專利名稱：膜轉(zhuǎn)位肽的制作方法
膜轉(zhuǎn)位肽發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及分離被稱為膜轉(zhuǎn)位肽(MTPs)的新型化合物的方法。該MTPs 的特征在于，具有將其自身及與MTP結(jié)合的非轉(zhuǎn)位部分轉(zhuǎn)運(yùn)穿過膜的能力。
背景技術(shù)：
將核酸、蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、小分子、病毒等(下文將被共同稱為"非 轉(zhuǎn)位部分")遞送至細(xì)胞內(nèi)或遞送至特定類型的細(xì)胞內(nèi)的能力可用于腫瘤學(xué)、發(fā) 育生物學(xué)和基因治療的多種應(yīng)用，以及對(duì)模型系統(tǒng)中特定蛋白質(zhì)、核酸和小分 子的操作模式的一般性理解也有用。大多數(shù)重要的治療性蛋白質(zhì)和肽不易于轉(zhuǎn) 位穿過生物膜。然而，已發(fā)現(xiàn)一些反式激活因子和同源異型蛋白能夠促進(jìn)膜轉(zhuǎn) 位，其中包括Tat衍生肽(Fawell & 1994 Prac. M^/. 5W. t/SJ91:664-668)、觸角足同源結(jié)構(gòu)域蛋白的第三螺旋(Derossi"a/.， 1994， J!5/o/.C/^附. 269:10444-10450; U.S. Pat. Nos. 5,888,762 and 6,015,787)和VP22 (Schwarze "/.， 2000, 7>e"(is T^(^maco/. 5W. 21:45-48)。這些天然衍生的肽一般被隔離于細(xì)胞 質(zhì)中的膜囊中，這常常阻止結(jié)合的非轉(zhuǎn)位部分接近其預(yù)期的靶(Potocky w d 2003, J6oz7 278:50188-94)。目前，通過兩種不同的途徑來工程化新型肽。第一種途徑通過化學(xué)合成6-10 個(gè)氨基酸肽的隨機(jī)文庫來生成候選肽(J.Eichler W a/., 1995， i 饑化v.15:481-496; K丄am, 1996,爿油c朋cw Dn/gDm. 12:145-167; M. Lebl W 1997, e"巧/wo/. 289:336-392)。第二種途徑中，通過將隨機(jī)的寡核苷酸文庫克 隆至Ff絲狀噬菌體基因中而合成候選肽，這樣使得更大的肽在噬菌體的表面表 達(dá)(H. Lowman， 1997,^4"". i ev. fifop/2ys. 5wmo/. Sfn^cf, 26:401-424; G. Smith ef o/.， 1993, Me仇￡/iz. 217:228-257)。也已經(jīng)制備出長度高達(dá)38個(gè)氨基酸的隨機(jī)肽文 庫，而且使用該系統(tǒng)，有可能制備出更長的肽。使用上述兩種策略任意一種制 備的肽文庫隨后通常與預(yù)選的結(jié)合基質(zhì)的蛋白靶相混合。洗脫結(jié)合的肽，并確 定其序列。根據(jù)這一信息，合成新的肽，并確定其生物學(xué)特性。噬菌體展示以 往被用來鑒定轉(zhuǎn)位蛋白，但是通過這種方法分離出的肽相對(duì)很少，并且那些已經(jīng)分離到的肽通常為細(xì)胞類型特異性的肽，并需要通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞(Gao e^/. 2002，MW C/ ew.， 10:4057-65)。肽依賴內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞的現(xiàn)有技 術(shù)的缺點(diǎn)之一是，這種機(jī)制導(dǎo)致轉(zhuǎn)位肽及結(jié)合的非轉(zhuǎn)位部分進(jìn)入包含體，在包 含體中他們均將遭到破壞，從而不能引起所需的細(xì)胞作用?，F(xiàn)有技術(shù)的又一缺點(diǎn)在于，通過噬菌體展示和化學(xué)合成而產(chǎn)生的文庫的容 量限制在106-109范圍內(nèi)。如果不繼而使用費(fèi)時(shí)的突變過程，這一限制導(dǎo)致較低 親和力肽的分離。上述文庫容量方面的限制導(dǎo)致了體外生成肽文庫技術(shù)的發(fā)展， 其中包括mRNA展示(Roberts, & Szostak, 1997, /Voc. A^/. 5W. C7&4， 94， 12297-12302)、核糖體展示(Mattheakis e "/., 1994,iVw/.C7&4， 91, 9022-9026)、和順式(CIS)展示(Odegrip ef a/.， 2004,尸rac. iVa" jcad [/&4, 101 2806-2810)等等。這些文庫優(yōu)于噬菌體展示文庫的方面在于通過該方法產(chǎn) 生的文庫容量比通過噬菌體展示而可能產(chǎn)生的文庫容量要大2至3個(gè)數(shù)量級(jí)。 其原因是，不同于諸如噬菌體展示等技術(shù)，其中不存在中間的體內(nèi)步驟。然而，目前還沒有記載使用體外展示系統(tǒng)而特異性和選擇性地鑒定膜轉(zhuǎn)位 肽(MTPs)的方法。而且，這種方法能鑒定可穿過細(xì)胞層(例如內(nèi)皮)的MTPs。因此，仍需能在MTP發(fā)現(xiàn)和肽藥物開發(fā)領(lǐng)域提供具有需要的較大進(jìn)步的方法。發(fā)明概述本發(fā)明提供了選擇被稱為膜轉(zhuǎn)位蛋白或MTP的新化合物的方法，該新的化 合物可將其自身和非轉(zhuǎn)位部分轉(zhuǎn)位穿過如細(xì)胞膜的脂膜。根據(jù)其有效地將結(jié)合 的部分納入膜包裹的隔室內(nèi)的能力來選擇本發(fā)明的MTP，所述隔室包括體內(nèi)和 體外的很多細(xì)胞類型。所鑒定的本發(fā)明MTP也可包括用于診斷和治療目的的分子。因此，本發(fā)明的第一方面提供了從肽展示文庫中分離顯示膜轉(zhuǎn)位活性的化 合物的方法，其中所述文庫包括多種編碼展示肽的核酸序列，且該方法包括如 下歩驟a)表達(dá)多種核酸構(gòu)建體，其中，每個(gè)核酸構(gòu)建體包括可操作地連接至核酸序列的啟動(dòng)子序列，如此 以來，多種核酸構(gòu)建體的表達(dá)導(dǎo)致了多種核酸-肽偶聯(lián)體的形成，且每一偶聯(lián)體包括至少一種展示肽，其中所述的展示肽與編碼展示肽的相應(yīng)核酸構(gòu)建體相結(jié) 合.b) 將多個(gè)核酸-肽偶聯(lián)體暴露于膜包裹的隔室群，從而使轉(zhuǎn)位反應(yīng)發(fā)生；c) 移除與膜包裹的隔室未結(jié)合的核酸-肽偶聯(lián)體；以及d) 從膜包裹的隔室中回收被納入的核酸-肽偶聯(lián)體，并且當(dāng)包括膜轉(zhuǎn)位蛋白 (MTP)時(shí)，表征核酸序列編碼的肽。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，膜包裹的隔室為細(xì)胞。因此，本發(fā)明提供了 從肽展示文庫中分離顯示細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位活性的化合物的方法，其中所述文庫包括 多種編碼展示肽的核酸序列，且該方法包括如下步驟a) 表達(dá)多種核酸構(gòu)建體，其中，每個(gè)核酸構(gòu)建體包括可操作地連接至核酸序列的啟動(dòng)子序列，如此 以來，多種核酸構(gòu)建體的表達(dá)導(dǎo)致多種核酸-肽偶聯(lián)體的形成，且每一偶聯(lián)體包 括至少一種肽，其中所述的肽與編碼展示肽的相應(yīng)核酸構(gòu)建體相結(jié)合；b) 將多個(gè)核酸-肽偶聯(lián)體暴露于一種或一種以上的細(xì)胞類型，從而使轉(zhuǎn)位反 應(yīng)發(fā)生；C)移除與一種或多種細(xì)胞類型未結(jié)合的核酸-肽偶聯(lián)體；以及d)從細(xì)胞中回收被納入的核酸-肽偶聯(lián)體，并且當(dāng)包括膜轉(zhuǎn)位蛋白(MTP)時(shí)，表征核酸序列編碼的肽。