專利名稱：：腦膜炎球菌nmb1870的嵌合型、雜交和串聯(lián)多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于免疫接種，特別是免疫接種抵御奈瑟球菌(A^&w/a)屬，例如腦膜炎奈瑟球菌(yV.me"/"g/"""')(腦膜炎球菌)病原菌所致疾病的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：腦膜炎奈瑟球菌(We/Men》mem'"g/"cfo)是莢膜革蘭氏陰性細(xì)菌，其寄居在約10%人群的上呼吸道中。雖然已有抗血清群A、C、W135和Y的多糖和偶聯(lián)物疫苗，但該方法不能應(yīng)用于血清群B，因?yàn)槠淝v膜多糖是聚唾液酸的聚合物，是一種人體自身抗原?，F(xiàn)已利用外膜囊泡(OMV)中所含的表面暴露蛋白來(lái)開(kāi)發(fā)抗血清群B的疫苗。這些疫苗能引發(fā)血清殺細(xì)菌抗體應(yīng)答并提供保護(hù)以抵御疾病，但它們不能誘導(dǎo)交叉菌株保護(hù)作用[l]。因此，一些研究人員將注意力集中在疫苗所用的特定腦膜炎球菌抗原上[2]。一種這樣的抗原是"NMB1870"。該蛋白質(zhì)最初披露為菌株MC58的蛋白質(zhì)"741"[參考文獻(xiàn)3中的SEQID2535和2536;本文SEQIDl]，也稱為"GNA1870"[參考文獻(xiàn)4-6，根據(jù)參考文獻(xiàn)2]和"ORF2086"[7-9]。該脂蛋白在所有腦膜炎球菌血清群中表達(dá)，也見(jiàn)于多種腦膜炎球菌菌株中。NMB1870序列分成三個(gè)家族(在本文中稱為家族I、II和III),發(fā)現(xiàn)針對(duì)某給定家族的抗血清在同一家族中具有殺菌活性，但對(duì)于表達(dá)其它兩家族之一的菌株無(wú)此活性，即具有家族內(nèi)交叉保護(hù)作用，但不具有家族間保護(hù)作用。因此，為利用NMB1870實(shí)現(xiàn)交叉菌株保護(hù)作用，利用了多個(gè)家族的此蛋白。有人提出可將不同家族蛋白表達(dá)成雜交蛋白[10-12]，包括將兩種或三種所述家族中的此蛋白表達(dá)在一條多肽鏈中，從而無(wú)需分別表達(dá)和純化蛋白質(zhì)。檢驗(yàn)了幾種雜交體，得到令人鼓舞的抗腦膜炎球菌效力。本發(fā)明的目的之一是提供其它改進(jìn)方法來(lái)克服NMB1870所致保護(hù)作用的家族特異性，并利用這些方法來(lái)提供抵御腦膜炎球菌疾病和/或感染，特別是血清群B的免疫力。
發(fā)明內(nèi)容作為補(bǔ)充參考文獻(xiàn)13所述的工作，本發(fā)明人用一個(gè)家族的NMB1870序列取代入另一家族的相應(yīng)位置，其目的是產(chǎn)生不具有野生型多肽的家族特異性的嵌合型NMB1870。除了工程改造一種NMB1870使之具有所有三個(gè)家族的特征，本發(fā)明人還制備了包含多個(gè)家族的NMB1870序列的新雜交多肽和串聯(lián)多肽，從而補(bǔ)充了參考文獻(xiàn)10和12所述的工作。雖然各家族的NMB1870多肽能引發(fā)僅對(duì)同一NMB1870家族內(nèi)的菌株有效的抗體(例如，在小鼠中)，但本發(fā)明的嵌合型雜交和串聯(lián)多肽能引發(fā)識(shí)別多個(gè)家族的NMB1870多肽的抗體。本發(fā)明還鑒定了NMB1870的各種新的多態(tài)性形式，包括與以前報(bào)道的三種家族不同的序列(家族IV)。參考文獻(xiàn)13披露了將一個(gè)NMB1870家族的序列取代入另一NMB1870框架中，從而產(chǎn)生了嵌合型NMB1870多肽。本發(fā)明人對(duì)雜交體實(shí)施了進(jìn)一步研究，鑒定到在家族INMB1870序列中進(jìn)行取代的許多關(guān)鍵殘基。這些殘基的取代可以提高此多肽引發(fā)能與家族n多肽交叉反應(yīng)的抗體的能力。因此，本發(fā)明提供包含與SEQIDNO:57有至少70。/。相同性的氨基酸序列的多肽，其中一個(gè)或多個(gè)以下殘基被另一氨基酸取代或刪除F14;T16;Q18;Q20;D21;S22;E23;H24;S25;G26;K27;K31;Q33;R35;136;G37;139;K48;E51;G52;R54;T56;A67;G68;K70;T72;A78;A79;N83;K85;D97;D102;P105;G107;R109;S114;S116;L118;N120;Q121;A122;K135;T147;V148;N149;G150;1151;R152;H153。優(yōu)選以下殘基中至少一個(gè)倍被取代F14;T16;Q18;K31;Q33;R35;136;G37;〗39;T56;K70;T72;A78;A79;K85;D97;D102;S114;S116;L118;K135。參考文獻(xiàn)13未選擇這些殘基中的任一個(gè)進(jìn)行取代。優(yōu)選進(jìn)行取代或刪除的氨基酸是F14;T16;Q18;Q20;D21;S22;E23;H24;S25;G26;K27;K31;Q33;R35;136;G37;K48;E51;G52;R54;T72;A79;K85;P105;G107;R109;L118;N120;Q121;A122;T147;V148;N149;G150;1151;R152;H153。優(yōu)選取代這些殘基，而優(yōu)選刪除E51。優(yōu)選用家族II或III的NMB1870中相應(yīng)氨基酸來(lái)取代所述殘基。因此，優(yōu)選的取代是F14L;T16I;Q18K;Q20N;D21N;S22P;E23D;H24K;S25I;S25T;G26D;K27S;K31Q;Q33S;R35L;I36V;G37S;I39L;K48Q;G52D;R54K;T56E;A67P;G68N;K70R;T72H;A78T;A79K;N83H;N83Y;K85R;D97E;D102E;P105A;G107E;R109S;S114L;S116D;L118R;N120G;Q121S;A122E;K135R;T147I;V148G;N149E;G150K;115IV;R152H;H153E。該清單中只有殘基25和83具有一個(gè)以......匕的優(yōu)選取代殘基，因?yàn)樗衅渌鼩埢诩易錓、n和ni的兩個(gè)家族中具有相同的氨基酸。所述氨基酸序列與SEQIDNO:57有至少70o/。相同性，例如^75%、^80%、285%、，％、295%、296%、297%、三98%、299%或更高。該序列可以是更大序列的一部分。給予宿主動(dòng)物后，該多肽能誘導(dǎo)殺細(xì)菌的抗-腦膜炎球菌抗體，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該多肽能誘導(dǎo)抵御三個(gè)NMB1870家族I-m中各家族菌株的殺細(xì)菌抗體。下文給出了殺細(xì)菌應(yīng)答的其它信息。一種優(yōu)選的氨基酸序列是SEQIDNO:58，與SEQIDNO:57相比，其以下殘基被取代F14;T16;Q18;Q20;D21;S22;E23;H24;S25;G26;K27;K31;Q33;R35;136;G37;K48;G52;R54;T72;A79;N83;K85;P105;G107;R109;L118;N120;Q121;A122;T147;V148;N149;G150;1151;R152;H153。殘基E51被刪除。另一取代的序列是SEQIDNO:59。另一取代的序列是SEQIDNO:60。舒攻舗顏,已鑒定的SEQIDNO:l表面環(huán)為(1)氨基酸164-168;(2)氨基酸179-182;(3)氨基酸188-196;(4)氨基酸203-208;(5)氨基酸216-224;(6)氨基酸233-237;(7)氨基酸247-25.1;和(8)氨基酸262-263。laaqgaektygngdslntgklkndkvsrfdfirqievdgqlitlesgefqvykqshsaltafqteq，sehsgkmvakrqfrigdiagehts麵ljgegg—ratyrgtafgsddaggkltytidfaakqgngkiehiikspeiinvdlaaadikpdgkrhavisgsvlynqaekgsyslgifggkaqevagsaevktyngirh工g:laakq通過(guò)比對(duì)SEQIDNO:l與任何其它NMB1870序歹U，技術(shù)人員能鑒定出該序列中環(huán)(l)-(8)的位置。然而，為便于引用，本文將環(huán)的坐標(biāo)定義為NMB1870序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的串，在采用兩兩比對(duì)算法與SEQIDN0:1比對(duì)時(shí)，所述氨基酸串始于和以上SEQIDN0:1中所鑒定環(huán)的第一個(gè)氨基酸殘基比對(duì)的氨基酸，終于以上SEQIDN0:1中所鑒定環(huán)的最后一個(gè)氨基酸。用一個(gè)家族的環(huán)序列取代入另一家族該環(huán)位置能產(chǎn)生具有多家族抗原性的嵌合型NMB1870。因此，本發(fā)明提供含有NMB1870第一家族的氨基酸序列修飾的多肽，其中所述修飾的序列包含NMB1870第二家族的至少1個(gè)(例如，1、2、3、4、5、6或7個(gè))表面環(huán)序列替代了第一家族的表面環(huán)序列。本發(fā)明還提供包含分成九部分的骨架序列的多肽，骨架序列中具有插入的八個(gè)環(huán)(骨架序列的各連續(xù)部分之間有一個(gè))，其中至少一個(gè)所述環(huán)序列取自不同于該骨架序列的NMB1870家族的NMB1870序列。優(yōu)選利用一個(gè)以上不同NMB1870序列的表面環(huán)，可將這些環(huán)插入一條骨架序列中，因此，本發(fā)明提供含有以下氨基酸序列的多肽-B廣L廣B2-I^-B3-L3-B4-]L4-B5-L5-B6-L6-B7-L7-B8-L8-B9-其中(a)所述B,、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8和Bg各自是(i)SEQIDNO:A/的片段；或(ii)與(i)所述片段有至少m"^序列相同性禾n/或包含(i)所述片段的至少J個(gè)連續(xù)氨媒酸的片段的^站酸序列；(b)所述L"L2、I小L4、L5、L6、L7禾ULs各自是:(i)SEQIDNO:l、SEQIDNO:2和/或SEQIDNO:3的片段；或(ii)與(i)所述片段有至少"％序列相同性和/或包含(i)所述片段的至少e個(gè)連續(xù)氨基酸的片段的氨基酸序列，前提是，所述L卜L2、L3、L4、L5、L6、L7和L8中至少一個(gè)不是SEQIDNO:M的片段。本發(fā)明還提供所述多肽的片段，只要所述片段包含L,、L2、L3、L4、L5、L6、L7和/或U中的至少一個(gè)，和B,、B2、B3、B4、B5、B6、B7、Bs和B9中兩個(gè)或多個(gè)的至少一個(gè)氨基酸。因此，在一些實(shí)施方式中，最小的片段包含一個(gè)環(huán)，與該環(huán)N末端相連的一個(gè)氨基酸和與該環(huán)C末端相連的一個(gè)氨基酸。M值選自1、2或3，B,、B2、B3、B4、B5、B6、B7、Bs和B9以及L,、L2、L3、L4、L5、L6、L7和Ln的定義取決于M值而不同。"(i)SEQIDNO:M的片段"的意義如下所示:<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>例如，本發(fā)明提供包含以下氨基酸序列的多肽:-B1-JL1-B2-L2-B，，-L3-B4-L4-B5-L5-B6-L6-B7-L7-B8-L8-B9-其中B,是SEQIDNO:l的氨基酸1-163，或其氨基酸序列與所述氨基酸1-163有至少附％序列相同性和/或包含所述氨基酸1-163的至少d個(gè)連續(xù)镢基酸的片段；B2是SEQIDNO:l的氨基酸169-178，或其氨基酸序列與所述氨基酸169-178有至少my。序列相同性和/或包含所述氨基酸169-178的至少t/個(gè)連續(xù)氨基酸的片段…B9是SEQIDNO:l的氨基酸264-274，或其氨基酸序列與所述氨基酸264-274有至少所％序列相同性和/或包含所述氨基酸264-274的.至少^個(gè)連續(xù)氨基酸的片段；J^是SEQIDNO:2的氨基酸164-168，或其氨基酸序列與所述氨基酸164-168有至少"％序列相同性和/或包含所述氨基酸164-168的至少e個(gè)連續(xù)氨基酸的片段；L2是SEQIDNO:2的氨基酸179-182，或其氨基酸序列與所述氨基酸179-182有至少"％序列相同性和/或包含所述氨基酸179-182的至少e個(gè)連續(xù)氨基酸的片段.,丄7是SEQIDNO:2的氨基酸269-270;或其氨基酸序列與所述氨基酸269-270有至少"％序列相同性和/或包含所述氨基酸269-270的至少e個(gè)連續(xù)氨基酸的片段；等等。m值選自50、60、70、75、80、85、90、92、94、95、96、97、98、99、99.5、99.9或更高。"值選自50、60、70、75、80、85、卯、92、94、95、96、97、98、99、99.5、99.9或更高。d值選自6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、40、45、50、60、70、75、100或更高。e值選自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。e值優(yōu)選小于20。本發(fā)明還提供了包含如上所述的以下嵌合型氨基酸序列的多肽在所述嵌合型序列的N-末端或C-末端還包含NMB1870序列，其中所述NMB1870序列與SEQIDNO:M的NMB1870序列家族相同。因此，所述多肽包含(i)某特定家族的NMB1870和(ii)同一家族但含不同NMB1870家族的其至少一個(gè)表面環(huán)取代的NMB1870。本發(fā)明提供了包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與SEQIDNO"的總序列相同性為《。/。，其中《值至少為r;在SEQIDNO:g的骨架區(qū)，所述氨基酸序列與SEQIDNO:g的序列相同性大于《％;在SEQIDNO:g的環(huán)區(qū)域，所述氨基酸序列與SEQIDNO:g的序列相同性小于^/。。r值選自80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99和99.5。