專利名稱：對(duì)映體選擇性酶還原羥基酮化合物的方法
對(duì)映體選擇性酶還原羥基酮化合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉^X寸映體選擇性酶還原通式I之羥基酮的方法:
<formula>formula see original document page 5</formula> (I)
所述通式I中，R1=C1-C6烷基，R2=Cl,-CN,-OH,-H或者d-C6烷基，以得到通式n的手性二醇
<formula>formula see original document page 5</formula> (II)
其中&與R2與通式I中的含義相同，在輔因子的條件下，用氣化還原酶還 原羥基酮。
通式n的手性二醇是藥品生產(chǎn)，特別是固G-CoA-還原IIW制劑生產(chǎn)過(guò)程 中的重要中間化合物。所述手性二醇是例如叔-丁萄3民5S)-6-氯-3,5--二羥基己酸 酉旨、叔-丁對(duì)3R,5R》6-氰基-3,5-二羥基己酸酯或者叔-丁與5S,3R)-3,5,6-三羥基己酸酯。
這種類型的二醇特別是MilX寸映體選擇性還原相應(yīng)的通式I羥基酮，例如叔
-丁對(duì)511)-6-氰基-5-羥基-3-氧代己酸酯、叔-丁對(duì)5S)A氯-S-羥基-3-氧代己酸酯 或者叔-丁基(5S)-5,6-二羥基-3-氧代己酸酯而形成。這種化學(xué)催化還原反應(yīng)的缺 點(diǎn)是， 一方面，苛刻的反應(yīng)條件會(huì)形成副產(chǎn)物，另一方面，形成不需要的對(duì)映 體或者非對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量，并且該技術(shù)的成本非常高。
由于上述原因，人們一直在^^索生物催化方法，以便用所述方法對(duì)映體選擇 性還原所述的羥基酮。生物催化方法通常在溫和的條件下完成，期待著在沒(méi)有 進(jìn)一步的副產(chǎn)物形成的情況下，還原已經(jīng)很不穩(wěn)定的5-羥基-3-氧代己酸酯衍生 物。但是，迄今一直沒(méi)有找到適宜的生物催化劑，用所述催化劑能夠有效地酶促還原所述的5-羥基-3-氧代己酸酯并且是用分離的酶。
美國(guó)專利6001615和國(guó)際專利申請(qǐng)W001/85975 Al例如描述了用來(lái)自白僵 菌(Beauvana)、 Pichia、念珠菌、克魯維酵母菌、Torulaspora的不同酵母還原叔-丁S(5R)-6-氰基-5-羥基-3-氧代己酸酯或者者叔-丁與5S)-5,6-二羥基-3-氧代己酸 酯的方法。但是所述轉(zhuǎn)化使用野生菌株的整個(gè)細(xì)胞，并且在遠(yuǎn)低于5%的很小濃 度下完成。這是由于迄今為止，尚未鑒定出與轉(zhuǎn)化有關(guān)的酶以及其DNA序列。
此外，在EP 0569 998 Bl中描述了微生物轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)相似的化合物。其中從 Acinetobacter calcoaceticus ATCC 33305中純化了 NADH依賴性酶，并以與葡萄 糖脫氫酶一起分離的形式，用于輔酶再生。在所述方法中，所述底物的濃度為 1%， NADH的"總轉(zhuǎn)化數(shù)"僅為10。因此，尚未描述適于工業(yè)應(yīng)用的方法。
在美國(guó)專利6645746 Bl中公開(kāi)了 Candida magnoliae的一種氨基酸序列，用 所述氨基,列可以有助于NADPH還原叔-丁對(duì)5S)-6-氯-5-羥基-3-氧代己酸酉旨 至叔-丁對(duì)3民5S)-6-氯-3,5-二羥基己酸酯。在該文獻(xiàn)的說(shuō)明書(shū)中，"謎將所述酶 與共表達(dá)的巨大芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶一起使用，葡萄糖脫氫酶有助于輔因 子NADPH的再生，且葡萄糖作為共底物而產(chǎn)生。
本發(fā)明面對(duì)該任務(wù)，提供了一種方法，該方法可以經(jīng)濟(jì)地以高產(chǎn)率和高對(duì)映
體純度，且沒(méi)有副產(chǎn)物而產(chǎn)生通式n的純對(duì)映體二醇。
根據(jù)本發(fā)明，由前述類型的方法而完成了所述任務(wù)，即在NADH或者 NADPH作為輔因子的條件下，通過(guò)氧化還原酶還原而實(shí)現(xiàn)，其特征在于，其中，
a) 羥基酮在反應(yīng)混合物中的濃fe50g/1，
b) fflMil式RxRYCHOH的二級(jí)醇氧化持續(xù)再生所得的氧化輔因子NAD或 者NADP，其中RxRy彼此獨(dú)立是氫、支鏈或者無(wú)支鏈d-C8烷基且C,g、^3， 禾口
c) 羥基酮的還原和二級(jí)醇的氧化由相同的氧化還原酶催化。 因此，所述方法《腿實(shí)施方案的特征在于，所述氧化還原酶
a) 含有氨基酉游列，其中至少50%的氨基酸與氨基 列SEQ ID NO:l、 SEQIDNO:8、 SEQIDNO:ll或者SEQIDNO:14的那些相同，
b) 由SEQIDNO:2、 SEQIDNO:3、 SEQIDNO:9、 SEQIDNO:10、 SEQED NO:12、 SEQIDNO:13或者SEQIDNO:15的核酸序列編碼，或者
