專利名稱：：生產(chǎn)冠狀病毒的細胞系的制作方法生產(chǎn)冠狀病毒的細胞系發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明特別涉及冠狀病毒如人類SARS-CoV的生產(chǎn)。發(fā)明背景嚴重急性呼吸困難綜合癥(SARS)是由SARS冠狀病毒(SARS-CoV)導(dǎo)致的一種新的人類呼吸系統(tǒng)疾病。這種疾病于2003年初在中國及在東南亞的許多國家出現(xiàn)，隨后迅速傳播至世界范圍。盡管該疾病在2003年6月已經(jīng)消失，但不能排除其再度出現(xiàn)。因此，目前更多的努力是開發(fā)關(guān)于SARS-CoV的治療和預(yù)防性療法。盡管SARS-CoV與先前所有已知的人和動物冠狀病毒在種系發(fā)生方面截然不同，但是對于SARS-CoV的分子和細胞生物學(xué)方面的了解已經(jīng)取得顯著進展。在鑒別了SARS-CoV基因組的完整序列之后(見Marraetal.(2003);Rotaetal.(2003))，最近Lietal.(2003)鑒別了一種鋅金屬肽酶一血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2蛋白質(zhì))為SARS-CoV的功能受體。有關(guān)SARS-CoV的分子和細胞生物學(xué)的這一知識和其它知識提供了開發(fā)抗病毒和疫苗策略的途徑?？筍ARS-CoV的保護性疫苗的研發(fā)主要集中于兩個方面，即使用失活的完整SARS-CoV(Tangetal,(2004);Takasukaetal.(2004))和使用SARS-CoV蛋白質(zhì)(Zhangetal.(2004);Yangetal.(2004);Kimetal.(2004))。失活的完整病毒疫苗的制備一般是通過在組織培養(yǎng)物中產(chǎn)生大量的病毒，然后在不破壞其免疫學(xué)性質(zhì)的條件下，使得所述病毒無害。為了在細胞培養(yǎng)物中進行病毒的優(yōu)化生產(chǎn)，關(guān)鍵的是相應(yīng)的病毒能感染細胞并在所述細胞中復(fù)制。迄今為止，據(jù)報道僅有有限數(shù)量的細胞對SARS-CoV感染易感并支持SARS-CoV在培養(yǎng)物中的復(fù)制(見Mosseletal.(2005))。在這方面最常使用的細胞是源自非洲綠猴的腎細胞如Vero或VeroE6細胞。這些細胞的一個缺點是其需要存在血清和/或粘附于固體支持物以生長，由此導(dǎo)致純化和安全性問題以及大規(guī)模生產(chǎn)所需的復(fù)雜系統(tǒng)。另外，所述細胞不是人細胞。最近揭示了通過使得耐受SARS-CoV感染的細胞表達功能受體即人ACE2受體而可以允許SARS-CoV復(fù)制。在WO2005/032487中，揭示了用ACE2蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染的人293T細胞支持SARS-CoV復(fù)制且適于生產(chǎn)SARS-CoV。然而，用這些細胞獲得的產(chǎn)量較低，無經(jīng)濟學(xué)利用價值?？傊?，在本領(lǐng)域仍需要一種在宿主細胞系統(tǒng)中生產(chǎn)SARS-CoV的方法，以改良現(xiàn)有的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，特別是改良獲得的產(chǎn)量。本發(fā)明通過提供表達ACE2蛋白質(zhì)的原代人視網(wǎng)膜母細胞(HER細胞)而解決了這種需要。這些細胞提供出乎意料的高SARS-CoV產(chǎn)量。它們所具備的另一個優(yōu)勢是在大規(guī)模生產(chǎn)、懸浮生長及不依賴于生長因子方面己經(jīng)有大量記載并且與現(xiàn)有技術(shù)中的細胞相比具備更好的作用。特別是所述細胞可以以高度可再生方式懸浮的事實使其非常適于大規(guī)模生產(chǎn)。另外，本發(fā)明的細胞可有利地用于復(fù)制人SARS-CoV的各種分離株，并且進一步地其不僅適于生產(chǎn)SARS-CoV,也適于生產(chǎn)利用ACE2蛋白質(zhì)作為功能受體的其它人冠狀病毒。附圖簡述圖1示出SARS-CoVS蛋白片段(第318—510位氨基酸)與表達ACE2蛋白質(zhì)的？￡11(6@細胞的結(jié)合。與野生型S318-510片段相比，變體F包含突變N9S，變體H包含突變K344RF360S、L472P、D480G、T487S。發(fā)明概述本發(fā)明提供了適于生產(chǎn)冠狀病毒的細胞。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述細胞是表達人ACE2蛋白質(zhì)的HER細胞。