專利名稱：用于癌癥預(yù)測(cè)和預(yù)后及監(jiān)測(cè)癌癥治療的方法
用于癌癥預(yù)測(cè)和預(yù)后及監(jiān)測(cè)癌癥治療的方法 發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及生物標(biāo)記物、用于癌癥預(yù)測(cè)和預(yù)后的生物標(biāo)記物的
用途以及用于監(jiān)測(cè)癌癥治療效果的生物標(biāo)記物的用途。具體地講，本
發(fā)明涉及作為多激酶抑制劑(multi-kinase inhibitor)的生物標(biāo)記物的 VEGF-165的用途。
背景技術(shù)：
血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEGFRs)及其配體、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 (VEGFs)在內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖中發(fā)揮關(guān)鍵作用。所述VEGFR7VEGF 系統(tǒng)包括三種受體(VEGFR-1、 VEGFR-2和VEGFR-3)和四種配體 (VEGF-A、 B、 C、 D，及E和胎盤生長(zhǎng)因子)。另外，VEGF-A由四種 亞型組成，VEGF陽(yáng)121、 VEGF-165、 VEGF-185和VEGF-204。其源于 VEGF-A基因的另一種轉(zhuǎn)錄。所述受體是帶有細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶域的 血漿5,膜蛋白。由于具有其它的蛋白激酶，VEGFRs的激活是內(nèi)皮細(xì) 胞增殖的調(diào)節(jié)信號(hào)中關(guān)鍵的機(jī)制，而且VEGFR/VEGF的異常被認(rèn)為 是多種人體疾病中的異常血管發(fā)生的原因，如牛皮癬和惡性腫瘤。
在胚胎形成中，VEGFR/VEGF系統(tǒng)對(duì)血管系統(tǒng)的正確發(fā)育是必 要的。在成人中，VEGFR/VEGF在傷口愈合、炎癥和血管發(fā)生中是重 要的。藥物治療前患者中循環(huán)VEGF-165水平的非侵襲性測(cè)試是做出 治療決定的一種可能的重要輔助。雖然已在人體中用總VEGF-A測(cè)試 作為疾病后果的預(yù)后的指示，4旦直至本發(fā)明，尚未見報(bào)道在患者化療 和治療結(jié)果之前VEGF-165水平之間的相關(guān)性。因此，VEGF-165可 用作有價(jià)值的預(yù)后的指示劑，并可用作監(jiān)測(cè)用多激酶抑制劑治療的有步丈性的生物標(biāo)i己物。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及生物標(biāo)記物、用于癌癥預(yù)測(cè)和預(yù)后的生物標(biāo)記物的 用途以及用于監(jiān)測(cè)癌癥治療效果的生物標(biāo)記物的用途。具體地講，本 發(fā)明涉及作為多激酶抑制劑(如索拉非尼)的生物標(biāo)記物VEGF-165的 用途。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在用多激酶抑制劑(如索拉非尼 (Sorafenib))治療前使用定量免疫測(cè)定法測(cè)定人體體液中VEGF-165蛋 白的水平。該水平尤其可用作用多激酶抑制劑(如索拉非尼)治療的癌 癥患者的有效指示劑，以便從這種療法受益。臨床上可使用VEGF-165預(yù)處理水平的測(cè)定法作為患者療法選 擇的一種治療輔助，用以監(jiān)測(cè)患者腫瘤形成前(preneoplastic)/腫瘤形成 疾病的狀態(tài)，和/或4企測(cè)腫瘤形成前/腫瘤形成疾病的患者如^f可響應(yīng)療 法。在一實(shí)施方案中，可用VEGF-165的水平在患者療法選擇中幫助 決定患者療法的最佳方法。可在患者樣本中測(cè)定VEGF-165的水平，患者樣本為例如，但 不限于血液、血清、血漿、尿、唾液、精液、乳房分泌液、腦脊髓液、 眼淚、痰、粘液、淋巴、細(xì)胞纟容膠、腹水、胸膜滲出液、羊水、膀胱 洗液和細(xì)支氣管肺泡灌洗液。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過(guò)測(cè)定患者樣本中的 VEGF-165的預(yù)處理水平并根lt可能患者結(jié)果對(duì)VEGF- 165水平的計(jì) 算圖(nomogram)估算可能的結(jié)果，而使用免疫測(cè)定法作為選擇患者的 一種方法，所述患者可能受益于多激酶抑制劑(如索拉非尼)的治療。
監(jiān)測(cè)患者中與激活的VEGF- 165途徑相關(guān)的疾病狀態(tài)的方法還 可用于預(yù)測(cè)疾病的預(yù)后，其中患者樣本中總VEGF-165蛋白的水平是 對(duì)患者治療結(jié)果好與壞的指征。所述預(yù)后可以是一種選自下列的臨床 結(jié)果響應(yīng)率(RR)、完全響應(yīng)(CR)、部分響應(yīng)(PR)、穩(wěn)定的疾病(SD)、和臨床益處[包括完全響應(yīng)(CR)、部分響應(yīng)(PR)和穩(wěn)定的疾病(SD)]、 進(jìn)展時(shí)間(TTP)、無(wú)疾病進(jìn)展存活期(PFS)和總存活期(OS)。
這些方法可以使標(biāo)準(zhǔn)模式，例如夾心免疫測(cè)定形式的免疫測(cè)定 法，如夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)或者等同的測(cè)定法。這些免 疫測(cè)定法可4吏用單克隆抗體，如抗-VEGF-165單克隆抗體。另外，所 述單克隆抗體可以被生物素化。本發(fā)明另一實(shí)施方案涉及一種測(cè)定患者樣本中總VEGF-165蛋 白水平中系列變化的定量免疫測(cè)定法，其作為一種患病(例如，腫瘤形 成前/腫瘤形成疾病)患者的治療選擇方法。
例如， 一種這樣的治療選擇方法可包括下列步驟
(a) 對(duì)取自對(duì)照群體的樣本中的總VEGF-165蛋白的平均水平進(jìn) 行免疫學(xué)檢測(cè)和定量；
(b) 對(duì)取自患者的樣本中的總VEGF-165蛋白隨時(shí)間推移的水平 進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)和定量；和
(c) 根據(jù)患者樣本中VEGF-165蛋白的水平，確定是否使用常規(guī) 療法和/或多激酶抑制劑(如索拉非尼)療法治療該患者。例如，如果發(fā)現(xiàn)患者樣本中VEGF-165蛋白的水平在約70pg/ml 以上，可得出結(jié)論該患者患有VEGF驅(qū)動(dòng)的疾病，可做出確定，即 使用多激酶抑制劑(如索拉非尼)療法治療該患者，可單獨(dú)使用該療法 或者與一或多種其它療法聯(lián)合4吏用。 VEGF-165途徑涉及的療法可以是多激酶抑制劑、酪氨酸激酶抑 制劑、二芳基脲、VEGFR-2的反義抑制劑或者單克隆抗體療法等。例 如，VEGF-165途徑涉及的療法可以是二芳基脲索拉非尼，其是一種 血管生成抑制劑以及酪氨酸激酶抑制劑，或者酪氨酸激酶抑制劑， STI571 (也稱為曱磺酸伊馬替尼或Gleevec )。本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及用定量免疫測(cè)定法檢測(cè)與一或多種 其它蛋白水平結(jié)合的VEGF-165水平的變化。