2值是1、2或3，環(huán)區(qū)域和骨架區(qū)域的邊界從上表相應(yīng)地選擇(LrL8是環(huán)，B,-B9是骨架)。如果2是1，環(huán)區(qū)域中的氨基酸序列可與SEQIDNO:2或SEQIDNO:3的相應(yīng)環(huán)區(qū)域具有大于《％的序列相同性。如果g是2，環(huán)區(qū)域中的氨基酸序列可與SEQIDNO:l或SEQIDNO:3的相應(yīng)環(huán)區(qū)域具有大于《％的序列相同性。如果2是3，環(huán)區(qū)域中的氨基酸序列可與SEQIDNO:l或SEQIDNO:2的相應(yīng)環(huán)區(qū)域具有大于《％的序列相同性。雜柳審薪微參考文獻(xiàn)10-13披露其中一條肽鏈包含NMB1870序列和不同腦膜炎球菌多肽序列的雜交多肽。例如，參考文獻(xiàn)10披露了含有NMB1870和NadA的雜交體。參考文獻(xiàn)12披露了稱為串聯(lián)多肽的特異性雜交多肽亞組，其中一條多肽鏈包含多個(gè)NMB1870序列，例如每個(gè)家族的序列。本發(fā)明提供許多新的雜交和串聯(lián)多肽。雜交多肽通常如下式所示-曙A-[-X-L-]n-B-其中X是包含奈瑟球菌序列的氨基酸序列，L是任選的接頭氨基酸序列，A是任選的N-末端氨基酸序列，B是任選是C-末端氨基酸序列，n是大于1的整數(shù)。n值可以是2、3、4、5、6、7、8或更高，但優(yōu)選2或3。-A-序列優(yōu)選位于多肽的N-末端，-B-序列優(yōu)選位于多肽的C-末端。按照本發(fā)明，至少一個(gè)-X-部分是NMB1870序列。用作-X-部分的優(yōu)選NMB1870序列截短最多可包括在成熟N-末端附近發(fā)現(xiàn)的聚-甘氨酸序列，即它們是AG序列。SEQIDN0:l-3的AG形式分別是SEQIDNO:22-24。對(duì)于X部分，特別是除X,以外的那些部分，優(yōu)選刪去其天然前導(dǎo)肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，應(yīng)刪除前導(dǎo)肽，除了位于此雜交多肽N-末端的-X-部分的前導(dǎo)肽外，即X,的前導(dǎo)肽保留，但刪去了X2.,.Xn的前導(dǎo)肽。這等于刪除了所有前導(dǎo)肽，而用Xi的前導(dǎo)肽作為部分-A-。對(duì)于[-X-L-]的各n例子，接頭氨基酸序列-L-可以存在或不存在。例如，當(dāng)n=2時(shí)，雜交體可以是NH2-X廣L廣X2-L2-COOH、NH2-X廣X2-COOH、NH2-X廣L「X2-COOH、NIl2-X,-X2-L2-COOH，等等。-個(gè)或多個(gè)接頭氨基酸序列-L-通常是短序列(例如，20個(gè)或更少的氨基酸，即19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括有助于克隆的短肽序列、聚-甘氨酸接頭(即，Glyn，其中n-2、3、4、5、6、7、8、9、10或更島)和組氨酸標(biāo)簽(S卩，Hisn,其中11=3、4、5、6、7、8、9、10或更高)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知il其它合適的接頭氨基酸序列。有用的接頭是GSGGGG(SEQIDNO:15)，其中Gly-Ser二肽由S蘭HI限制性位點(diǎn)形成，從而有助于克隆和操作，Gly4四肽(SEQIDNO:16)是另一典型的聚-甘氨酸接頭。另有用的接頭是SEQIDNO:17，任選其前方是Gly匿Ser二肽(SEQIDNO:18，由S"mHI形成)或Gly-Lys二肽(SEQIDNO:19，由歷"dIII形成)。-A-是任選的N-末端氨基酸序列。該序列通常是短序列(例如，40或更少的氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例亍包括引導(dǎo)蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)那皩?dǎo)序列，或有助于克隆或純化的短肽序列(例如，組氨酸標(biāo)簽，即HiSn，其中11=3、4、5、6、7、8、9、0或更高)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道其它合適的N-末端氨基酸序列。如果X,缺乏其自身的N-末端甲硫氨酸，-A-可在翻譯的多肽中提供這種甲硫氨酸殘基(例如，-A-是一個(gè)Met殘某)。Met可以與接頭序列，例如SEQIDNO:17的N-末端相連(即，SEQIDNO:21)或位于短序列的N-末端(例如，SEQIDNO:26)。-A-序列的例子包括SEQIDNO:21、26和43。-B-是任選的C-末端氨基酸序列。該序列通常是短序列(例如，40或更少的氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括引導(dǎo)蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)男蛄?，有助于克隆或純化的短肽序?例如，包含組氨酸標(biāo)簽，即HiSn，其中n-3、4、5、6、7、8、9、10或更高，如SEQIDNO:20)，或能提高多肽穩(wěn)定性的序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道其它合適的C-末端氨基酸序列。一個(gè)合適的-B-部分是SEQIDNO:41，其中SEQIDNO:20.....Ir.游的Leu-Glu(SEQ1DNO:44)來(lái)源于X/wI限制性位點(diǎn)。在本發(fā)明優(yōu)選的雜交多肽中，X部分之一是"蛋白質(zhì)936"序列。參考文獻(xiàn)3首先披露了蛋白質(zhì)936，即SEQIDNO:2884(本文中是SEQIDNO:14)，在本文中該序列的信號(hào)肽截短形式(signal-加ncatedversion)是SEQIDNO:25。本發(fā)明所用的"936"序列包括以下序列(i)與SEQIDNO:25至少有^%序列相同性的序列，和/或(ii)包含SEQIDNO:25的至少/個(gè)連續(xù)氨基酸的片段的序列。z值選自50、60、70、75、80、85、90、92、94、95、96、97、98、99、99.5、99.9或更高。/值選自6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、40、45、50、60、70、75、100、150、200或更高。一些優(yōu)選的雜交多肽包含一條936序列和兩條NMB1870序列。所述兩條NMB1870序列來(lái)自兩個(gè)不同的家族，例如I和II、I和III或II和III。優(yōu)選的雜交體包含936序列，家族I的NMB1870序列和家族II的NMB1870序列。936(序列)優(yōu)選位于這三種序列的最N-末端。SEQIDNO:28、29、34和35是雜交多肽的例子，所述多肽包含與兩個(gè)不同家族的NMB1870序列的N-末端相連的936序列。例如，如果11=2，則Xt可以是"936"序列，X2可以是NMB1870序列。類似地，如果11=3，則&可以是"936"序列，X2可以是第一家族的NMB1870序列，并且X2可以是第二家族的NMB1870序列。在本發(fā)明的優(yōu)選串聯(lián)多肽中，n是2或3。本發(fā)明的14種特異性雜交和串聯(lián)多肽如SEQIDNO:27-40所示，作為指導(dǎo)，其SEQIDNO的構(gòu)成如下所示<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>本發(fā)明的其它優(yōu)選雜交和串聯(lián)多肽包含家族IV的序列。因此，至少一個(gè):95具有至少v。/。序列相同性，和/或(ii)包含SEQIDNO:95的至少vv個(gè)連續(xù)氨基酸的片段。v值選自50、60、70、75、80、85、90、92、94、95、96、97、98、99、99.5、99.9或更高。vv值選自6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、40、45、50、60、70、75、100、150、200或更高。包含家族IV序列可以增強(qiáng)抗269cpx菌株的血清活性。層緒70游#疑浙潛稱凝除了利用全長(zhǎng)NMB1870序列(例如，SEQIDNO:l)，本發(fā)明通常使用片段。例如，通常刪去成熟N-末端的上游氨基酸(SEQIDNO:l中的Cys-20)。優(yōu)選利用"AG"序列，其中刪除了最多可包括NMB1870的聚-甘氨酸序列的所有氨基酸，即刪除了SEQIDNO:l中的氨基酸1-26。例如，在SEQIDNO:27-40中，上表顯示利用了NMB1870的AG形式(即，SEQIDNO:22-24)。如參考文獻(xiàn)13所述，NMB1870可以分成稱為A、B和C的三個(gè)結(jié)構(gòu)域。以家族I序列(SEQIDNO:l)為例，其中成熟加工的脂蛋白的N-末端是Cys-20，所述三個(gè)結(jié)構(gòu)域是(A)1-119，(B)120-183和(C)184-274:mnrtafcc:ls:lttali:ltacssggggvmd工gaglada:ltap]jDhkdkg:lqsIjT:ldqsvrknek:lkLAAQGAEKTYGNGDSIiNTGKLKMDKVSRFDF工RQIEVDGQL工TLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQiqdsehsgkmvakrqfrigdiagehtsfdklpeggratragtafgsddaggkltytidfaakqgngk工ehlkspelnvdlaaadikpdgkrhavisgsvlynqaekgsyslgifggkaqevagsaevktvngirhig:laakq自其C-末端半胱氨酸開(kāi)始的結(jié)構(gòu)域"A"的成熟形式稱為"A成熟"。對(duì)于MC58，這些結(jié)構(gòu)域是"A"=SEQIDNO:4;"B"=SEQIDNO:5;"C"=SEQIDNO:6;和"A成熟"=SEQIDNO:13。己知多種NMB1870序列[例如，見(jiàn)參考文獻(xiàn)4、8和10]，采用標(biāo)準(zhǔn)方法不難比對(duì)。借助這種比對(duì)，技術(shù)人員可以通過(guò)與MC58序列中的坐標(biāo)進(jìn)行比較來(lái)鑒定任何給定NMB1870序列中的結(jié)構(gòu)域"A"(和"A,雄")、"B"和"C"。然而，為便于引用，各結(jié)構(gòu)域如下定義-任何給定NMB1870序列中的結(jié)構(gòu)域"A"是該序列的片段，當(dāng)采用兩兩比對(duì)算法與SEQIDNO:l比對(duì)時(shí)，所述片段始于和SEQIDNO:l的Met-1比對(duì)的氨基酸，終于和SEQIDNO:l的Lys-119比對(duì)的氨基酸。-任何給定NMB1870序列中的結(jié)構(gòu)域"A成熟"是該序列的片段，當(dāng)采用兩兩比對(duì)算法與SEQIDNO:l比對(duì)時(shí)，所述片段始于和SEQIDNO:l的Cys-20比對(duì)的氨基酸，終于和SEQIDNO:l的Lys-119比對(duì)的氨基酸。-任何給定NMB1870序列中的結(jié)構(gòu)域"B"是該序列的片段，當(dāng)采用兩兩比對(duì)算法與SEQIDN0:1比對(duì)時(shí)，所述片段始于和SEQIDN0:1的Gin-120比對(duì)的氨基酸，終于和SEQIDNO:1的Gly-183比對(duì)的氨基酸。-任何給定NMB1870序列中的結(jié)構(gòu)域"C"是該序列的片段，當(dāng)采用兩兩比對(duì)算法與SEQIDN0:1比對(duì)時(shí)，所述片段始于和SEQIDN0:1的Lys-184比對(duì)的氨基酸，終于和SEQIDN0:1的Gln-274比對(duì)的氨基酸。用于確定結(jié)構(gòu)域的優(yōu)選兩兩比對(duì)算法是利用默認(rèn)參數(shù)(例如，空位開(kāi)放罰分=10.0，空位延伸罰分=0.5，采用EBLOSUM62評(píng)分矩陣)的Needleman-Wunsch全比對(duì)算法(Needleman-Wunschglobalalignmentalgorithm)[14]。利用EMBOSS軟件包中的工具可以方便地實(shí)施該算法[15]。NMB1870序列屬于本文稱為家族I、II和III的三個(gè)家族[4、10]。家族I-III的原型序列(prototypics叫uence)分別是SEQIDNO:l-3。采用參考文獻(xiàn)4的種系發(fā)生學(xué)和進(jìn)化系統(tǒng)樹(shù)方法不難測(cè)定任何給定NMB1870序列的家族，還可利用該三個(gè)原型NMB1870序列各自的兩兩比對(duì)來(lái)尋找最接近的家族匹配。諸序列明顯屬于這三個(gè)家族，其中家族1和11之間的序列相同性是74.1%，家族I和III之間的序列相同性是62.8%,家族II和III之間的序列相同性是84.7%，各家族內(nèi)的序列差異低(例如，家族1中最低有91.6%的相同性，家族n中最低有93.4%，家族III中最低有93.2%)。快速測(cè)定序列的家族而無(wú)需種系發(fā)生學(xué)分析的方法是如果某序列與SEQIDNO:l有至少85%序列相同性，則其屬于家族I;如果某序列與SEQIDNO:2有至少85。/。序列相同性，則其屬于家族II;如果某序列與SEQIDNO:3有至少85。/。序列相同性，則其屬于家族III。根據(jù)參考文獻(xiàn)4圖6中的比對(duì)，NMB1870的三個(gè)原型家族(SEQIDNO:l-3)的示范性結(jié)構(gòu)域A、B和C如下所示<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>本發(fā)明所用的優(yōu)選結(jié)構(gòu)域包含以下氨基酸序列(a)與SEQIDNO:4-12巾的一個(gè)或多個(gè)至少有乂％序列相同性的序列，和/或(b)包含SEQIDNO:4-12中的一個(gè)或多個(gè)的至少,個(gè)連續(xù)氣基酸序列的片段的序列。x值選自50、60、70、75、80、85、卯、92、94、95、96、97、98、99、99.5、99.9或更高。y值選自6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、35、40、45、50或更高。