本發(fā)明進一步提供了使用所述細胞生產(chǎn)冠狀病毒、特別是SARS-CoV的方法。發(fā)明詳述第一方面，本發(fā)明包含表達人ACE2蛋白質(zhì)的細胞。由于最近已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ACE2基因多態(tài)性不影響嚴重急性呼吸困難綜合癥的結(jié)果(見Chiuetal.(2004))，因此表達ACE2蛋白質(zhì)的變體的細胞也是本發(fā)明的一部分。所述變體當(dāng)然是仍能發(fā)揮作為SARS-CoV受體的功能。本發(fā)明的細胞是El永生化的視網(wǎng)膜細胞。它們通過用腺病毒El序列例如E1A和E1B序列永生化而衍生自視網(wǎng)膜細胞。所述E1A序列可以受其內(nèi)源腺病毒E1A啟動子的影響，但也可以由異源啟動子控制，例如PGK啟動子。E1A蛋白質(zhì)具有轉(zhuǎn)化活性，而E1B蛋白質(zhì)具有抗細胞凋亡活性。另外，E1A可有助于增加從細胞表達的水平。優(yōu)選地，本發(fā)明的細胞衍生自原代細胞。它們可以是任何來源的細胞，優(yōu)選來源于人。在一個優(yōu)選方面，所述細胞衍生自原代人胚胎視網(wǎng)膜細胞，換句話說，本發(fā)明的細胞衍生自原代人胚胎視網(wǎng)膜母細胞(HER細胞)，在其基因組中包含編碼腺病毒E1A和E1B的序列。原代HER細胞可以分離自胎兒(見Byrdetal.(1982);Byrdetal.(1988))。用腺病毒El序列對細胞進行永生化例如見于美國專利5,994,128所描述。因此，通過這種方法可以獲得已經(jīng)用腺病毒El序列永生化的胚胎視網(wǎng)膜細胞。因此可制備表達腺病毒E1A和E1B的其它細胞。為本發(fā)明方法和應(yīng)用最優(yōu)選的HER細胞是于1996年2月29日以保藏號96022940保藏在ECACC的細胞或其衍生物?？捎糜诒景l(fā)明并具有以保藏號96022940保藏在ECACC的細胞的特征的一種El永生化細胞系是由CmcellHollandB.V銷售的商標為PER.C6⑧的細胞系。用于本發(fā)明的PER.C6細胞是指來自以ECACCno.96022940保藏的細胞的上游或下游傳代或者其上游或下游傳代的后代?！昊?@較例如也已經(jīng)由腺病毒El區(qū)域永生化的轉(zhuǎn)化的人293細胞在操作性方面的表現(xiàn)更好。另外，？511(6@細胞已經(jīng)充分鑒定并且廣泛論證，它們在大規(guī)模生產(chǎn)、懸浮生長及不依賴于生長因子方面的表現(xiàn)顯著更好。特別是？5化06@細胞可以以高度可再生的方式懸浮的事實使其非常適于大規(guī)模生產(chǎn)。另外，它們可以在指定的沒有任何人或動物血清蛋白質(zhì)的無血清培養(yǎng)基中生長，其生長與滾瓶、搖瓶、轉(zhuǎn)瓶和生物反應(yīng)器培養(yǎng)相容及倍增時間大約35小時的事實使其適于作為生長中的病毒的宿主。E1A和E1B序列可衍生自任何腺病毒血清型，包括腺病毒血清型2、5、12和35(其它合適的腺病毒血清型見例如EP1054064中表1所示)。本發(fā)明的細胞可包含穩(wěn)定整合進基因組材料中或者作為自主復(fù)制載體一部分的編碼人ACE2蛋白質(zhì)的多核苷酸，即人ACE2蛋白質(zhì)可以瞬時表達，但是優(yōu)選人ACE2蛋白質(zhì)的長期、高產(chǎn)量穩(wěn)定表達。換句話說，本發(fā)明的細胞經(jīng)工程化以表達人ACE2蛋白質(zhì)。例如，本發(fā)明的細胞可以使用表達載體轉(zhuǎn)化，所述表達載體可含有病毒復(fù)制起點和/或內(nèi)源表達元件及在同一或不同載體上的選擇標記基因。在導(dǎo)入載體后，可以使細胞在富集培養(yǎng)基中生長l一2天，之后將其移至選擇性培養(yǎng)基中。所述選擇標記的目的是賦予選擇抗性，其存在可以使成功表達ACE2蛋白質(zhì)的細胞得以生長和回收?？梢允褂眠m于本發(fā)明細胞的組織培養(yǎng)技術(shù)使穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細胞的抗性克隆增殖。包含大量本發(fā)明細胞的細胞培養(yǎng)物也是本發(fā)明的一部分，其可用于如下的方法中。另一方面，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)冠狀病毒例如人SARS-CoV的方法，所述方法包括用冠狀病毒感染本發(fā)明的細胞并從培養(yǎng)基或細胞中收獲所述冠狀病毒。