這些其它蛋白可包括， 例如抑制劑(如金屬蛋白酶-1的組織抑制劑(TIMP-l))、癌蛋白(oncoproteins)(如HER-2/neu、 ras p21)、生長(zhǎng)因子受體(如表皮生長(zhǎng)因 子受體(EGFR)、血小板衍生的生長(zhǎng)因子受體a(PDGFR-ot))、轉(zhuǎn)移蛋白 (metastasis proteins)(如尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA))、腫瘤標(biāo)記物 (如癌胚抗原(carcinoembryonic)(CEA))和月中瘤4中制劑(suppressors)(如 p53)。然后可使用這些方法，例如作為診斷/預(yù)測(cè)工具，對(duì)疾病患者進(jìn) 行療法選擇，監(jiān)測(cè)患者的疾病a夫態(tài)，并監(jiān)測(cè)患病患者如何響應(yīng)VEGF 途徑涉及的或其它的療法。這將有利于檢測(cè)患者(例如癌癥患者)總 VEGF-165和其它蛋白的系列變化，如激活VEGF-165途徑的蛋白， 作為一種擴(kuò)大臨床前景的手段、治療資源和診斷/預(yù)測(cè)參數(shù)，以得到最 有希望的治療效果而選擇最佳的治療組合。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種在患者樣本中供監(jiān)測(cè)治療 效果的試驗(yàn)試劑盒，其包含一種對(duì)一種蛋白的特異性抗體。在某些實(shí) 施方案中，所述試劑盒還包括使用該試劑盒的說(shuō)明書。在某些實(shí)施方 案中，所述試劑盒還可包括供混懸或固定細(xì)胞的溶液、可檢測(cè)的標(biāo)記 或標(biāo)簽、促使多肽易于結(jié)合抗體的溶液、溶解細(xì)胞的溶液或者純化多 肽的溶液。在再一實(shí)施方案中，該抗體對(duì)VEGF-165具有特異性。
圖示說(shuō)明

圖1說(shuō)明患者群體中穩(wěn)定的和發(fā)展的疾病的平均VEGF-165水 平。圖2說(shuō)明患者群體中所測(cè)定的穩(wěn)定的和發(fā)展的疾病的平均腫瘤 皺縮度。
發(fā)明詳述應(yīng)清楚的是本發(fā)明不受限于具體的方法學(xué)、試驗(yàn)方案、細(xì)胞系、 動(dòng)物的種屬、結(jié)構(gòu)和試劑，因此可以變化。還應(yīng)清楚的是此處所用的 命名法目的僅為說(shuō)明具體的實(shí)施方案，并不意味著限定本發(fā)明的范 圍，本發(fā)明的范圍僅受所附權(quán)利要求的限定。
必需注意的是除上下文明確指明外，此處以及所附權(quán)利要求 書中所用的單數(shù)形式"一，，、"一個(gè)"和"該"包括復(fù)數(shù)。因此，例 如，對(duì)于"一種基因"是指一或多種基因，并包括本領(lǐng)域技術(shù)人員 已知的其等同物，依次類推。除另有定義，否則此處所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)均具有本領(lǐng) 域任一普通技術(shù)人員通常了解的屬于本發(fā)明的相同意義。雖然，可在 本發(fā)明的實(shí)踐和測(cè)試中使用類似于或等同于本文所述的任何方法、設(shè) 備和材料，但現(xiàn)在描述的是優(yōu)選的方法、設(shè)備和材料。
在此所提及的所有出版物和專利均結(jié)合到本發(fā)明中作為參考， 目的在于例如描述和公開所述各出版物中描述的結(jié)構(gòu)和方法學(xué)，其可 與目前所述的發(fā)明結(jié)合使用。所提供的以上及貫穿于正文中所討論的 所述出版物的公開內(nèi)容僅僅限于本申請(qǐng)?zhí)峤蝗掌谥?。在此不解釋?允許所述發(fā)明人無(wú)權(quán)提前公開在先發(fā)明的內(nèi)容。
定乂為方便起見，以下給出本說(shuō)明書、實(shí)施例和所附權(quán)利要求書中 所用的某些術(shù)語(yǔ)和詞組的意義。此處所用的術(shù)語(yǔ)"患者樣本"指從患者獲得的樣本。樣本可以 是任何生物學(xué)組織或流體。所述樣本可以是源自患者的樣本。這些樣 本包括，但不限于血液、血清、血漿、尿、唾液、精液、乳房分泌液、 腦脊髓液、眼淚、痰、粘液、淋巴、細(xì)胞溶膠、腹水、胸膜滲出液、 腹膜流體、羊水、膀胱洗液和細(xì)支氣管肺泡灌洗液、血細(xì)胞(例如白細(xì) 胞)、組織和活組織檢查樣本(例如腫瘤活組織檢查)或者其中的細(xì)胞。 生物學(xué)樣本還可包括組織切片，如供組織學(xué)檢查目的用的冷凍切片。
術(shù)語(yǔ)"生物標(biāo)記"包括很寬范圍的細(xì)胞內(nèi)外事件以及全機(jī)體生 理學(xué)變化。生物標(biāo)記可基本代表細(xì)胞功能的任何方面，例如，但不限 于信號(hào)分子產(chǎn)生的水平或速率、轉(zhuǎn)錄因子、代謝產(chǎn)物、基因轉(zhuǎn)錄物以 及蛋白的翻譯后變形。生物標(biāo)記可包括轉(zhuǎn)錄物水平的全染色體組分析(modifications)的全蛋白組(proteome)分析。
生物標(biāo)記還可以指基因或基因產(chǎn)物，與未治療的疾病細(xì)胞相比， 其上調(diào)或下調(diào)患病患者的化合物治療的疾病細(xì)胞。即，該基因或基因 產(chǎn)物對(duì)所治療的細(xì)胞具有足夠的特異性，可將其任選與其它基因或基 因產(chǎn)物一起鑒定、預(yù)測(cè)或檢測(cè)小分子的效果。因此，生物標(biāo)記是一種 特征在于顯現(xiàn)疾病細(xì)胞中化合物的效力或者所述疾病細(xì)胞對(duì)化合物 治療的響應(yīng)的基因或基因產(chǎn)物。術(shù)語(yǔ)"癌癥"包括但不限于固體瘤，如乳房、呼吸道、大腦、 生殖器官、消化道、尿道、眼、肝、皮膚、頭和頸、曱狀腺、曱狀旁 腺的癌癥及其它們的遠(yuǎn)期的轉(zhuǎn)移病灶。該術(shù)語(yǔ)還包括淋巴瘤、肉瘤和 白血病。乳腺癌的實(shí)例包括但不限于侵襲性導(dǎo)管癌、侵襲性小葉癌、原 位導(dǎo)管癌和原位小葉癌。呼吸道癌的實(shí)例包括但不限于小細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌以及支氣 管腺瘤和胸膜肺胚細(xì)胞瘤。腦癌的實(shí)例包括但不限于腦干和下丘腦(hypophtalmic)神經(jīng)膠質(zhì) 瘤、小腦和大腦星細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、室管膜瘤以及神經(jīng)外胚 層和松果腺腫瘤。男性生殖器官腫瘤包括^旦不限于前列腺癌和睪丸癌。女性生殖 器官癌包括但不限于子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌、卵巢癌、陰道和外陰癌 以及子宮肉瘤。消化道腫瘤包括但不限于肛門、結(jié)腸、結(jié)腸直腸、食管、膽嚢、 胃、胰臟、直腸、小腸和唾液&泉癌。尿道腫瘤包括但不限于膀胱、陰莖、腎、腎盂、輸尿管和尿道癌。眼癌包括但不限于眼內(nèi)黑素瘤和成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤。肝癌的實(shí)例包括但不限于肝細(xì)胞癌(帶有或不帶有纖維層狀變
型的肝細(xì)胞癌)、膽管癌(cholangiocarcinoma)(肝內(nèi)膽汁管癌)和混合性
12肝細(xì)胞膽管癌。皮膚癌包括但不限于鱗狀細(xì)胞癌、卡波濟(jì)氏瘤、惡性黑素瘤、 Merkel細(xì)胞皮膚癌和非-黑素瘤皮膚癌。頭頸癌包括但不限于喉/下咽/鼻咽/口咽癌以及唇和口腔癌。淋巴瘤包括但不限于AIDS-相關(guān)淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、
皮膚T-細(xì)胞淋巴瘤、霍奇金氏病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤。肉瘤包括但不限于軟組織肉瘤、骨肉瘤、惡性纖維組織細(xì)胞癌、
