均數(shù)多、各基因間差異小、在基因序 列中分布較均勻的序列CGGC、 CATG、 GGCG、 CCGG、 CTTC、 GGCC分別設(shè)計 高頻序列引物，作為細(xì)胞色素P450基因家族通用高頻序列引物。表i s對基因序列中4個gyi排列組合的 部分序列頻率情況械基排列組合 的部分序列平均數(shù)變異系數(shù)CCTC13.60.5949CGGC20.80.3276CATG14.40.3447GGAG14.50.3849GAGG15.10.3559GGCG19.90.4431GCGG14.30.4844GGTG11.30.4322GACG14.40.4414CCGG16.90.2182GGCC15.50.3253AATT6.61.0127TTAA2.51.5126CTTC12.80.2610TGAT7.60.77412、按實施例一第3步驟所述方法，對細(xì)胞色素P450基因家族各基因特 異引物與通用高頻序列引物組合進行PCR擴增，篩選出一對引物accession no: XM—477684的下游特異引物GGAGGMGTCATGGGAGGA與高頻序列引物 GATCATGTATGGCC組合，在前6個循環(huán)采用低退火溫度36、后34個循環(huán)采 用高退火溫度51'C，進行PCR、凝膠電泳后，得到水稻、辣椒、蓖麻、大豆、 柑橙和富貴竹等不同物種間基因擴增多態(tài)性條帶，驗證了基因家族多態(tài)性可 在未知基因序列的物種中分析，如圖2。實施例三、mRNA表達(dá)多態(tài)性檢測。1、水稻品種R6經(jīng)誘抗劑惡霉靈處理后再用l%NaCl脅迫、僅用l%NaCl脅迫和淡水對照等三種處理，分別提取RNA，用AMV反轉(zhuǎn)錄酶與accession no: NM—190973下游特異引物反轉(zhuǎn)錄為cDNA。2、按實施例一所述步驟，用下游特異引物與上游高頻序列引物組合， 前6個循環(huán)采用低退火溫度35'C、后35個循環(huán)考用高退火溫度50'C，進行 PCR、凝膠電泳后，比較三種處理的NM—190973 i因表達(dá)及多態(tài)性。
權(quán)利要求
1. 一種基于功能基因多態(tài)性的分子標(biāo)記方法，其特征是利用已知物種的公用數(shù)據(jù)庫中的gDNA、cDNA或EST序列信息，設(shè)計不同基因的特異引物和高頻序列引物并配合其相應(yīng)的退火溫度，作為基于PCR的功能基因擴增多態(tài)性標(biāo)記方法。
2、據(jù)權(quán)利要求1所述的基于功能基因多態(tài)性的分子標(biāo)記方法，其特 征是通過下述步驟進行-(1) 根據(jù)公用數(shù)據(jù)庫目的基因的cDNA或EST序列設(shè)計多對候選特異 引物，經(jīng)電子PCR后，選擇只有一個PCR產(chǎn)物、擴增片段位于基因易變的 中心區(qū)域及引物長度最短的一對特異引物，進一步實際PCR驗證其特異性 并確定所需退火溫度；(2) 根據(jù)公用數(shù)據(jù)庫目的基因的gDNA序列，分別按2個、3個和4 個不同堿基可能的排列組合，查找在目的基因gDNA序列中出現(xiàn)頻率高的 序列為髙頻序列引物的3、端選擇性堿基，然后在5、端填充不同堿基以合 符一般引物設(shè)計要求；(3) 根據(jù)目的基因序列同源性分析，在公用數(shù)據(jù)庫已知的同源性基 因家族各序列中，分別按2個、3個和4個不同堿基可能的排列組合，査 找共同出現(xiàn)頻率高的序列為高頻序列引物的3、端選擇性堿基，然后在5' 端填充不同堿基以合符一般引物設(shè)計要求；(4) 以上游特異引物與不同的下游高頻序列引物組合、下游特異引 物與不同的上游高頻序列引物組合；以前4-8個循環(huán)采用低退火Mjg，循 環(huán)次數(shù)在第4-8到第34-42次采用特異性擴增所需的高退火溫度，進行 PCR、凝膠電泳后篩選基因多態(tài)性引物組合；(5) 進一步地，從生物體提取RNA后，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，以目的基因下游特異引物與上游高頻序列引物組合；以前4-8個循 環(huán)采用低退火溫度,循環(huán)次數(shù)在第4-8到第34-42次采用高退火溫度，進 行PCR、凝膠電泳后檢測基因表達(dá)多態(tài)性。