在包含不同家族的NMB1870序列的多肽中，各家族的:c和y值可以相同或不同。結(jié)構(gòu)域"A"序列的長(zhǎng)度優(yōu)選在";和a2(包括端點(diǎn))個(gè)氨基酸之間，其中/選自110、115、120、125和130;"2選自115、120、125、130和135。結(jié)構(gòu)域"B"序列的長(zhǎng)度優(yōu)選在67和62(包括端點(diǎn))個(gè)氨基酸之間，其中6,選自55、60、65禾卩70;^選自60、65、70和75。結(jié)構(gòu)域"C"序列的長(zhǎng)度優(yōu)選在Q和C2(包括端點(diǎn))個(gè)氨基酸之間，其中C/選自80、85、90、95和100;^選自85、90、95、100和105。如果需要，可用一個(gè)NMB1870結(jié)構(gòu)域(A、B或C)或用兩個(gè)NMB1870結(jié)構(gòu)域(AB、AC或BC)取代NMB1870的任何全長(zhǎng)形式。層肌70效泉吝性形式NMB1870的各種多態(tài)形式己見(jiàn)諸報(bào)道。已鑒定了新序列，因此，本發(fā)明提供包含選自下組的氨基酸序列的多肽SEQIDNO:46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、86、87、88、89、90、91、92、93和94。SEQIDNO:94(還可見(jiàn)參考文獻(xiàn)12的SEQIDNO:140)是家族IV序列的例子，其通過(guò)在家族I和m之間重組而產(chǎn)生。微本發(fā)明提供上述各種多肽。本發(fā)明還提供包含選自以下的氨基酸序列的多肽SEQIDNO:27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55和56。本發(fā)明還提供具有以F氨基酸序列的多肽(a)與選^下組的氨基酸序列具有序列相同性的氨基酸序列SEQIDNO:27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55和56，禾P/或(b)包含選自卜'組的氮基酸序列片段的氨基酸序列SEQIDNO:27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55和56。序列相同性程度優(yōu)選高于50%(例如，60%、70%、80%、90%、95%、99%或更高)。所述片段優(yōu)選包含起始序列的7個(gè)或更多個(gè)連續(xù)氨基酸(例如，7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、45、50、55、60、65、70、75、70、85、90、95、100或更多個(gè))。NMB1870是腦膜炎奈瑟球菌的天然脂蛋白。在大腸桿菌(￡."http://)中表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)其還能被脂質(zhì)化。本發(fā)明多肽可具有C-末端半胱氨酸殘基，該殘基可脂質(zhì)化，例如含有棕櫚?；１景l(fā)明優(yōu)選多肽的特征是給予宿主動(dòng)物后能誘導(dǎo)抗腦膜炎球菌的殺細(xì)菌抗體的能力。可通過(guò)各種方法制備本發(fā)明多肽，例如通過(guò)化學(xué)合成(至少部分)，用蛋白酶消化較長(zhǎng)的多肽，從RNA翻譯，從細(xì)胞培養(yǎng)物中純化(例如，從重組表達(dá)或腦膜炎奈瑟球菌培養(yǎng)物中純化)，等等。用大腸桿菌宿主異源表達(dá)是優(yōu)選的表達(dá)途徑(例如，用[〕H5a、BL21(I)E3)、BLR，等等)。本發(fā)明多肽可以與固體支持物相連或固定于其上。本發(fā)明多肽可包含可檢測(cè)標(biāo)記物，例如放射性標(biāo)記物，熒光標(biāo)記物或生物素標(biāo)記物。這在免疫測(cè)定技術(shù)中特別有用。多肽可采取各種形式(例如，天然多肽、融合多肽、糖基化多肽、非糖基化多肽、脂質(zhì)化多肽、含二硫鍵的多肽，等等)。優(yōu)選將多肽制備成基本純的或基本分離的形式(即，基本上不含其它奈瑟球菌或宿主細(xì)胞的多肽)或基本分離的形式。這些多肽通常在非天然產(chǎn)生的環(huán)境中提供，例如使它們與其天然產(chǎn)生的環(huán)境分開(kāi)。在某些實(shí)施方式中，所述多肽存在于相比于對(duì)照更豐富的組合物中。因此，本發(fā)明提供純化的多肽，藉此"純化"表示該多肽所處的組合物中基本上不含表達(dá)的其它多肽，而"基本上不含"表示構(gòu)成組合物的其它表達(dá)的多肽低于90%，通常低于60%，更常見(jiàn)低于50%。術(shù)語(yǔ)"多肽"指任何長(zhǎng)度的氨基酸聚合物。聚合物可以是線性或支鏈的，其可包含修飾的氨基酸，并可間插有非氨基酸。這些術(shù)語(yǔ)還包括天然或經(jīng)干預(yù)而得到修飾的氨基酸聚合物；例如形成二硫鍵、糖基化、脂化、乙?；?、磷酸化或任何其它操作或修飾，例如與標(biāo)記組分偶聯(lián)。這些定義還包括，例如含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸類似物(包括，例如非天然氨基酸，等等)以及本領(lǐng)域已知的其它修飾的多肽。多肽可以單鏈或締合鏈(associatedchain)存在。微本發(fā)明提供編碼上述本發(fā)明多肽的核酸。本發(fā)明還提供包含以下的核酸(a)所述核酸的至少n個(gè)連續(xù)核苷酸的片段，其中m是10或更高(例如，12、14、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、卯、100、150、200、500或更高)；和/或(b)與所述核酸有至少50%(例如，60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高)序列相同性的序列。此外，本發(fā)明提供能與編碼本發(fā)明多肽的核酸雜交的核酸，優(yōu)選在"高度嚴(yán)格性"條件下(例如，65°C，O.IXSSC，0.5。/。SDS溶液)?？蓪⒈景l(fā)明核酸用于雜交反應(yīng)(例如，Northern或Sourthern印跡或核酸微陣列或"基因芯片"中)和擴(kuò)增反應(yīng)(例如，PCR、SI)A、SSSR、LCR、TMA、NASBA，等等)以及其它核酸技術(shù)中?？梢栽S多方法制備本發(fā)明核酸，例如完全或部分采用化學(xué)合成(例如，DNA的亞磷酰胺合成)，用核酸酶(例如，限制性內(nèi)切酶)消化較長(zhǎng)的核酸，通過(guò)連接較短核酸或核苷酸(例如，利用連接酶或聚合酶)，從基因組或cDNA文庫(kù)制備，等等。本發(fā)明核酸可采取各種形式，例如單鏈、雙鏈、載體、引物、探針、作標(biāo)記的、未作標(biāo)記的，等等。本發(fā)明核酸優(yōu)選分離的或基本上分離的形式。本發(fā)明包括含有上述那些序列的互補(bǔ)序列的核酸，例如反義(核酸)或用于檢測(cè)，或用作引物。術(shù)語(yǔ)"核酸"包括DNA和RNA，還包括它們的類似物，例如含有修飾骨架的那些，還包括肽核酸(PNA)，等等。本發(fā)明的核酸可以作標(biāo)記，例如含放射性或熒光標(biāo)記物。如果將核酸用于核酸檢測(cè)技術(shù)，例如核酸是引物或在諸如PCR、LCR、TMA、NASBA等技術(shù)中用作探針時(shí)，這特別有用。本發(fā)明還提供包含本發(fā)明核苷酸序列的載體(例如，克隆或表達(dá)載體，例如適合于核酸免疫接種的那些)和用這種載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。微蘑座麥本發(fā)明的優(yōu)選多肽能引發(fā)抗腦膜炎球菌的殺細(xì)菌抗體應(yīng)答。不難檢測(cè)小鼠的殺細(xì)菌抗體應(yīng)答，其是疫苗效力的標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)[例如，見(jiàn)參考文獻(xiàn)2的附注14]。本發(fā)明多肽優(yōu)選能引發(fā)抗以下三組菌株中至少兩組各自至少一種腦膜炎奈瑟球菌菌株的殺細(xì)菌抗體應(yīng)答(I)MC58、gbl85(=M01-240185)、m4030、m2197、m2937、issl001、NZ394/98、67/00、93/114、bzl98、m1390、nge28、Inpl7592、00-241341、傷124、205卯0、m198/172、bzl33、gbl49(=M01-240149)、nm008、nm092、30/00、39/99、72/00、95330、bzl69、bz83、cu385、h44〃6、ml5卯、m2934、m2969、m3370、m4215、m4318、n44/89、14847。(II)961-5945、2996、96217、312294、11327、a22、gb013(=M01-240013)、e32、m畫、m4287、860800、599、95N477、90-18311、cll、m986、m2671、1000、m1096、m3279、bz232、dk353、m3697、ngh38、L93/4286。(III)M1239、16889、gb355(=M01-240355)、m3369、m3813、ngpl65。例如，嵌合型多肽能引發(fā)有效抵御血清群B腦膜炎奈瑟球菌菌株MC58、961-5945和M1239中兩種或多種的殺細(xì)菌應(yīng)答。所述多肽優(yōu)選能引發(fā)抵御臨床相關(guān)腦膜炎球菌血清群B的至少50%菌株(例如，60%、70%、80%、90%、95%或更高)的殺細(xì)菌抗體應(yīng)答。所述多肽可引發(fā)抵御血清群B腦膜炎奈瑟球菌菌株和血清群A、C、W135和Y中至少一種(例如，1、2、3、4種)的菌株的殺細(xì)菌抗體應(yīng)答。所述多肽可引發(fā)抵御淋病奈瑟球菌(Mgwwcocc仏sO和/或灰色奈瑟球菌(/V.c/;7en")菌株的殺細(xì)菌抗體應(yīng)答。所述多肽可引發(fā)抗參考文獻(xiàn)4中圖5所示進(jìn)化系統(tǒng)樹(shù)的三個(gè)主要分枝中至少兩分枝的菌株的殺細(xì)菌應(yīng)答。所述多肽可引發(fā)抗以下超毒譜系(hypervirulentlineage)中至少2個(gè)(例如，2、3、4、5、6、7)的腦膜炎奈瑟球菌菌株的殺細(xì)菌抗體應(yīng)答ET-37、ET-5、簇A4、譜系3、亞群I、亞群III和亞群IV-I[16，17]。這些多肽還可誘導(dǎo)抗一種或多種超侵襲性譜系(hyperinvasivelineage)的殺細(xì)菌抗體應(yīng)答。這些多肽可引發(fā)抗以下多基因座序列類型中至少2種(例如，2、3、4、5、6、7)的腦膜炎奈瑟球菌菌株的殺細(xì)菌抗體應(yīng)答ST1、ST4、ST5、ST8、STll、ST32和ST41[1.8:i。所述多肽還可引發(fā)抗ST44菌株的殺細(xì)菌抗體應(yīng)答。所述多肽無(wú)需誘導(dǎo)抗所述譜系或MLST內(nèi)各種和每一種MenB菌株的殺細(xì)菌抗體應(yīng)答；而是，就具體超毒譜系或MLST內(nèi)多種血清群B腦膜炎球菌菌株中四種的任何給定組而言，該組合物誘導(dǎo)的殺細(xì)菌抗體優(yōu)選抗該組的至少50%(例如，60%、70%、80%、90%或更多)。優(yōu)選的菌株組包括在至少4個(gè)以下國(guó)家中分離的菌株GB、AU、CA、NO、IT、US、NZ、NL、BR和CU。血清的殺細(xì)菌滴度優(yōu)選至少1024(例如，210、2'1、2'2、213、2'4、215、216、217、2'8或更高，優(yōu)選至少2")，即1:1.024稀釋的血清能殺傷具體測(cè)試菌株的至少50%細(xì)菌，例如參考文獻(xiàn)2的附注14所述。優(yōu)選的嵌合型多肽在小鼠中引發(fā)的抗體應(yīng)答即使其血淸作1:4096稀釋或進(jìn)一步稀釋仍能殺細(xì)菌。應(yīng)疫麥辨本發(fā)明多肽優(yōu)選作為免疫原性組合物提供，本發(fā)明提供用作藥物的免疫原性組合物。本發(fā)明還提供在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生抗體應(yīng)答的方法，所述方法包括將本發(fā)明的免疫原性組合物給予所述哺乳動(dòng)物。所述抗體應(yīng)答優(yōu)選保護(hù)性和/或殺細(xì)菌抗體應(yīng)答。本發(fā)明還提供保護(hù)哺乳動(dòng)物免遭奈瑟球菌(例如，腦膜炎球菌)感染的方法，所述方法包括將本發(fā)明的免疫原性組合物給予所述哺乳動(dòng)物。本發(fā)明提供用作藥物(例如，作為嵌合型組合物或疫苗)或診斷試劑的本發(fā)明嵌合型多肽。本發(fā)明還提供本發(fā)明的核酸、多肽或抗體在制備用于預(yù)防哺乳動(dòng)物的奈瑟球菌(例如，腦膜炎球菌)感染的藥物中的應(yīng)用。所述哺乳動(dòng)物優(yōu)選人。人可以是成年人，或者優(yōu)選兒童。如果疫苗是預(yù)防性應(yīng)用，則人優(yōu)選兒童(例如，學(xué)步童或嬰兒)；如果疫苗是治療性應(yīng)用，則人優(yōu)選成年人。也可將用于兒童的疫苗給予成年人，例如以檢驗(yàn)其安全性、劑量、免疫原性，等等。這些應(yīng)用和方法特別可用于預(yù)防/治療包括但不限于腦膜炎(特別是細(xì)菌性腦膜炎)和菌血癥在內(nèi)的疾病。可通過(guò)監(jiān)測(cè)給予本發(fā)明組合物后的奈瑟球菌感染來(lái)測(cè)試治療性治療的效力?？赏ㄟ^(guò)監(jiān)測(cè)給予所述組合物后抗NMB1870的免疫應(yīng)答來(lái)測(cè)試預(yù)防性治療的效力?？蓪⒈景l(fā)明組合物給予測(cè)試對(duì)象(例如，12-16月齡的兒童，或動(dòng)物模型[19])，然后測(cè)定包括血清殺細(xì)菌抗體(SBA)和ELISA滴度(GMT)在內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)來(lái)測(cè)定其免疫原性。通常在給予組合物后約4周測(cè)定這些免疫應(yīng)答，并與給予組合物前的測(cè)定值作比較。最好SBA升高至少4倍或8倍。如果給予多劑量組合物，則可進(jìn)行多次給藥后測(cè)定。