c) 由在嚴(yán)格^f牛下，與SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO:3、 SEQ ID NO:9、 SEQ IDNO:IO、 SEQIDNO:12、 SEQIDNO:13或者SEQIDNO:15雜交的核,列編 碼。
根據(jù)本發(fā)明，，任務(wù)還可以Mil前述類型的方法完成，其中，所用氧化還 原酶
a) 含有氨基酸序列，其中至少50%的氨基酸與氨基酸序列SEQ ID NO:l、 SEQE)NO:8、 SEQIDNO:ll或者SEQIDNO:14的那些相同，
b) 由SEQIDNO:2、 SEQIDNO:3、 SEQDDNO:9、 SEQK)NO:IO、 SEQID NO:12、 SEQIDNO:13或者SEQIDNO:15的核,列編碼，或者
c) 由在嚴(yán)格^[牛下，與SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:9、SEQID NO:IO、 SEQIDNO:12、 SEQ ID NO:13或者SEQ ID NO:15雜交的核酸序列編 碼。
已發(fā)現(xiàn)具有SEQIDNO:l、 SEQ IDNO:8和SEQ E)NO:ll氨基酸序列的多 肽具有氧化還原酶活性，并可用于以>99%的非對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量將叔-丁教511)-6-氰基-5-羥基-3-氧代己酸酯還原為叔-丁萄3R，5R)-6-氰基-3,5-二羥基己酸酯。用同 樣的方法，用SEQIDNO:l、 SEQ IDNO:8和SEQ IDNO:ll氨基酸序列可以還 原通式I的其他羥基酮。
另外，所述氧化還原酶所具有的優(yōu)點(diǎn)是，能夠?qū)⒃谶€原反應(yīng)過(guò)程中形成的氧 化的輔因子，通過(guò)二級(jí)醇的還原而再生。即，所述氧化還原酶的一種特別經(jīng)濟(jì) 的優(yōu)點(diǎn)也是，與現(xiàn)有技術(shù)的方法(US6645746B和EP0569998B)相比，不必再用 其他酶使輔因子再生。
編碼SEQ ID NO: 1之多肽的DNA序列SEQ ID NO:2例如來(lái)自喜木聚糖紅色 桿菌(Rubrobacterxylanophilus) DSM9941的基因組。此外，還發(fā)現(xiàn)，可以用 DNA序列SEQ ID NO:3 ，以便在大腸桿菌中表達(dá)SEQ ID NO: 1的多肽。
編碼SEQ ID NO:8之多肽的DNA序列SEQ ID NO:9例如來(lái)自Geobacillus thermodenitrificans DSM 465的基因組。此夕卜，還發(fā)現(xiàn)，可以用DNA序列SEQ ID NO:IO，以便在大腸桿菌中表達(dá)SEQIDNO:8的多肽。
編碼SEQ ID NO: 11之多肽的DNA序列SEQ ID NO: 12來(lái)自橙色綠屈撓菌 DSM 635的基因組。
編碼SEQ ID NO:14之多肽的DNA序列SEQ ID NO:15來(lái)自Candida magnoliaeCBS 6396。因此，本發(fā)明還涉及用氨基鵬列SEQIDNO:l、 SEQ ID NO:8、 SEQ ID NO:ll或者SEQIDNO:14之多肽，或者含有與氨基酸序列SEQE)NO:l、 SEQ IDNO:8、SEQIDNO:11或者SEQE)NO:14的氨基酸序列有至少50%的同一性 的氨基 列的多肽，即Mil取代、插入、缺失或增加SEQIDNOl、 SEQID NO:8、 SEQIDNO:ll或者SEQIDNO:14的至少一個(gè)氨基酸而獲得的多肽，或 者用由SEQIDNO:2、 SEQIDNO:9、 SEQ IDNO:12或者SEQIDNO:15的核苷 辦列，或者由與SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:9、 SEQ ID NO:12或者SEQ ID NO:15的核苷辦列在嚴(yán)格剝牛下雜交之核苷f(shuō)游列編碼的多肽，將通式I的羥
基酮還原^ffi式n的二醇的方法。
例如在嚴(yán)格^#下與SEQ ID NO:2雜交的核苷,將列應(yīng)理解為，是指用SEQ IDNO:2作為探針，ffiil菌落雜交方法、噬菌斑雜交方法、Southern雜交法或者 類似的方法可以鑒定的多核苷酸。
為此目的，在0.7-1 MNaCl溶液中，6CTC，將在過(guò)濾器上固定的多核苷酸與 SEQIDNO:2雜交。用描述于例如，分子克隆(MolecularCloning)，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)， 第二版(Cold Spnng Harbor Laboratory Press, 1989)或者類似文獻(xiàn)中的方法，完成 所述雜交。最后，用0.1-2倍SSC溶液，于65。C沖洗所述過(guò)濾器，其中，1倍SSC 溶液是一禾中混合物，由150 mM NaCl和15mM檸檬酸,內(nèi)組成。
根據(jù)本發(fā)明方法，含SEQIDNO:l、 SEQIDNO:8、 SEQIDNO:ll或者SEQ IDNO:14序列之多肽，或者由所述多肽衍生的多肽可以以完全純化、部分純化 或者以含SEQIDNO:l、 SEQEDNO:8、 SEQIDNO:ll或者SEQEDNO:14多肽 之細(xì)胞的形式使用。這里所用的細(xì)胞可以是天然的、滲透性的或者溶解形式。 4腿在一種適宜的宿主生物，例如大腸桿菌中，過(guò)表達(dá)含有SEQIDNO:l、 SEQ IDNO:8、 SEQIDNO:ll或者SEQIDNO:14序列的多肽或者其衍生物，然后用 重組多肽還原通式I的羥基酮。
