專利名稱：一種冷凍保存神經(jīng)干細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)與組織工程領(lǐng)域，涉及一種冷凍保存細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
組織工程技術(shù)是將體外培養(yǎng)擴(kuò)增的正常組織細(xì)胞接種于一種具有優(yōu)良細(xì)胞相容性，并可被機(jī)體降解吸收的生物材料中形成復(fù)合物，然后將細(xì)胞與生物材料復(fù)合物植入人體組織、器官的病損部位，在逐漸被機(jī)體降解吸收的同時(shí)，細(xì)胞不斷增殖、分化，形成新的、且形態(tài)和功能與相應(yīng)組織、器官一致的組織，從而達(dá)到修復(fù)創(chuàng)傷和重建功能的目的。
膠原蛋白因其具有無抗原性、生物相容性好的特點(diǎn)，不僅可以促進(jìn)細(xì)胞生長代謝，參與組織愈合、誘導(dǎo)組織再生，而且，植入體內(nèi)后能在體液、酶、細(xì)胞等的作用下發(fā)生降解，變成小分子物質(zhì)被肌體吸收或通過新陳代謝排出體外。因此成為組織再生工程的首選的生物材料。
隨著以膠原為主要支架材料的組織工程產(chǎn)品，在臨床上逐漸得以應(yīng)用，長期冷凍保存是一個(gè)需要解決的問題。Dixit等人將肝細(xì)胞包埋于含有膠原的三明治結(jié)構(gòu)的微膠囊中進(jìn)行冷凍保存，解凍后的細(xì)胞保持較高活率，并且保持正常的分泌功能。Wu等人用甲基化膠原和半乳糖膠原替代了天然膠原制備三明治結(jié)構(gòu)的微膠囊包裹肝細(xì)胞進(jìn)行玻璃化冷凍，進(jìn)一步證明膠原這種細(xì)胞-生物材料復(fù)合物在冷凍的過程中對細(xì)胞的形態(tài)和功能均有一定的保護(hù)作用。
低溫保存技術(shù)主要分為兩種形式一種是慢速冷凍法；另一種是快速冷卻非晶態(tài)固化，即玻璃化法。在組織細(xì)胞低溫保存的過程中，細(xì)胞外結(jié)構(gòu)損傷是低溫下細(xì)胞、組織和器官長期保存的主要障礙。如果要保持其結(jié)構(gòu)和功能的完整性，就應(yīng)該避免降溫和復(fù)溫過程中冰晶的形成，以及冷凍保護(hù)劑導(dǎo)入和導(dǎo)出過程中由于細(xì)胞膜兩側(cè)滲透壓不平衡所造成的“滲透休克”。其中避免和減輕“滲透休克”的方法是冷凍保護(hù)劑的濃度變化應(yīng)漸升或漸降，以避免較大的濃度梯度出現(xiàn)。I型膠原由300nm，三股螺旋原纖維組成，凝固成膠后形成非取向的網(wǎng)絡(luò)，其空隙的大小由膠原的濃度決定。因此，當(dāng)冷凍保護(hù)劑加入細(xì)胞-膠原復(fù)合物時(shí)，其具有復(fù)雜的孔道結(jié)構(gòu)，大大降低了冷凍保護(hù)劑的滲透速率，起到了一種“緩滲”作用，從而減輕細(xì)胞膜兩側(cè)滲透壓差驟變帶來的傷害。另外，膠原的基本化學(xué)特征是含有羥賴氨酸糖類，羥基與水分子中的氫作用，干擾了水分子冷凍結(jié)晶的排布規(guī)則，因此，可能減少冰晶形成對細(xì)胞的機(jī)械損傷，也起到保護(hù)細(xì)胞的作用。
神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells)是一類多能干細(xì)胞，能夠長期自我更新(復(fù)制)，同時(shí)具有分化形成神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的多潛能特性。它們是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)長期提供新細(xì)胞(神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞)的源泉。目前已在多種動(dòng)物模型及人體中嘗試過將神經(jīng)干細(xì)胞移植到紋狀體等腦神經(jīng)病變區(qū)及受損傷的脊髓中，并獲得一定療效，但要廣泛地應(yīng)用于臨床治療領(lǐng)域，其來源和數(shù)量仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需求。