本發(fā)明的優(yōu)選組合物能賦予患者的抗體滴度優(yōu)于各抗原性組分對(duì)于可接受百分比的人對(duì)象的血清保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)。具有相關(guān)抗體滴度(高于該滴度則認(rèn)為宿主對(duì)該抗原是血清轉(zhuǎn)化的)的抗原是熟知的，這種滴度由諸如WHO等組織發(fā)布。優(yōu)選超過(guò)80%的對(duì)象的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著樣本是血清轉(zhuǎn)化的，更優(yōu)選超過(guò)90%，還更優(yōu)選超過(guò)93%，最優(yōu)選96-100%。本發(fā)明的組合物通常應(yīng)直接給予患者?？梢越?jīng)胃腸外注射(例如皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或組織間隙)，或通過(guò)直腸、口服、陰道、局部、透皮、鼻內(nèi)、眼睛、耳部、肺部或其他粘膜給藥實(shí)現(xiàn)直接遞送。優(yōu)選大腿或上臂肌肉內(nèi)給藥。注射可以通過(guò)針(例如皮下注射針)，或者可使用無(wú)針注射。典型的肌肉內(nèi)劑量是0.5ml?？刹捎帽景l(fā)明弓I發(fā)全身性和/或粘膜免疫力。劑量療法可以是單一劑量用藥法或多劑量用藥法。多劑量可以用于初次免疫接種程序表和/或加強(qiáng)免疫接種程序表。初次給藥方案之后可以是加強(qiáng)給藥方案。致敏給藥之間(例如4-16周之間)以及致敏和加強(qiáng)之間的適當(dāng)時(shí)間可以按常規(guī)確定。本發(fā)明的免疫原性組合物通常含有藥學(xué)上可接受的載體，所述載體可以是自身不誘導(dǎo)對(duì)接受該組合物的患者產(chǎn)生有害抗體的任何物質(zhì)，并且給予所述載體不會(huì)產(chǎn)生過(guò)分的毒性。藥學(xué)上可接受的載體可以包括液體，例如水、鹽水、甘油和乙醇。在這種載體中還可存在輔助物質(zhì)，例如潤(rùn)濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等。合適載體的詳盡討論見(jiàn)參考文獻(xiàn)20。奈瑟球菌感染影響身體的各個(gè)部位，因此可將本發(fā)明組合物制成各種形式。例如，可將該組合物制成可注射的(液體溶液或懸浮液)。還可制備成適合于先溶解或懸浮在液體運(yùn)載體中再注射的固體形式?？蓪⒔M合物制備成用于局部給藥的，例如軟膏、乳膏或粉末?？蓪⒔M合物制備成用于口服給藥的，例如片劑或膠囊，或糖漿(任選加入調(diào)味劑)?？蓪⒔M合物制備成用于肺部給藥的，例如使用細(xì)粉末或噴霧的吸入器。可將組合物制備成栓劑或陰道栓劑?？蓪⒔M合物制備成用于鼻、耳或眼睛給藥的，例如滴劑。所述組合物優(yōu)選無(wú)菌。優(yōu)選無(wú)熱原。優(yōu)選緩沖至，例如pH6-pH8之間，通常約為pH7。如果某組合物含有氫氧化鋁鹽，優(yōu)選使用組氨酸緩沖液[21]。本發(fā)明組合物對(duì)人體是等滲透壓的。免疫原性組合物包含免疫學(xué)有效量的抗原以及所需要的任何其它特定組分。"免疫學(xué)有效量"表示給予個(gè)體該用量(單一劑量或作為系列劑量的一部分)對(duì)于治療或預(yù)防有效。該用量取決于所治療個(gè)體的健康和身體狀況、年齡、待治療個(gè)體的分類學(xué)分組(例如非人靈長(zhǎng)類、靈長(zhǎng)類等等)、該個(gè)體免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、所需的保護(hù)程度、疫苗劑型、主治醫(yī)生對(duì)醫(yī)學(xué)狀況的評(píng)估以及其他相關(guān)因素而不同。估計(jì)該用量的范圍較寬，可通過(guò)常規(guī)試驗(yàn)確定。劑量療法可以是單劑量用藥法或多劑量用藥法(例如，包括加強(qiáng)給藥)。可聯(lián)合給予所述組合物和其它免疫調(diào)節(jié)劑。本發(fā)明組合物可用的佐劑包括但不限于A.含有礦物質(zhì)的組合物適合用作本發(fā)明佐劑的含有礦物質(zhì)的組合物包括礦物鹽，例如鋁鹽和鈣鹽。本發(fā)明包括礦物鹽，例如氫氧化物(如羥基氧化物)、磷酸鹽(如羥基磷酸鹽、正磷酸鹽)、硫酸鹽等[如參見(jiàn)參考文獻(xiàn)22的第8和9章]，或不同礦物質(zhì)化合物的混合物，這些化合物可采取任何合適的形式(如凝膠、晶體、無(wú)定形等)，優(yōu)選(具有)吸附性。含有礦物質(zhì)的組合物也可配制為金屬鹽顆粒[23]。特別優(yōu)選磷酸鋁，尤其是在包含流感嗜血桿菌(/^'^/7we"z"e)糖抗原的組合物中，典型的佐劑是P04/A1摩爾比在0.84和0.92之間的無(wú)定形羥基磷酸鋁，含量為0.6mgAl3+/ml。可用低劑量磷酸鋁吸附，例如每劑每種偶連物50-100|igAl3+。當(dāng)組合物中含有一種以上偶連物時(shí)，不需要吸附所有偶連物。B.油乳劑適合用作本發(fā)明佐劑的油乳劑組合物包括角鯊烯-水乳劑，例如MF59[參考文獻(xiàn)22的第10章；也可參見(jiàn)參考文獻(xiàn)24](利用微流化劑配制成亞微米顆粒的5%角鯊烯、0.5%吐溫80和0.5%司盤85)。也可用完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA)。本發(fā)明可利用水包油乳液佐劑。C.皂苷制劑f參考文獻(xiàn)22的第22章l皂苷制劑也可用作本發(fā)明的佐劑。皂苷是在許多植物種類的樹(shù)皮、葉、莖、根、甚至花中發(fā)現(xiàn)的固醇糖苷和三萜系糖苷的異質(zhì)混合物(heterologousgroup)。皂樹(shù)(0^7/a/a^;o"an'aMolina)樹(shù)皮中的皂苷是廣泛研究的佐劑。皂苷也可購(gòu)自麗花菝葜OSm/tec(墨西哥菝葜(sars叩rilla))、錐花絲石竹(G^戸o;/w7/a;am'cw/a,a)(婚紗花(bridesveil))禾口月巴皇草(Sapom2n'aq^c/"wa//51)(皇根(soaproot))。皂苷佐劑制劑包括純化的制劑，例如QS21，以及脂質(zhì)制劑，例如ISCOM。QS21的商品名為Stimulon。也可利用HPLC和RP-HPLC純化皂苷組合物。己經(jīng)鑒定了用這些技術(shù)專門純化的組分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。皂苷優(yōu)選QS21。參考文獻(xiàn)25公開(kāi)了QS21的制備方法。皂苷制劑也可含有固醇，例如膽固醇[26]?？陕?lián)用皂苷和膽固醇來(lái)形成稱為免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)的獨(dú)特顆粒[參考文獻(xiàn)22的第23章]。ISCOM—般也含有磷脂，例如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰膽堿。任何已知的皂苷可用在ISCOM中。ISCOM優(yōu)選含有QuilA、QHA和QHC的一種或多種。參考文獻(xiàn)26-28進(jìn)一步描述了ISCOM。ISCOM任選不含其它去污劑[29]。皂苷佐劑開(kāi)發(fā)的綜述見(jiàn)參考文獻(xiàn)30和31。D.病毒體和病毒樣顆粒病毒體和病毒樣顆粒(VLP)也可用作本發(fā)明的佐劑。這些結(jié)構(gòu)通常含有一種或多種任選與磷脂混合或用磷脂配制的病毒蛋白質(zhì)。它們通常無(wú)致病性、非復(fù)制性，通常不含有任何天然病毒基因組?？芍亟M產(chǎn)生或從完整病毒分離這些病毒蛋白。適用于病毒體或VLP中的病毒蛋白包括源自以下的蛋白質(zhì)流感病毒(例如HA或NA)、乙肝病毒(例如核心或衣殼蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德畢斯病毒、輪狀病毒、口蹄疫病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、諾瓦克病毒、人乳頭瘤病毒、HIV、RNA-噬菌體、Q(3-噬菌體(例如外殼蛋白)、GA-噬菌體、fr-噬菌體、AP205噬菌體和Ty(例如逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ty蛋白pl)。參考文獻(xiàn)32-37進(jìn)一步討論了VLP。例如，參考文獻(xiàn)38進(jìn)一步討論了病毒體。E.細(xì)菌或微生物衍生物適用于本發(fā)明的佐劑包括細(xì)菌或微生物衍生物，例如腸細(xì)菌脂多糖(LPS)的無(wú)毒衍生物、脂質(zhì)A衍生物、免疫剌激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素和它們的脫毒衍生物。LPS的無(wú)毒衍生物包括單磷?；|(zhì)A(MPL)和3-0-脫酰基MPL(3dMPL)。3dMPL是具有4、5或6條?；湹?脫-O-酰化單磷?；|(zhì)A的混合物。參考文獻(xiàn)39公開(kāi)了3脫-O-?；瘑瘟柞；|(zhì)A的優(yōu)選"小顆粒"形式。3dMPL的這種"小顆粒"足夠小從而可經(jīng)0.22pm膜除菌過(guò)濾[39]。其它無(wú)毒的LPS衍生物包括單磷?；|(zhì)A模擬物，例如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯衍生物，如RC-529[40、41]。脂質(zhì)A衍生物包括大腸桿菌的脂質(zhì)A衍生物，例如OM-174。例如，OM-174描述于參考文獻(xiàn)42和43。適合用作本發(fā)明佐劑的免疫刺激性寡核苷酸包括含有CpG基序(含有通過(guò)磷酸鍵與鳥苷相連的未甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)的核苷酸序列。含有回文或聚(dG)序列的雙鏈RNA和寡核苷酸也顯示具有免疫刺激性。CpG可含有核苷酸修飾/類似物，例如硫代磷酸酯修飾并且可以是雙鏈或單鏈的。參考文獻(xiàn)44、45和46公開(kāi)了可能的類似物取代，例如用2'-脫氧-7-脫氮鳥苷取代鳥苷。參考文獻(xiàn)47-52進(jìn)一步討論了CpG寡核苷酸作為佐劑的作用。CpG序列可導(dǎo)向TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[53]。CpG序列，例如CpG-AODN能特異性誘導(dǎo)Thl免疫應(yīng)答，或者，例如CpG-BODN能更特異性誘導(dǎo)B細(xì)胞應(yīng)答。參考文獻(xiàn)54-56討論了CpG-A和CpG-BODN。CpG優(yōu)選CpG-AODN。優(yōu)選將CpG寡核苷酸構(gòu)建為5'端易為受體識(shí)別。兩條CpG寡核苷酸序列任選在它們的3'端相連而形成"免疫聚物"(immunomer)。參見(jiàn)，例如參考文獻(xiàn)53和57-59。細(xì)菌ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物可用作本發(fā)明的佐劑。此種蛋白質(zhì)優(yōu)選源自大腸桿菌(大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素"LT")、霍亂("CT")或百日咳("PT")。參考文獻(xiàn)60描述了脫毒的ADP-核糖基化毒素作為粘膜佐劑的應(yīng)用，參考文獻(xiàn)61描述了其作為胃腸外佐劑的應(yīng)用。所述毒素或類毒素優(yōu)選為含有A和B亞基的全毒素形式。A亞基優(yōu)選含有脫毒性突變；B亞基優(yōu)選未突變。佐劑優(yōu)選脫毒的LT突變體，例如LT-K63、LT-R72和LT-G192。ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物，特別是LT-K63和LT-R72作為佐劑的應(yīng)用見(jiàn)參考文獻(xiàn)62-69。氨基酸取代的數(shù)字基準(zhǔn)優(yōu)選以參考文獻(xiàn)70所述的ADP-核糖基化毒素的A和B亞基比對(duì)為基礎(chǔ)，該文獻(xiàn)通過(guò)引用專門全文納入本文。F.人免疫調(diào)節(jié)劑適合用作本發(fā)明佐劑的人免疫調(diào)節(jié)劑包括細(xì)胞因子，例如白介素(如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[71]等)[72]、干擾素(如，干擾素-y)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子和腫瘤壞死因子。G.生物粘附劑和粘膜粘附劑生物粘附劑(bioadhesive)和粘膜粘附劑(mucoadhesive)也可用作本發(fā)明的佐劑。合適的生物粘附劑包括酯化的透明質(zhì)酸微球[73]，或者粘膜粘附劑，例如聚(丙烯酸)的交聯(lián)衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯垸酮、多糖和羧甲基纖維素。殼多糖及其衍生物也可用作本發(fā)明的佐劑[74]。H.微粒微粒也可用作本發(fā)明的佐劑?？捎蒙锟山到夂蜔o(wú)毒的材料(例如，聚(a-羥酸)、聚羥基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己酸內(nèi)酯等)，優(yōu)選聚(丙交酯-共-乙交酯)形成微粒(即，直徑約100nm到約150(im，優(yōu)選約200nm到約30最優(yōu)選約500nm到約10pm的顆粒)，任選將這些微粒處理成表面帶負(fù)電(例如，用SDS)或表面帶正電(例如，用陽(yáng)離子洗滌劑，如CTAB)。I.脂質(zhì)體(參考文獻(xiàn)22的第13和14章)適合用作佐劑的脂質(zhì)體制劑的例子描述于參考文獻(xiàn)75-77。J.聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯制劑適用于本發(fā)明的佐劑包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[78]。這種制劑還包括聯(lián)用辛苯聚醇的聚氧乙烯山梨糖醇酯表面活性劑[79]以及聯(lián)用至少一種其它非離子表面活性劑，例如辛苯聚醇的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性劑[80]。