每公斤待轉(zhuǎn)化的通式I的化合物使用5000至10 Mo U氧1極原酶SEQ ID NO: 1 、 SEQ ID NO:8、 SEQ ID NO: 11或者SEQ ID NO: 14或其衍生物(如上所公 開(kāi)的)。這里酶單位1U是每為H中(mm)轉(zhuǎn)化Wmol式I的羥基酮所需要的酶量。
根據(jù)本發(fā)明的酶促還原反應(yīng)在溫和的條件一F進(jìn)行，使得通常不穩(wěn)定的羥基酮 的P絲狩口因此不需要的副產(chǎn)物的形成可以在很大程度上受到抑制。根據(jù)本發(fā)明 方法，手性二醇形成的時(shí)間長(zhǎng)，且非對(duì)映異構(gòu)體的純度通》99%。本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的特征在于，在所述方法中用共底物持續(xù)地還原所用的 輔因子。
f腿用NAD(P)H作為輔因子，其中在還原反應(yīng)中形成的NAD(P)由共底物 再次還原成NAD(P)H。
這里，優(yōu)選用二級(jí)醇，例如2-丙醇、2-丁醇、2-戊醇、3-戊醇、4-甲基-2-戊 醇、2-庚醇、2-辛醇或者環(huán)己醇作為共底物。根據(jù)特另iH雄的實(shí)施方案，將2-丙醇用于輔酶再生。再生所用的共底物含量可占總體積的5-95 Vd%。
同樣例如用含有SEQ IDNO:l、 SEQ ID NO:8、 SEQ IDNO:l 1或者SEQ ID NO: 14的多肽完成輔酶再生。
根據(jù)本發(fā)明方法，j繼通式I的羥基酮占總體積的5重:1%-50重*%(50 g/l-50g/l)，優(yōu)詵8重#%-40重#%，更{^10重:1%-25重:1%。
一^#別{雄的實(shí)施方案的特征在于，用叔-丁與511)-6-氰基-5-羥基-3-氧代 己酸酯、叔-丁與SS)-6-氯-5-羥基-3-氧代己酸酯或者叔-丁教58)-5,6-二羥基-3-氧 代己酸酯作為通式I的羥基酮。
優(yōu)選本發(fā)明方法在水-有機(jī)兩相系統(tǒng)中完成。
其中進(jìn)行酶促還原反應(yīng)的反應(yīng)混合物的水部分，優(yōu)選含有pH為5-]0，優(yōu)選 pH6-9的緩沖液，例如磷酸鈣-、Tns/HCl-或者三乙醇胺-緩沖液。為了穩(wěn)定或者 激舌酶，所述緩沖液還可以含有離子，例如鋅離子或者鎂離子。
合適地，本發(fā)明方法的反應(yīng)溫度為大約1(TC-70°C，優(yōu)選2(TC-45"C。
在本發(fā)明方法進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酶促轉(zhuǎn)化在與水不混溶或僅與 水有限可混溶的有機(jī)溶齊碎在下進(jìn)行。所述旨提例如對(duì)稱或者不對(duì)稱二(CVQO 烷基醚，直鏈(geradkettiges)或者支鏈烷或者環(huán)j:完或者水溶性二級(jí)醇，同時(shí)，形 成共底物。優(yōu)選的有機(jī)溶劑是乙醚、叔-丁基甲基醚、二異丙基醚、二丁基醚、 乙酸丁酯、庚烷、己垸、2-辛醇、2-庚醇、4-甲基-2-戊醇和環(huán)己醇。后者所述二 級(jí)醇的情況下溶齊阿同時(shí)可作為共底物使輔因子再生。
在加入水溶性溶劑或者共底物時(shí)，反應(yīng)混合物由水和有機(jī)相組成。所述羥基 酮根據(jù)其相應(yīng)的溶解性分散在有機(jī)相和水相之間。所述有機(jī)相通常占總反應(yīng)體 積的5-95%， <魏]0-90%比例。tt^將所述兩個(gè)液相進(jìn)行機(jī)械混合，這樣在兩 相之間形成一個(gè)大上層。例如在本實(shí)施方案中，酶促還原反應(yīng)形成的NAD還可 用共底物，如上所述，再還原成NADH。輔因子，特別是NADH或者NADPH在水相中的濃度通常為0.001 mM-10 mM，特別是0.01mM-lmM。
根據(jù)本發(fā)明方法，還可以使用氧化還原藤脫氫酶的穩(wěn)定劑。適宜的穩(wěn)定劑 是例如甘油、山梨醇、1,4-DL-二硫蘇糖酉l(DTT)或者二甲亞P(DMSO)。
本發(fā)明方法例如在密封的玻璃或者金屬反應(yīng)容器中完成。所述組分分別轉(zhuǎn)移 到所述反應(yīng)容器中，并在氣體，例如氮?dú)饣蚩諝庀聰嚢琛?br> 根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步可能的實(shí)施方案，可以將氧化的共底物(例如丙,不斷除
去，禾n/或不斷補(bǔ)充新的共底物(例如2-丙,，以便反應(yīng)向反應(yīng)產(chǎn)物(通式n的二
酉D方向進(jìn)行。
在另一實(shí)施方案中，在反應(yīng)過(guò)程中逐漸加入SEQIDNO:l、 SEQIDNO:8、 SEQIDNO:ll或者SEQIDNO:14的氧化還原HSV或共底物。
反應(yīng)結(jié)束后，處理反應(yīng)混合物。如果需要，將7]C相與有機(jī)相分離，然后過(guò)濾 含產(chǎn)物的有機(jī)相。如果需要還可以提取水相，如同進(jìn)一歩處理有機(jī)相一樣。然