在另一個(gè)實(shí)施方式中，膜包裹的隔室優(yōu)選為脂質(zhì)囊。例如，人工構(gòu)建的脂質(zhì)包裹的隔室，如微團(tuán)或脂質(zhì)體。優(yōu)選地，脂質(zhì)囊是脂質(zhì)體。優(yōu)選地，膜包括脂雙層。在上述發(fā)明的另一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述方法在(c)后進(jìn)一步包括移除 核酸-肽偶聯(lián)體的步驟，其中所述的核酸-肽偶聯(lián)體連結(jié)至膜包裹隔室(例如，脂 質(zhì)體或一種或一種以上的細(xì)胞類型)表面，但沒有被納入隔室。因此，本發(fā)明 的方法優(yōu)選地進(jìn)一步包括步驟(C')移除與細(xì)胞表面結(jié)合的核酸-肽偶聯(lián)體。該 實(shí)施方式相對(duì)噬菌體展示而言顯示了本技術(shù)領(lǐng)域的顯著進(jìn)步，因?yàn)槠鋮^(qū)分了表 面結(jié)合的MTPs和被納入的MTPs。令人驚喜的是，這顯著提高了經(jīng)過一輪、兩 輪或多輪的選擇之后被鑒定出的MTPs的數(shù)目。確實(shí)，在對(duì)順式(CIS)展示文 庫進(jìn)行5輪選擇后，9/23的肽被鑒定為MTPs (實(shí)施例1)。相反，通常在用于6鑒定MTPs的噬菌體展示選擇中，只發(fā)現(xiàn)了很少數(shù)量的MTPs (Gao 2002, 所owg.C/ze附.10:4057-4065)。在另一實(shí)施方式中，所選擇的MTP的膜轉(zhuǎn)位活性不涉及或不需要內(nèi)吞作用。 優(yōu)選地，MTP能在無內(nèi)吞機(jī)制的情況下穿過靶膜。因而，在優(yōu)選的方法中，所 述的一種或一種以上的細(xì)胞類型是沒有內(nèi)吞能力的，例如紅血細(xì)胞。本發(fā)明的另一方面提供了通過本發(fā)明的方法所鑒定的MTP。優(yōu)選地，MTP 為被分離的肽。本發(fā)明進(jìn)一步包括本發(fā)明的MTP的衍生物。在另一優(yōu)選的實(shí)施 方式中，本發(fā)明的MTP或衍生物連接、結(jié)合或者附著/偶聯(lián)至非轉(zhuǎn)位部分。如以 下詳述，非轉(zhuǎn)位部分可為肽、核酸或另一化合物。優(yōu)點(diǎn)在于，上述連接、結(jié)合、 附著或偶聯(lián)的方式易于通過酶促反應(yīng)或其它的化學(xué)方法/降解而被斷裂。如果轉(zhuǎn)位是單向的，至少對(duì)于轉(zhuǎn)位穿過膜的化合物的部分是單向的，則是 優(yōu)選的。這樣是有好處的，因?yàn)镸TP可能能夠轉(zhuǎn)位進(jìn)入膜包裹的隔室或從膜包 裹的隔室轉(zhuǎn)位出來。因而， 一旦MTP轉(zhuǎn)位至膜包裹的隔室內(nèi)，至少肽的一部分 保留在隔室中。保留在隔室中的肽的一部分可為MTP本身、結(jié)合的非轉(zhuǎn)位部分、 或者M(jìn)TP和非轉(zhuǎn)位部分兩者。優(yōu)選地，至少非轉(zhuǎn)位部分保留在膜包裹的隔室例 如靶細(xì)胞中。因此，更優(yōu)選地，MTP連接、結(jié)合或者附著/偶聯(lián)至(例如通過可 斷裂的鍵的方式)非轉(zhuǎn)位部分，且在轉(zhuǎn)位至膜包裹的隔室中之后，非轉(zhuǎn)位部分 從MTP釋放至隔室或細(xì)胞。方便的是，非轉(zhuǎn)位部分的釋放是通過酶切或化學(xué)方 法，例如化學(xué)降解，這些將在下文中有進(jìn)一步的描述。本發(fā)明進(jìn)一步提供包括MTP的治療性分子，其中所述的MTP偶聯(lián)至或功 能性地連接至治療性分子，例如治療性肽或核酸。方便的是，治療性分子為如 上所述的非轉(zhuǎn)位部分，其包括用作診斷劑或治療劑的任何化合物。非轉(zhuǎn)位部分和潛在性治療性分子的非限制性實(shí)例包括核酸(例如siRNA分 子)、酶、激素、細(xì)胞因子、抗體或抗體片段、肽片段(例如抗體識(shí)別的肽)、 止痛劑、退熱劑、抗炎劑、抗生素、抗病毒劑、抗真菌藥物、心血管藥物、影 響腎功能和電解質(zhì)新陳代謝的藥物、作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥物和化療藥物等 等。本發(fā)明的又一方面提供了包括編碼本發(fā)明MTP的核酸序列的核酸分子，該 核酸序列任選地進(jìn)一步編碼非轉(zhuǎn)位肽或非轉(zhuǎn)位部分，并任選地進(jìn)一步包括調(diào)節(jié) 性核酸序列。同時(shí)也提供了包含本發(fā)明核酸分子的表達(dá)載體。本發(fā)明的又一方面提供了一種組合物(例如治療性組合物)，其包括膜包裹的隔室(例如脂質(zhì)體)和本發(fā)明的MTP。優(yōu)選地，該組合物進(jìn)一步包括偶聯(lián)至 MTP的非轉(zhuǎn)位部分。最優(yōu)選地，非轉(zhuǎn)位部分是治療性分子。進(jìn)一步優(yōu)選地，治 療性組合物是通過將一種或一種以上的治療性分子或/和本發(fā)明的MTP，或者兩 者一起添加至一種或一種以上脂質(zhì)體的制劑中并使轉(zhuǎn)位發(fā)生而制備的。本發(fā)明的MTP文庫由例如肽或肽的衍生物(如由天然的或非天然的氨基酸 組成的肽模擬物和肽類似物)組成。根據(jù)本發(fā)明，通過本發(fā)明分離的膜轉(zhuǎn)位肽 (MTP)優(yōu)選為非天然的氨基酸序列，其能越過或橫跨脂質(zhì)膜，優(yōu)選地，越過 或橫跨脂雙層。通常，本發(fā)明的MTP能越過靶膜，從而肽被釋放至膜內(nèi)空間，即細(xì)胞的胞 質(zhì)溶膠或脂質(zhì)體的內(nèi)空間。然而，在某些情況下，MTP可僅僅嵌入至靶膜中， 進(jìn)而其能橫跨膜。在這種情況下，至少M(fèi)TP的一部分處于膜中，優(yōu)選地，至少 MTP的一部分和/或結(jié)合的非轉(zhuǎn)位部分中的一種處于內(nèi)膜空間中。優(yōu)選地，本發(fā) 明的MTP能越過靶膜并進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，例如紅血細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。優(yōu)選地，MTP 為大約2-25個(gè)或大約8-20個(gè)氨基酸殘基的非天然氨基酸序列。優(yōu)選地，通過本發(fā)明的方法來選擇這些化合物，以進(jìn)入膜包裹的隔室(例 如目標(biāo)細(xì)胞)，同時(shí)保持與編碼性核酸連接，從而也將核酸轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)。這些化合物的特異性實(shí)例包括線性肽或環(huán)肽(優(yōu)選的長度為2-25個(gè)氨基酸 或大約8-20個(gè)氨基酸殘基)、上述線性肽和環(huán)肽的組合(任選地，肽在N端或C 端、或兩端有修飾)、及其鹽和衍生物、其功能性類似物、和在序列的末端帶有 氨基酸或多肽的延長的肽鏈。