優(yōu)選的聚氧乙烯醚選自聚氧乙烯-9-月桂基醚(月桂醇聚醚9)、聚氧乙烯-9-硬脂?；?steoryl)醚、聚氧乙烯-8-硬脂?；?steoryl)醚、聚氧乙烯-4-月桂基醚、聚氧乙烯-35-月桂基醚和聚氧乙烯-23-月桂基醚。K.聚磷腈(PCPP)PCPP制劑描述于，例如參考文獻(xiàn)81和82中。L.胞壁酰肽適合用作本發(fā)明佐劑的胞壁酰肽的例子包括N-乙酰基-胞壁酰-L-蘇氨?；?D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲胞壁酰(normuramyl)-L-丙氨?；?D-異谷氨酰胺(nor-MDP)和N-乙?；邗?L-丙氨?；?D-異谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(l'-2'-二棕櫚?；?sn-甘油基-3-羥基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)。M.咪唑并喹啉化合物適合用作本發(fā)明佐劑的咪唑并喹啉化合物包括參考文獻(xiàn)83和84中進(jìn)一步描述的咪喹莫特(Imiquamod)及其同系物(例如，"瑞喹莫德3M")。本發(fā)明也包括聯(lián)用一種或多種以上鑒定的佐劑的各方面。例如，以下佐劑組合物可用于本發(fā)明(l)皂苷和水包油乳劑[85];(2)皂苷(例如(^21)+無(wú)毒的LPS衍生物(例如3dMPL)[86];(3)皂苷(例如QS21)十無(wú)毒的LPS衍生物(例如3dMPL)+膽固醇；(4)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IL-12(任選+固醇)[87];(5)聯(lián)用3dMPL與例如QS21和/或水包油乳劑[88];(6)含有10%角鯊烯、0.4%吐溫80、5%普朗尼克嵌段聚合物L(fēng)121和thr-MDP的SAF，微流化為亞微米乳劑或旋振(vortex)產(chǎn)生較大粒度的乳劑；(7)RibiTM佐劑系統(tǒng)(RAS)，(Ribi免疫化學(xué)公司(Ribilmmunochem))，其中含有2%角鯊烯、0.2%吐溫80和單磷酸酰脂質(zhì)A(mon叩hosphorylipidA)(MPL)、海藻糖二分枝菌酸酯(TDM)和細(xì)胞壁骨架(CWS)的一種或多種由，優(yōu)選MPL+CWS(DetoxTM)組成的細(xì)菌細(xì)胞壁組分；和(8)—種或多種礦物鹽(例如鋁鹽)+LPS的無(wú)毒衍生物(例如3dMPL)。參考文獻(xiàn)22的第7章公開(kāi)了可用作免疫剌激劑的其它物質(zhì)。鋁鹽(磷酸鋁，尤其是羥基磷酸鋁，和/或氫氧化鋁，尤其是羥基氧化鋁(oxyhydroxide))和MF59是腸胃外免疫的優(yōu)選佐劑。毒素突變體是優(yōu)選的粘膜佐劑。QS21是NMB1870的另一種有用佐劑，它可單獨(dú)使用或與一種或多種其它佐劑如鋁鹽聯(lián)用。胞壁酰肽包括N-乙?；?胞壁酰-L-蘇氨酰基-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙?；?去甲胞壁酰-L-丙氨酰基-D-異谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨?；?D-異谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(l'-2'-二棕櫚酰基-sn-甘油基-3-羥基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)等。微蘇微分本發(fā)明組合物包含NMB1870序列。尤其優(yōu)選該組合物不應(yīng)當(dāng)包括復(fù)雜或不明確的抗原混合物，例如，優(yōu)選組合物中不包含外膜囊泡。本發(fā)明多肽優(yōu)選以重組方式在異源宿主中表達(dá)，然后純化。除了包含NMB1870序列，本發(fā)明組合物還包含一種或多種其它奈瑟球菌抗原，因?yàn)榘邢蛎糠N細(xì)菌的多種抗原的疫苗降低了選擇逃逸突變體的可能性。該組合物中包含的奈瑟球菌抗原包括含有一種或多種以下成分的多肽(a)參考文獻(xiàn)89中所公開(kāi)的446種偶數(shù)SEQID(即2、4、6、…、890、892);(b)參考文獻(xiàn)90中所公開(kāi)的45種偶數(shù)SEQID(即2、4、6、…、88、90);(c)參考文獻(xiàn)3中所公開(kāi)的1674種偶數(shù)SEQID2-3020、偶數(shù)SEQID3040-3114，以及所有的SEQID3115-3241;(d)參考文獻(xiàn)2中NMB0001到NMB216的共2160條氨基酸序列；(e)任何亞型的腦膜炎球菌PorA蛋白，優(yōu)選重組表達(dá)的亞型；(f)(a)-(e)的變體、同系物、直系同源物、旁系同源物、突變體等等；或(g)從腦膜炎奈瑟球菌制備的外膜囊泡[例如見(jiàn)參考文獻(xiàn)182]。除了奈瑟球菌多肽抗原，所述組合物可以包括能賦予抗其他疾病或感染免疫力的抗原。例如，該組合物可以包括以下一種或多種其它抗原-腦膜炎奈瑟球菌血清群A、C、W135和/或Y的糖抗原，如參考文獻(xiàn)91所述的血清群C的寡糖[也可參見(jiàn)參考文獻(xiàn)92]或參考文獻(xiàn)93的寡糖。-肺炎鏈球菌0S的/7tococc"s/7weMmo"/ae)的糖抗原[例如，94、95、96]。-甲肝病毒抗原，如滅活的病毒[例如，97、98]。-乙肝病毒抗原，如表面和/或核心抗原[例如，98、99]。-白喉抗原，如白喉類毒素[例如參考文獻(xiàn)100第3章]，例如CRM^突變體[例如，101]。-破傷風(fēng)抗原，諸如破傷風(fēng)類毒素[例如參考文獻(xiàn)100第4章]。-百日咳博德特菌(^^^￡//0/^^肌》抗原，如百日咳博德特菌的百日咳全毒素(PT)和絲狀血凝素(FHA)，任選也可以與百日咳桿菌黏附素(pertactin)和/或凝集原2和3[例如參考文獻(xiàn)102和103]聯(lián)用。-流感嗜血桿菌(ifoemo/^7附Z"/7we"zae)B的糖抗原[例如92]。-脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原[例如，104、105]，如IPV。-麻疹、腮腺炎和/或風(fēng)疹病毒抗原[例如參考文獻(xiàn)100的第9、10、11章]。-流感病毒抗原[例如參考文獻(xiàn)100的第19章],如血凝素和/或神經(jīng)氨酸酶表面蛋白。-粘膜炎莫拉菌(Moraxe〃flcato;r/zafc)抗原[例如，106]。-無(wú)乳鏈球菌(&w;tococc^"ga/ac"ae)(B型鏈球菌)蛋白抗原[例如，107、108]。-無(wú)乳鏈球菌(&w/7tococcz^aga/a"/ae)(B型鏈球菌)糖抗原。-化胺性鏈球菌0^印tococc^vcyoge"^)(A型鏈球菌)抗原[例如，108、109、110]。-金黃色葡萄球菌(Sto/7/^/ococa^ofwe"力抗原[例如，111〗。所述組合物可包含這些其它抗原中的一種或多種。如需要，可以對(duì)有毒的蛋白抗原進(jìn)行脫毒處理(例如通過(guò)化學(xué)和/或遺傳手段對(duì)百日咳毒素的脫毒處理[103])。如果所述組合物包含白喉抗原，優(yōu)選同時(shí)包含破傷風(fēng)抗原和百日咳抗原。類似地，如果組合物包含破傷風(fēng)抗原，優(yōu)選也包含白喉和百日咳抗原。類似地，如果組合物包含百日咳抗原，優(yōu)選也包含白喉和破傷風(fēng)抗原。因此優(yōu)選DTP組合。糖抗原優(yōu)選偶連物的形式。下文詳細(xì)描述了偶連物的載體蛋白。組合物中的各抗原的濃度通常應(yīng)至少1pg/ml。通常，任何特定抗原的濃度應(yīng)足以引發(fā)抗該抗原的免疫反應(yīng)。本發(fā)明免疫原性組合物可以用于治療(即治療已存在的感染)或預(yù)防(即防止將來(lái)的感染)。本發(fā)明免疫原性組合物中除了使用蛋白抗原，還可使用編碼該抗原的核酸(優(yōu)選DNA，例如質(zhì)粒形式)。本發(fā)明尤其優(yōu)選的組合物包含(a)腦膜炎球菌血清群Y、W135、C和(任選的)A的糖抗原；(b)B型流感嗜血桿菌(//^附0/^//船/"y7wen加e)糖抗原；和/或(c)月巿炎鏈球菌(5^e/7tococc船；"ewmom'ae)抗原中的一禾中、兩種或三種。腦膜炎球菌血清群Y、W135、C和(任選的)A抗血清群A、C、W135和Y的多糖疫苗是多年來(lái)已知的。這些疫苗(MENCEVAXACWYtm和MENOMUNEtm)基于生物體的英膜多糖，雖然它們?cè)谇嗌倌旰统扇酥杏行?，但它們產(chǎn)生的免疫反應(yīng)弱且保護(hù)時(shí)間短，而且不能用于嬰兒。與這些疫苗中非偶連多糖相反，最近批準(zhǔn)的血清群C疫苗(MenjugateTM[112、91]、Meningitec和NeisVac-C)包含偶連糖。Menjugate和MeningitecTM含有與CRM197載體偶連的寡糖抗原，而NeisVac-CTM使用與破傷風(fēng)類毒素載體偶連的完整多糖(脫-O-乙?；?。MenActraTM疫苗包含血清群Y、W135、C和A中各自的偶連的莢膜糖抗原。本發(fā)明組合物優(yōu)選包含一種或多種腦膜炎球菌血清群Y、W135、C和(任選的)A的莢膜糖抗原，其中所述抗原與載體蛋白偶連，和/或是寡糖。例如，該組合物可以包含以下血清群的莢膜糖抗原血清群C;血清群A和C、血清群A、C和W135;血清群A、C和Y;血清群C、W135和Y;或血清群A、C、W135和Y的所有4種。每劑量的各腦膜炎球菌糖抗原的典型含量介于1pg和20pg之間，例如約1|ug、約2.5pg、約4|Lig、約5pg、或約10pg(以糖表示)。如果混合物同時(shí)包含血清群A和C莢膜糖，MenA糖MenC糖的比例(w/w)可以大于1(例如2:1、3:1、4:1、5:1、10:1或更高)。如果混合物包含血清群Y莢膜糖以及血清群C和W135的一種或兩種莢膜糖，MenY糖MenW135糖的比例(w/w)可以大于l(例如2:1、3:1、4:1、5:1、10:1或更高)和/或MenY糖MenC糖的比例(w/w)可以小于l(例如1:2、1:3、1:4、1:5或更低)。血清群A:C:W135:Y的糖的優(yōu)選比例(w/w)是1:1:1:1;1:1:1:2;2:1:1:1;4:2:1:1;8:4:2:1;4:2:1:2;8:4:1:2;4:2:2:1;2:2:1:1;4:4:2:1;2:2:1:2;4:4:1:2;和2:2:2:1。血清群C:W135:Y的糖的優(yōu)選比例(w/w)是1:1:1;1:1:2;1:1:1;2:1:1;4:2:1;2:1:2;4:1:2;2:2:1;和2:1:1。各種糖的用量?jī)?yōu)選基本相同。莢膜糖通常應(yīng)以寡糖形式使用。這不難通過(guò)破碎純化的莢膜多糖(例如通過(guò)水解)形成，隨后通常純化具有所需大小的片段。優(yōu)選片段化多糖以產(chǎn)生最終小于30平均聚合度(DP)的寡糖(例如對(duì)于血清群A的DP在10和20之間，優(yōu)選10左右；血清群W135和Y在15和25之間，優(yōu)選15-20左右；血清群C的DP在12和22之間；等等)。DP可以通過(guò)離子交換色譜或比色試驗(yàn)方便地測(cè)量[113]。如果進(jìn)行水解，應(yīng)對(duì)水解產(chǎn)物進(jìn)行篩分以去除短的寡糖[92]。這可以通過(guò)多種方法實(shí)現(xiàn)，例如超濾后進(jìn)行離子交換色譜。對(duì)于血清群A，優(yōu)選去除聚合度小于或等于約6的寡糖，對(duì)于血清群W135和Y，優(yōu)選去除那些聚合度小于約4的寡糖。參考文獻(xiàn)112中公開(kāi)了如MenjugateTM中所用的優(yōu)選MenC糖抗原。糖抗原可以進(jìn)行化學(xué)修飾。這對(duì)于減少血清群A糖的水解尤其有用[114;見(jiàn)下文]。可以進(jìn)行腦膜炎球菌糖的脫-O-乙?；?duì)于寡糖，修飾可發(fā)生在解聚之前或之后。如果本發(fā)明組合物包含MenA糖抗原，該抗原優(yōu)選其中天然糖的一個(gè)或多個(gè)羥基已被封閉基團(tuán)(blockinggroup)取代的修飾的糖[114]。該修飾提高了對(duì)水解的耐受性。一般通過(guò)包括以下步驟的方法制備腦膜炎球菌莢膜多糖多糖沉淀(例如使用陽(yáng)離子洗滌劑)、乙醇分餾、冷苯酚抽提(以去除蛋白質(zhì))和超速離心(去除LPS)[例如參考文獻(xiàn)115]等。然而，更優(yōu)選的方法[93]包括多糖沉淀，隨后用低級(jí)醇溶解所沉淀的多糖。可以用諸如四丁基銨鹽和十六烷基三甲基銨鹽(如溴鹽)、或海美溴銨(hexadimethrinrbromide)和十四垸基三甲基銨鹽等陽(yáng)離子洗滌劑實(shí)現(xiàn)沉淀。尤其優(yōu)選十六烷基三甲基溴銨(CTAB)[116]。通過(guò)使用諸如甲醇、丙-l-醇、丙-2-醇、丁-l-醇、丁-2-醇、2-甲基-丙-l-醇、2-甲基-丙-2-醇、二醇等低級(jí)醇溶解沉淀的物質(zhì)，但乙醇尤其適于溶解CTAB-多糖復(fù)合物。優(yōu)選將乙醇添加到沉淀的多糖中至終濃度在50%和95%之間(以乙醇和水的總含量計(jì))。重溶后，可進(jìn)一步處理多糖以去除污染物。這在不接受哪怕些許污染的情況(例如對(duì)于人類疫苗生產(chǎn))中尤其重要。這通常應(yīng)包括一步或多步過(guò)濾，例如可用深層過(guò)濾、經(jīng)活性碳過(guò)濾、分子大小排阻過(guò)濾和/或超濾。一旦過(guò)濾去除了污染物，可沉淀該多糖以進(jìn)一步處理和/或加工。這不難通過(guò)陽(yáng)離子交換(例如通過(guò)添加鈣鹽或鈉鹽)實(shí)現(xiàn)。除了純化，可以通過(guò)完全或部分合成(例如參考文獻(xiàn)117中公開(kāi)的Hib合成以及參考文獻(xiàn)118中公開(kāi)的MenA合成)來(lái)獲得莢膜糖。本發(fā)明組合物包含腦膜炎奈瑟球菌的至少兩種血清群的莢膜糖。所述糖優(yōu)選分別制備(包括片段化、偶連、修飾等等)，然后混合以產(chǎn)生本發(fā)明組合物。然而，如果該組合物包含血清群A的莢膜糖，為盡可能減少水解，優(yōu)選直到使用前才將血清群A的糖與其他糖混合。這不難通過(guò)利用凍干粉末形式的血清群A的組分(通常與適當(dāng)賦形劑一起)和液體形式的其它血清群的組分(也含合適賦形劑)而實(shí)現(xiàn)，在準(zhǔn)備使用時(shí)用液體組分重建凍干的MenA組分。