后，蒸發(fā)有機(jī)相的纟輸(」，其中含有作為粗產(chǎn)物的通式n的二s享?？梢赃M(jìn)一步純
化所述粗產(chǎn)物，或者直接用于下面產(chǎn)物的合成。
下列實(shí)施例將用于進(jìn)一歩說(shuō)明本發(fā)明。 實(shí)施例1
從喜木聚糖紅色桿菌DSM9941中克隆氧化還原酶
A) 培養(yǎng)喜木聚糖紅色桿菌DSM9941
在細(xì)菌振蕩培養(yǎng)箱中，將喜木聚糖紅色桿菌DSM9941細(xì)胞于50。C(pH7.2)， 以140rpm，在下列介質(zhì)中培養(yǎng)0.1%酵母提取物、0.1%Tiypton、 0.004%CaSO4 x2H20、 0.02% MgCl2 x6H20、 0.01%次氮基三乙酸、100 mg磷ltfe緩沖液[5.44 g/1 KH2P04,43 g/1 Na2HP04 xl2H20]、 500(il/l 0.01 M檸檬酸鐵、500^/1示蹤元素 [500jul/l H2S04, 2.28 g/1 MnS04 x H20, 500 mg/1 ZnS04 x7 H20, 500mg H3B03, 25
CuS04 x 5 H20,25mg/l Na2Mo04 x2 H20,45 mg/1 CoCl2 x 6 H20]。在培養(yǎng)第6 天后，將培養(yǎng)介質(zhì)離心分離細(xì)胞，然后于-80。C貯存。
B) 擴(kuò)增編碼選擇性氧化還原酶的基因
按照Manniatis & Sambrook在"分子克隆"中的描述方法提取基因組DNA。 用所得的核酸作為聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)反應(yīng)的模板，這里4OT NCBI數(shù)據(jù)庫(kù) 中46106817公開(kāi)的基因序列衍生的特^i性引物。這里，引物在5'-末端提供有用于核酸內(nèi)切酶Nole 1和Hind m的限制性切割位，以用于隨后克隆到表達(dá)載 體。(SEQIDNO:4、 SEQIDNO:5、 SEQIDNO:7)。
在PCR緩沖液[IO mM Tns-HCl,(pH8.0); 50 mM KC1; 10 mM MgS04; lmM dNTP Mix;每20 pMol引物和2.5 U鉑Pfe DNA聚合酶(Invitrogen)]中，使用 500ng基因組DNA和下列溫度循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增 循環(huán)l: 94°C， 2分鐘
循環(huán)2x30: 94°C， 15秒 54°C， 30秒 68。C， 60秒 循環(huán)3: 68°C， 7分鐘
4°C， oo
所得大小約750 bp的PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠純化后，用核酸內(nèi)切酶Nde I和Hindm或者Sphl和Hind m限制切割，然后與用相同核酸內(nèi)切酶處理過(guò)的 pET21a載體主M(Novagen)或者PQE70載俠Qmgen)連接。轉(zhuǎn)化2|iil連接液至大 腸桿菌Top 10F鄰胞(I而trogen)后，用核酸內(nèi)切酶Nde I和Hind m或者Sphl和 Hind m限制分析檢測(cè)質(zhì)粒-DNA-氨芐青霉素-抗性菌落，檢測(cè)750 bp大小的插 入片段的存在情況。對(duì)來(lái)自對(duì)所述片段正性的菌落的質(zhì)粒制備物進(jìn)行序列分析， 然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21菌株(Invitrogen)或者大腸桿菌RB791 (genetic stock, Yale)。 實(shí)施例2
在大腸桿菌細(xì)胞中有效表達(dá)SEOIDNO:1多肽
為了在大腸桿菌細(xì)胞中有效表達(dá)SEQ ID NO:l多肽，為了在表達(dá)載體中克 隆，用編碼DNASEQE)NO:3作為PCR反應(yīng)中的模板。所述DNA序列與前述 DNA序歹U(SEQ IDNO:2)的前160個(gè)堿基對(duì)有51個(gè)堿基不同。所述修飾是保守 的，不會(huì)改變氨基gg/^列。
在含50 ng DNA SEQ ID NO:3作為模板的PCR緩沖液[IO mM Tns-HCl, (pH8.0); 50 mM KC1; ]0 mM MgS04; lmM dNTP Mix;每20 pMol弓l物(SEQ ID NO:6、 SEQ ID NO:5)和2.5 U鉑Pfe DNA聚合SI(Invi加gen)]中，按下列溫i芰循 環(huán)完成擴(kuò)增循環(huán)l: 94°C， 2^|中
循環(huán)2x30: 94°C， 40秒
56°C， 30秒
68°C， 60秒 循環(huán)3: 68°C， 7分鐘
4。C， oo
所得大小約750bp的PCR產(chǎn)物用P/o瓊脂撒!搬純化后，用核酸內(nèi)切酶Nde I和Hindin在與用相同核酸內(nèi)切酶處理過(guò)的pET21a載^(Novagen:)主鏈中連接。 轉(zhuǎn)化2pl連接液至大腸桿菌Top 10F細(xì)胞(Invi加gen)后，用核酸內(nèi)切酶Nde I和 Hind m限制分析檢測(cè)質(zhì)粒-DNA-氨節(jié)青霉素-抗性菌落，檢測(cè)750 bp大小的插 入片段的存在情況。對(duì)來(lái)自對(duì)所述片段正性的菌落的質(zhì)粒制備物進(jìn)行序列分析， 然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21菌株(Invitrogen) 實(shí)施例3