在一個實施方案中，所述生產(chǎn)方法包括如下步驟a)將編碼人ACE2蛋白質(zhì)的核酸分子提供給上述人細胞，例如衍生自原代人胚胎視網(wǎng)膜母細胞的人細胞，所述細胞在其基因組中包含編碼腺病毒E1A和E1B的序列，b)將所述細胞在適于人ACE2蛋白質(zhì)表達的條件下培養(yǎng)，c)用冠狀病毒感染所述細胞，和d)從所述培養(yǎng)基或細胞中收獲所述冠狀病毒。培養(yǎng)所述細胞以優(yōu)化ACE2蛋白質(zhì)的表達。這可以在所述細胞的常規(guī)培養(yǎng)基中實現(xiàn)。如果需要，可以針對例如適當(dāng)?shù)倪x擇、擴增或轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)而對培養(yǎng)基進行改良。細胞的培養(yǎng)條件如溫度、pH、營養(yǎng)成分等為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。將經(jīng)工程化的細胞在有助于冠狀病毒生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)?？梢栽谝坏┯^察到CPE時即開始收獲。產(chǎn)生的冠狀病毒可以從無細胞提取液中回收/收獲，但也可以從培養(yǎng)基中回收/收獲。從無細胞提取物或者培養(yǎng)基中回收病毒的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，可包括離心或?qū)游霾襟E。優(yōu)選地，本發(fā)明方法中使用的人細胞是以ECACCno.96022940保藏的PER.C6⑧或其衍生物。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述人細胞能懸浮生長和/或可以在無血清條件下培養(yǎng)。在一個優(yōu)選的實施方案中，冠狀病毒選自用ACE2蛋白質(zhì)作為感染入口的受體的一組冠狀病毒。這種冠狀病毒包括但不限于人冠狀病毒，包括人SARS-CoV分離株和CoV-NL63(見Hofmannetal.(2005))。在一個實施方案中，工程化的細胞可適于生產(chǎn)所有的人SARS-CoV分離株(已知人SARS-CoV分離株見表1所示)。人ACE2蛋白質(zhì)可以瞬時表達，但優(yōu)選穩(wěn)定表達。通過合適的核酸構(gòu)建體例如載體可以將編碼人ACE2蛋白質(zhì)的核酸分子提供給所述細胞。載體可以衍生自質(zhì)粒如F、Rl、RP1、Col、pBR322、TOL、Ti等；粘粒；噬菌體如？u入樣、M13、Mu、Pl、P22、Qp、T-even、T-odd、T2、T4、T7等；植物病毒；或者動物病毒。載體的選擇依賴于進行的重組方法及使用的細胞。將載體導(dǎo)入細胞中可以通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染、病毒感染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂染或者電穿孔方法實現(xiàn)。載體可以是自主復(fù)制的，或者可以與已經(jīng)整合的染色體一起復(fù)制。優(yōu)選地，所述載體含有一或多個選擇標記。標記的選擇可依賴于所選擇的宿主細胞，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的那樣，這對于本發(fā)明不是關(guān)鍵的。所述標記包括但不限于卡那霉素、新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、zeocin、單純皰疹病毒的胸苷激酶基因(HSV-TK)、小鼠的二氫葉酸還原酶基因(dhfr)。如果需要，載體可包含編碼ACE2蛋白質(zhì)的核酸分子，其與編碼可用于分離目的的蛋白質(zhì)或肽的一或多個核酸分子可操作連接。這些蛋白質(zhì)或肽包括但不限于谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶、麥芽糖結(jié)合蛋白、金屬結(jié)合多組氨酸、綠色熒光蛋白、熒光素酶和卩-半乳糖苷酶。所述核酸構(gòu)建體可包含調(diào)節(jié)表達的核酸序列。在此使用的這個術(shù)語是指對于可操作連接的編碼序列在特定宿主生物體中的表達而言所必需的和/或影響所述的表達的多核苷酸序列。