而且還存在移植細(xì)胞源于待移植患者在時(shí)間和空間上的匹配問題。因此神經(jīng)干細(xì)胞的體外大規(guī)模擴(kuò)增，以及將擴(kuò)增后的細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存，建立資源豐富的“神經(jīng)干細(xì)胞庫”，就成為一個(gè)重要的研究課題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種新的冷凍保存神經(jīng)干細(xì)胞的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下1)確定冷凍保護(hù)劑DMSO在室溫15℃下，加入到膠原-神經(jīng)球復(fù)合物中的平衡時(shí)間為15min；2)制備15％2×DMSO的冷凍培養(yǎng)液；3)離心收集“神經(jīng)球”(神經(jīng)干細(xì)胞聚球增殖生長)，計(jì)每10ul體積的神經(jīng)球數(shù)。準(zhǔn)備冷凍保存的“神經(jīng)球”的直徑不要超過100μm，否則影響冷凍效果；4)制備膠原-神經(jīng)球的混合液，膠原的終濃度為1.75mg/ml，神經(jīng)球的密度為1×104個(gè)/ml；5)將膠原-神經(jīng)球混合液轉(zhuǎn)移到2ml的凍存管中，每管250μl，在37℃，2小時(shí)膠原凝固成膠；6)將制備好的冷凍培養(yǎng)液加入到膠原-神經(jīng)球凝膠中，每管250μl，室溫平衡20分鐘。
7)將凍存管轉(zhuǎn)入控速降溫凍存盒(Nalgene，Rochester，NY)中，并將凍存盒放置于-85℃冰箱，4小時(shí)后，將凍存管轉(zhuǎn)入-196℃液氮中長期保存。
8)37℃水浴，快速復(fù)溫，吸出棄掉膠原-細(xì)胞復(fù)合物上層的冷凍保護(hù)液。加入新鮮培養(yǎng)基500μl，室溫平衡5分鐘，吸收棄掉；重復(fù)該步驟3次；9)將膠原-細(xì)胞復(fù)合物從凍存管中轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)，準(zhǔn)備進(jìn)一步的生物學(xué)特性的檢測。
本發(fā)明的效果和益處是直接將細(xì)胞包埋固定于一定濃度的膠原培養(yǎng)基中成膠，省去了制備微膠囊的復(fù)雜過程；利用膠原“屏障”的緩滲作用以及富含羥基的特性，以減輕冷凍保護(hù)劑DMSO導(dǎo)入過程中由于細(xì)胞膜兩側(cè)滲透壓不平衡所造成的“滲透休克”，同時(shí)減少冰晶的形成對細(xì)胞造成的損傷。在冷凍保護(hù)劑DMSO洗脫的過程中，可省去離心的步驟，從而避免了離心力對解凍后脆弱的細(xì)胞造成的機(jī)械傷害。復(fù)蘇后細(xì)胞-膠原復(fù)合物保持良好的完整性，細(xì)胞形態(tài)和活性好，可直接用于體內(nèi)移植。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合技術(shù)方案詳細(xì)敘述本發(fā)明的具體實(shí)施例。
實(shí)施例1神經(jīng)干細(xì)胞在膠原中的固定I型鼠尾膠原購自Upstate公司，該膠原溶于0.2％(v∶v)無菌乙酸溶液中，濃度為100mg/28.1ml，pH 3-4。首先，用0.5 N NaOH將膠原的pH調(diào)整為7.4；然后，離心收集的神經(jīng)球(用于冷凍保存的“神經(jīng)球”直徑不宜超過100μm)，顯微鏡計(jì)神經(jīng)球數(shù)，并用2X的細(xì)胞培養(yǎng)液(DMEM∶F12∶1640/1∶1∶1；N2；bFGF；EGF)重新懸浮。取神經(jīng)球懸液與膠原等體積混合，使膠原-神經(jīng)球混合液的密度為1×104個(gè)/ml。含有膠原的所有溶液均置于冰浴中，以防止膠原的凝固。將膠原-神經(jīng)球的混合液轉(zhuǎn)移到2ml的凍存管中，每管250μl(凝膠厚度約為3mm)，37℃，2小時(shí)膠原凝固成膠。