根據(jù)本發(fā)明，體外肽展示文庫通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適方法而制得。 例如，體外產(chǎn)生的核酸-肽偶聯(lián)體的文庫可通過下述合適的方法而適宜地產(chǎn)生， 例如Robert, & Szostak (1997,Ato/. ^cad 94, 12297-12302)、Mattheakis ef a/"(1994, iVa".爿cad Sci, 91,9022國9026)和Odegrip ""/.，(2004,戶rac. 7V"f/. ^cad t/&4, 101 2806-2810)以及WO2004/022746所描述 的方法。諸如在文庫的最大庫容在噬菌體展示技術(shù)或化學(xué)合成的限度內(nèi)的某些 情況下，這些方法可擇一使用。然后根據(jù)轉(zhuǎn)位越過(或至少為橫跨)靶膜例如 目標(biāo)類型細(xì)胞的膜的能力，對(duì)體外產(chǎn)生的核酸-肽偶聯(lián)體的文庫進(jìn)行選擇。在本發(fā)明所述方法的另一步驟中，編碼MTP的文庫成員通過使用合適的核 酸酶或蛋白酶或其兩者的結(jié)合，從靶膜或細(xì)胞的表面移除編碼非膜轉(zhuǎn)位肽的核 酸-肽偶聯(lián)體而被進(jìn)一步選擇。然后回收和表征能越過膜，進(jìn)而進(jìn)入細(xì)胞或囊(例 如脂質(zhì)體)，并將結(jié)合的核酸部分轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞的MTP。本發(fā)明還提供了編碼MTP的核酸-肽偶聯(lián)體的選擇，其中的MTP連接至兩 種或更多種MTP或本領(lǐng)域技術(shù)人員可想到的其它任何組合上。例如，核酸序列 文庫的一個(gè)或一個(gè)以上(優(yōu)選"每個(gè)")成員可編碼2、 3、 4或更多MTP或潛 在的MTP序列。本發(fā)明進(jìn)一步提供了編碼連接至兩種或更多種非轉(zhuǎn)位部分的 MTP的核酸-肽偶聯(lián)體的選擇。本文引用的所有文獻(xiàn)以整體引用的方式納入本文。如果沒有特別限定，本 文所有的技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所述領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的 含義。本發(fā)明通過附圖進(jìn)一步說明，其中

圖1顯示非固定的Jurkat細(xì)胞的FACS分析和熒光顯微觀察。肽7、 13和 19為通過本發(fā)明的方法分離的膜轉(zhuǎn)位肽。肽24為陰性對(duì)照FLAG表位肽。圖2顯示了通過本發(fā)明的方法所選擇出的膜轉(zhuǎn)位肽與已知的HIV-TAT的膜 轉(zhuǎn)位肽之間的肽序列比較。詳細(xì)描述為了有助于理解本發(fā)明，本文對(duì)幾個(gè)術(shù)語進(jìn)行了定義。本文所用的"肽"、"膜轉(zhuǎn)位肽"或"MTP"是指以線性鏈的形式連接在一 起的多個(gè)氨基酸，包括二肽、三肽、寡肽和多肽。二肽包括兩個(gè)氨基酸；三肽 包括3個(gè)氨基酸；寡肽通常是指具有2至大約50個(gè)或更多個(gè)氨基酸的肽。大于 50個(gè)氨基酸的肽通常被稱為多肽或蛋白質(zhì)。本發(fā)明的"肽"和"膜轉(zhuǎn)位肽"或 "MTP"不被限制于任何特定的氨基酸數(shù)目。優(yōu)選地，它們包含約2-約50或約 2-約40個(gè)氨基酸，更優(yōu)選地，它們包括約2-約30個(gè)氨基酸或約2-約25個(gè)氨基 酸。最優(yōu)選地，肽或MTP包括約2-約20個(gè)氨基酸或約8-約20個(gè)氨基酸。例如， 本發(fā)明所鑒定的MTP的長度可為18、 19、 20、 21、 22、 23、 24或25個(gè)氨基酸， 通常，蛋白質(zhì)的膜橫跨結(jié)構(gòu)域的長度是22-25個(gè)氨基酸，因此，特別在MTP橫 跨而非越過靶膜的情況下，MTP的長度可為22、 23、 24或25個(gè)氨基酸。本文所用的"膜轉(zhuǎn)位肽"(MTP)是指氨基酸序列(如上所述)，其可包含 天然氨基酸和非天然的氨基酸。所以，所謂的"肽模擬物"和"肽類似物"在 本發(fā)明的上下文中也可為"膜轉(zhuǎn)位肽"，其中所述的"肽模擬物"和"肽類似物" 可包括模擬特定氨基酸或肽的非氨基酸性的化學(xué)結(jié)構(gòu)。該模擬物或類似物的特 性通常表現(xiàn)為相似的物理性質(zhì)，諸如大小、帶電性或疏水性，以及在他們的天 然肽對(duì)等物中所發(fā)現(xiàn)的合適的空間定位。肽模擬化合物的特定實(shí)例是其中的一 個(gè)或多個(gè)氨基酸之間的酰胺鍵被例如為碳-碳鍵或其它非酰胺鍵的鍵所替代的化 合物，這是本領(lǐng)域所熟知的(例如，見尸e/ "fifeBasWDn/gr^/g/z, pp. 378-422， ACS, Washington D.C. 1995中的Sawyer)。本發(fā)明針對(duì)從肽群(或肽庫)中鑒定和表征MTP， g卩，在核酸序列文庫中 表達(dá)的潛在的或假定的MTP。盡管本文用到術(shù)語"肽"，應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明 并不排除那些可能按照傳統(tǒng)的命名法而被恰當(dāng)?shù)胤Q為多肽或蛋白質(zhì)的MTP或更 大的肽結(jié)構(gòu)域和基序的鑒定。進(jìn)一步地，術(shù)語"膜轉(zhuǎn)位肽"(MTP)可包括越過膜的肽，從而MTP以及 任何結(jié)合的非轉(zhuǎn)位部分從膜的一邊穿過到膜的另一邊，并且，該術(shù)語也可包括 僅僅"橫跨"靶膜的肽。"橫跨"是指，MTP可插入(或貫穿)靶膜，從而至少 MTP的一部分留在膜中。因此，例如，通過本發(fā)明的方法選擇的MTP可橫跨靶 膜，從而導(dǎo)致了 MTP的一部分留在膜(或脂雙層)中以及MTP的一部分或結(jié) 合的非轉(zhuǎn)位部分被納入(即被發(fā)現(xiàn)位于各自囊或細(xì)胞的內(nèi)部)。然而優(yōu)選地，本 發(fā)明的MTP越過靶膜，從膜的一側(cè)穿過到另一側(cè)。有一種形式是，本發(fā)明的 MTP能越過多個(gè)膜，例如多層Caco-2細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞，這樣，MTP能從組織 的一側(cè)移動(dòng)到組織的另一側(cè)或到組織的層中。MTP的"衍生物"是指能將自身和任選的結(jié)合的順聯(lián)的非轉(zhuǎn)位部分穿過靶 膜的肽序列，其包含對(duì)通過本發(fā)明的方法鑒定的MTP的初級(jí)肽序列的一個(gè)或一 個(gè)以上的突變或修飾。因此，MTP的衍生物可具有引入至本發(fā)明的MTP的一個(gè) 或一個(gè)以上，例如1、 2、 3、 4、 5和更多個(gè)化學(xué)修飾的側(cè)鏈。另外，或可選擇 地，MTP的衍生物可含有對(duì)本發(fā)明的MTP的初級(jí)肽序列的一個(gè)或一個(gè)以上，例 如1、 2、 3、 4、 5和更多氨基酸突變、替換或缺失。因此，本發(fā)明包括為改善 MTP的一個(gè)或一個(gè)以上的性質(zhì)而對(duì)MTP進(jìn)行的突變?cè)囼?yàn)的結(jié)果。