3、據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于功能基因多態(tài)性的分子標(biāo)記方法， 其特征是其中所用的特異引物是指在gDNA中僅能擴增出一條帶的一對引物，引物長度為能擴增出特異帶所需的最少堿基數(shù)，且某一基因上游特 異引物能與下游不同高頻序列引物組合、下游特異引物能與上游不同高頻序列引物組合，形成該基因以特異帶區(qū)段為中心向一側(cè)或兩側(cè)延伸至PCR 所能擴增范圍的檢測方法。
4、 據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于功能基因多態(tài)性的分子標(biāo)記方法，其 特征是其中所用的高頻序列引物是指某一基因和/或同源性基因家族中， 根據(jù)gDNA序列片段,包括外顯子的編碼區(qū)、非編碼區(qū)；內(nèi)含子及在特異引 物上、下游PCR可能擴增的范圍,査找2-4個不同堿基種類的各種排列組 合中出現(xiàn)高頻率的序列，或是單核苷酸多態(tài)性位點的序列，作為引物3、 端選擇性堿基，引物5'端填充適當(dāng)堿基以滿足與特異引物配對及退火溫度 要求，同一高頻序列引物可設(shè)計為上、下游引物，將基因中高頻率出現(xiàn)的 2-4個堿基短序列作為選擇性堿基，以增加長度多態(tài)性條帶和引物結(jié)合位 點的檢測。
5、 據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于功能基因多態(tài)性的分子標(biāo)記方法， 其特征是其中PCR所用的相應(yīng)退火溫度是指兩種退火溫度PCR中循環(huán) 次數(shù)在第1到第4-8次時采用33-39'C的低退火溫度，循環(huán)次數(shù)多少和退 火溫度高低根據(jù)髙頻序列引物中選擇性堿基數(shù)而定，循環(huán)次數(shù)在第4-8到 第34-42次采用高退火溫度，其退火溫度高低根據(jù)該對特異引物能擴增特 異帶所需的最低退火溫度。
6、 據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于功能基因多態(tài)性的分子標(biāo)記方法， 其特征是該方法應(yīng)用于對單基因多態(tài)性分子檢測，對同源性基因家族多 態(tài)性分子檢測或?qū)RNA表達(dá)多態(tài)性的分子檢測。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述基于功能基因多態(tài)性的分子標(biāo)記方法，其特 征是其中，對單基因多態(tài)性分子檢測，包括基因編碼序列、非編碼序列、 內(nèi)含子序列及基因兩側(cè)PCR所能擴增范圍的序列長度多態(tài)性和選擇性堿基 結(jié)合位點的檢測。
8、 根據(jù)權(quán)利要求6所述基于功能基因多態(tài)性的分子標(biāo)記方法，其特 征是其中，對同源性基因家族多態(tài)性分子檢測，包括利用已知物種同源 性基因家族的序列，設(shè)計通用高頻序列引物，對已知物種或未知物種同源 性基因家族多態(tài)性檢測。9、根據(jù)權(quán)利要求6所述基于功能基因多態(tài)性的分子標(biāo)記方法，其特 征是其中，對mRNA表達(dá)多態(tài)性的分子檢測，主要是提取RNA并經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄為cDNA后，使用基因下游特異引物與上游高頻序列引物組合對 cDNA擴增多態(tài)性檢測。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于功能基因多態(tài)性的分子標(biāo)記方法。其中包括利用已知物種的公用數(shù)據(jù)庫中的gDNA、cDNA或EST序列信息，設(shè)計不同基因的特異引物和高頻序列引物并配合其相應(yīng)的退火溫度進行PCR擴增，可實現(xiàn)gDNA單基因多態(tài)性、同源性基因家族多態(tài)性和mRNA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA多態(tài)性分析，易于與生物形態(tài)性狀、生理生化特征或某個特定的環(huán)境適應(yīng)型相聯(lián)系。
文檔編號C12Q1/68GK101235417SQ200710026739
公開日2008年8月6日 申請日期2007年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月30日
發(fā)明者方良俊 申請人:廣東海洋大學(xué)