所述調(diào)節(jié)表達的核酸序列可以是在選擇的宿主生物體中顯示出活性的任何核酸序列和可以衍生自編碼與宿主生物體同源或異源的蛋白質(zhì)的基因，所述調(diào)節(jié)表達的核酸序列如適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄起始序列、終止序列、啟動子序列、增強子序列；阻抑物或激活物序列；有效的RNA加工信號剪接信號和聚腺苷酸化信號；穩(wěn)定胞質(zhì)mRNA的序列；增強翻譯效率的序列(例如核糖體結(jié)合位點)；增強蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的序列；及當(dāng)需要時增強蛋白質(zhì)分泌的序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知調(diào)節(jié)表達的序列的鑒別與應(yīng)用。通常使用的表達和/或轉(zhuǎn)染載體包括質(zhì)粒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。本發(fā)明優(yōu)選質(zhì)粒載體，因為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體具有僅感染和結(jié)合分裂細胞的缺點。其它問題包括制備麻煩及相對較低的效價，插入的基因的大小限制，難于控制或保證表達，及由于隨機整合進宿主基因組而具有潛在遺傳破壞性。在實驗室中使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括潛在的毒性，特別是病毒可感染人細胞所產(chǎn)生的安全性問題是使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的另一缺點。另一方面，本發(fā)明提供了一種方法，其進一步包括失活或減毒收獲的冠狀病毒的步驟。失活的或減毒的冠狀病毒可以在所述失活或減毒步驟之前、期間或之后純化。純化可以通過適于病毒的純化方法進行，例如通過甘油墊離心或者本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它方法進行。失活可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法進行，例如Y射線或UV放射、熱處理或者用化合物如甲醛、丙酮、乙醇和烷化劑如乙撐氧、乙撐亞胺、乙酰乙撐亞胺和B-丙內(nèi)酯處理而失活。在失活步驟后，可以測試病毒在細胞培養(yǎng)物中的感染性的存在與否。測試病毒是否仍存在感染性或者部分或完全失活的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。一旦確定不存在感染性，則這樣獲得的失活的病毒制品可進一步應(yīng)用，例如用于疫苗制備。減毒降低了病毒的毒力，由此盡管其仍存活，但其不可再導(dǎo)致疾病。最常用的減毒方法包括使生物體適應(yīng)在非尋常條件下生長，以便使其喪失對其慣常宿主的適應(yīng)性。最常用的病毒減毒方法是延長組織培養(yǎng)生長。延長的組織培養(yǎng)生長包括用病毒感染組織培養(yǎng)平板，進行多個世代。由于病毒在組織培養(yǎng)物中不再具有毒力，因此對于毒力不再選擇，所述病毒喪失其導(dǎo)致疾病的能力。用于產(chǎn)生減毒的疫苗的組織培養(yǎng)物優(yōu)選來自用所述減毒的疫苗接種的相同物種，以降低組織免疫反應(yīng)的機會。在這方面，人細胞優(yōu)選作為組織培養(yǎng)系統(tǒng)。所述失活的或減毒的冠狀病毒可用于疫苗中。可以利用本領(lǐng)域已知的方法配制疫苗。通常包括加入佐劑和/或合適的載體。在一個實施方案中，收獲的冠狀病毒的病毒效價在感染后24小時為至少4.00、4.25、4.50、4.75、5.00、5.25、5.50、5.75、6.00、6.25、6.50、6.75、7.00、7.25、7.50，優(yōu)選至少7.75loglOTCID50/ml。另外，本發(fā)明提供了本發(fā)明的人細胞在生產(chǎn)冠狀病毒、優(yōu)選人冠狀病毒如SARS-CoV或HCoV-NL63中的應(yīng)用。本發(fā)明的人細胞也可用于篩選抗冠狀病毒的抗病毒劑。所述抗病毒劑可以是以任何方式影響病毒與受體結(jié)合或者影響ACE2蛋白質(zhì)的受體功能的分子或化合物。它們可例如通過測定候選分子與所述細胞或攜帶ACE2蛋白質(zhì)的細胞膜的結(jié)合而獲得，可包括化學(xué)化合物、肽、多肽、抗體或其片段。另一方面，本發(fā)明提供了一種鑒別能抑制冠狀病毒感染和/或復(fù)制的分子的方法，所述方法包括如下步驟a)將本發(fā)明的細胞與冠狀病毒在有和無候選分子的條件下保溫，b)確定候選分子的存在是否抑制冠狀病毒感染和/或復(fù)制。本領(lǐng)域技術(shù)人員意識到本發(fā)明方法的一些步驟包括洗滌步驟和保溫條件需要優(yōu)化?？梢詫⑺霾《竞退龊蜻x分子混合在一起，之后再與細胞接觸。