淋巴肉瘤和4黃故月幾肉瘤。白血病包括但不限于急性骨髓白血病、急性成淋巴細(xì)胞白血病、 慢性淋巴細(xì)胞白血病、慢性骨骨it性白血病和毛狀細(xì)胞白血病。
本文中所用的術(shù)語(yǔ)"患者"和"病患"包括哺乳動(dòng)物(例如人和 動(dòng)物)。本發(fā)明涉及測(cè)定患者樣本中VEGF-165蛋白水平的定量免疫測(cè) 定法。這些測(cè)試可用于對(duì)患有與VEGF-165途徑相關(guān)的疾病的患者選 擇療法。此處所用"VEGF-165途徑"被定義為通過(guò)VEGF-165蛋白 的過(guò)度表達(dá)或突變激活VEGF-165途徑，由此包括上調(diào)節(jié)和/或突變刺 激VEGF-165途徑。與激活的VEGF-165途^f圣相關(guān)的瘤形成疾病以及導(dǎo)致瘤形成疾 病的前期癌的實(shí)例如下轉(zhuǎn)移性成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、胃腸基質(zhì)瘤(GIST)、 隆凸性皮膚纖維肉瘤(DFSP)、慢性骨髓增生性疾病(CMPD)、結(jié)腸直 腸癌、結(jié)腸癌、肺癌、非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、急性骨髓性白血 病、曱狀&泉癌、胰腺癌、膀胱癌、腎癌、黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、 卵巢癌、宮頸癌、頭頸癌、腦瘤、肝細(xì)胞癌和血液惡性腫瘤。因此， 可單獨(dú)使用VEGF-165蛋白水平或者與其它蛋白(例如其它癌蛋白)水 平聯(lián)合使用，以預(yù)測(cè)臨床結(jié)果和/或作為一種療法選擇的輔助。
因此，本發(fā)明公開和要求免疫測(cè)定法定量測(cè)定患者樣本中 VEGF-165水平(例如循環(huán)的VEGF-165水平)的應(yīng)用，目的是評(píng)估癌癥 患者將受益于多激酶抑制劑(如索拉非尼)治療的可能性。
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在本發(fā)明的一實(shí)施方案中，在診斷時(shí)或在治療前，對(duì)取出的患 者樣本中的VEGF-165蛋白進(jìn)行定量。這些患者樣本可以是例如血液、 血清、血漿、尿、唾液、精液、乳房分泌液、腦脊髓液、眼淚、痰、 粘液、淋巴、細(xì)胞溶膠、腹水、胸膜滲出液、羊水、膀胱洗液和細(xì)支 氣管肺泡灌洗液以及其它的體液樣本。患者樣本可以是新鮮采集的或 冷凍的，并可以用肝素、檸檬I臾鹽或EDTA處理。
例如，可用于本發(fā)明方法中的一種免疫測(cè)定法為夾心ELISA法 (sandwich ELISA)。但是，可^E解的是除在此^Hf的那些方法以外， 可使用其它方法對(duì)患者樣本中的VEGF-165蛋白進(jìn)行定量。另外，可 使用4艮多才企測(cè)方法顯像VEGF-165蛋白，如發(fā)光標(biāo)記法。
很多方法可適合用于本發(fā)明的方法。例如，患者樣本中的 VEGF-165蛋白的沖全測(cè)和定量可通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法、放射免疫 測(cè)定法、雙抗體夾心測(cè)定法、聚集測(cè)定法、熒光免疫測(cè)定法、免疫電 子和掃描顯微鏡檢查法以及其它本領(lǐng)域一般已知的其它測(cè)定法進(jìn)行。 這些測(cè)定法中VEGF-165蛋白的定量可通過(guò)本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法進(jìn) 行。在一實(shí)施方案中，循環(huán)VEGF-165蛋白水平中的系列變化可通過(guò) 夾心測(cè)定法檢測(cè)和定量，其中4吏用常規(guī)技術(shù)將捕獲抗體固定在載體的 表面。適合的載體包括，例如合成的聚合物載體，如聚丙烯、聚苯乙 烯、取代的聚苯乙烯、聚丙烯酰胺(如聚酰胺和聚氯乙烯)、玻璃珠、 瓊脂糖和硝基纖維素。本發(fā)明方法中可使用的 一種ELISA夾心免疫測(cè)定法的實(shí)例使用 純化的小鼠抗-人VEGF-165單克隆抗體作為捕獲抗體，并使用生物素 化山羊抗-人VEGF-165多克隆抗體作為檢測(cè)抗體。將捕獲單克隆抗體 固化在微量滴定板孔中。將稀釋的人血清/血漿樣本或VEGF-165標(biāo)準(zhǔn) 品(重組野生型VEGF-165蛋白)在各孔中孵育，使得通過(guò)捕獲單克隆 抗體結(jié)合VEGF-165抗原。洗滌各孔后，將固化的VEGF-165抗原暴 露于生物素化的檢測(cè)抗體，然后再次洗滌各孔。然后加入鏈霉抗生物素-辣根過(guò)氧化物酶綴合物。最后洗滌后，向各孔加入TMB藍(lán)底物 (Blue Substrate),以檢測(cè)結(jié)合的過(guò)氧化物酶的活性。將反應(yīng)通過(guò)加入 2.5 N硫酸終止，在450 nm處測(cè)定吸光度。樣本的吸光值與VEGF-165 標(biāo)準(zhǔn)品相關(guān)使得允許定量測(cè)定血清或血漿中VEGF-165的值(pg/ml)。
應(yīng)清楚的是其它蛋白(例如抑制劑、癌蛋白、生長(zhǎng)因子受體、血 管生成因子、轉(zhuǎn)移蛋白、腫瘤標(biāo)記物、腫瘤抑制劑、與VEGF途徑有 關(guān)的蛋白)可適合于與VEGF-165聯(lián)合檢測(cè)和定量。例如，適合于與 VEGF-165 —同檢測(cè)的其它蛋白包括金屬蛋白酶-1的組織抑制劑 (TIMP-1)、 HER-2/neu、 ras p21、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、血小板 衍生的生長(zhǎng)因子受體a、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、尿激酶型纖溶酶 原激活劑(uPA)、癌胚抗原(CEA)和p53。這些其它蛋白可使用本領(lǐng)域 技術(shù)人員已知的測(cè)定法檢測(cè)。例如HER-2/neu和TIMP-1的定量免疫 測(cè)定法為市售提供，如Oncogene Science TIMP-1 ELISA (Oncogene Science, Cambridge, MA (USA))，其可檢測(cè)人血清或血漿中ng/ml的 TIMP-1的水平。監(jiān)測(cè)VEGF-165的預(yù)治療水平可以為用多激酶抑制劑(如索拉非 尼)治療后的臨床效果的指征。 一種評(píng)估臨床效果的方法可以是對(duì)下列 參數(shù)的判定響應(yīng)率(RR)、完全響應(yīng)(CR)、部分響應(yīng)(PR)、穩(wěn)定的疾 病(SD)、臨床益處(包括完全響應(yīng)(CR)、部分響應(yīng)(PR)和穩(wěn)定的疾病 (SD))、進(jìn)展時(shí)間(TTP)、無(wú)疾病進(jìn)展存活期(PFS)和總存活期(OS)。
此處術(shù)語(yǔ)"抗體，，用其廣義含義，并特別涵蓋單克隆抗體(包括 全長(zhǎng)單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和 抗體片段。本發(fā)明方法可用的抗體可通過(guò)常規(guī)的方法學(xué)和/或通過(guò)遺傳 工程制備。例如，本發(fā)明抗體包括與VEGF-165結(jié)合的抗體。
"抗體片斷"包括抗體全長(zhǎng)的一部分，通常是其抗原結(jié)合或可 變區(qū)域?？贵w片段的實(shí)例包括Fab、 Fab'， F(ab')2和Fv片段、雙體、 線性抗體、單鏈抗體分子、生物特異性抗體和由抗體片段形成的多特 異性抗體。