實(shí)施例2繪制冷凍保護(hù)劑DMSO導(dǎo)入過程中濃度變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線DMSO的濃度可根據(jù)測定其滲透壓值獲得。首先，配制冷凍保護(hù)劑溶液冷凍保護(hù)劑為DMSO，溶劑為神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液(DMEM∶F12∶1640/1∶1∶1；N2；bFGF；EGF)，DMSO濃度從0％到20％(v/v)，間隔為2.5％(v/v)，用滲透壓儀測量所配制的所有冷凍保護(hù)劑溶液的滲透壓，每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)重復(fù)測量3次，計(jì)算平均值以及方差，求得回歸方程，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
實(shí)施例3冷凍保護(hù)劑DMSO在神經(jīng)球-膠原凝膠中的滲透平衡時(shí)間測定在凍存管中加入250μl神經(jīng)球-膠原混合液(凝膠厚度為約3mm)，神經(jīng)球的密度為1×104個(gè)/ml；待37℃，2小時(shí)膠原凝固成膠后，將250μl的15％DMSO溶液一次性快速加入其中，同時(shí)開始計(jì)時(shí)。分別在0min，3min，5min，10min，15min，20min，40min，60min取樣10μl，室溫(15℃)下，用滲透壓儀測量其滲透壓。再根據(jù)測量結(jié)果繪制滲透壓的變化曲線。當(dāng)滲透壓變化極小，幾乎不再變化時(shí)，視為滲透平衡，滲透平衡開始點(diǎn)的時(shí)間點(diǎn)為滲透平衡時(shí)間。實(shí)驗(yàn)設(shè)立對照組，對照組為神經(jīng)球的密度為1×104個(gè)/ml的懸液(無膠原)，方案同實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示15％DMSO在1.75mg/ml的神經(jīng)球-膠原凝膠中需45min達(dá)到滲透平衡，平衡時(shí)膠原上層DMSO的濃度為6.2％；而對照組15％DMSO的滲透平衡時(shí)間為12min，平衡時(shí)DMSO的濃度為7.0％。
本實(shí)施例證明膠原體系對冷凍保護(hù)劑DMSO有明顯的緩滲作用。
實(shí)施例4冷凍過程中冷凍保護(hù)劑DMSO最佳導(dǎo)入時(shí)間的確定首先，測定15％DMSO的凝固點(diǎn)。取15％的DMSO溶液50μl，放置于低溫冷臺的坩堝中，以-1℃/min的降溫速率降溫，并觀察其變化，有明顯冰晶產(chǎn)生時(shí)的溫度即為凝固點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)測得的15％DMSO凝固點(diǎn)為-15℃。即由室溫(15℃)到DMSO凝固點(diǎn)(-15℃)，按程序進(jìn)行降溫(-1℃/min)。需要30min。根據(jù)實(shí)施例3測得的15％DMSO滲透平衡時(shí)間45min。本實(shí)驗(yàn)確定神經(jīng)球-膠原復(fù)合物在室溫(15℃)下平衡15min后，轉(zhuǎn)入凍存盒(Nalgene，Rochester，NY)中，進(jìn)入程序化降溫過程。
實(shí)施例5膠原-神經(jīng)球的冷凍取制備好的2X DMSO(20％)的冷凍培養(yǎng)液250μl，加入到等體積的膠原-神經(jīng)球凝膠中，使DMSO的終濃度為10％。室溫平衡15分鐘后，將凍存管轉(zhuǎn)入預(yù)先裝滿異丙醇的控速降溫凍存盒中，并將凍存盒放置于-85℃冰箱，使整個(gè)冷凍過程以-1℃/分鐘降溫，4小時(shí)后，將凍存管轉(zhuǎn)入液氮中保存。