本發(fā)明還提供了一種選擇能降低冠狀病毒對細胞的感染的抗病毒分子的方法，其中所述方法包括如下步驟a)將本發(fā)明的細胞與冠狀病毒的表面蛋白在有或無候選抗病毒分子的條件下接觸，所述表面蛋白參與冠狀病毒與由所述細胞表達的人ACE2蛋白質(zhì)的結(jié)合，所述表面蛋白如冠狀病毒S蛋白，b)測定所述細胞與所述表面蛋白之間的結(jié)合，c)選擇這樣的候選抗病毒分子，即其中在存在所述候選抗病毒分子的條件下的結(jié)合相互作用與不存在所述抗病毒分子的條件下的結(jié)合相互作用相比降低或減少。攜帶ACE2蛋白質(zhì)的細胞膜也可用于上述選擇方法。所述細胞和細胞膜也可以用于篩選特異性結(jié)合ACE2蛋白質(zhì)的化合物庫中使用的篩選分析中。由于ACE2蛋白質(zhì)在某些冠狀病毒如SARS-CoV禾QHcoV-NL63進入細胞中發(fā)揮作用，因此這種化合物可用于治療或預(yù)防冠狀病毒感染。因此，本發(fā)明提供了一種篩選影響人ACE2蛋白質(zhì)的這種功能的化合物的方法。這些化合物可抑制受體的功能?？捎帽景l(fā)明的篩選/鑒別/選擇方法鑒別的化合物和分子可衍生自各種來源，包括化學(xué)化合物庫或(天然)化合物的混合物。所述方法可包括測定候選分子或化合物與本發(fā)明的細胞或其攜帶ACE2蛋白質(zhì)的細胞膜的結(jié)合?？梢灾苯踊蜷g接測定結(jié)合。例如利用與候選分子相關(guān)的標記可直接測定結(jié)合。也可以間接測定結(jié)合。例如間接測定候選分子的結(jié)合可包括用(標記的)競爭物進行競爭結(jié)合。候選分子的結(jié)合的測定也可例如在基于細胞的分析中確定，其中可以確定候選分子是否能阻斷冠狀病毒進入細胞。在這種情況中，可以確定在存在候選分子或化合物的條件下，細胞是否仍可被冠狀病毒感染。或者，可以將與ACE2蛋白質(zhì)結(jié)合的標記的人SARS-CoVS蛋白質(zhì)或其片段與本發(fā)明的細胞在有或無候選化合物的條件下接觸。接下來，可以確定所述候選化合物是否降低與所述細胞結(jié)合的S蛋白或其片段的量。候選分子或化合物可以是化學(xué)化合物或者也可以是其它分子，例如抗體或抗體片段。所述候選分子或化合物能結(jié)合ACE2蛋白質(zhì)或者能結(jié)合參與感染和/或復(fù)制的冠狀病毒的蛋白質(zhì)如S蛋白?；蛘?，所述候選分子或化合物可以以任何其它方式降低或抑制/消除病毒進入和/或復(fù)制。抑制冠狀病毒感染和/或復(fù)制的所述候選分子或化合物可用于治療或預(yù)防冠狀病毒感染的方法中。實施例為了舉例描述本發(fā)明，提供了如下實施例。所述實施例不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實施例h穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人ACE2PER,C6⑧細胞系的產(chǎn)生為了評價重組表達血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2，人SARS-CoV和HCoV-NL63的天然受體)的PERX6⑧細胞使SARS-CoV及其它冠狀病毒生長的能力，將PER.C6⑧細胞用攜帶編碼ACE2蛋白質(zhì)的cDNA序列(見Donoghueetal.(2000)和Tipnisetal.(2000)所述；也見GenBank編號AAF78220和AAF99721;及SEQIDNO:1)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標準技術(shù)選擇穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染體(見ColiganJE,D畫BM，PloeghHL,SpeicherDWandWingfieldPT(eds.)(2001)Currentprotocolsinproteinscience,volumeI.JohnWiley&Sons，Inc.,NewYork)。將編碼ACE2蛋白質(zhì)的cDNA作為Hindlll-Xbal片段克隆在pcDNA2004neo(-)(SEQIDNO:2)中。使用標準技術(shù)在PER.C6⑧細胞中進行DNA轉(zhuǎn)染。在存在0.5mg/mlG418(Gibco)的條件下選擇穩(wěn)定的克隆。使用流式細胞計量術(shù)監(jiān)測ACE2的表達。將轉(zhuǎn)染的細胞與山羊抗人ACE2胞外域多克隆抗體(R&D系統(tǒng))在4°C保溫1小時。將細胞用含有0.5%BSA的PBS洗滌3次，與藻紅蛋白-偶聯(lián)的F(ab')2猴抗山羊IgG保溫45分鐘，在FACSCalibur上使用CELLQuestPro軟件(BectonDickinson)分析。分析表明大約40%被分析的克隆表達ACE2蛋白質(zhì)。