來(lái)自喜木聚糖紅色桿菌DSM 9941的氧化還原酶的制備
將表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株BL21 Star(Invitrogen, Kadsmhe，德國(guó))或 者RB791C大腸桿菌genetic stocky Yale， USA)在含氨芐青霉素i:50 1^ml)的i音養(yǎng)基 (1% Tiyptone, 0.5%酵母提取物，1% NaCl)中培養(yǎng)，直到光密度可達(dá)到0.5在 550nm下測(cè)量。M加入O.l mM異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)重組蛋白的表 達(dá)。在25。C， 220rpm誘導(dǎo)后16小時(shí)，收集細(xì)胞，并冷凍于-2(TC。
為了進(jìn)行Slfe取，將30g細(xì)胞懸浮于150 ml三乙醇胺緩沖液(IOO mM, pH=7, 2 mMMgCb, 10%甘油)中，然后用高壓勻漿機(jī)分解。然后，將所述酶溶液用bOmJ 甘油混合，并于-2(TC貯存。
將這樣獲得的酶溶液用于合成叔-丁與3民511)-6-氰基-3,5-二羥基己酸酯。
在稀釋的情況下，所得的酶溶液也用于相應(yīng)的酶領(lǐng)糧?；钚詸z測(cè)按如下870 tinOOmMTEA-緩沖液，pH7.0,160昭NAD(P)H,10pl稀釋的細(xì)胞溶解物。i131 向反應(yīng)混合物中加入100夂il 100 mM叔-丁與SR)"6-氰基-S-羥基-3-氧代己酸酯溶 液而啟動(dòng)反應(yīng)。 實(shí)施例4
用氧化還原酶SEO ID NO:l將叔-丁對(duì)5RV6-氰基-5-羥落3-氧代己酸酯轉(zhuǎn)化為 叔-丁掛3R5R)-6-氰基-3,5-二羥基己酸酉旨為了將叔-丁對(duì)5R)-6-氰基-5-羥基-3-氧代己酸酯轉(zhuǎn)化為叔-丁對(duì)3民5R)-6-氰 基-3,5-二羥基己酸酯，按Eppendorf反應(yīng)設(shè)備中，將由下列物質(zhì)組成的混合物在 室溫恒定混合下培養(yǎng)24小時(shí)900^緩沖液(100mMTEA^pH二7,lmMMgCl2)，
2-丙醇、10nl叔-丁對(duì)5R)-6-氰基-5-羥基-3-氧代己酸酯粗產(chǎn)品(對(duì)映異構(gòu)體 純度〉99%)、 0.1mgNAD和100pl酶懸浮液(見(jiàn)實(shí)施例3)。 24小時(shí)后，96%所用 叔-丁對(duì)5R)^6-氰基-5-羥基-3-氧代己酸酯還原為叔-丁S(3民5R)-6-氰基-3,5-二羥 基己酸酯。剩余非對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量〉99%。
用手性氣相色譜跟蹤測(cè)定轉(zhuǎn)化率以及非對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量。為此，使用 Shimadzu的Gax-Chromatograph GC-17A，其帶有手性分離柱CP-Chirasil-DEX CB(Varian Chrompack^ Darmstadt德國(guó)),Flammen-Ionisations-Detektor，用氮作為 載氣。
在0.72bar,10勿H中，50°C， 5。C/么H中—200°C 10 ^1中分離叔-丁基-6-氰基-3，5-
二羥基己酸酯。
保留時(shí)間為(R-BCH)4.4勿H中；(民R-BCH)47.1 5H沖和(R,S-BCH)48.2力H中。
實(shí)施例5
用氧化還原酶SEO ID NO:l從叔-丁掛5RV6-氰^5-羥基3-謝t己酸酯合成為 叔-丁教3民5R)-6-氰基-3,5-二羥基己酸酯
為了進(jìn)一步將叔-丁基(5R》6-氰基-5-羥基-3-氧代己酸酯轉(zhuǎn)化成為叔-丁基 (3艮5R)-6-氰基-3,5-二羥基己酸酯，在Eppendorf反應(yīng)設(shè)備中，將由下列物質(zhì)組 成的混合物培養(yǎng)550^1緩沖液(100mMTE夂pH-7,lmMMgCl2)， 150^12-丙醇、 200M1叔-丁萄511>6-氰基-5-羥基-3-氧代己酸酯粗產(chǎn)品(對(duì)映異構(gòu)體純度>99%)、 0.1 mgNAD和200 ^l酶懸浮液(見(jiàn)實(shí)施例3)。在反應(yīng)過(guò)程中，產(chǎn)生的丙S/2-丙 醇混合物多次通入氮?dú)庹舭l(fā)，并加入新鮮的2-丙醇和5(Vl酶。24小時(shí)內(nèi)重復(fù) 2-3次后，>90%的所用叔-丁.對(duì)511)-6-氰基-5-羥基-3-氧代己酸酯被還原為叔-丁 教3民5R)-6-氰基-3，5-二羥基己酸酯。非對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量>99%。 實(shí)施例6
艦氧化還原酶SEO ID NO:l從叔-丁教5R)-6-氰基-5-羥基-3-氧代己酸酯合成 叔-丁掛3FL5RV6-氰基-3,5-二羥基己酸酯