此處所用術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體"指從基本上同種抗體群得到的抗 體，即各單個(gè)抗體包括相同的種群，除可以以少量出現(xiàn)的可能的天然 存在的突變體外。單克隆抗體具有高度特異性，即定向針對(duì)單一的抗 原位置。另外，與一般包括定向針對(duì)不同決定子(抗原決定簇)的不同 的抗體的常規(guī)的(多克隆)抗體制備不同，各單克隆抗體定向針對(duì)抗原 上的單一決定子。修飾語(yǔ)"單克隆的"指作為從基本上同種抗體群得 到的抗體的特性，并不被解釋為通過(guò)任何具體方法需要產(chǎn)生抗體。例 如，用于本發(fā)明的單克隆抗體可通過(guò)Kohler等(Nature 256:495, 1975) 首先描述的雜交瘤方法制備，或者可通過(guò)重組DNA方法制備(參見， 例如美國(guó)專利No. 4,816,567)。還可采用例如Clackson等(Nature 352:624-628,1991)和Marks等(J. Mol. Biol. 222:581-597， 1991)描迷的 技術(shù)，從噬菌體抗體庫(kù)中分離單克隆抗體。此處單克隆抗體還包括"嵌合的(chimeric)"抗體(免疫球蛋白)， 其中重鏈和/或輕鏈部分與源于特定種類的抗體中的對(duì)應(yīng)序列相同或 類似，或者屬于特定抗體類型或亞型，而所述鏈的其余部分與源自另 一種種類的抗體中的對(duì)應(yīng)序列相同或類似，或者屬于另一種抗體類型 或亞型，以及這種抗體的片斷，只要它們呈現(xiàn)所要求的生理學(xué)活性即 可(參見，例如美國(guó)專利No. 4,816,567;和Morrison等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :6851-6855, 1984)。非人類(例如小鼠)抗體的"人源化"形式是嵌合抗體，其包含源 自非人類免疫球蛋白的最小化序列。對(duì)于大部分來(lái)講，人源化抗體是 人免疫球蛋白(受體抗體)，其中該受體的高變異度區(qū)域殘基被具有所 要求的特異性、親合性和能力的非人類(供體抗體)(如小鼠、大鼠、家 兔或非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物)的高變異度區(qū)域殘基代替。在某些情況下，人 免疫球蛋白的骨架區(qū)域(FR)殘基可被對(duì)應(yīng)的非-人類殘基代替。另外， 人源化抗體可包含在受體抗體或在供體抗體中未發(fā)現(xiàn)的殘基。可進(jìn)行 這種修飾以進(jìn)一步凈化抗體的性能。所述人源化抗體一般可基本上包 括所有的至少 一種或者一般兩種可變區(qū)域，其中所有的或基本上所有的高變異度區(qū)域都對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的那些區(qū)域，而所有的或基
本上所有的FR都是人免疫球蛋白序列的那些區(qū)域。所述人源化抗體 還可任選包含至少一部分的免疫球蛋白不變區(qū)域(Fc)， 一般為人免疫 球蛋白的一部分。有關(guān)綜述參見Jones等，(Nature 321 :522-525， 1986); Reichmann等，(Nature 332:323-329， 1988);和Presta， (Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596， 1992)。"單鏈Fv"或"sFv"抗體片斷包括抗體的Vh和Vl域，其中 這些域出現(xiàn)于單多肽鏈中。所述Fv多肽一般還包括Vh和Vt域之間 的多肽連接體(linker), Vh和V^或能使sFv為抗原結(jié)合形成所要求的 結(jié)構(gòu)。有關(guān)綜述參見Pluckthun (單克隆抗體的藥理學(xué)(The Pharmacology of Monoclonal Antibodies), Vol. 113， Rosenburg和Moore eds. Springer畫Verlag， New York, pp. 269-315, 1994)。
術(shù)語(yǔ)"雙體(diabodies)"指帶有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小抗體片斷， 所述片斷包括在相同多肽鏈(V『VL)中與輕鏈可變域(variable domain)(VD連接的重鏈可變域(VH)。通過(guò)使用很短以致不能在相同鏈 上兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間配對(duì)的連接體。可強(qiáng)迫所述各結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的 互補(bǔ)區(qū)域配對(duì)，并產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。有關(guān)雙體更詳細(xì)的描述見 例如EP 404,097; WO 93/11161和Hollinger等(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448， 1993)。術(shù)語(yǔ)"線型抗體，，指Zapata等(Protein Eng. 8(10): 1057-1062， 1995) 所述的抗體。簡(jiǎn)言之，這種抗體包括形成一對(duì)抗原結(jié)合域的一對(duì)串聯(lián) 的Fd片斷(Vh-Ch1-Vh-Ch1)。線型抗體可以具有雙重特異性或單一特 異性。本發(fā)明可用的代表性單克隆抗體包括小鼠抗-人總VEGF-165單 克隆抗體，如在設(shè)計(jì)用于測(cè)定人VEGF-165的Oncogene Science夾心 ELISA試劑盒中發(fā)現(xiàn)的那些。本發(fā)明可用的單克隆抗體用于鑒定各種 實(shí)驗(yàn)室預(yù)測(cè)試-瞼(例如臨床樣本)中的VEGF-165蛋白。
描述此處所用的其它分子生物學(xué)技術(shù)(包括抗體的制備)的一般內(nèi)容包括Berger和Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology (分子克隆技術(shù)指南，酶學(xué)方法)，Vol. l52， Academic Press, Inc.); Sambrook等(Molecular Cloning: A Laboratory Manual (分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, N.Y.; 1989) Vol. l畫3); Gurrent Protocols in Molecular Biology(分子生物學(xué)的最新實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì))，(F. M. Ausabel等.[Eds.], Current Protocols (最新方案),a joint venture between Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc. (2000增 才卜本》； Harlow等(Monoclonal Antibodies: A Laboratory Manual(克隆 抗體實(shí)-驗(yàn)室手冊(cè))，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988), Paul [Ed,]); Fundamental Immunology (基礎(chǔ)免疫學(xué))，(Lippincott Williams & Wilkins (1998)); 和Harlow等(Using Antibodies: A Laboratory Manual (抗體使用實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)).Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998))。