如果使用鋁鹽佐劑，優(yōu)選在含液體疫苗的小瓶中包括佐劑，而凍干的MenA組分不添加佐劑。因此，可將制備的本發(fā)明組合物裝在試劑盒中，該試劑盒包括(a)凍干形式的腦膜炎奈瑟球菌血清群A莢膜糖；和(b)液體形式的該組合物的其它抗原。本發(fā)明也提供了制備本發(fā)明組合物的方法，該方法包括將凍干的腦膜炎奈瑟球菌血清群A莢膜糖與其它抗原混合，其中所述其它抗原是液體形式的。本發(fā)明也提供一種試劑盒，該試劑盒包括(a)含有凍干形式的腦膜炎奈瑟球菌血清群C、W135和Y中兩種或多種的莢膜糖的第一容器；以及(b)含有液體形式的以下物質(zhì)的第二容器，(i)在給予對(duì)象后能誘導(dǎo)對(duì)象抗體反應(yīng)的組合物，其中所述抗體反應(yīng)具有抗腦膜炎奈瑟球菌血清群B的超毒譜系A(chǔ)4、ET-5和譜系3中兩種或多種(例如2或3種)譜系的殺菌活性，(ii)腦膜炎奈瑟球菌血清群C、W135和Y之一或不是這些血清群的莢膜糖，和任選的(iii)不包括腦膜炎球菌莢膜糖的其它抗原(見(jiàn)下文)，其中，用容器(b)的內(nèi)容物重建容器(a)的內(nèi)容物而提供本發(fā)明的組合物。在各劑量范圍內(nèi)，各糖抗原的含量通常應(yīng)在1-50(ig之間(以糖的質(zhì)量檢測(cè))，優(yōu)選每種約2.5|ig、5pg或10嗎。由于A:C:W135:Y的重量比是1:1:1:1;1:1:1:2;2:1:1:1;4:2:1:1;8:4:2:1;4:2:1:2;8:4:1:2;4:2:2:1;2:2:1:1;4:4:2:1;2:2:1:2;4:4:1:2;和2:2:2:1，所以，數(shù)字1表示的含量?jī)?yōu)選約2.5嗎、5pg或10iag。因此，對(duì)于1:1:1:1比例的A:C:W:Y組合物和10pg的各種糖，每劑量給予40)ig糖。優(yōu)選的組合物每劑量包含約以下嗎的糖<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>腦膜炎球菌糖。其它優(yōu)選的組合物每劑量包含《25pg腦膜炎球菌糖。其它優(yōu)選的組合物每劑量包含《2(Hlg腦膜炎球菌糖。其它優(yōu)選的組合物每劑量包含《10pg腦膜炎球菌糖，但是，本發(fā)明組合物每劑量宜包含至少10pg腦膜炎球Menjugate和NeisVacMenC偶連物使用氫氧化物佐劑，而MeningitecTM使用磷酸鹽。氫氧化鋁可吸附本發(fā)明組合物中一些抗原，而其它抗原與磷酸鋁結(jié)合。對(duì)于四價(jià)血清群組合，例如可以使用下面的排列<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>如果組合物包括B型流感嗜血桿菌(i/./"/7we"zae)抗原，該抗原通常是Hib莢膜糖抗原。B型流感嗜血桿菌糖抗原是熟知的。優(yōu)選將Hib糖與載體蛋白共價(jià)偶連以增強(qiáng)其免疫原性(特別是在兒童體內(nèi))。多糖偶連物(特別是Hib莢膜多糖)的制備方法一般是充分公開(kāi)的[例如參考文獻(xiàn)119-127等等]。本發(fā)明可以使用任何合適的Hib偶連物。下文描述了合適的載體蛋白，Hib糖的優(yōu)選載體是CRM^7('HbOC')、破傷風(fēng)類毒素('PRP-T')和腦膜炎奈瑟球菌的外膜復(fù)合物('PRP-OMP')。偶連物的糖部分可以是多糖(例如全長(zhǎng)的聚磷酸核糖基核糖醇(PRP))，但優(yōu)選水解多糖以形成寡糖(例如分子量約l-5kDa)。一種優(yōu)選的偶連物包括經(jīng)脂肪酸接頭與CRMi97共價(jià)連接的Hib寡糖[128、129]。破傷風(fēng)類毒素也是優(yōu)選的載體。本發(fā)明組合物可以包含多種Hib抗原。如果組合物包含Hib糖抗原，優(yōu)選不同時(shí)包含氫氧化鋁佐劑。如果組合物包含磷酸鋁佐劑，則Hib抗原可以吸附于佐劑[130]，或不吸附[131]。Hib抗原可以凍干，例如與腦膜炎球菌抗原一起凍干。肺炎鏈球菌如果組合物包含肺炎鏈球菌CS.;朋wmom'fle)抗原，該抗原通常是優(yōu)選與載體蛋白偶連的莢膜糖抗原[例如參考文獻(xiàn)94-96]。優(yōu)選包括肺炎鏈球菌多種血清型的糖。例如，廣泛使用23種不同血清型的多糖混合物，例如使用5到11種不同血清型多糖的偶連物疫苗[132]。例如，PrevNarTM[133]包含7種血清型(4、6B、9V、14、18C、19F和23F)的抗原，各種糖通過(guò)還原氨化與CRM197偶連，每0.5毫升劑量(4昭的血清型6B)含2嗎各種糖，偶連物吸附于磷酸鋁佐劑。本發(fā)明組合物優(yōu)選至少包括血清型6B、14、19F和23F。偶連物可以吸附于磷酸鋁。除了使用肺炎球菌糖抗原，組合物可包含一種或多種多肽抗原。已知幾種肺炎球菌菌株的基因組序列[134、135]，可對(duì)其進(jìn)行反向疫苗學(xué)(研究)[136-139]來(lái)鑒別合適的多肽抗原[140、141]。例如，組合物可以包括一種或多種以下抗原PhtA、PhtD、PhtB、PhtE、SpsA、LytB、LytC、LytA、Spl25、SplOl、Spl28和Spl30，如參考文獻(xiàn)142所述。在一些實(shí)施方式中，組合物可以同時(shí)包含肺炎球菌的糖和多肽抗原。這些糖類和多肽抗原可簡(jiǎn)單混合后使用，或可將肺炎球菌糖抗原與肺炎球菌蛋白偶連。這種實(shí)施方式的合適載體蛋白包括前一段中所列舉的抗原[142]。肺炎球菌抗原可以凍干，例如與腦膜炎球菌和/或Hib抗原一起凍干。共價(jià)偶連通常將本發(fā)明組合物中的莢膜糖與載體蛋白偶連。偶連通常能增強(qiáng)糖的免疫原性，因?yàn)閷⑺鼈儚腡非依賴性抗原轉(zhuǎn)變?yōu)門依賴性抗原，從而引發(fā)免疫記憶。偶連對(duì)于兒科疫苗尤其有用，這是熟知的技術(shù)[參見(jiàn)參考文獻(xiàn)143和119-127]。優(yōu)選的載體蛋白是細(xì)菌毒素或類毒素，例如白喉類毒素或破傷風(fēng)類毒素。尤其優(yōu)選CRMm突變白喉毒素[144、145、146]。其他合適的載體蛋白包括腦膜炎奈瑟球菌外膜蛋白[147]，合成肽[148、149]，熱激蛋白[150、151]，百日咳蛋白[152、153]，流感嗜血桿菌的蛋白D[154、155],細(xì)胞因子[156]，淋巴因子[156]，包含各種源自病原體抗原的多種人CD4+T細(xì)胞表位的人工蛋白[157]，鏈球菌蛋白、激素[156]，生長(zhǎng)因子[156]，肺炎球菌表面蛋白PspA[158]，艱難梭菌毒素A或B[159]，鐵攝取蛋白[160]，等等。優(yōu)選的載體是CRM197。在本發(fā)明組合物中，可以使用多種載體蛋白，例如以降低載體抑制的風(fēng)險(xiǎn)。因此，對(duì)于不同的血清群可以使用不同的載體蛋白，例如，血清群A糖可以與CRM^偶連而血清群C糖可以與破傷風(fēng)類毒素偶連。對(duì)一種具體糖抗原也可使用多種載體蛋白，例如血清群A糖類可以分成兩組，一些與CRMw偶連，其它與破傷風(fēng)類毒素偶連。然而，所有糖通常宜用相同載體蛋白。一種載體蛋白可以攜帶多種糖抗原[161]。例如，一種載體蛋白可以與血清群A和C的糖偶連。為實(shí)現(xiàn)這一目的，可先混合諸糖再進(jìn)行偶連反應(yīng)。然而，各種血清群通常宜具有不同的偶連物。糖:蛋白比例(w/w)優(yōu)選在l:5(蛋白過(guò)量)和5:1(糖過(guò)量)之間。比例優(yōu)選在1:2和5:1之間，更優(yōu)選在1:1.25和1:2.5之間。對(duì)于MenC和MenA，優(yōu)選載體蛋白過(guò)量。偶連物可以與游離載體蛋白聯(lián)用[162]。當(dāng)本發(fā)明組合物中同時(shí)存在某種特定載體蛋白的游離和偶連形式時(shí)，以該組合物中所有載體蛋白總量計(jì)，非偶連形式優(yōu)選不超過(guò)5%，更優(yōu)選以重量計(jì)低于2%?？梢允褂萌魏芜m當(dāng)?shù)呐歼B反應(yīng)，需要時(shí)可用任何合適的接頭。偶連之前通常應(yīng)活化或功能化糖。活化可以涉及，例如氰化試劑，如CDAP(例如1-氰基-4-二甲基氨基吡啶鈸四氟硼酸鹽)[163、164等]。其他合適的技術(shù)使用碳二亞胺、酰肼、活性酯、降冰片垸、對(duì)-硝基苯甲酸、N-羥基琥珀酰亞胺、S-NHS、EDC、TSTU(也可參見(jiàn)參考文獻(xiàn)125的介紹)。可采用任何已知方法，例如參考文獻(xiàn)165和166所述的方法經(jīng)連接基團(tuán)進(jìn)行連接。一種類型的連接涉及多糖的還原氨化，獲得的氨基與己二酸連接基團(tuán)的一端偶聯(lián)，隨后將己二酸連接基團(tuán)的另一端與蛋白質(zhì)偶聯(lián)[123、167、168]。其他接頭包括B-丙酰胺[169]、硝基苯-乙胺[170]、鹵?；u(haloacylhalide)[171]、糖苷連接鍵[172]、6-氨基己酸[173]、ADH[174]、C4-C12部分[175]等等。除了使用接頭，還可以采用直接連接。與蛋白質(zhì)的直接連接可以包括先氧化多糖，再與該蛋白進(jìn)行還原氨化，例如參考文獻(xiàn)176和177所述。優(yōu)選的方法包括在糖中引入氨基(例如通過(guò)用-NH2取代末端K)基團(tuán))，隨后用己二酸二酯(例如己二酸N-羥基琥珀酰亞胺二酯)衍生化并與載體蛋白反應(yīng)。另一種優(yōu)選的反應(yīng)使用CDAP活化和蛋白D載體,例如用于MenA或MenC的。偶連后，可分離游離的和偶連的糖。有多種合適的方法可用，包括疏水層析、切線超濾、滲濾等等[參見(jiàn)參考文獻(xiàn)178和179等]。如果本發(fā)明組合物包含偶連寡糖，優(yōu)選先制備寡糖再偶連。外膜囊泡優(yōu)選的本發(fā)明組合物不應(yīng)包括復(fù)雜或不明確的抗原混合物，這是OMV的典型特征。然而，本發(fā)明可與OMV聯(lián)用，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)NMB1870能增強(qiáng)它們的效力[6]，特別是在制備OMV所用的菌株中過(guò)量表達(dá)本發(fā)明多肽時(shí)。此方法通?？捎糜诟纳颇X膜炎奈瑟球菌血清群B微泡[180]、"天然0MV"[181]、細(xì)胞泡(bleb)或外膜囊泡[例如參考文獻(xiàn)182-187等]的制備。這些囊泡可以從經(jīng)遺傳改造的細(xì)菌制備[188-191]，例如以增強(qiáng)免疫原性(例如超表達(dá)免疫原)、降低毒性、抑制莢膜多糖合成、下調(diào)ProA表達(dá)等等。它們可以從多泡(hyperblebbing)菌株制備[192-195]?？梢园ǚ侵虏∧紊蚓哪遗輀196〗?？梢圆皇褂孟礈靹┒苽銸MV[197、198]。它們可以在其表面表達(dá)非奈瑟球菌蛋白[199]?？扇コ鼈兊腖PS(LPS-depleted)。它們可以與重組抗原混合[182、200]?？梢允褂肐型外膜蛋白不同亞型的細(xì)菌的囊泡，例如使用各自展示3種亞型的遺傳改造的兩種不同囊泡群的6種不同亞型[201、202]，或使用各自展示3種亞型的遺傳改造的三種不同囊泡群的9種不同亞型等等。有用的亞型包括P1.7，16;P1.5-l，2-2;Pl.19,15-1;P1.5-2，10;Pl.12-1,13;P1.7-2,4;P1.22,14;P1.7-l，l;Pl.18-1,3,6。歪雄表達(dá)細(xì)菌表達(dá)技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。細(xì)菌啟動(dòng)子是能結(jié)合細(xì)菌RNA聚合酶并啟動(dòng)下游(3')編碼序列(例如結(jié)構(gòu)基因)轉(zhuǎn)錄成mRNA的任何DNA序列。啟動(dòng)子應(yīng)具有通常位于靠近編碼序列5'端的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。此轉(zhuǎn)錄起始區(qū)通常包括RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。細(xì)菌啟動(dòng)子也可含稱為操縱子的第二區(qū)，它可以與RNA合成開(kāi)始處的毗鄰RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)重疊。由于基因阻遏蛋白可以結(jié)合操縱子而抑制具體基因的轉(zhuǎn)錄，故操縱子能負(fù)調(diào)節(jié)(可誘導(dǎo)性)轉(zhuǎn)錄。在不存在諸如操縱子等負(fù)調(diào)節(jié)元件時(shí)，可以發(fā)生組成型表達(dá)。此外，通過(guò)基因激活蛋白結(jié)合序列(如果存在的話通常位于RNA聚合酶結(jié)合序列5'附近)可實(shí)現(xiàn)正調(diào)節(jié)。基因激活蛋白的一個(gè)實(shí)例是分解代謝激活蛋白(CAP)，它能協(xié)助啟動(dòng)大腸桿菌lac操縱子的轉(zhuǎn)錄[Raibaud等，(1984)爿"m/,及ev.Ge"W.18:173]。因此，受調(diào)節(jié)的表達(dá)可以是正或負(fù)調(diào)節(jié)，從而能增強(qiáng)或降低轉(zhuǎn)錄。編碼新陳代謝途徑酶的序列提供了尤其有用的啟動(dòng)子序列。實(shí)例包括衍生自諸如半乳糖、乳糖(/ac)[Chang等，(1977)A^w"卵:1056]和麥芽糖等糖代謝酶的啟動(dòng)子序列。其它實(shí)例包括衍生自諸如色氨酸("77)等生物合成酶的啟動(dòng)子序列[Goeddel等，(1980)7Vwc.」c/^iey.5:4057;Yelverton等，(1981)M/cL4c/A/^.9:731;美國(guó)專利4,738,921;EP-A-0036776和EP-A-0121775]。(3-內(nèi)酰胺酶(Wfl)啟動(dòng)子系統(tǒng)[見(jiàn)I.Gresser編的《干擾素3》(/"&r/era"3)中Weissmann(1981)著《干擾素的克隆及其它錯(cuò)誤》(Thecloningofinterferonandothermistakes)]、lambda噬菌體PL[Shimatake等，(1981)Nature,292:128]和T5[美國(guó)專利4,689,406]啟動(dòng)子系統(tǒng)也提供了有用的啟動(dòng)子序列。