所有表達ACE2蛋白質(zhì)的克隆均結(jié)合SARS-CoVS318-510片段(見下文實施例3)。實施例2:人SARS-CoV在表達ACE2蛋白質(zhì)的PER.C6⑧細胞上的生產(chǎn)為了評價ACE2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的？￡11.06@細胞是否是人SARS-CoV容許的以及是否支持人SARS-CoV生長，將三組表達ACE2蛋白質(zhì)的？￡11(6@細胞培養(yǎng)物用人SARS-CoVFrankflirt1毒株以0.1的感染復(fù)數(shù)(MOI)平行感染。容許SARS-CoV的Vero細胞作為陽性對照細胞系。在感染后(pi)12、24、48和72小時收獲感染的培養(yǎng)物上清并在一80'C速凍。在收集了所有樣品之后，將上清解凍并通過離心澄清。制備10倍系列稀釋液，在Vero細胞的鋪滿培養(yǎng)物上滴定以確定效價。表2中示出的計算效價表明表達人ACE2蛋白質(zhì)的￡11.06@細胞能產(chǎn)生與Vero細胞相似水平的SARS-CoV，高于經(jīng)工程化表達ACE2蛋白質(zhì)的其它細胞如293T細胞。實施例3:刺突(spike)蛋白片段與表達ACE2蛋白質(zhì)的？￡11(6@細胞的結(jié)合使用流式細胞計量術(shù)分析S蛋白的重組片段與ACE2轉(zhuǎn)染的￡11〔6@細胞的結(jié)合。將表達ACE2的PER.C6⑧細胞與飽和濃度的myc-標記的S318-510片段在4。C保溫1小時。重組S片段的構(gòu)建和表達基本如vandenBrinketal.(2005)所述進行。簡而言之，將SARS-CoV毒株Frankfurt1的刺突糖蛋白的SI亞基的第318—510位氨基酸在293T細胞中瞬時表達為myc/His-標記的蛋白質(zhì)，使用Ni-層析法純化(野生型FrankfUrt1S318-510片段的氨基酸序列見SEQIDN0:3;包括信號序列、myc標記和his標記的S318-510片段的氨基酸序列見SEQIDN0:4)。接下來，將衍生自公開的人SARS-CoVS蛋白質(zhì)序列的選擇的突變導(dǎo)入S318-510片段中。所述突變相應(yīng)于在毒株BJ302cl.2(變體F，GenBankno.AY429073;突變N479S)和GD03T0013(變體H，GenBankno.AY525636;突變K344R、F360S、L472P、D480G、T487S)中發(fā)現(xiàn)的突變。在三次洗滌后，通過流式細胞計量術(shù)使用生物素?；目?myc抗體(SantaCruzBiotechnologyInc.)和鏈霉抗生物素偶聯(lián)的藻紅蛋白(Caltag)分析檢測結(jié)合的片段。所有保溫和洗滌均在4。C在補加了0.5。/。牛血清白蛋白(BSA)的PBS中進行?？?ACE2IgG與重組S片段的結(jié)合表明在傳代18次后沒有觀察到ACE2表達喪失(數(shù)據(jù)未示出)。如圖l所示，所有片段均能結(jié)合表達ACE2蛋白質(zhì)的？￡11〖6@細胞，野生型S318-510片段及片段變體F的結(jié)合最強。一些人SARS-CoV分離株的S蛋白片段與表達ACE2的￡11(6@細胞的結(jié)合示出所述細胞可用于生產(chǎn)人SARS-CoV分離株。表1:能在表達ACE2蛋白的PER,C6⑧細胞上生長的人SARS-CoV毒株列表<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表2在PER.C6⑧和Vero培養(yǎng)物以MOI0.1感染12，24,48和72小時之后收獲的培養(yǎng)物上清中測定的SARS-CoV效價。效價表示為loglO士loglO標準誤。參考文獻ByrdP,BrownKW,andGallimorePH.1982.Malignanttransformationofhumanembryoretinoblastsbyclonedadenovirus12DNA.Nature298:69-71。ByrdPJ,GrandRJA，andGallimorePH.1988.DifferentialtransformationofprimaryhumanembryoretinalcellsbyadenovirusElregionsandcombinationsofElA+ras.Oncogene2:477-484。ChiuRW,TangNL，HuiDS,ChungGT，ChimSS，ChanKC，SungYM，ChanLY，TongYK,LeeWS,ChanPK,andLoYM(2004).ACE2genepolymorphismsdonotaffectoutcomeofsevereacuterespiratorysyndrome.Clin.Chem.50:1683-1686。