例如，使用本 領(lǐng)域已知的方法(例如通過修飾編碼性DNA或RNA序列)而隨機(jī)突變或特異性突變MTP的1、 2、 3、 4、 5和更多個(gè)氨基酸殘基，并通過本領(lǐng)域已知的任何 方法，根據(jù)預(yù)定的要求(例如對(duì)轉(zhuǎn)位至特定細(xì)胞類型的改善，或?qū)μ囟?xì)胞類 型選擇性的改善)而選擇所獲得的衍生肽的文庫或群。所選擇出的顯示出膜轉(zhuǎn) 位能力的肽為MTP的衍生物，并落入到本發(fā)明的范圍之內(nèi)。"膜轉(zhuǎn)位蛋白"短語中的術(shù)語"膜"包括任何人工的或天然的膜，其包括 單層或雙層的脂肪族分子，例如脂肪酸或脂質(zhì)分子。因此，該術(shù)語包括微團(tuán)的 膜、脂質(zhì)體膜或本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的其它囊的膜、和任何類型天然細(xì)胞的膜， 其中包括細(xì)菌、真菌、植物、動(dòng)物或人，例如血細(xì)胞(如紅細(xì)胞)或上皮細(xì)胞(包括皮膚細(xì)胞和腸壁細(xì)胞)。優(yōu)選地，膜是脂雙層并包裹人工脂質(zhì)體，或是胞 內(nèi)機(jī)能不全的細(xì)胞。本文所述的"非轉(zhuǎn)位部分"是指不能使其自身穿過膜(例如為脂單層、脂 雙層或細(xì)胞膜)的實(shí)體；或指不能使其自身充分有效地越過膜從而產(chǎn)生預(yù)期胞 內(nèi)效果的部分。這種非轉(zhuǎn)位部分包括核酸和其它聚合物、肽、蛋白質(zhì)、肽核酸(PNAs)、抗體、抗體片段和膜不透性小分子等。優(yōu)選地，非轉(zhuǎn)位部分是治療性 分子，這些在本文的其它部分有進(jìn)一步的描述。本發(fā)明范圍內(nèi)的術(shù)語"氨基酸"以其最廣泛的含義使用，其旨在包括天然 的L型a氨基酸或氨基酸殘基。本文使用通常所使用的天然氨基酸的單字母或 三字母簡稱(Lehninger， A丄.，(1975)歷0c/^附W7, 2d ed.， pp. 71-92， Worth Publishers, New York)。標(biāo)準(zhǔn)的單字母代碼和標(biāo)準(zhǔn)的三字母代碼的對(duì)應(yīng)關(guān)系是本 領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，復(fù)述如下A=Ala; C=Cys; D=Asp; E=Glu; F=Phe; G=Gly; H=His; I=Ile; K=Lys; L=Leu; M=Met; N=Asn; P=Pro; Q=Gln; R=Arg; S=Ser;T=Thr;V=Val; W=Trp;Y=Tyr。 一般性術(shù)語"氨基酸"進(jìn)一步包括D氨基 酸以及化學(xué)修飾的氨基酸(例如氨基酸類似物)、通常不包含在蛋白質(zhì)中的天然 氨基酸(如正亮氨酸)和具有本領(lǐng)域已知的氨基酸特性的化學(xué)合成化合物。例 如苯丙氨酸或脯氨酸的類似物或模擬物同天然的Phe或Pro—樣對(duì)肽化合物起到 相同的構(gòu)象限制作用，所以他們屬于氨基酸定義的范疇。這種類似物或模擬物 在本文被稱為各自氨基酸的"功能性類似物"。氨基酸的其它實(shí)例見通過引用被 納入本文的下述文獻(xiàn)Robert and Vellaccio， 7T e尸e/ ^/asv ^wa/ys/s, Gross and Meiehofer， eds., Vol. 5p. 341, Academic Press, Inc., N.Y. 1983.本發(fā)明針對(duì)從肽群(或庫)中鑒定和表征MTP，即潛在的或假定MTPs。 具體地說，本發(fā)明的MTPs的選擇是通過使用體外產(chǎn)生的肽庫的體外展示而進(jìn) 行的。本文所用的術(shù)語"體外展示"、"體外肽展示"和"體外產(chǎn)生的文庫"是指 這樣的系統(tǒng)，其中肽庫以被表達(dá)的肽與編碼它們的核酸相結(jié)合的方式被表達(dá)， 而且這種結(jié)合不隨細(xì)胞或細(xì)菌與所述核酸而轉(zhuǎn)化。該系統(tǒng)與噬菌體展示和其它 "體內(nèi)展示"系統(tǒng)形成鮮明的對(duì)比，在后者的系統(tǒng)中，肽與編碼它們的核酸的 結(jié)合隨細(xì)胞或細(xì)菌與所述核酸而轉(zhuǎn)化。本文的上下文中所用的膜轉(zhuǎn)位肽可"偶聯(lián)"至非轉(zhuǎn)位部分。本文所用的術(shù) 語"偶聯(lián)"以其最廣泛的含義使用，從而包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的所有聯(lián)結(jié)或 連接的方法。例如，非轉(zhuǎn)位部分可以是MTP的C端或N端的氨基酸延伸。另 外，在MTP和非轉(zhuǎn)位部分之間可存在短的氨基酸連接子序列。本發(fā)明進(jìn)一步提 供了MTP連接的分子，例如任選地通過連接子序列化學(xué)偶聯(lián)至非轉(zhuǎn)位部分。一 般情況下，MTP將通過非轉(zhuǎn)位部分中不影響非轉(zhuǎn)位部分活性的位點(diǎn)而被連接至 非轉(zhuǎn)位部分。再一次地，認(rèn)為MTP被偶聯(lián)至非轉(zhuǎn)位部分。任選地，在被納入后 這種連接可被細(xì)胞質(zhì)中的還原性環(huán)境所破壞。如本文所用的，術(shù)語"偶聯(lián)"可與術(shù)語"連接"、"結(jié)合"或"附著"互換 使用。廣泛的共價(jià)和非共價(jià)形式的偶聯(lián)是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，并落入至 本發(fā)明的范圍之中。例如雙硫鍵、化學(xué)性連接和肽鏈都是共價(jià)連接的形式。在 優(yōu)選非共價(jià)方式的偶聯(lián)時(shí)，聯(lián)結(jié)的方式可為，例如生物素-抗生蛋白(鏈菌素) 連接或與其類似的連接?？贵w(或抗體片段)-抗原間的相互反應(yīng)也適用于將本 發(fā)明的MTP偶聯(lián)至非轉(zhuǎn)位部分。合適的抗體-抗原的配對(duì)是熒光素-抗熒光素間 的相互反應(yīng)。用這種方式制備單向和靶向的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，借此，MTP及其結(jié)合的非轉(zhuǎn)位部 分之間的偶聯(lián)方式優(yōu)選地在一旦MTP及其結(jié)合的非轉(zhuǎn)位部分(至少是非轉(zhuǎn)位部 分本身)越過靶膜時(shí)被斷裂/剪切?？墒褂门悸?lián)方式與剪切系統(tǒng)的任一合適的組 合，例如酶切、配體競爭、輻射等等。優(yōu)選地，當(dāng)靶膜為細(xì)胞膜時(shí)(這時(shí)非轉(zhuǎn) 位部分將被遞送至細(xì)胞)，偶聯(lián)方式為在細(xì)胞內(nèi)(例如在細(xì)胞質(zhì)內(nèi))能被酶(優(yōu) 選為內(nèi)切酶)剪切的肽鍵?；蛘?，偶聯(lián)優(yōu)選為易于在細(xì)胞的胞內(nèi)還原性環(huán)境剪 切的二硫橋。當(dāng)膜包裹的隔室不是細(xì)胞，例如為脂質(zhì)囊、脂質(zhì)體或其類似物時(shí)，優(yōu)選使用偶聯(lián)方式與剪切方式的替代組合。同樣，只要非轉(zhuǎn)位部分可被單向性 地遞送至隔室內(nèi)部(如需要)，可使用任何合適的方式。偶聯(lián)形式的非轉(zhuǎn)位部分可以是活性的，也可以不是活性的，但在任何情況下優(yōu)選地是，其從MTP上解離后(也就是一旦偶聯(lián)被斷裂)是活性的。