另一種感興趣的啟動(dòng)子是可誘導(dǎo)的阿拉伯糖啟動(dòng)子(pBAD)。此外，自然界中不存在的合成啟動(dòng)子也可以作為細(xì)菌啟動(dòng)子起作用。例如，可將一種細(xì)菌或噬菌體啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活序列與另一種細(xì)菌或噬菌體啟動(dòng)子的操縱子序列相連，從而產(chǎn)生合成的雜合啟動(dòng)子[美國(guó)專利4，551，433]。例如，toc啟動(dòng)子是由啟動(dòng)子和/ac操縱子序列構(gòu)成，由/"c阻遏物調(diào)節(jié)的雜合^-/flc啟動(dòng)子[Amann等，(1983)25:167;deBoer等，(1983)尸rac.AtoL4c^^c/.朋:21]。此外，細(xì)菌啟動(dòng)子可以包含天然產(chǎn)生的、能結(jié)合細(xì)菌RNA聚合酶并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的非細(xì)菌來(lái)源的啟動(dòng)子。還可將天然產(chǎn)生的非細(xì)菌來(lái)源啟動(dòng)子與相容的RNA聚合酶偶聯(lián)從而在原核細(xì)胞中高水平表達(dá)一些基因。噬菌體T7RNA聚合酶/啟動(dòng)子系統(tǒng)是偶聯(lián)啟動(dòng)子系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)例[Studier等，(1986)JMo/.說(shuō).o/.759:113;Tabor等，(1985)PracAto/A;ao^"',52:1074]。此外，雜合啟動(dòng)子也可以由噬菌體啟動(dòng)子和大腸桿菌操縱子區(qū)域構(gòu)成(EPO-A-0267851)。除了功能性啟動(dòng)子序列，有效的核糖體結(jié)合位點(diǎn)也可用在原核細(xì)胞中表達(dá)外來(lái)基因。在大腸桿菌中，核糖體結(jié)合位點(diǎn)被稱為Shine-Dalgamo(SD)序列，其包括起始密碼子(ATG)和位于起始密碼子上游3-11個(gè)核苷酸處長(zhǎng)3-9個(gè)核苷酸的序列。據(jù)認(rèn)為SD序列通過(guò)SD序列和大腸桿菌16SrRNA3'末端之間的堿基配對(duì)而促進(jìn)mRNA與核糖體結(jié)合[R.F.Goldberger主編《生物學(xué)調(diào)控和發(fā)育基因表達(dá)》C6/o/og/ca/iegw/a"o"a"dDeve/o/we"r五x;rej^/ow)一書中Steitz等(1979)所著《信使RNA中的遺傳信號(hào)和核苷酸序列》(GeneticsignalsandnucleotidesequencesinmessengerRNA)]。為了表達(dá)含弱核糖體結(jié)合位點(diǎn)的原核基因與真核基因[Sambrook等，(1989)《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》(Mo/ecw/wC7o"/wg:」丄avorato^Afam/a/)—書中《大腸桿菌中克隆基因的表達(dá)》(ExpressionofclonedgenesinEscherichiacoli.)]。啟動(dòng)子序列可以直接與DNA分子相連，在這種情況下，N末端的第一個(gè)氨基酸總是ATG起始密碼子編碼的甲硫氨酸。如果需要，可以通過(guò)與溴化氰體外培育或通過(guò)與細(xì)菌甲硫氨酸N末端肽酶體外或體內(nèi)培育切去蛋白的N末端甲硫氨酸(EP-A-0219237)。通常，細(xì)菌識(shí)別的轉(zhuǎn)錄終止序列是位于翻譯終止密碼子3'端的調(diào)控區(qū)，從而與啟動(dòng)子一起位于編碼序列的側(cè)翼。這些序列指導(dǎo)能翻譯成DNA編碼的多肽的mRNA轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄終止序列經(jīng)常包括能形成有助于終止轉(zhuǎn)錄的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的約50個(gè)核苷酸的DNA序列。實(shí)例包括源自含強(qiáng)啟動(dòng)子的基因，例如大腸桿菌^7基因以及其它生物合成基因的轉(zhuǎn)錄終止序列。通常，包括啟動(dòng)子、信號(hào)序列(如果需要)、感興趣的編碼序列以及轉(zhuǎn)錄終止序列的上述組分組合在一起形成表達(dá)構(gòu)件。表達(dá)構(gòu)件經(jīng)常維持在復(fù)制子中，例如能穩(wěn)定維持在諸如細(xì)菌等宿主中的染色體外元件(例如質(zhì)粒)。該復(fù)制子含有復(fù)制系統(tǒng)，從而能維持在原核宿主中表達(dá)或克隆和擴(kuò)增。此外，復(fù)制子可以是高拷貝數(shù)或低拷貝數(shù)質(zhì)粒。高拷貝數(shù)質(zhì)粒通常的拷貝數(shù)應(yīng)為約5到200之間、通常是約10到150個(gè)拷貝數(shù)。包含高拷貝數(shù)質(zhì)粒的宿主優(yōu)選應(yīng)包含至少約10個(gè)、更優(yōu)選至少約20個(gè)質(zhì)粒?？筛鶕?jù)載體和外來(lái)蛋白對(duì)宿主的影響選擇高拷貝數(shù)或低拷貝數(shù)載體?；蛘撸梢杂谜陷d體將表達(dá)構(gòu)件整合入細(xì)菌基因組。整合載體通常包含至少一段與細(xì)菌染色體同源從而允許其整合的序列。整合似乎是載體和細(xì)菌染色體的同源DNA之間重組的結(jié)果。例如，將用各種棒狀桿菌菌株的DNA構(gòu)建的整合載體整合入棒狀桿菌染色體(EP-A-0127328)。整合載體也可以包含噬菌體或轉(zhuǎn)座子序列。通常，染色體外的和整合的表達(dá)構(gòu)件可以包含可選擇標(biāo)記從而能選擇已轉(zhuǎn)化的細(xì)菌菌株?？蛇x擇標(biāo)記可以在細(xì)菌宿主中表達(dá)并可包含賦予細(xì)菌對(duì)諸如氨芐青霉素、氯霉素、紅霉素、卡那霉素(新霉素)和四環(huán)素等藥物的抗性的基因?？蛇x擇標(biāo)記也可包含生物合成基因，例如組氨酸、色氨酸和亮氨酸生物合成途徑中的那些基因。或者，上述有些組分可以一起置于轉(zhuǎn)化載體中。如上所述，轉(zhuǎn)化載體通常包含維持在復(fù)制子中的可選擇標(biāo)記或開(kāi)發(fā)成整合載體。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了用于轉(zhuǎn)化入多種細(xì)菌的表達(dá)和轉(zhuǎn)化載體，或是染色體外復(fù)制子或是整合載體。例如，特別開(kāi)發(fā)了以下細(xì)菌的表達(dá)載體枯草芽孢桿菌(^^7/Mw6"7,力[Palva等，(1982)尸rac.M^/.Jc"c/6X479:5582;EP-A-0036259和EP-A-0063953;WO84/04541]、大腸桿菌[Shimatake等，(1981)A^w"292:128;Amann等，(1985)Ge"e.40:183;Studier等，(1986)JMo/.B/o/,/卵,"3，'EP-A-0036776、EP-A-0136829和EP-A-0136907]、變鉛青鏈球菌0^印tococcw//v^a似)[Powe11等，(1988)^7/7/.￡>w>o".M/craWo/.5(655]、變鉛青鏈霉菌(S^e;tomycM//Wdara)[美國(guó)專利4,745,056]。將外源DNA引入細(xì)菌宿主的方法是本領(lǐng)域熟知的，通常包括用CaCb或諸如二價(jià)陽(yáng)離子和DMSO等其它試劑處理而轉(zhuǎn)化細(xì)菌。也可通過(guò)電穿孔將DNA引入細(xì)菌細(xì)胞。轉(zhuǎn)化方法常隨所轉(zhuǎn)化的細(xì)菌種屬而不同。參見(jiàn)例如[Masson等，(1989)尸五MSMifcTo6/o/.丄e".60:273;Palva等，(1982)尸rac.A^/v4cad.Sc/."&479:5582;EP-A-0036259和EP-A-0063953;WO84/04541，棒狀桿菌]、[Miller等，(1988)Prac.A^/.Jcfld55:856;Wang等，(1990)J^ac^7o/.772:949，弧桿菌]、[Cohen等，(1973)尸toc.A^L4c^&/.69:2110;Dower等，(1988)A^c/e/cA^ds76:6127;H.W.Boyer和S.Nicosia主編《遺傳工程遺傳工程國(guó)際論±云會(huì)議錄》(Ge"e"c五"gz'wem'"gviVocee&"g5o/AeMemWowa/S，pos7'應(yīng)o"Ge"e"c五"g/"em'"g)中Kushner(1978)所著《一種用Co正l來(lái)源質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌的改進(jìn)方法》(AnimprovedmethodfortransformationofEscherichiacoliwithColEl-derivedplasmids);Mandel等，(1970)/Mo/,53:159;Taketo(1988)5/oc/z/m.5/o;/^Jcto949:318;埃希氏菌]、[Chassy等，(1987)尸五MSM/cra6/o/丄""A173乳酸菌]、[Fiedler等，(1988)爿"a/.5/oc/zem770:38，假單胞菌]、[Augustin等，(1990)F五MSMfcra6/o/丄e".66:203，葡萄球菌]、[Barany等，(1980)J5a"eno/.144:698;J.Ferretti和R.Curtiss主編《鏈球菌遺傳學(xué)》(&re/7tococca/Gew^os)中Harlander(1987)所著《通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化乳鏈球菌》(TransformationofStreptococcuslactisbyelectroporation);Perry等，(1981)/"/e"Jwm肌32:1295;Powell等，(1988)^;/.五謂7w7M/croZ^'o/.54:655;Somkuti等，(1987)々/zCo"g.5fofec/z"o/ogy1:412，鏈球菌]。術(shù)語(yǔ)"包含"意味著"包括"以及"由...構(gòu)成"，例如"包含"X的組合物可以僅由X構(gòu)成，或可以包括其它物質(zhì)，例如X+Y。與數(shù)值x有關(guān)的術(shù)語(yǔ)"約"表示，例如X士100/0。"基本上"不排斥"完全地"，例如"基本上不含"Y的組合物可完全不含Y。需要時(shí)，"基本上"這個(gè)詞可以從本發(fā)明定義中省略。"序列相同性"優(yōu)選通過(guò)如MPSRCH程序(牛津分子公司(OxfordMolecular))所執(zhí)行的Smith-Waterman同源檢索算法測(cè)定，該算法使用參數(shù)為空位開(kāi)放罰分=12及空位延伸罰分=1的仿射(affine)空位檢索。血清群分類后，腦膜炎球菌的類型包括血清型、血清亞型和隨后的免疫型，標(biāo)準(zhǔn)命名法列出了血清群、血清型、血清亞型和免疫型，各自用冒號(hào)分隔，例如B:4:P1.15:L3,7,9。在血清群B中，有些譜系經(jīng)常引發(fā)疾病(高侵襲性)，有些譜系比其它譜系引發(fā)更嚴(yán)重形式的疾病(超毒性)，其它的根本很少引發(fā)疾病。已識(shí)別了7個(gè)超毒性譜系，即亞群I、III和IV-1、ET-5復(fù)合物、ET-37復(fù)合物、A4群落和譜系3。已經(jīng)通過(guò)多基因座酶電泳(MLEE)確定了這些譜系，但是多基因座序列分型(MLST)也已用于腦膜炎球菌的分類[參考文獻(xiàn)18]。4種主要的超毒性群落是ST32、ST44、ST8和ST11復(fù)合物。本發(fā)明一般不包括參考文獻(xiàn)4、5、7、8、9、10、11、12、13和203中專門披露的各種NMB1870序列，盡管這些NMB1870序列也可用于本發(fā)明，例如用于構(gòu)建嵌合序列，等等。本發(fā)明的實(shí)施方法參考文獻(xiàn)13披露了取代SEQIDNO:59，用作家族I、II和III的NMB1870嵌合體。通過(guò)取代產(chǎn)生的該肽含有以下鑒定的SEQIDNO:l的7個(gè)區(qū)域MNRTAFCCLSLTTAL工LTACSSGGGGVAAD工GAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKIiAAQGAEKTYGNGDSIjNTGKIjKNDKVSRFDFIRQIEVDGQIjITIjESGEFQVYKQSHSAIiTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGgGKIEHIiKSPELNVDIiAAADIKPDGKRHAVISGSVIiYNQAEKGSYSLG工FGGKAQEVAGSAEVKTVNgIRHIGLAAKQ〖S￡QID歡1》雖然該嵌合體能引發(fā)抗各種NMB1870家族腦膜炎球菌的殺細(xì)菌抗體，但抗家族II和家族III菌株的應(yīng)答總不高。通過(guò)組合各種方法，包括家族I多肽BC結(jié)構(gòu)域的NMR-衍生3D結(jié)構(gòu)，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)圍繞殘基162-168(第二個(gè)下劃線區(qū)域)的一片氨基酸在腦膜炎球菌MC58(家族I)與2996(家族II)之間保守。因此，這種取代在MC58多肽的表面產(chǎn)生了廣泛的2996-樣區(qū)域，這可以解釋為何含有該取代的嵌合體能引發(fā)抗家族II菌株的殺細(xì)菌應(yīng)答。第三下劃線區(qū)域的取代(ProAsn取代AlaGly)可能改變局部骨架構(gòu)型，引入高度剛性，從而改變多肽的折疊并降低殺細(xì)菌活性。根據(jù)(i)家族II內(nèi)的序列比對(duì)和(ii)家族內(nèi)血清交叉反應(yīng)性的比較，鑒定了能提高嵌合體引發(fā)良好抗-II反應(yīng)能力的許多氨基酸殘基。這些殘基是(a)根據(jù)NMR結(jié)構(gòu)，表面暴露的，因而是免疫可接近的；(b)在抗-2996血清無(wú)法殺傷的家族II菌株內(nèi)保守的；和(c)不處于疏水性袋內(nèi)的。