為了進(jìn)一歩將叔-丁基(5R)-6-氰基-5-羥基-3-氧代己酸酯轉(zhuǎn)化為叔-丁基 (3民5R)-6-氰基-3,5-二羥基己酸酯，在反應(yīng)容器中，在45°?！绤痧B(yǎng)下列混合物6.7ml緩沖液(100mMTE入pH^)， 1.7ml2-丙醇、2 ml叔-丁對(duì)5R)-6-氰基-5-羥基 -3-氧代己酸酯粗產(chǎn)品(對(duì)映異構(gòu)體純度>99%)、 1.0 mg NAD和150 mg冷凍的大 腸桿菌BL21菌株細(xì)胞，所述細(xì)胞中含氧化還原酶SEQ ID NO:l(見(jiàn)實(shí)施例3)。 24小時(shí)后，>90%的所用叔-丁對(duì)5!1>6-氰基-5-羥基-3-氧代己酸酯被還原為叔-丁教3民5R)-6-氰基-3,5-二羥基己酸酯。非對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量〉99%。 實(shí)施例7
M31氧化還原酶SE0 ID NO:8 H丁掛5R)-6-氰基-5-羥基-3-氧代己酸酯合成 叔-丁敏3R5R)-6-氰基-3,5-二羥基己酸酯
為了進(jìn)一步將叔-丁基(5R)-6-氰基-5-羥基-3-氧代己酸酯轉(zhuǎn)化為叔-丁基 (3民5R)-6-氰基-3，5-二羥基己酸酯，在反應(yīng)容器中，在40。C保溫下列混合物5.0 ml緩沖液(IOO mM TEA^ pH=7.5)， 2.0 ml 2-丙醇、4.0 ml叔-丁萄5R)-6-氰基-5畫(huà) 羥基-3-氧代己酸酉旨粗產(chǎn)品(對(duì)映異構(gòu)體純度〉99%)、 1.0 mg NAD和250 mg冷凍 大腸桿菌RB791菌株細(xì)胞，所述細(xì)胞中含氧化還原酶SEQIDNO:8(見(jiàn)相應(yīng)實(shí)施 例2和3)。 24小時(shí)后，>90%的所用叔-丁與511)-6-氰基-5-羥基-3-氧代己酸酯被 還原為叔-丁與3R,5R)-6-氰基-3,5-二羥基己酸酯。非對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量>99%。 實(shí)施例8
通過(guò)氧化還原酶SEO ID NO: 11從叔-丁掛5R)-6-氰基-5-羥基-3-氧代己酸酯合成 叔-丁敏3R5IQ-6-氰基-3,5-二羥基己酸酯
為了將叔-丁對(duì)511)-6-氰基-5-羥基-3-氧代己酸酯轉(zhuǎn)化為叔-丁對(duì)3民511)-6-氰 基-3,5-二羥基己酸酯，在Eppendorf反應(yīng)容器中，在室溫且恒定混合下，保溫下 列混合物48小時(shí)350 jil緩沖液(100mM磷酸藥,pH二7)， 150 jnl 2-丙醇、50 ji 叔-丁對(duì)5R)-6-氰基-5-羥基-3-氧代己酸酯粗產(chǎn)品(對(duì)映異構(gòu)體純度〉99。/。)、 0.025 mg NAD和15 pl酶懸浮液SEQ ID NO:ll(見(jiàn)實(shí)施例3)。 48小時(shí)后，〉80%的所 用叔-丁對(duì)5尺)-6-氰基-5-羥基-3-氧代己酸酯被還原為叔-丁與3民511>6-氰基-3,5-二羥基己酸酯。非對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量>99%。1 mlegkvavit gagsgigrat alrfaregar vwaelderr 41 geewreile sggeavfvrt dvsefeqvea averaveeyg 81 tldvmfnnag ighyaplleh dpehydrwr vnqygvyygi 121 laagrkmael e叩gviinta svyaflaspg vigyhaskga 161 vkmmtqaaal elaphgirw aiapggvdtp iiqgykdmgl 201 gerlargqmr rrlqtpeqla gawllatee adaingswm 241 tddgyaefk
1 atgctcgaggggaaggtcgcggtcatcacgggggccggca 41 gcggcataggccgggccaccgcgctcaggttcgcccgcga 81 aggggcccgggtggtcgtggcggagrtcgacgagcggagg 121 ggggaggaggtcgtccgggagatcctcgagtccggcgggg 161 aggccgtcttcgtg柳acggacgtctcggagttcgagca 201 ggttgaggccgccgtcgagcgcgccgtcgaggsgtacggg 241 acgctggacgl:catgttcaacaacgccggcatcgggcact 281 acgcccccctgrtggagcacgacccggagcactacgaccg 321 ggtggtccgggtgaaccagtacggcgtctactacgggata 361 ctcgccgccggcaggaagatggccgagctggagaaccccg 401 gcgtgatcatcaacaccgcctcggtctacgctttcctggc 441 ctcccccggtgtgatcggctatcacgcttccaagggggcg 481 gtgaagatgatgacccaggccgcagccctggagctcgccc 521 cccacggcatacgggtcgtcgccatcgccccgggcggggt 561 ggacaccccgatcatccagggctacaaggacatgggcctc 601 ggtgagcggctggcccgcggccagatgcgtcgcaggctcc 641 agacccccgagcagatcgccggcgccgtcgtcctgctcgc 681 caccgaggaggcagacgccataaacggctcggtggtgatg 721 accgacgacggctacgcggagttcaagtaa