本發(fā)明通過在體外產(chǎn)生的文庫中篩選膜轉(zhuǎn)位性質(zhì)，從而表現(xiàn)出在肽藥物開 發(fā)領(lǐng)域的顯著進(jìn)步。合成編碼多種肽的體外產(chǎn)生的文庫并首先對(duì)結(jié)合、貫穿(例 如橫跨膜)或納入至靶細(xì)胞或脂質(zhì)體群進(jìn)行選擇。不能以上述一種或兩種方式 與靶細(xì)胞或脂質(zhì)體相結(jié)合文庫成員通過洗滌或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它的合 適方法被移除。例如，密度足夠大的細(xì)胞和脂質(zhì)體(或其它靶膜包裹的隔室) 可以通過旋轉(zhuǎn)穿過非水相的油層，從未結(jié)合的文庫成員中分離結(jié)合膜的文庫成 員。優(yōu)選地，所述油為礦物油。其它合適的油包括比重比水小的油。在這一方 面，礦物油在25'C下具有的比重為0.84g/ml。優(yōu)選地，諸如血紅細(xì)胞的細(xì)胞通 過離心穿過礦物油而從未結(jié)合文庫成員中分離出來。如上面所提到的，MTP可 貫穿或越過靶膜，編碼MTP或表面結(jié)合肽的文庫成員在這一過程中保持與靶的 結(jié)合或被納入至細(xì)胞。隨后通過非特異性蛋白酶(例如胰蛋白酶)或核酸酶(例如DNaseI)、或上 述兩者的組合，或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其它的方法將表面結(jié)合文庫成員 從細(xì)胞表面移除。只有編碼MTP的文庫成員保留在細(xì)胞群中。然后回收被納入的MTPs，并通過對(duì)結(jié)合的核酸進(jìn)行測(cè)序以及通過例如表達(dá) 或合成編碼的MTP以確認(rèn)所需的膜轉(zhuǎn)位特性，從而對(duì)其逐一進(jìn)行表征。也可確 定MTP的最終亞細(xì)胞定位。如前所述，該步驟(即，從MTPs中移除與膜結(jié)合 的文庫成員)不能用于噬菌體展示文庫，這是因?yàn)檫@些噬菌體展示文庫對(duì)蛋白 酶(例如胰蛋白酶)有天然抗性(見例如WO-A-9卯58655)，并且由于病毒衣 對(duì)噬菌體核酸的保護(hù)而導(dǎo)致不能使用核酸酶。噬菌體展示文庫的又一限制在于， 噬菌體顆粒對(duì)細(xì)胞膜的固有的非特異性結(jié)合，該非特異性結(jié)合對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù) 人員而言是熟知的。優(yōu)點(diǎn)是，本發(fā)明的MTPs被分離并被分別表征。然而，可通過本發(fā)明的方 法來獲得MTPs的混合群，例如在本發(fā)明的方法中當(dāng)一種以上核酸-肽偶聯(lián)體越 過膜并被納入至例如脂質(zhì)體或細(xì)胞中時(shí)。這時(shí)，本發(fā)明也包括所述的MTPs的 混合群。優(yōu)選地，本發(fā)明提供了不是通過內(nèi)吞作用而令人驚訝地越過細(xì)胞膜的MTPs。這些MTPs可通過在選擇中使用沒有已知的內(nèi)吞轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的細(xì)胞(例如 血紅細(xì)胞)，或通過使用膜包裹的隔室(例如脂質(zhì)體)進(jìn)行進(jìn)一步的選擇。任選地，本發(fā)明可用于細(xì)胞類型特異性MTPs的分離。合成體外產(chǎn)生的編 碼多種肽的核酸文庫，并在與不同的非靶細(xì)胞群一起進(jìn)行較早時(shí)的溫育以移除 可交叉反應(yīng)的MTP (即那些與非耙細(xì)胞類型相結(jié)合的MTP)后，根據(jù)結(jié)合或納 入至所感興趣的靶細(xì)胞群(例如癌細(xì)胞群)而進(jìn)行選擇。實(shí)施該方法的手段將 為本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知。通常，通過洗滌或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法 移除不能結(jié)合至所感興趣靶細(xì)胞群的文庫成員。然后通過非特異性蛋白酶(例 如胰蛋白酶)、或核酸酶(例如DNaseI)、或上述兩者的結(jié)合、或本領(lǐng)域技術(shù)人 員已知的其它方法將表面結(jié)合的文庫成員從細(xì)胞表面移除。在本發(fā)明上述方法 中，只有編碼MTP的文庫成員保留在細(xì)胞群中。然后回收被納入的MTPs，并 通過對(duì)結(jié)合的核酸進(jìn)行測(cè)序、表達(dá)或合成編碼的MTP進(jìn)行測(cè)序以確認(rèn)所需的膜 轉(zhuǎn)位特性，而對(duì)其進(jìn)行逐一表征，而且，如果有可能，也可通過確定MTP的亞 細(xì)胞定位進(jìn)行表征。本發(fā)明也可用于對(duì)能越過諸如Caco-2細(xì)胞或人上皮細(xì)胞的細(xì)胞層的MTPs 的分離。合成編碼多種靶肽的體外產(chǎn)生的核酸文庫，然后根據(jù)結(jié)合、貫穿或納 入至感興趣的細(xì)胞群進(jìn)行選擇，其中所述的靶細(xì)胞群，例如為生長于層中的 Caco-2細(xì)胞。通過洗滌或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他方法移除不能結(jié)合至靶細(xì) 胞群的文庫成員。優(yōu)選地，然后通過非特異性蛋白酶(例如胰蛋白酶)、或核酸 酶(例如DNaseI)、或上述兩者的結(jié)合、或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法將表 面結(jié)合的文庫成員從細(xì)胞表面移除。再一次地，只有編碼MTP的文庫成員保留 在細(xì)胞群中，并免遭蛋白酶和核酸酶的裂解。然后回收被納入的MTPs，并通過 對(duì)結(jié)合的核酸進(jìn)行測(cè)序、以及任選的表達(dá)或合成編碼的MTP以確認(rèn)所需的上皮 細(xì)胞層的轉(zhuǎn)位特性，而對(duì)其進(jìn)行逐一表征?；蛘撸?xì)胞可在聚碳酸酯濾器上排 列成單層，并如Stevenson等(1999， 7/ t. /尸力ar瓜177, pp 103-115)所述進(jìn)行選擇。如果其轉(zhuǎn)位通過細(xì)胞的話，可將放置在細(xì)胞頂面的體外肽文庫回 收在基底外測(cè)面。使用這種方法，有可能選擇能越過生物膜(例如腸細(xì)胞壁或 皮膚)的MTPs。用這種方式分離的MTPs具有作為非轉(zhuǎn)位部分的口服遞送劑的用途。舉例 來說，本發(fā)明的MTP可偶聯(lián)至諸如胰島素的蛋白質(zhì)藥物并配制成合適的藥物組 合物，從而在進(jìn)入腸時(shí)MTP將胰島素轉(zhuǎn)位至血液循環(huán)系統(tǒng)。再舉一例，本發(fā)明 的MTP可偶聯(lián)至小分子并配制成合適的藥物組合物，從而在進(jìn)入腸時(shí)MTP將 小分子轉(zhuǎn)位至血液循環(huán)系統(tǒng)。在又一實(shí)例中，可將MTP以適當(dāng)?shù)乃幬锝M合物包 被在包含蛋白質(zhì)、肽或小分子藥物的納米顆粒表面，從而在進(jìn)入腸時(shí)MTP將納 米顆粒轉(zhuǎn)位至血液循環(huán)系統(tǒng)。在本發(fā)明的另一組合物中，MTP及其結(jié)合的非轉(zhuǎn)位部分(即治療性分子) 與脂質(zhì)偉群(即脂質(zhì)囊或其它人工膜包裹的隔室)相混合，以產(chǎn)生包含MTP和 治療性分子的脂質(zhì)體治療性群?？赏ㄟ^例如靜脈注射的方式將脂質(zhì)體治療性群 施用至患者。