可將本發(fā)明鑒定VEGF-165蛋白使用的抗體以任何常規(guī)的方式 標(biāo)記。標(biāo)記物的實(shí)例是辣根過(guò)氧化物酶，標(biāo)記抗體的方法實(shí)例是通過(guò) 使用生物素-鏈霉抗生物素綴合物。.適當(dāng)時(shí)，可以以任何直4矣或間接的方式，將用作示蹤物的本發(fā) 明免疫測(cè)定法中使用的抗體進(jìn)^f亍標(biāo)記，使得產(chǎn)生可見的或能夠可見的 信號(hào)?？蓹z測(cè)的標(biāo)記物質(zhì)包括方欠射性核素，如力、1251和1311;熒光劑， 如異硫氰酸熒光素和其它熒光色素、藻膽蛋白質(zhì)、藻紅蛋白、稀土螯 合物、得克薩斯紅、丹酰(dansyl)和藍(lán)光堿性蕊香紅；比色劑 (colorimetricreagents)(色原體)；電子-不透明材料，如膠體金；生物發(fā) 光劑；化學(xué)發(fā)光劑；染料；酶，如辣根過(guò)氧化物酶、；咸性磷酸酶、葡 萄糖氧化酶、葡糖-6-磷酸脫氫酶、乙酰膽堿酯酶、a-、 P-半乳糖苷酶 等；輔酶；酶底物；酶輔因子；酶抑制劑；酶亞單位；金屬離子；游 離基；或者提供一種檢測(cè)或測(cè)定所形成的免疫復(fù)合物的存在或量的方 法的任何其它免疫學(xué)活性或惰性物質(zhì)。酶底物組合的實(shí)例是辣根過(guò)氧 化物酶和四曱基聯(lián)苯胺(TMB),以及石咸性磷酸酶和對(duì)硝基苯基磷酸酶
18(pNPP)。本發(fā)明另一種檢測(cè)和定量系統(tǒng)產(chǎn)生發(fā)光信號(hào)、生物發(fā)光(BL)或 化學(xué)發(fā)光(CL)。在化學(xué)發(fā)光(CL)或生物發(fā)光(BL)測(cè)定法中，測(cè)定密度 或總發(fā)射光，并與未知的分析物的濃度相關(guān)?？墒褂霉舛扔?jì)(作為檢測(cè) 器的光電倍增管)或電偶合裝置定量檢測(cè)光，或者通過(guò)照相或X-射線 薄膜定量。使用這種測(cè)定法的主要優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單并且分析靈敏，能夠測(cè) 定和/或定量極小量的分析物。發(fā)光標(biāo)記物的實(shí)例是吖啶鏡酯、吖啶鐠磺酰曱酰胺、魯米諾、傘 形酮、異氨基苯二酰肼(isoluminol)衍生物、發(fā)光蛋白，如水母素和源 于螢火蟲的螢光素酶、海產(chǎn)細(xì)菌、Varqulla和海腎螢光素酶(Renilla)。 可將魯米諾任選與增強(qiáng)劑分子，如4-碘苯酚或4-羥基桂皮酸一起使用。 CL信號(hào)一般通過(guò)在堿性條件下用氧化劑處理產(chǎn)生。
其它的發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)是那些其中信號(hào)(檢測(cè)標(biāo)記物)通過(guò)底物酶 反應(yīng)產(chǎn)生的系統(tǒng)。已研制出CL和BL檢測(cè)方案以檢測(cè)堿性磷酸酯酶 (AP)、葡萄糖氧化酶、葡萄糖6-磷酸脫氫酶、辣根過(guò)氧化物酶(HRP) 和黃嘌呤氧化酶標(biāo)記物等。AP和HRP是兩種酶標(biāo)記物，其可通過(guò)CL 和BL反應(yīng)的范圍定量。例如，可將AP與底物一起使用，如金剛烷 基1，2-二氧雜環(huán)丁烷芳基磷酸酯底物(例如AMPPD或CSPD; Kricka， LJ.， "Chemiluminescence and Bioluminescence， Analysis by (化學(xué)發(fā)光和 生物發(fā)光分析)，"Molecular Biology and Biotechnology (分子生物學(xué)和 生物工程)A Comprehensive Desk Reference (辦公桌參考大全)(ed. R.A. Meyers) (VCH Publishers; N.Y" N.Y.; 1995));例如，4-曱氧基-4隱(3-磷酸苯基)螺[l，2-二氧雜環(huán)丁烷-3,2，-金剛烷胺]二鈉鹽， 其帶有或不帶 有增強(qiáng)劑分子，如l-(三辛基轔曱基)-4-(三丁基轔曱基)苯二氯化物。 可將HRP與諸如2，，3，,6，-三氟苯基-甲氧基-10-曱基二氫化吖啶-9-羧酸 酯的底物一起使用。 CL和BL反應(yīng)不僅可適用于分析酶，還適用于分析其它底物、 輔因子、抑制劑、金屬離子等。例如，魯米諾、螢火蟲熒光素酶和海
19產(chǎn)細(xì)菌熒光素酶反應(yīng)物分別是產(chǎn)生或消耗過(guò)氧化物、ATP和NADPH 的指示劑反應(yīng)物?？蓪⑺鼈兣c涉及氧化酶、激酶和脫氫酶的其它反應(yīng) 偶聯(lián)，并可用于測(cè)定該偶聯(lián)反應(yīng)的任何組分(酶、底物、輔因子)。
可將檢測(cè)標(biāo)記直接或間4妾連接到本發(fā)明測(cè)定法中所用的抗體 上?？蓹z測(cè)的標(biāo)記的間接連接的實(shí)例是抗體和標(biāo)記物之間的結(jié)合對(duì)的 應(yīng)用或者信號(hào)擴(kuò)增系統(tǒng)的應(yīng)用。
白素、鏈霉抗生物素或抗生物素；卵白素/抗-卵白素；曱狀腺素/曱狀 腺素結(jié)合球蛋白；抗原/抗體；抗體/抗-抗體；碳水化合物/外源凝集素； 半抗原/抗-半抗原；染料和疏水性分子/疏水性蛋白結(jié)合位點(diǎn)；酶抑制 劑、輔酶或輔因子/酶；多核S^/同染色體多核酸序列；焚光素/抗-熒光 素；二硝基苯酚/抗-二硝基苯酚；維生素B12/內(nèi)在因子；可的松、氫 化可的松/氫化可的松結(jié)合蛋白；和特異性受體蛋白的配體/膜相關(guān)特 異性受體蛋白。標(biāo)記物與抗體直接或間*接連接的各種方法在本領(lǐng)域是熟知的。 例如，標(biāo)記物可以以共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵結(jié)合。抗體軛合方法的實(shí)例在 下列文獻(xiàn)中描述，Avarmeas等，Scan. J. Immunol. 8(Suppl. 7): 7， 1978; Bayer等，Meth. Enzymol. 62: 308, 1979; Chandler，等.，J. Immunol. Meth. 53:187， 1982; Ekeke和Abuknesha, J. Steroid Biochem. 11: 1579， 1979; Engvall和Perimann， J. Immunol. 109:129， 1972; Geoghegan等，Immunol. Comm. 7:1， 1978;和Wilson和Nakane，免疫熒光法和相關(guān)技術(shù) (Immunofluorescence and Related Techniques), Elsevier/North Holland Biomedical Press; Amsterdam (1978)。依據(jù)標(biāo)記物的性質(zhì)，可4吏用各種4支術(shù)檢測(cè)和定量標(biāo)記物。對(duì)于 熒光劑，可使用很多種熒光計(jì)。對(duì)于化學(xué)發(fā)光劑，可用光度計(jì)或膠片。 使用酶，可通過(guò)熒光分析、光度法、分光光度法或視覺(jué)上檢測(cè)或測(cè)定 熒光性、化學(xué)發(fā)光性或有色的產(chǎn)物。其它標(biāo)記物的實(shí)例是各種類型的具有吖啶輸、苯并吖啶鏡或雜環(huán)
20系統(tǒng)的二氫化吖啶類型的化學(xué)發(fā)光化合物。吖咬輸酯的實(shí)例包括那些 具有雜環(huán)或環(huán)系統(tǒng)的化合物，其具有正氧化態(tài)的雜原子，包括諸如下