1 atgrtggaag gtaaagtggc agtcatcacc ggtgcaggca 41 gcggcattgg gcgtgccact gcgctgcgtt ttgcgcgtga 81 aggcgctcgc gtcgttgtgg ccgagctgga tgaacgtcgc 121 ggtgaggaag ttgtacgtga gattctggaa tctggcgggg 161 gggaggccgt cttcgtgagg acggacgtct cggagttcga201 gcaggttgag gccgccgtcg agcgcgccgt cgaggagtac
241 gggacgctgg acgtcatgtt caacaacgcc ggcatogggc
281 actacgcccc cctgctggag cacgacccgg agcactacga
321 ccgggtggtc cgggtgaacc agtacggcgt ctactacggg
361 atactcgccg ccggcaggaa gatggccgag ctggagaacc
401 ccggcgtgat catcaacacc gcctcggtct acgctttcct
441 ggcctccccc ggtgtgatcg gctatcacgc ttccaagggg
481 gcggtgaaga tgatgaccca ggccgcagcc ctggagctcg
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641 tccagacccc cgagcagatc gccggcgccg tcgtcctgct
681 cgccaccgag gaggcagacg ccataaacgg ctcggtggtg
721 atgaccgacg acggctacgc ggagttcaag tea
GGGAATTCCATATGATGCTCGAGGGGMGGTCG CCCMGCTTATTAOTGAACTCCGCGTAGCCGTC
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CCTAGCTAGCATGCTGGMGGTAAAGTGGC CACATGCATGCGAATGCTCGAGGGGAAGGTC
GeoZ)。"'〃tw f/iewiodeM//"》co/w DSM465 蛋白質(zhì)序列^炭基還原酶
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241 lsvdgggltfGeo6ac"/w fAermode""祈c。"j DSM 465核酸序列羰基還原酶
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G《otoC ^r膨d抓 "》oi;w DSM 465 核酸序列合成基團(tuán)
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661gtggctaatgcggttctgtttctggcaagcgctttattacgggtgcaacc
721ctctccgtagatgggggcgggttsaccttcta3橙色綠屈撓菌DSMZ635 蛋白質(zhì)序列羰基還原酶
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61 vrcdvsqrde ver丄ialavd tfgridfahn nagiegvqam JLadypeevwd rvieinlkgv 121wlcmkyeirh mlJcqgggaiv ntssvaglag srgvsayvas khgivgit)ca aaleyarngi
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橙色綠屈撓菌DSMZ 635 核酸序列羰基還原酶
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橙色綠屈撓菌 DSMZ 635 核酸序列合成基團(tuán)
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Candida magnoliae CBS 6396 蛋白質(zhì)序列羰基還原酶
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Candida magnoliae CBS 6396 核酸序列合成基團(tuán)
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541 cacgttasct gcgtgaaccc gggcacgacg cgcaccgaga tgacaaaggg cgttgatctc
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"721 ttcggtgttt
權(quán)利要求