當(dāng)治療性脂質(zhì)體有必要特異性地靶向特定細(xì)胞類型時(shí)，脂質(zhì)體組 合物可與識(shí)別耙細(xì)胞類型的抗體結(jié)構(gòu)域或其類似物進(jìn)行進(jìn)一步地配制。該方法 對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是公知的。本發(fā)明的MTPs以及結(jié)合至非轉(zhuǎn)位肽的MTPs可通過重組DNA技術(shù)和標(biāo)準(zhǔn) 的蛋白表達(dá)和純化步驟進(jìn)行制備。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了編碼本發(fā)明的 MTPs、及其衍生物或治療性分子的核酸分子。例如，根據(jù)常規(guī)技術(shù)(Sambrook J. et al, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY)將編碼相關(guān)肽的DNA插入至合適的表達(dá)載體(例如 pGEM ， PromegaCorp.，USA)中，并轉(zhuǎn)化至合適的宿主細(xì)胞中進(jìn)行蛋白表達(dá)。 合適的宿主細(xì)胞是那些能在培養(yǎng)物中生長并順從外源DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，包括細(xì) 菌、真菌細(xì)胞以及較高等的真核來源細(xì)胞(優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞)。或者，可使用 合適的體外(轉(zhuǎn)錄和)翻譯系統(tǒng)(例如大腸桿菌S30提取系統(tǒng)，Promega corp.,USA)來體外合成MTPs。應(yīng)用于DNA序列(例如在表達(dá)載體中或構(gòu)建體中)的術(shù)語"可操作地連接" 是指排列序列，以使序列能協(xié)調(diào)作用，從而達(dá)到所期望的目的，即，啟動(dòng)子序 列起始轉(zhuǎn)錄，并使之繼續(xù)進(jìn)行通過所連接的編碼性序列，直至終止序列。選擇和分離MTP后，通過合適的手段將諸如治療性分子的功能性群體聯(lián)結(jié) 至MTP。如之前所述，MTP可偶聯(lián)至治療性分子的任一合適形式，例如抗體、 酶和小分子化學(xué)性化合物。治療性分子的優(yōu)選形式是能在靶細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)RNAi 的siRNA分子。通常，使用化學(xué)連接子將siRNA連接至諸如MTP的肽。例如，通過馬來酰亞胺-巰基鍵(馬來酰亞胺基在肽上，而巰基在核酸上)或二硫鍵(游離的半胱氨酸基在肽上，而巰基在核酸上)將核酸或PNA連接至肽。按照常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)配制本發(fā)明的藥物制劑和組合物，并以口服、靜脈、局部或 其它標(biāo)準(zhǔn)途徑的形式施用。藥物組合物的形式可為片劑、丸劑、洗劑、凝膠劑、 液體、粉劑、栓劑、混懸劑、脂質(zhì)體、微顆粒或本領(lǐng)域已知的其它合適劑型。因此，本發(fā)明也包括根據(jù)本發(fā)明方法分離的MTP在治療性或診斷性處理中 的用途。具體地說，本發(fā)明提供了MTP將非轉(zhuǎn)位部分(如前文所述)遞送至一 種或一種以上膜包裹的隔室群中的用途。優(yōu)選地，所述的膜包裹的隔室是脂質(zhì) 體或一種或一種以上的細(xì)胞類型的群。尤其優(yōu)選的本發(fā)明的MTP的用途是將 非轉(zhuǎn)位部分(尤其是諸如siRNA分子的治療性分子)遞送至靶細(xì)胞類型或群體。 靶細(xì)胞或細(xì)胞群可為體內(nèi)的，即在動(dòng)物或人受試者中；或?yàn)殚g接體內(nèi)的，即從 動(dòng)物或人受試者中移除后并將其重新導(dǎo)入；或者另外，細(xì)胞、細(xì)胞群或脂質(zhì)體 是體外的?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的任一施用途徑。具體而言，優(yōu)選使用 對(duì)靶細(xì)胞類型或靶細(xì)胞群優(yōu)選的施用途徑。例如，施用至受試者或患者的優(yōu)選 途徑包括皮下注射、攝食或栓劑。示例性地，為了治療受試者的病毒感染，本發(fā)明的MTP可偶聯(lián)至合適的抗 病毒劑，然后將MTP和抗病毒分子以裸露的形式或以包含在如人工脂質(zhì)體中的 形式施用至受試者。相似地，如果受試者患有諸如癌癥的細(xì)胞性疾病，本發(fā)明 的MTP可偶聯(lián)至合適的抗癌分子/藥物(例如siRNA分子或其它治療性實(shí)體)， 并通過合適的施用途徑將其施用至受試者。MTPs可用于將其自身或非轉(zhuǎn)位部分 遞送至細(xì)菌細(xì)胞。因此，通過將本發(fā)明的MTP偶聯(lián)至抗細(xì)菌劑能治療受試者的 細(xì)菌感染。進(jìn)一步，在這方面有時(shí)需要治療性組合物，諸如偶聯(lián)至治療性分子的MTP， 被遞送至受試者中特異性的細(xì)胞類型或細(xì)胞群。這可通過下述方式以間接體外 的方式完成，例如，將治療性組合物添加至已從受試者或患者中移除的細(xì)胞群 中。另外，可根據(jù)需要如前所述地選擇MTP以轉(zhuǎn)位至特異性的細(xì)胞類型。另外， MTP可直接偶聯(lián)至抗體分子、抗體片段(例如Fab、 F(ab)2、 scFv等)或其它 合適的靶向性試劑，從而MTP和任何其它的被偶聯(lián)部分靶向需要治療和診斷的 特異性細(xì)胞群。在另一個(gè)實(shí)施方式中，MTP和其結(jié)合的非轉(zhuǎn)位部分可包含在脂16質(zhì)體群中，其中脂質(zhì)體(例如脂質(zhì)體膜)又包括合適的靶向性部分，例如抗體 和抗體片段。然后可將所得的脂質(zhì)體施用至受試者和患者。在上述用途中，優(yōu)選地，MTP通過在靶細(xì)胞類型中可剪切的相互作用偶聯(lián) 至非轉(zhuǎn)位部分或治療性分子，例如通過酶切，或源于細(xì)胞內(nèi)還原性環(huán)境的方式。 本發(fā)明將通過下述非限制性的實(shí)施例得到進(jìn)一步的闡釋。實(shí)施例除非另外指出，實(shí)施例中使用市售的反應(yīng)試劑和分子生物學(xué)和生物化學(xué)中 的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。材料和方法本申請(qǐng)所使用的下述方法在上述的Sambrook， J. et al.， 1989:analysis of restriction enzyme digestion products on agarose gels and preparation of phosphate buffered saline中有描述。通常用途的反應(yīng)試劑從SIGMA-AldrichLtd (Poole， Dorset, U.K.)處購買。 寡核苷酸得自Eurogenetec Ltd (Southampton, U.K.)。氨基酸和S30提取物得自Promega Ltd( Southampton, Hampshire, U.K. )。 Vent 和Taq DNA聚合酶得自New England Biolabs(Cambridgeshire, U.K.)。 FITC標(biāo)記 的肽得自Pepscan Systems (Lelystad, Netherlands )。