列的環(huán)系統(tǒng)，如吖啶鐨、苯并[a]吖，定鏡、苯并[b]吖啶鏡、苯并[c]吖啶 鏘、苯并咪唑陽(yáng)離子、喹啉錄、、異會(huì)啉鏘、喹漆鏡(quinolizinium)、環(huán) 取代的喹啉鏡、菲啶輸和喹喔啉鏡。示蹤物可通過(guò)將所選擇的抗體直接或間接連接在吖啶輸或苯并 吖啶鏡酯上存在的活性官能團(tuán)上來(lái)制備，如本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方 法(參見，例如Weeks，等.，Clin. Chem. 29(8): 1474-1479， 1983)?；衔?的實(shí)例為帶有芳環(huán)離去基團(tuán)的吖啶鏡和苯并吖啶鏡酯，其在芳環(huán)的對(duì) 位或間位存在活性官能團(tuán)(參見，例如美國(guó)專利No. 4,745,181和WO 94/21823)。此處所用"涉及VEGF途徑療法"包括靶向VEGF途徑的任何 療法，包括抑制VEGF蛋白表達(dá)(例如反義寡核苷酸)、預(yù)防VEGFR 激活必要的膜定位或者抑制VEGFR的下游效應(yīng)器(例如Raf絲氨酸/ 蘇氨酸激酶)。涉及VEGF途徑療法包括多激酶抑制劑、酪氨酸激酶抑 制劑、單克隆抗體和二芳基脲。激酶抑制劑的實(shí)例是二芳基脲索拉非尼， 一種小分子并是新的 Raf (—種蛋白-絲氨酸/蘇氨酸激酶)和VEGFR (血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受 體， 一種受體酪氨酸激酶)的雙重作用抑制劑，并且因此是腫瘤細(xì)胞增 殖和血管生成兩種的抑制劑(Onyx Pharmaceuticals, Richmond, CA，和 Bayer Pharmaceuticals Corporation, West Haven, CT (USA); Lyons等， Endocrine-Related Cancer (內(nèi)分泌腺相關(guān)癌)8: 219-225, 2001)。另外， 已發(fā)現(xiàn)索拉非尼能抑制涉及腫瘤發(fā)展和新血管生成的數(shù)種其它受體 酪氨酸激酶，包括PDGFR-"、 Flt-3和c畫KIT。 PD166285 (Pfizer, Groton， CT)， 一種普通的酪氨酸激酶抑制劑，可對(duì)抗PDGF和FGF-2-介導(dǎo)的 響應(yīng)(Bansai,等.，J, Neuroscience Res. 74(4): 486-493, 2003)。
耙向于VEGF途徑的其它示例性療法包括Sutent/SUl 1248、PTK 787、 MLN518、 PKC-412、 CDP860和XL9999。 Sutent/SUl 1248 (蘋果酸舒尼替尼， 一種二氫吲哚-2-酮)(Pfizer, Groton, CT)靶向作用于受 體酪氨酸激酶(RTKs)，包括PDGFR,具有抗血管生成和抗腫瘤作用。 PDGFR通過(guò)調(diào)節(jié)外膜細(xì)胞的增殖和遷移而在培養(yǎng)血管生成中發(fā)揮明 顯作用，外膜細(xì)胞是一種支持血管的細(xì)胞，并且認(rèn)為Sutent/SU 11248 能抑制PDGFR的血管生成作用。 MLN518 (先前被稱為CT53518; Millenium Pharmaceuticals, Cambridge, MA)是一種口服的小分子，其被設(shè)計(jì)為抑制III型受體酪氨 酸激酶(RTKs)，包括PDGFR、 FLT3和c-Kit。 PKC-412 [米。朵妥林(midostaurin); N-苯曱?；?十字孢堿(十字孢 堿(staurosporine)的一種衍生物， 一種鏈霉菌屬細(xì)菌的產(chǎn)物)；Novartis, Basel,瑞士)抑制PDGFR、 VEGFR和多種蛋白激酶Cs，"其對(duì)帶有 PDGFR突變的野生型KIT的患者特別有效"(PKC 412-An Interview with Charles Blanke， MD， FACP (www.gistsupport.org/pkc412.html)， 還可參見Reichardt,等.，J, Clin. Oncol. 23(16S): 3016, 2005)。
XL999 [幾種鐠系選擇性激酶抑制劑TM (SSKIs)之一，源自 Exelixis (South San Francisco, CA, USA)]抑制VEGFR以及其它的 RTKs，如PDGFR-(3、 FGFR1和FLT3。
實(shí)施例此處所述的結(jié)構(gòu)、材料、組合物和方法均指本發(fā)明的代表性實(shí) 例，應(yīng)清楚的是本發(fā)明的范圍并不受限于所述實(shí)施例的范圍。本領(lǐng)域 技術(shù)人員將了解在實(shí)踐本發(fā)明時(shí)，可對(duì)所公開的結(jié)構(gòu)、材料、組合物 和方法進(jìn)行改變，并且這些改變被認(rèn)為在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。 ,滋夢(mèng)/2. 乂j6清^^M^^本賴g^^^關(guān)心凝^v漆定^x/5^
適合VEGF-165 ELISA分析的樣本包括用肝素鈉、杵檬酸鹽或 EDTA治療的人血漿以及人血清。由于可能的干擾因素，在人血清和 血漿的制備和測(cè)定中必須特別小心。在稀釋前，通過(guò)微量離心應(yīng)從樣 本中除去任何的絮凝劑。進(jìn)行檢測(cè)的血清或血漿樣本的初濃度應(yīng)該約 為12-13% (用樣本稀釋劑l:8稀釋樣品)。例如，可將40|nl樣本稀釋至 280pl樣本稀釋劑中，然后將100 |Lil加入到微量滴定板的各孔中。 橫#翔以下ELISA實(shí)驗(yàn)方案用于夾心ELISA (Oncogene Science, Cambridge, MA),以測(cè)定人血漿或血清中的人VEGF畫164。
1. 制備洗板的工作溶液(1X)(作為測(cè)試試劑盒的部分提供)。
2. 加入預(yù)稀釋的樣本和對(duì)照物，用吸量管向各適當(dāng)孔中加入100
(一式二份)的各個(gè)6個(gè)VEGF-165標(biāo)準(zhǔn)物(0-8000 pg/mL)，各樣本 和標(biāo)準(zhǔn)物使用干凈的吸管。將標(biāo)準(zhǔn)物0加入另一孔中，用作底物 空白的測(cè)定。
3. 用干凈的塑料外膜或平板蓋(sealer)覆蓋各孔。將微量滴定板在37°C
下孵育1.5小時(shí)。
4. 小心除去塑料外膜或平板蓋。用每孔300iiL洗板緩沖液洗滌各孔，
6個(gè)循環(huán)。(洗滌三個(gè)循環(huán)，將板旋轉(zhuǎn)180° ，然后再洗滌3個(gè)循 環(huán))。
5. 用吸量管向所有各孔中加入100 iLiL檢測(cè)抗體，除底物空白孔外，
該孔保持空的。然后用新塑料膜片覆蓋各孔。將微量滴定板在37°C 下孵育1小時(shí)。
6. 通過(guò)將適當(dāng)體積的綴合物濃縮液(1:50稀釋)稀釋成綴合物稀釋液，
制備工作綴合物。
7. 按步驟4洗滌各孔。立即進(jìn)行步驟8。
8. 用吸量管向所有各孔中加入100pL工作綴合物，除底物空白孔外，
該孔保持空的。然后用新塑料膜片覆蓋各孔。將微量滴定板在室 溫(20-27。C)下孵育1小時(shí)。9. 通過(guò)將等份溶液A和溶液B混合，制備工作底物。6mL各底物溶
液將提供12mL工作底物，足以展開一微量滴定板。根據(jù)所用的 條帶數(shù)，調(diào)節(jié)工作底物的體積。充分混合。
10. 將工作底物分配到潔凈試劑槽內(nèi)，使其達(dá)到室溫。
11. 按步驟5洗滌各孔。注意不允許使各板干燥。立即進(jìn)行步驟12。
12. 用吸量管向所有各孔中加入100pL工作底物，然后用塑料膜或平 板蓋覆蓋平板。將微量滴定板在室溫(20-27。C)下孵育45分鐘。
13. 用吸量管向所有各孔中加入100 itiL終止溶液。