1、對(duì)映體選擇性酶促還原通式I羥基酮的方法所述通式I中，R1＝C1-C6烷基，R2＝-Cl，-CN，-OH，-H或者C1-C6烷基，以得到通式II的手性二醇其中R1與R2與通式I中的含義相同，其中在NADH或者NADPH作為輔因子的條件下，用氧化還原酶還原羥基酮，其特征在于a)羥基酮在反應(yīng)混合物中的濃度≥50g/l，b)通過(guò)通式RXRYCHOH的二級(jí)醇氧化持續(xù)再生所得的氧化輔因子NAD或者NADP，其中RX，RY彼此獨(dú)立是氫、支鏈或者無(wú)支鏈C1-C8烷基，且C總數(shù)≥3，和c)羥基酮的還原和二級(jí)醇的氧化是由相同的氧化還原酶催化。
2、根據(jù)禾又利要求1的方法，其特征在于，所i^氧化還原酶a) 含有氨基酸序列，其中至少50%的氨基酸與氨基酸序列SEQ ID NO:l、 SEQ ID NO:8、 SEQ ID NO: 11或者SEQ ID NO: 14的那些相同，b) 由SEQIDNO:2、 SEQIDNO:3、 SEQIDNO:9、 SEQ ID NO: 10、 SEQID NO: 12、 SEQ ID NO: 13或者SEQ ED NO: 15的核酸序列編碼，或者c) 由在嚴(yán)格^f牛下，與SEQ ED NO: 2、 SEQIDNO:3、 SEQIDNO:9、 SEQ IDNO:10、 SEQIDNO:12、 SEQIDNO:13或者SEQIDNO:15雜交的核酉游列編碼。
3、對(duì)映體選擇性酶促還原通式I羥基酮的方法<formula>formula see original document page 3</formula>所M式I中，RKVC6烷基，R2^"Cl,-CN,畫(huà)OPi-H或者C《6烷基，以得到通式n的手性二醇<formula>formula see original document page 3</formula>(II)其中&與R2與通式I中的含義相同，其中在輔因子存在的條件下，用氧化還原酶還原羥基酮，其特征在于所述 氧化還原酶a) 含有氮基酸序列，其中至少50y。的氨基酸與氨基酸序列SEQIDNO:l、 SEQIDNO:8、 SEQIDNO:ll或者SEQIDNO:14的那些相同，b) 由SEQIDNO:2、 SEQIDNO:3、 SEQIDNO:9、 SEQIDNO:IO、 SEQID NO:12、 SEQE)NO:13或者SEQIDNO:;i5的核酸序列編碼，或者-c) 由在嚴(yán)格條件下，與SEQIDNO:2、 SEQIDNO:3、 SEQIDNO:9、 SEQ IDNO:IO、 SEQIDNO:12、 SEQIDNO:13或者SEQIDNO:15雜交的核酸序列 編碼。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其特征在于，輔因子被共底物持續(xù)還原。
5、 權(quán)利要求3或者4的方法，其特征在于用NAD(P)H作為輔因子。
6、 權(quán)利要求]-5的任一項(xiàng)的方法，其特征在于用2-丙醇、2-丁醇、2-戊醇、 4-甲基-2-戊醇、2-庚醇或者2-辛醇作為共底物或者二級(jí)醇。
7、 根據(jù)豐又利要求1-6的任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述羥基酮占總反應(yīng)體 積的5-50重*%， {雌8-40重*%，特別ifc^ 10-25重*%。
8、 根據(jù)權(quán)利要求l-7的任一項(xiàng)的方法，其特征在于用叔-丁萄5R)-6-氰基-5-羥基-3_氧代己酸酯、叔-丁與58>6-氯-5-羥基-3-氧代己酸酯或者叔-丁對(duì)58>5，6-二羥基-3-氧代己酸酯作為通式I的羥基酮。
9、 根據(jù)禾又利要求1-8的任一項(xiàng)的方法，其特征在于TTN(總轉(zhuǎn)化數(shù)二md 還原的羥基S/mo1所用的輔因子ei03。
10、 根據(jù)木又利要求1-9的任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述方法在含水有禾幾兩 相系統(tǒng)中進(jìn)fi1。
11、 根據(jù)權(quán)禾腰求1-10的任一項(xiàng)的方法，其特征在于別外地4柳有機(jī)線U， 如乙醚、叔-丁基甲基醚、二異丙基醚、二丁基醚、乙酸丁酯、庚烷、己烷或者 環(huán)己醇。
全文摘要
對(duì)映體選擇性酶還原通式I之羥基酮的方法，所述通式I中，R₁＝C₁-C₆烷基，R₂＝-Cl，-CN，-OH，-H或者C₁-C₆烷基，以得到通式II的手性二醇，其中R₁與R₂與通式I中的含義相同。在NADH或者NADPH作為輔因子的條件下，用氧化還原酶還原羥基酮，其中a)所述羥基酮在反應(yīng)混合物中的濃度為＞50g/l，b)通過(guò)氧化通式R_XR_YCHOH的二級(jí)醇持續(xù)再生所得的氧化輔因子NAD或者NADP，其中R_X，R_Y彼此獨(dú)立是氫、支鏈或者無(wú)支鏈C₁-C₈烷基，且C_總數(shù)≥3，并且c)羥基酮的還原和二級(jí)醇的氧化是由相同的氧化還原酶催化的。
文檔編號(hào)C12P13/00GK101432435SQ200680047754
公開(kāi)日2009年5月13日 申請(qǐng)日期2006年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月19日
發(fā)明者A·古普塔, A·申茨徹, M·博布科瓦 申請(qǐng)人:Iep有限責(zé)任公司