DonoghueM,HsiehF，BaronasE，GodboutK,GosselinM，StaglianoN,DonovanM,WoolfB，RobisonK,JeyaseelanR,BreitbartRE，andActonS.2000.Anovelangiotensin-convertingenzyme-relatedcarboxypeptidase(ACE2)convertsangiotensinItoangiotensin1-9.Circ,Res.87:El-9。HofmannH，PyreK，vanderHoekL,GeierM，BerkhcmtB，andPohlmannS.2005.HumancoronavirusNL63employsthesevereacuterespiratorysyndromecoronavirusreceptorforcellularentry.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.102:7988-7993。KimTW，LeeJH,HungCF，PengS,RodenR，WangMC，ViscidiR,TsaiYC，HeL，ChenPJ,BoydDA，andWuTC,2004.GenerationandcharacterizationofDNAvaccinestargetingthenucleocapsidproteinofsevereacuterespiratorysyndromecoronavirus.J.Virol.78:4638-4645。LiW,MooreMJ,VasilievaN,SuiJ,WongSK，BerneMA，SomasundaranM，SullivanJL，LuzuriagaK，GreenoughTC，ChoeH，andFarzanM.2003.Angiotensin-convertingenzyme2isafunctionalreceptorfortheSARScoronavirus.Nature426:450-454。MarraMA，etal.2003.ThegenomesequenceoftheSARS-associatedcoronavirus.Science300:1399-1404。MosselEC,HuangC，NarayananK,MakinoS,TeshRB,andPetersCJ.2005，ExogenousACE2expressionallowsrefractorycelllinestosupportsevereacuterespiratorysyndromecoronavirusreplication.丄Virol.79:3846-3850。RotaPA，etal.2003.Characterizationofanovelcoronavirusassociatedwithsevereacuterespiratorysyndrome.Science300:1394-1399。TakasukaN，F(xiàn)ujiiH,TakahashiY,KasaiM，MorikawaS，ItamuraS,IshiiK，SakaguchiM，OhnishiK，OhshimaM，HashimotoS，OdagiriT，TashiroM，YoshikuraH,TakemoriT，andTsunetsugu-YokotaY.AsubcutaneouslyinjectedUV-inactivatedSARScoronavirusvaccineelicitssystemichumoralimmunityinmice.2004.Int.Immunol.16:1423-1430。TangL,ZhuQ，QinE，YuM,DingZ,ShiH,ChengX，WangC,ChangG，ZhuQ，F(xiàn)angF，ChangH，LiS,ZhangX,ChenX，YuJ，WangJ，andChenZ.2004.InactivatedSARS-CoVvaccinepreparedfromwholevirusinducesahighlevelofneutralizingantibodiesinBALB/cmice.DNACellBiol.23:391-394。Tipnis，SR,HooperNM，HydeR，KarranE，ChristieG，andTurnerAJ.2000.Ahumanhomologofangiotensin-convertingenzyme.Cloningandfunctionalexpressionasacaptopril-insensitivecarboxypeptidase,J.Biol,Chem.275:33238-33243。