14. 使用分光光度計(jì)的平板讀凄欠計(jì)，在650 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光 度。應(yīng)在加入終止溶液的30分鐘內(nèi)讀取各孔。
標(biāo)準(zhǔn)曲線通過(guò)使用VEGF-165標(biāo)準(zhǔn)品(重組人VEGF-165),在6個(gè)不同濃 度0、 150、 1000、 3000、 5000和8000 pg/ml下，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)進(jìn)
行定量分析。 人血清和血漿樣本冷凍血漿樣本從被證實(shí)患有非小細(xì)胞肺癌、并在用索拉非尼治 療前的患者中得到。
《滋辨2《《#'/、勿^單4,悉;#^^襲按照制造商指導(dǎo)，利用Oncogene Science VEGF-165 ELISA (Oncogene Science, Cambridge, MA)，用 一式二4分樣本測(cè)定VEGF-165 水平。對(duì)每名患者測(cè)定兩份測(cè)量結(jié)果的平均值。該研究中31名患者 的平均VEGF-165水平在表1中報(bào)告。表2表示各患者組中放射性測(cè) 定平均腫瘤皺縮度(shrinkage)。結(jié)果表明隨響應(yīng)索拉非尼治療后顯示 穩(wěn)定病情的患者中的平均VEGF-165水平為67.9 pg/ml。索拉非尼治 療后仍顯示發(fā)展性疾病的那些患者具有的平均VEGF-165水平為 227.2pg/ml。顯示穩(wěn)定病情的那些患者具有5.1%的平均腫瘤皺縮度， 而那些病情發(fā)展的患者具有20.6%的平均腫瘤生長(zhǎng)。這些結(jié)果可示于 圖1和2中。
24表1 : VEGF-165
穩(wěn)定的疾病 發(fā)展的疾病平均VEGF-165 (pg/ml)67.9227.2
ii238
表2:腫瘤皺縮度
穩(wěn)定的疾病 發(fā)展的疾病平均腫瘤皺縮率％-5.120.6
n228
SEM-3.17.6以上給出的本發(fā)明實(shí)施方案的描述目的在于示例性說(shuō)明和描 述。但其并非是窮舉的或者將本發(fā)明限定于所公開的精確形式，對(duì)于 以上公開內(nèi)容，可能存在很多明顯的修飾和改變。選擇和描述所述實(shí) 施方案是為了解釋本發(fā)明的機(jī)理及其實(shí)際用途，以使得本領(lǐng)域其它技 術(shù)人員能夠利用適于所涉及的具體用途時(shí)的各種實(shí)施方案以及帶有 各種修飾的各實(shí)施方案中的本發(fā)明。在此摘？ 1的所有參考文獻(xiàn)均結(jié)合 到本發(fā)明中作為參考。
2權(quán)利要求
1. 一種監(jiān)測(cè)患者中與VEGF-165途徑有關(guān)的疾病狀態(tài)和/或監(jiān)測(cè)患有該病的患者如何響應(yīng)治療的方法，其包括在所取的患者樣本中免疫性檢測(cè)和定量VEGF-165蛋白水平的隨時(shí)間推移的系列變化，其中VEGF-165蛋白水平隨時(shí)間推移的增加表明疾病的發(fā)展和對(duì)該療法的負(fù)性反應(yīng)，而其中VEGF-165蛋白水平隨時(shí)間推移的降低表明疾病的減輕和對(duì)該療法的正性反應(yīng)。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述療法選自多激酶抑制劑、酪氨酸 激酶抑制劑、單克隆抗體和二芳基脲。
3. 權(quán)利要求1的方法，其中所述療法是一種涉及VEGF-165途徑 的療法。
4. 權(quán)利要求2的方法，其中所述涉及VEGF-165途徑的療法是酪 氨酸激酶抑制劑曱磺酸伊馬替尼或二芳基脲索拉非尼。
5. 權(quán)利要求1的方法，其中所述疾病是腫瘤形成前/腫瘤形成疾病。
6. 權(quán)利要求5的方法，其中所述腫瘤形成前/腫瘤形成疾病選自 轉(zhuǎn)移性成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、隆凸性皮膚纖維肉瘤、胃腸基質(zhì)瘤、結(jié)腸直 腸癌、結(jié)腸癌、肺癌、非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、慢性骨髓增生性 疾病、急性骨髓性白血病、曱狀腺癌、胰腺癌、膀胱癌、腎癌、黑素 瘤、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌、頭頸癌、腦瘤、肝細(xì)胞癌、 血液惡性腫瘤和導(dǎo)致上述癌癥的前期癌。
7. 權(quán)利要求1的方法，該方法還用于所述疾病的預(yù)后，其中患者 樣本中的VEGF-165蛋白水平預(yù)示所述患者的較好或較差預(yù)后。
8. 權(quán)利要求7的方法，其中所述預(yù)后是選自下列的臨床后果響 應(yīng)率(RR)、完全響應(yīng)(CR)、部分響應(yīng)(PR)、穩(wěn)定的疾病(SD)、進(jìn)展時(shí) 間(TTP)、無(wú)疾病進(jìn)展存活期(PFS)、總存活期(OS)和臨床益處，其包 括完全響應(yīng)(CR)、部分響應(yīng)(PR)和穩(wěn)定的疾病(SD)。
9. 權(quán)利要求7的方法，其中VEGF-165水平的增加預(yù)示早期復(fù)發(fā) 或肺瘤轉(zhuǎn)移的可能性較大。
10. 權(quán)利要求l的方法，其中所述患者的樣本是治療前樣本。
11. 權(quán)利要求1的方法，其中所述患者樣本選自血液、血清、血 漿、尿、唾液、精液、乳房分;必液、腦脊髓液、眼淚、痰、粘液、淋 巴、細(xì)胞溶膠、腹水、胸膜滲出液、羊水、膀胱洗液和細(xì)支氣管肺泡 灌洗液。
12. 權(quán)利要求1的方法，其中所述體液是血清或血漿。
13. 權(quán)利要求1的方法，其中所述免疫學(xué)^r測(cè)和定量是通過(guò)夾心 ELISA或等同的測(cè)定法形式的免疫測(cè)定法進(jìn)行的。
14. 權(quán)利要求13的方法，其中所述夾心ELISA或等同的測(cè)定法 包括使用一或多種選擇性結(jié)合VEGF-165蛋白的單克隆抗體。
15. 權(quán)利要求1的方法，其還包括使用一種免疫測(cè)定法檢測(cè)或者 檢測(cè)和定量患者樣本中的 一或多種其它蛋白水平。
16. 權(quán)利要求15的方法，其中所述其它蛋白選自抑制劑、癌蛋白、 生長(zhǎng)因子受體、血管生成因子、轉(zhuǎn)移蛋白、腫瘤標(biāo)記物和腫瘤抑制劑。
17. 權(quán)利要求16的方法，其中所述抑制劑是金屬蛋白酶-1的組 織抑制劑(TIMP-1 )，所述癌蛋白選自HER-2/neu和rasp21，所述生長(zhǎng) 因子受體選自表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)和血小板衍生的生長(zhǎng)因子受 體a(PDGFR-a)，所述血管生成因子是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF),所 述轉(zhuǎn)移蛋白是尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA),所述腫瘤標(biāo)記物是癌 胚抗原(CEA),而所述腫瘤抑制劑是p53。
18. —種對(duì)患病病人的治療選擇方法，其包括(a) 對(duì)取自對(duì)照群體中各個(gè)體的對(duì)照樣本中的VEGF-165蛋白的 平均水平進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)和定量；(b) 對(duì)取自患者的等量患者樣本中的VEGF-165蛋白水平隨時(shí)間 推移的系列變化進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)和定量；(c) 將患者樣本中VEGF-165蛋白水平與對(duì)照樣本中VEGF-165蛋白的平均水平相比較；和(d)根據(jù)患者樣本中的VEGF-165蛋白水平與對(duì)照樣本中 VEGF-165蛋白的平均水平之間的差另，J，并根據(jù)患者樣本中VEGF-165 蛋白水平的系列變化，確定是否使用常規(guī)療法和/或涉及VEGF-165途 徑的療法治療患者。