實(shí)施例l(i) 用于選擇MTPs的順式展示文庫的構(gòu)建 文庫構(gòu)建及體外轉(zhuǎn)錄和翻譯的實(shí)施在文獻(xiàn)Odrgrip et al., 2004, Proc. Natl.Acad. SciUSA， 101 2806-2810中有描述。通過PCR將18-mer NNB文庫(其中N為任一核苷酸，B為C、 T或G) 附著至tac啟動(dòng)子，然后通過PCR擴(kuò)增將其連接至-RepA-CIS-ori區(qū)域，從而制 得tac-NNB-RepA-CIS-ori構(gòu)建體。(ii) 具有細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位能力的肽的選擇3(TC下在大腸桿菌S-30溶菌產(chǎn)物系統(tǒng)中用2pg文庫DNA進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄和 翻譯30分鐘，然后用封閉緩沖液進(jìn)行稀釋(含1%BSA的PBS)。通常，每50^1S-30溶菌產(chǎn)物中添加2嗎線性DNA。向表達(dá)的文庫中添加5^1 PBS洗滌的紅血 細(xì)胞(RBC)中，并在冰上孵育30分鐘。在2000 rpm下離心RBC達(dá)5分鐘，然后移除上清液。RBC沉淀物在200^1添加有2mM CaC12、2mM MgCl和l嗎DNasel的PBS中重新懸浮，并在室溫下溫育15分鐘。用PBS洗滌細(xì)胞一次，通過離心形成松 散的沉淀物，然后將該沉淀物再次重新懸浮于20(^1 PBS中。將RBC混懸液置 于200ial鄰苯二甲酸二丁酯上，并在11000rpm下離心4分鐘。移除水相，并將 RBC沉淀物從油中慢慢吸出，再重新懸浮在100plPBS中。在500(il PB緩沖液(Qiagen)中溶解細(xì)胞，使用Qiagen柱純化DNA，然 后將純化的DNA重新懸浮于50^1無菌水中。在平行選擇中，用lkig/ml胰蛋白酶代替DNaseI在37"C下處理RBC達(dá)30 分鐘，此時(shí)，旋轉(zhuǎn)細(xì)胞，移除上清液，然后將沉淀物重新懸浮于200^1 PBS中。 旋轉(zhuǎn)細(xì)胞通過鄰苯二甲酸二丁酯，并且將如上所述回收的DNA用于DNase處理 的細(xì)胞。如Odegrip等的文獻(xiàn)(2004， Proc.Natl. Acad. Sci USA, 101 2806-2810)所 述，分別從兩種選擇中擴(kuò)增N末端文庫區(qū)域，并用Rep-CIS-ori進(jìn)行重新組裝, 從而產(chǎn)生用于下輪選擇的輸入用DNA。5輪選擇后，使用PCR擴(kuò)增回收的DNA， 純化后用和iVcoI消化。然后將上述DNA連接至被相似消化的M13 gpVIII 噬菌粒載體，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌XL-1藍(lán)細(xì)胞中，然后平鋪在2%葡萄糖、2xTY、 100 pg/ml氨卡青霉素平板上。使單克隆生長過夜，分離噬菌體DNA并對(duì)其測(cè) 序以確定其肽序列。(m)膜轉(zhuǎn)位能力分析合成所選擇的肽，同時(shí)在N端用FITC標(biāo)記，并使用Jurkat細(xì)胞通過FACS 分析細(xì)胞結(jié)合。在PBS中洗滌Jurkat細(xì)胞(100 000)，室溫下在100 pl添加有1% 胎牛血清的PBS中與1嗎標(biāo)記肽溫育15分鐘，在PBS中洗滌兩次，然后在Becton Dickinson FACS分析儀中分析。在沒有固定的情況下用熒光顯微鏡下觀察結(jié)合 細(xì)胞的肽以監(jiān)測(cè)細(xì)胞的納入。23種肽中，有9種與細(xì)胞相結(jié)合。實(shí)例如圖l所示。圖1顯示了非固定的Jurkat細(xì)胞的熒光顯微鏡檢測(cè)以及FACS分析。肽7、 13和19為通過所述方法分離的示例性膜轉(zhuǎn)位肽。通過顯微鏡所觀察到的細(xì)胞內(nèi)的熒光(左邊和中間的圖片)和FACS得到細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度(右邊的曲線圖) 可觀察標(biāo)記。FACS分析的曲線圖表明了FITC-熒光(X軸)對(duì)細(xì)胞數(shù)目(Y軸) 的計(jì)數(shù)。肽24是作為陰性對(duì)照的FLAG表位肽，其通過顯微鏡下或FACS分析 時(shí)不使細(xì)胞產(chǎn)生熒光。如上所述，用DNaseI或胰蛋白酶進(jìn)行平行選擇，以移除膜結(jié)合的或非轉(zhuǎn)位 的肽-repA-DNAl體，從而避免對(duì)細(xì)胞溶解后對(duì)MTP回收的污染。被納入的肽 -repA-DNAl體對(duì)這些酶中的任何一個(gè)的處理具有抗性。在另一個(gè)方法中，或者 使用DNaseI消化repA DNA，從而其不能被擴(kuò)增，或者使用胰蛋白酶消化肽-repA 蛋白以及任何潛在的蛋白-蛋白間的相互反應(yīng)。己發(fā)現(xiàn)，這兩種方法在選擇所需 MTPs方面是成功的。(iv) MTP的序列分析選擇膜轉(zhuǎn)位活性肽(MTP)進(jìn)行序列分析，以確定膜轉(zhuǎn)位活性肽序列是否 與己知的膜轉(zhuǎn)位基序具有序列相似性。結(jié)果如圖2所示。如所顯示的那樣，所選擇的肽(表示為D4，最上面的一行，SEQIDNO: 1) 顯示出與已知的mV-TAT蛋白的膜轉(zhuǎn)位基序(最下面的一行)具有某種程度的 序列同源性(如中間的一行所示)。結(jié)果進(jìn)一步說明了所述選擇方法的功效，其中所述的選擇方法用于分離顯 示出細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位活性的化合物。然而需要指出的是，根據(jù)所述及的方法分離到的其它MTPs并沒有顯示出 與已知轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域的序列同源性。這提供了對(duì)新型MTPs的鑒定。實(shí)施例2(i) 用于選擇MTPs的順式展示文庫的構(gòu)建 下述實(shí)施例描述了能夠越過或貫穿合成脂質(zhì)膜的MTPs的選擇。文庫構(gòu)建以及體外轉(zhuǎn)錄和翻譯根據(jù)上述實(shí)施例1所述進(jìn)行。(ii) 合成的具有膜轉(zhuǎn)位能力的肽的選擇 體外轉(zhuǎn)錄和翻譯根據(jù)上述實(shí)施例1所述進(jìn)行。人造油性隔室的乳劑通過如下步驟制備將50plPBS (以10pl等分)緩緩 加至0.5 ml冰冷的含0.5% Triton X-100和4.5% Span80 (山梨糖醇酐三油酸酯 (sorbitane trioleate))的輕礦物油，并于冰上以1600rpm攪拌5分鐘。乳劑混合物在3000g下旋轉(zhuǎn)5分鐘，移除油相，使乳劑保留在管底部。然后將體外轉(zhuǎn)錄 和翻譯混合物加至lml PBS中的乳劑混合物中，并緩緩翻轉(zhuǎn)5次進(jìn)行混合，然 后在冰上孵育30分鐘。然后加入2.5pg DNaseI以及2mM CaCl2和2mM MgCl (最終濃度)，并在室 溫下溫育15分鐘。作為DNaseI的替代，可加入lpg/ml胰蛋白酶，并在37"C下 溫育30分鐘。通過每次加入lml PBS并在3000g下離心5分鐘，再去除洗液來洗滌乳劑5 次。通過加入lml己垸、漩渦、簡短離心和移除己烷層來破壞和洗滌乳劑。洗 滌步驟可重復(fù)1次或兩次以上，殘留的己垸通過在Speedvac (Farmingdale， NY) 中室溫下干燥5分鐘來移除。通過加入100plPB緩沖液(Qiagen)來回收DNA，且如實(shí)施例1所示制備 用于下一輪的選擇的DNA。在如實(shí)施例1所示將DNA克隆至噬菌體之前，選擇步驟可重復(fù)多次，例如 5次。通過測(cè)序可鑒定肽序列，并且如實(shí)施例1所示檢測(cè)肽。