VandenBrinkEN，TerMeulenJ,CoxF，JongeneelenMA，ThijsseA,ThrosbyM，MarissenWE，RoodPM，BakkerAB，GelderblomHR，MartinaBE，OsterhausAD，PreiserW,DoerrHW,deKruifJ，andGoudsmitJ.2005,Molecularandbiologicalcharacterizationofhumanmonoclonalantibodiesbindingtothespikeandnucleocapsidproteinsofsevereacuterespiratorysyndromecoronavirus.J.Virol.79:1635-1644。YangZY,KongWP，HuangY,RobertsA，MurphyBR,SubbaraoK,andNabelGJ.2004.ADNAvaccineinducesSARScoronavimsneutralizationandprotectiveimmunityinmice.Nature.428:561-564。ZhangH,WangG，LiJ,NieY，ShiX，LianG,WangW,YinX，ZhaoY，QuX，DingM，andDengH，2004,IdentificationofanantigenicdeterminantontheS2domainofthesevereacuterespiratorysyndromeeoronavirusspikeglycoproteincapableofinducingneutralizingantibodies,J.ViroL78:6938-6945。權(quán)利要求1.一種衍生自原代人胚胎視網(wǎng)膜母細胞的人細胞，所述細胞在其基因組中包含編碼腺病毒E1A和E1B的序列，特征在于所述細胞經(jīng)工程化而表達人ACE2蛋白質(zhì)。2.權(quán)利要求1的人細胞，特征在于所述細胞是以保藏號ECACCno.96022940保藏的PER.C6細胞或其衍生物。3.權(quán)利要求1或2的人細胞，特征在于所述人ACE2蛋白質(zhì)被穩(wěn)定表達。4.一種生產(chǎn)冠狀病毒的方法，所述方法包括如下步驟a)將編碼人ACE2蛋白質(zhì)的核酸分子提供給衍生自原代人胚胎視網(wǎng)膜母細胞的人細胞，所述細胞在其基因組中包含編碼腺病毒EA和E1B的序列，b)將所述細胞在適于人ACE2蛋白質(zhì)表達的條件下培養(yǎng)，c)用冠狀病毒感染所述細胞，和d)從所述培養(yǎng)基或所述細胞中收獲所述冠狀病毒。5.權(quán)利要求4的方法，特征在于所述冠狀病毒選自SARS-CoV和HcoV-NL63組成的組。6.權(quán)利要求4或5的方法，特征在于所述人細胞是以保藏號ECACCno.96022940保藏的PER.C6或其衍生物。7.權(quán)利要求4一6任一項的方法，特征在于所述人ACE2蛋白質(zhì)被穩(wěn)定表達。8.權(quán)利要求4一7任一項的方法，特征在于編碼人ACE2蛋白質(zhì)的核酸分子是由載體提供的。9.權(quán)利要求4一8任一項的方法，特征在于所述人細胞能懸浮生長。10.權(quán)利要求4一9任一項的方法，特征在于所述人細胞可以在無血清的條件下培養(yǎng)。11.權(quán)利要求4一10任一項的方法，其進一步包括失活或減毒所收獲的冠狀病毒的步驟。12.權(quán)利要求l一3任一項的人細胞在生產(chǎn)冠狀病毒中的應(yīng)用。13.權(quán)利要求l一3任一項的人細胞在篩選抗冠狀病毒的抗病毒劑中的應(yīng)用。14.一種鑒別能抑制冠狀病毒感染和/或復(fù)制的分子的方法，所述方法包括如下步驟a)將權(quán)利要求l一3任一項的細胞與冠狀病毒在有和無候選分子的條件下一起保溫，和b)確定所述候選分子的存在是否抑制冠狀病毒感染和/或復(fù)制。15.—種選擇能降低冠狀病毒對細胞的感染的抗病毒分子的方法，所述方法包括如下步驟a)將權(quán)利要求l一3任一項的細胞與冠狀病毒的表面蛋白在有或無候選抗病毒分子的條件下接觸，所述表面蛋白參與所述冠狀病毒與由所述細胞表達的人ACE2蛋白質(zhì)的結(jié)合，b)測定所述細胞與所述表面蛋白之間的結(jié)合相互作用，和c)選擇與在無所述候選抗病毒分子的條件下的所述結(jié)合相互作用相比，使得該結(jié)合相互作用降低的候選抗病毒分子。全文摘要本發(fā)明涉及冠狀病毒的生產(chǎn)。本發(fā)明特別涉及通過使用表達功能性SARS-CoV受體的細胞生產(chǎn)SARS-CoV的方法。文檔編號C12N7/00GK101228267SQ200680026522公開日2008年7月23日申請日期2006年7月21日優(yōu)先權(quán)日2005年7月22日發(fā)明者E·N·范登布林克,J·H·特爾默倫申請人:克魯塞爾荷蘭公司