實(shí)施例6復(fù)蘇后的神經(jīng)球活性的鑒定兩周后，37℃水浴，快速復(fù)溫解凍，將凝膠上層的冷凍培養(yǎng)液吸出棄掉，加入新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液，室溫平衡5分鐘，吸出棄掉；重復(fù)上一步驟3次，以達(dá)到稀釋并置換出培養(yǎng)體系中的DMSO的目的，從而減少DMSO對細(xì)胞的毒性傷害。保證在無菌操作條件下，將凍存管中的膠原-神經(jīng)球凝膠轉(zhuǎn)移到24孔板中，每孔加入500μl的新鮮培養(yǎng)基。37℃，5％CO2，培養(yǎng)24h后，取部分膠原-神經(jīng)球樣品進(jìn)行Calcium-AM/EthD-1雙染，在鏡下取不同的10個(gè)視野，通過IPP6.5軟件分析，計(jì)算細(xì)胞活率，結(jié)果顯示，采用本項(xiàng)技術(shù)冷凍保存的神經(jīng)干細(xì)胞球，解凍后活率可達(dá)到87％，說明冷凍效果良好。同時(shí)，對解凍7天后的神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，其干細(xì)胞的標(biāo)記蛋白nestin的陽性表達(dá)率為40％；經(jīng)誘導(dǎo)分化，神經(jīng)干細(xì)胞具有分化為神經(jīng)元(β-IIItubulin陽性)、星型膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP)和少突膠質(zhì)細(xì)胞(RIP)的能力。證明，采用此種方法冷凍保藏的神經(jīng)干細(xì)胞能夠保持其原有生物學(xué)特性。
權(quán)利要求
1.一種冷凍保存神經(jīng)干細(xì)胞的方法，其特征在于如下步聚1)確定冷凍保護(hù)劑DMSO在室溫15℃下，加入到膠原-神經(jīng)球復(fù)合物中的平衡時(shí)間為15min；2)制備15％2×DMSO的冷凍培養(yǎng)液；3)離心收集“神經(jīng)球”，計(jì)每10ul體積的神經(jīng)球數(shù)；4)制備膠原-神經(jīng)球的混合液，膠原的終濃度為1.75mg/ml，神經(jīng)球的密度為1×104個(gè)/ml；5)將膠原-神經(jīng)球的混合液轉(zhuǎn)移到2ml的凍存管中，每管250μl，在37℃，2小時(shí)膠原凝固成膠；6)將制備好的冷凍培養(yǎng)液加入到膠原-神經(jīng)球凝膠中，每管250μl，室溫平衡15分鐘；7)將凍存管轉(zhuǎn)入控速降溫凍存盒中，并將凍存盒放置于-85℃冰箱，確保降溫速率為-1℃/min，4小時(shí)后轉(zhuǎn)入-196℃液氮保存；8)37℃水浴，快速復(fù)溫，吸出棄掉膠原-細(xì)胞復(fù)合物上層的冷凍保護(hù)液；加入新鮮培養(yǎng)基500μl，室溫平衡5分鐘后，吸出棄掉；該步驟重復(fù)3次；9)將膠原-細(xì)胞復(fù)合物從凍存管中轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)，準(zhǔn)備進(jìn)一步的生物學(xué)特性的檢測。
全文摘要
一種冷凍保存神經(jīng)干細(xì)胞的方法，屬于細(xì)胞生物技術(shù)領(lǐng)域。其特征是直接將細(xì)胞包埋固定于一定濃度的膠原培養(yǎng)基中，凍存管中成膠；通過實(shí)驗(yàn)確定冷凍保護(hù)劑DMSO在膠原－細(xì)胞復(fù)合物中的最佳導(dǎo)入時(shí)間；將15％2×DMSO導(dǎo)入膠原－細(xì)胞復(fù)合物中，室溫平衡15分鐘；將凍存管轉(zhuǎn)入控速降溫凍存盒中，并將凍存盒放置于－85℃冰箱，確保降溫速率為－1℃/min，4小時(shí)后轉(zhuǎn)入－196℃液氮保存。本發(fā)明的效果和益處是該方法減輕了DMSO滲透過程中對細(xì)胞膜兩側(cè)造成壓差損傷。復(fù)蘇后細(xì)胞－膠原復(fù)合物保持良好的完整性，細(xì)胞形態(tài)和活性好，可直接用于體內(nèi)移植。
文檔編號C12N5/06GK101070534SQ200710011279
公開日2007年11月14日 申請日期2007年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月11日
發(fā)明者葛丹, 馬學(xué)虎, 劉天慶, 崔占峰, 高志新, 李香琴 申請人:大連理工大學(xué)