權(quán)利要求
1. 從肽展示文庫中分離顯示膜轉(zhuǎn)位活性的化合物的方法，其中所述文庫包括多種編碼展示肽的核酸序列，該方法包括如下步驟a)表達(dá)多種核酸構(gòu)建體其中，每個(gè)核酸構(gòu)建體包括可操作地連接至核酸序列的啟動(dòng)子序列，以使多種核酸構(gòu)建體的表達(dá)導(dǎo)致多種核酸-肽偶聯(lián)體的形成，且每一偶聯(lián)體包括至少一種展示肽，所述展示肽與編碼展示肽的相應(yīng)核酸構(gòu)建體相結(jié)合；b)將多個(gè)核酸-肽偶聯(lián)體暴露于膜包裹的隔室群，從而使轉(zhuǎn)位反應(yīng)發(fā)生；c)移除與膜包裹的隔室未結(jié)合的核酸-肽偶聯(lián)體；以及d)從膜包裹的隔室中回收被納入的核酸-肽偶聯(lián)體，并且當(dāng)包含膜轉(zhuǎn)位肽(MTP)時(shí)，表征核酸序列編碼的肽。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的膜包裹的隔室群是一種或一種以上類型的細(xì)胞群。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中一種或一種以上類型的細(xì)胞群包括細(xì) 胞層。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中步驟(d)被修改為回收轉(zhuǎn)位通過細(xì)胞 層的核酸-肽偶聯(lián)體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其中所述的細(xì)胞為Caco-2細(xì)胞。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的膜包裹的隔室群為脂質(zhì)體群。
7. 根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其在(c)部分后進(jìn)一步包括移除 核酸-肽偶聯(lián)體的步驟，其中所述的核酸-肽偶聯(lián)體結(jié)合至膜包裹的隔室表面，但 并沒有被納入隔室內(nèi)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的移除包括將膜包裹的隔室暴露 于蛋白酶、核酸酶或蛋白酶和核酸酶的組合。
9. 根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中通過離心隔室通過非水層將 未結(jié)合膜的肽-核酸偶聯(lián)體與膜包裹的隔室分離。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述非水層為礦物油。
11. 根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述的肽展示文庫為體外肽 展示文庫。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中體外肽展示文庫為順式體外肽展示 文庫。
13. 根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其進(jìn)一步包括將步驟(d)中的 一種或一種以上表達(dá)的膜轉(zhuǎn)位肽與相應(yīng)的核酸構(gòu)建體相關(guān)聯(lián)的步驟，從而鑒定 膜轉(zhuǎn)位肽化合物的核酸序列。
14. 根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述MTP包括長度為2-50 個(gè)殘基的氨基酸序列。
15. 根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述MTP包括長度為2-25 個(gè)殘基的氨基酸序列。
16. 根據(jù)以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述MTP包括長度為2-20 個(gè)殘基的氨基酸序列。
17. 通過以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法獲得的膜轉(zhuǎn)位肽(MTP)或其衍生物。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的MTP或其衍生物，其偶聯(lián)至非轉(zhuǎn)位部分。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的MTP,其中偶聯(lián)的非轉(zhuǎn)位部分是治療性分子。
20. 根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的MTP，其中所述的偶聯(lián)可在細(xì)胞內(nèi)被剪 切，從而非轉(zhuǎn)位部分或治療性分子被胞內(nèi)遞送。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的MTP，其中所述的偶聯(lián)借助二硫鍵或可酶切肽鍵。
22. 根據(jù)權(quán)利要求19-21任一項(xiàng)所述的MTP，其中所述的治療性分子是 siRNA分子、肽核酸、或者抗體或抗體片段。
23. 通過權(quán)利要求1-16任一項(xiàng)所述的方法獲得的編碼MTP的核酸。
24. 包含權(quán)利要求23所述核酸的表達(dá)載體或構(gòu)建體。
25. —種脂質(zhì)體組合物，其包括一種或一種以上的脂質(zhì)體以及一種或一種以 上的權(quán)利要求14-19任一項(xiàng)所述的肽。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的脂質(zhì)體組合物，其進(jìn)一步包括諸如抗體或抗體 片段的靶向部分。
27. 權(quán)利要求17所述的MTP在將非轉(zhuǎn)位部分遞送至耙細(xì)胞中的應(yīng)用。
全文摘要
本申請(qǐng)?zhí)峁┝藦碾恼故疚膸熘羞x擇膜轉(zhuǎn)位肽(MTPs)的方法，其中所述的轉(zhuǎn)位肽越過或貫穿脂質(zhì)膜。表達(dá)編碼展示肽的多種核酸構(gòu)建體，從而形成多種核酸-肽偶聯(lián)體，且每一偶聯(lián)體包含至少一種展示肽，其中所述展示肽結(jié)合有編碼該展示肽的相應(yīng)核酸構(gòu)建體；將偶聯(lián)體暴露于膜包裹的隔室群中，從而使轉(zhuǎn)位反應(yīng)發(fā)生；移除與膜未結(jié)合的偶聯(lián)體；任選地，移除與膜結(jié)合的偶聯(lián)體；并回收被納入的核酸-肽偶聯(lián)體。所述的膜包裹的隔室可為人造小囊，例如脂質(zhì)體，或?yàn)橐环N或一種以上細(xì)胞類型的群。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101258242SQ200680026758
公開日2008年9月3日 申請(qǐng)日期2006年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月22日
發(fā)明者克里斯·厄爾曼, 凱文·菲茨杰拉德, 戴維·孔伯, 托馬斯·利安德森, 鄧肯·麥格雷戈 申請(qǐng)人:伊索杰尼卡有限公司