19. 權(quán)利要求18的方法，其中所述患者的樣本是預(yù)處理樣本。
20. 權(quán)利要求18的方法，該方法還用于所述疾病的預(yù)后，其中患 者樣本中的VEGF-165蛋白水平預(yù)示所述患者的較好或較差的預(yù)后。
21. 權(quán)利要求20的方法，其中所述預(yù)后是選自下列的臨床后果 響應(yīng)率(RR)、完全響應(yīng)(CR)、部分響應(yīng)(PR)、穩(wěn)定的疾病(SD)、進(jìn)展 時(shí)間(TTP)、無(wú)疾病進(jìn)展存活期(PFS)、總存活期(OS)和臨床益處，其 包括完全響應(yīng)(CR)、部分響應(yīng)(PR)和穩(wěn)定的疾病(SD)。
22. 權(quán)利要求18的方法，其中所述疾病是腫瘤形成前/腫瘤形成 疾病。
23. 權(quán)利要求22的方法，其中所述腫瘤形成前/腫瘤形成疾病選 自轉(zhuǎn)移性成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、隆凸性皮膚纖維肉瘤、胃腸基質(zhì)瘤、結(jié)腸 直腸癌、結(jié)腸癌、肺癌、非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、慢性骨髓增生 性疾病、急性骨髓性白血病、曱狀腺癌、胰腺癌、膀胱癌、腎癌、黑 素瘤、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌、頭頸癌、腦瘤、肝細(xì)胞 癌、血液惡性腫瘤和導(dǎo)致上述癌癥的前期癌。
24. 權(quán)利要求18的方法，其中所述患者樣本來(lái)自對(duì)治療沒(méi)有響應(yīng) 的癌癥患者。
25. 權(quán)利要求18的方法，其還包括測(cè)定或測(cè)定并定量患者樣本中 一或多種其它蛋白的水平的免疫檢測(cè)法的用途。
26. 權(quán)利要求25的方法，其中所述其它蛋白是或者所述其它蛋白 選自抑制劑、癌蛋白、生長(zhǎng)因子受體、血管生成因子、轉(zhuǎn)移蛋白、肺 瘤標(biāo)記物和腫瘤抑制劑。
27. 權(quán)利要求26的方法，其中所述抑制劑是金屬蛋白酶-1的組織抑制劑(TIMP-1 ),所述癌蛋白選自HER-2/neu和rasp21，所述生長(zhǎng) 因子受體選自表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)和血,J、板衍生的生長(zhǎng)因子受 體oc(PDGFR-a)，所述血管生成因子是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，所 述轉(zhuǎn)移蛋白是尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)，所述腫瘤標(biāo)記物是癌 胚抗原(CEA)，而所述腫瘤抑制劑是p53。
28. —種在患者中檢測(cè)與VEGF-165途徑相關(guān)的疾病的診斷方 法，其包括(a) 對(duì)取自對(duì)照群體中各個(gè)體的對(duì)照樣本中的VEGF-165蛋白的 平均水平進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)和定量；(b) 對(duì)取自患者的患者樣本中的VEGF-165蛋白隨時(shí)間推移的系 列變化進(jìn)行免疫學(xué)4企測(cè)和定量；和(c) 將患者樣本中VEGF-165蛋白水平與對(duì)照樣本中VEGF-165 蛋白的平均水平相比較；其中患者樣本中VEGF-165蛋白水平高于對(duì)照樣本中VEGF-165 蛋白的平均水平為患者中激活的VEGF-165途徑和存在疾病的指征。
29. 權(quán)利要求28的方法，其中步驟(a)和(b)的所述免疫學(xué)檢測(cè)和 定量是通過(guò)夾心ELISA或等同的測(cè)定法形式的免疫測(cè)定法進(jìn)行的。
30. 權(quán)利要求28的方法，該方法還用于所述疾病的預(yù)后，其中患 者樣本中的VEGF-165蛋白水平為所述患者的較好或較差預(yù)后的指 征。
31. 權(quán)利要求30的方法，其中所述預(yù)后是一種選自下列的臨床結(jié) 果響應(yīng)率(RR)、完全響應(yīng)(CR)、部分響應(yīng)(PR)、穩(wěn)定的疾病(SD)、 進(jìn)展時(shí)間(TTP)、無(wú)疾病進(jìn)展存活期(PFS)、總存活期(OS)和臨床益處， 其包括完全響應(yīng)(CR)、部分響應(yīng)(PR)和穩(wěn)定的疾病(SD)。
32. 權(quán)利要求28的方法，其中所述疾病是腫瘤形成前/腫瘤形成 疾病。
33. 權(quán)利要求32的方法，其中與激活的PDGF途徑相關(guān)的所述腫 瘤形成前/腫瘤形成疾病選自轉(zhuǎn)移性成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、胃腸基質(zhì)瘤、隆凸性皮膚纖維肉瘤、結(jié)腸直腸癌、結(jié)腸癌、肺癌、非小細(xì)胞肺癌、小 細(xì)胞肺癌、慢性骨髓增生性疾病、急性骨髓性白血病、曱狀腺癌、胰 腺癌、膀胱癌、腎癌、黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌、 頭頸癌、腦瘤、肝細(xì)胞癌、血液惡性腫瘤和導(dǎo)致上述癌癥的前期癌。
34. 權(quán)利要求28的方法，其還包括測(cè)定或測(cè)定并定量患者樣本中 一或多種其它蛋白的水平的免疫檢測(cè)法的用途。
35. 權(quán)利要求34的方法，其中所述其它蛋白是或者所述其它蛋白 選自抑制劑、癌蛋白、生長(zhǎng)因子受體、血管生成因子、轉(zhuǎn)移蛋白、腫 瘤標(biāo)記物和肺瘤抑制劑。
36. 權(quán)利要求35的方法，其中所述抑制劑是金屬蛋白酶-1的組 織抑制劑(TIMP-1)，所述癌蛋白選自HER-2/neu和rasp21，所述生長(zhǎng) 因子受體選自表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)和血小板衍生的生長(zhǎng)因子受 體a(PDGFR-a)，所述血管生成因子是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF),所 述轉(zhuǎn)移蛋白是尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)，所述腫瘤標(biāo)記物是癌 胚抗原(CEA)，而所述腫瘤抑制劑是p53。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物標(biāo)記物、用于預(yù)見和預(yù)測(cè)癌癥的生物標(biāo)記物的用途以及用于監(jiān)測(cè)癌癥治療效果的生物標(biāo)記物的用途。具體地講，本發(fā)明涉及作為多激酶抑制劑的生物標(biāo)記物的VEGF-165的用途。
文檔編號(hào)C12N5/06GK101506351SQ200680047741
公開日2009年8月12日 申請(qǐng)日期2006年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月21日
發(fā)明者J·J·埃爾廷, P·J·哈默, W·P·卡尼 申請(qǐng)人:拜爾健康護(hù)理有限責(zé)任公司