根據(jù)SEQIDN0:2的編號(hào)，這些殘基是D121;D165;A180;G181;K183;T185;T187;A191;A192;H196;K198;A213;S234和G261。除了D121和D165外，這些殘基各自在對(duì)2996序列所產(chǎn)生的抗血淸具有抗性的三種菌株內(nèi)保守。對(duì)該三種菌株的一種D121是N，對(duì)該三種菌株的兩種D165是S。因此，改變SEQIDNO:57產(chǎn)生的SEQIDNO:60是全長(zhǎng)NMB1870序列的一部分。將SEQIDNO:57中的KLPEGGR7-聚體序列(SEQIDNO:61)用QLPDGK6-聚體(SEQIDNO:62)替代。因此，刪除了一個(gè)氨基酸。根據(jù)這兩條序列的比對(duì)結(jié)果，司—確定刪除的殘基是E51、G52、G53或R54。最終的結(jié)果并不取決于哪個(gè)殘基名義上據(jù)稱被刪除，而是根據(jù)參考文獻(xiàn)4中的比對(duì)結(jié)果，刪除的殘基最好是E51。審薪多嚴(yán)如參考文獻(xiàn)12所述，制備所有三種NMB1870家族的三-串聯(lián)(triple-tandem)多肽，其中從N-末端到C-末端這三個(gè)家族的次序?yàn)镮-III-II。含或不含C-末端組氨酸標(biāo)簽的該多肽引發(fā)了對(duì)含有家族I和ni的NMB1870的腦膜炎球菌良好的免疫反應(yīng)(通常可觀察到對(duì)100%的測(cè)試菌株血清殺細(xì)菌滴度21:128)，但對(duì)NMB1870家族II的菌株的反應(yīng)較弱(通?？捎^察到對(duì)60%的測(cè)試菌株滴度21:128)。具體地說(shuō)，利用串聯(lián)多肽的反應(yīng)低于利用三種不同蛋白質(zhì)的混合物。相反，n-ni串聯(lián)多肽得到良好的結(jié)果，因此家族II序列不是天生與該串聯(lián)表達(dá)方法不相容。對(duì)家族I和II的反應(yīng)至關(guān)重要，但家族III菌株較為罕見(jiàn)。為提高對(duì)家族II菌株的效力，目前采用了三種方法(a)改變家族次序，可以是I-II-III、II-in-I或II-I-III;(b)刪去了家族III序列，并將家族I和II表達(dá)為I-II或II-I;或(C)將家族I和II表達(dá)在"蛋白質(zhì)936序列"下游，即936-I-II或936-11-1。表達(dá)的這些多肽可含有各種接頭，前導(dǎo)肽等，可含有/不含C-末端聚-His標(biāo)簽。這三種方法的實(shí)施方式見(jiàn)SEQIDNO:27-38:<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>利用這些蛋白質(zhì)免疫小鼠。測(cè)試了不同的佐劑，包括完全弗氏佐劑、氫氧化鋁佐劑、MF59水包油乳劑和MF59與免疫刺激性寡核苷酸的混合物。采用殺細(xì)菌試驗(yàn)測(cè)試小鼠的血清?？傮w上，SEQIDNO:28和29是等效的。有時(shí)，SEQIDNO:34顯示活性優(yōu)于SEQIDNO:28。對(duì)于包含所有三個(gè)家族的蛋白質(zhì)，利用SEQIDNO:37通?？捎^察到最好的結(jié)果。選擇NMB1870家族I1的5種不同菌株M3153、M00-0243143、1000、NGH38和M0579。利用以下引物擴(kuò)增片段，將其插入pET大腸桿菌表達(dá)載體的A^7A7w/位點(diǎn)。這些序列擴(kuò)增為AG序列；在"嵌合AG(chimAG)"序列中，引物將SEQIDNO:66加到N-末端。正向引物提供A^e/位點(diǎn)；反向引物提供Z/w/位點(diǎn)。<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>裔游層甜70殷y可利用NMB1870的廣泛序列信息[例如，參考文獻(xiàn)4、7、8和10]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)其它新的NMB1870序列。這些序列是SEQIDNO:46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、63、64、65、86、87、88、89、卯、91、92、93和94。用菌株NM117測(cè)試了針對(duì)不同NMB1870蛋白質(zhì)所產(chǎn)生的血清。家族I、II或III的蛋白質(zhì)所產(chǎn)生的血清的殺細(xì)菌活性低于同源血清的。類似地，NM117序列所產(chǎn)生的血清抗NMB1870家族I、II或III菌株的BSA活性較低。應(yīng)該知道以上只是借助實(shí)施例描述了本發(fā)明，可作出改進(jìn)而依舊屬于本發(fā)明的范圍和構(gòu)思。參考文獻(xiàn)(其內(nèi)容通過(guò)引用的方式全文納入本文)Jodar等(2002)Lancet359(9316):1499-1508.[2]Pizza等(2000)Science287:1816-1820.WO99/57280.Masignani等(2003)JExpMed197:789-799.[5]Welsch等(2004)JImmunol172:5605-15.[6]Hou等.(2005)JInfectDis92(4):580-卯.[7]WO03/063766.Fletcher等(2004)InfectImmun72:2088-2100.[9]Zhu等(2005)InfectImmun73(10):6838陽(yáng)45.[10]WO01/64920.WO03/020756.[12]WO2004/048404.[13]WO2006/024954.Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48,443-453.[15]Rice等(2000)TrendsGenet16:276-277.Cartwight編的《腦膜炎球菌病》(Meningococcaldisease),ISBN:0-471-95259-1，第159-175頁(yè)，Achtman(1995)著《腦膜炎球菌病的全球流行病學(xué)》(Globalepidemiologyofmeningococcaldisease)。Caugant(1998)APMIS106:505-525.Maiden等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:3140-3145.問(wèn)WO01/303卯.Gennaro(2000)《雷明頓制藥科學(xué)與實(shí)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A-0680512.L192]WO02/062378.W099/59625.美國(guó)專利6,180,111.WO01/34642.WO03/051379.美國(guó)專利6,558,677.WO2004/019977.WO02/062380.WO00/258U.Peeters等(1996)Vaccine14:1008-1015.[202]Vermont等(2003)Infectlmmun71:1650-1655.2[203]WO2004/094596序列表簡(jiǎn)述<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>權(quán)利要求1.一種多肽，所述多肽含有的氨基酸序列與SEQIDNO57有至少70％相同，其中一個(gè)或多個(gè)以下殘基被另一氨基酸取代或刪除F14；T16；Q18；Q20；D21；S22；E23；H24；S25；G26；K27；K31；Q33；R35；136；G37；139；K48；E51；G52；R54；T56；A67；G68；K70；T72；A78；A79；N83；K85；D97；D102；P105；G107；R109；S114；S116；L118；N120；Q121；A122；K135；T147；V148；N149；G150；I151；R152；H153。2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，至少一個(gè)以下殘基被取代或刪除F14;T16;Q18;Q20;D21;S22;E23;H24;S25;G26;K27;K31;Q33;R35;136;G37;K48;E51;G52;R54;T72;A79;K85;P105;G107;R109;Ll18;N120;Q121;A122;T147;V148;N149;G150:1151;R152;H153。3.如權(quán)利要求2所述的多肽，其特征在于，E51被刪除。4.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，至少一個(gè)以下殘基被取代F14;T16;Q18;K31;Q33;R35;136;G37;139;T56;K70;T72;A78;A79;K85;D97;D102;Sl14;S116;L118;K135。5.如權(quán)利要求2或4所述的多肽，其特征在于，所述多肽包含選自以下的取代F14L;T161;Q18K;Q20N;D21N;S22P;E23D;II24K;S25I;S25T;G26D;K27S;K31Q;Q33S;R35L;I36V;G37S;I39L;K48Q;G52I);R5復(fù)；T56E;A67P;G68N;K70R;T72H;A78T;A79K;N83H;N83Y;K85R;D97E;D102E;P105A;G107E;R109S;S114L;S116D;L118R;N120G;Q121S;A122E;K135R;T147I;V148G;N149E;G150K;I151V;R152H;H153E。6.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的多肽，其特征在于，所述氨基酸序列與SEQIDNO:57有至少80%相同。7.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的多肽，其特征在于，所述氨基酸序列與SEQIDNO:57有至少90%相同。8.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的多肽，其特征在于，所述多肽包含選自以下的氨基酸序列SEQIDNO:58、SEQIDNO:59或SEQIDNO:60。9.一種多肽，其包含修飾的NMB1870第一家族的氨基酸序列，其中所述修飾的氨基酸序列包含NMB1870第二家族的至少一個(gè)(例如，1、2、3、4、5、6或7個(gè))表面環(huán)序列而取代了第一家族的表面環(huán)序列。10.—種多肽，其包含以下氨基酸序列-B1-L1-B2-L2-B3-L3-B4-L4-B5-L5-B6-L6-B7-L7-B8-L8-B9-此序列中(a)所述Bl、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8禾0B9各自是(i)SEQIDNO:.M的片段；或(ii)與(i)所述片段有至少75%序列相同性和/或包含(1)所述片段的至少10個(gè)毗連氨基酸的片段的氨基酸序列；和(b)所述Ll、L2、L3、L4、L5、L6、L7禾口L8各自是(i)SEQIDNO:l、SEQIDNO:2禾U/或SEQIDNO:3的片段；或(ii)與(i)所述片段有至少75%序列相同性和/或包含(i)所述片段的至少.0個(gè)毗連氨基酸的片段的氨基酸序歹ij，前提是所述.Ll、L2、L3、L4、L5、L6、L7和L8中至少一個(gè)不是SEQIDNO:M的片段，其中M是1、2或3,而B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8、B9、Ll、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8根據(jù)M選自以下SEQIDN0:M內(nèi)的氨基酸坐標(biāo)<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>11.權(quán)利要求10所述多肽的片段，前提是該片段包含Ll、L2、L3、L4、L5、L6、L7禾U/或L8中的至少一個(gè)和Bl、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8和/或B9中兩個(gè)或多個(gè)的至少一個(gè)氨基酸。12.—種多肽，所述多肽包含權(quán)利要求10或11所述的以下嵌合氨基酸序列-Bl-Ll-B2-L2-B3-L3-B4-L4-B5-L5-B6-L6-B7-L7-B8-L8-B9-，所述多肽還包含與所述嵌合序列的N-末端或C-末端相連的NMB1870序列，其中所述NMB1870序列與SEQIDNO:M為同一NMB1870家族。13.—種如下式所示的雜交多肽-A-[X-L-]n-B-式中X是包含奈瑟球菌序列的氨基酸序列，L是任選的接頭氨基酸序列，A是任選的N末端氨基酸序列，B是任選的C末端氨基酸序列，n是2或更高，其中至少一個(gè)-X-部分是NMB1870序列。14.如權(quán)利要求13所述的雜交多肽，其特征在于，所述雜交多肽包含選自以下的氨基酸序列SEQIDNO:27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39和40。15.如權(quán)利要求13所述的雜交多肽，其特征在于，所述至少個(gè)-X-部分與SEQIDNO:95有至少90%序列相同性。16.—種多肽，所述多肽包含選自以—'F的氨基酸序列SEQIDNO:46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、86、87、88、89、90、91、92、93和94。全文摘要NMB1870是腦膜炎奈瑟球菌的一種蛋白質(zhì)。已知NMB1870有三個(gè)家族。為增強(qiáng)NMB1870蛋白質(zhì)引發(fā)在家族之間有交叉反應(yīng)性的抗體的能力，工程改造了NMB1870?？捎靡粋€(gè)NMB1870家族的序列取代另一家族的相應(yīng)位置。不同家族的NMB1870蛋白質(zhì)序列可彼此相連。文檔編號(hào)C12N15/62GK101356274SQ200680050927公開(kāi)日2009年1月28日申請(qǐng)日期2006年11月27日優(yōu)先權(quán)日2005年11月25日發(fā)明者M(jìn)·斯卡塞利,M·朱利亞尼,M·皮扎,R·拉普奧里,V·馬西格納尼申請(qǐng)人:諾華疫苗和診斷有限公司