專利名稱：：膠囊青霉阿拉伯糖呋喃糖苷酶的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及具有a-L-阿拉伯糖呋喃糖苷酶活性的分離的多肽和編碼該多肽的分離的核酸序列。本發(fā)明還涉及包含所述核S交序列的核酸構建體、載體和宿主細胞，以及用于產生和使用所述多肽的方法。
背景技術：
：阿拉伯糖呋喃糖苷酶能水解a-L-阿拉伯糖苷中的末端非還原性a-L-阿拉伯糖呋喃糖香殘基，并被分類為EC3.2.1.55。Filho等G4;//.￡"v/ra".M/cra&o/.1996，Vol.62,168-173)公開了來自膠囊青霉(/5ca/^M/^wm)的兩個a-L-阿拉伯糖呋喃糖芬酶的純化和表征，所述兩個a-L-阿拉伯糖呋喃糖苷酶的分子量分別為64.5kDa和62.7kDa。來自黑曲霉的a-L-阿拉伯糖呋喃糖苷酶及其序列可從WO9606935得知。發(fā)明簡述本發(fā)明人令人驚訝地從膠嚢青霉菌抹中分離出a-L-阿拉伯糖呋喃糖苷酶。所述a-L-阿拉伯糖呋喃糖苷酶的大小為大約35kDa。本發(fā)明的成熟氨基酸序列與WO9606935中的黑曲霉阿拉伯糖呋喃糖苦酶具有76%的同源性。本發(fā)明人還分離出編碼所述新a-L-阿拉伯糖呋喃糖苷酶的基因。因此，在本發(fā)明的第一方面提供阿拉伯糖呋喃糖芬酶，其為a)多肽，該多肽具有如SEQIDNO:2所示成熟肽的氨基酸序列，或者可通過一個或多個氨基酸的取代、缺失，和/或插入由其獲得的多肽；b)(a)或(b)所述多肽的類似物，其i)與所述多肽具有至少80%同源性，ii)是所述多肽的等位變體，c)由核酸序列編碼的多肽，所述核酸序列在高嚴緊條件下與編碼成熟多肽的SEQIDNO:2的核酸序列的互補《連或其具有至少100個核苷酸的亞序列雜交。在第二方面，本發(fā)明提供核酸序列，所述核酸序列包含編碼第一方面中阿拉伯糖呋喃糖香酶的核酸序列。在第三方面，本發(fā)明提供核酸序列，其包含a)編碼SEQIDNO:2所示的阿拉伯糖呔喃糖香酶的DNA序列，b)類似物DNA序列，其i)與所述DNA序列具有至少80%同源性，或者ii)在高嚴緊條件下與所述DNA序列的互補鏈，或其具有至少100個核苷酸的亞序列雜交，iii)是其等位變體，或者包含a)或b)的互補鏈。在第四方面，本發(fā)明凈是供核酸序列，其與SEQIDNO:l所示的DNA序列具有至少80%同源性，或者a)在高嚴緊條件下與所述DNA序列的互補鏈或其具有至少100個核苷酸的亞序列雜交，b)是其等位變體，或者是a)或b)的互補鏈。在第五方面，本發(fā)明提供核酸構建體，其包含第二、第三和第四方面的核酸序列，所述核酸序列與能指導阿拉伯糖呋喃糖苷酶在合適的表達宿主中表達的一個或多個控制序列可操作地連接。在第六方面，本發(fā)明提供重組表達載體，其包含第五方面的核酸構建體。在第七方面，本發(fā)明提供重組宿主細胞，其包含第六方面的核酸構建體。在第八方面，本發(fā)明提供用于產生阿拉伯糖呋喃糖苷酶的方法，其包括在有益于阿拉伯糖呋喃糖普酶產生的條件下培養(yǎng)第七方面的宿主細胞，和回收阿拉伯糖呋喃糖芬酶。在第九方面，本發(fā)明提供第一方面的阿拉伯糖呋喃糖香酶的用途。發(fā)明詳述在本發(fā)明的第一個實施方案中，分離的多肽具有的氨基&^f列與SEQIDNO:2的氨基酸1至328(即，成熟多肽)所示的氨基酸序列具有至少80%同一性。在本發(fā)明的令人感興趣的實施方案中，所述多肽與SEQIDNO:2的氨基酸l至328所示的氨基酸序列具有至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%，或者至少99%的同一性(下文中的"同源多肽，，)。在優(yōu)選的實施方案中，同源多肽具有的氨基S臾序列與SEQIDNO:2的氨基酸1至328所示的氨基酸序列相差5個氨基酸，例如4個氨基酸，如3個氨基酸，相差2個氨基酸，或相差l個氨基酸?？梢酝ㄟ^本領域已知的計算機軟件，如GCG軟件包(ProgramManualfortheWisconsinPackage,Version8，August1994,GeneticsComputerGroup,575ScienceDrive,Madison,Wisconsin,USA5371l)中提供的GAP合適地比對序列和計算同源性(Needleman，S.B.andWunsch，C.D.,(1970),JournalofMolecularBiology,48,443-453)。使用下述設置比較氨基酸序列GAP產生罰分為3.0，GAP延伸罰分為0.1。用于確定同源性的氨基S交序列的相關部分是成熟多肽，即，無信號肽。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽包含如SEQIDNO:2的氨基酸1至328所示的氨基酸序列，其等位變體，或其具有阿拉伯糖呋喃糖苷酶活性的片段。明顯地，本發(fā)明的多肽也可以由SEQIDNO:2的氨基酸1至328所示的氨基酸序列組成。形式。等位變異通過突變天然地發(fā)生，并且可導致種群內的多態(tài)性。基因突變可以是沉默的(在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。在本發(fā)明的第二個實施方案中，分離的多肽由核酸序列編碼，所述核酸序列在低嚴緊條件下，優(yōu)選在中嚴緊條件下，更優(yōu)選在高嚴緊條件下，與下述序列雜交(i)SEQIDNO:1的核苷酸1至987所示的核酸序列的互補鏈，或者(ii)(i)的至少100個核苷酸的亞序列(J.Sambrook，E.F.Fritsch,andT.Maniatus,1989，Mo/ecwAarC7om'"g,爿/^oratoryM/，2dedition,ColdSpringHarbor,NewYork)。如SEQIDNO:1的核苷酸1至987所示的核酸序列，其互補鏈的亞序列可以為至少100個核苷酸，或者優(yōu)選至少200個核苷酸。此外，亞序列應該編碼具有葡萄糖轉移酶活性的多肽片段。多肽也可以是具有葡萄糖轉移酶活性的多肽的等位變體或片段。SEQIDNO:l或其亞序列，以及SEQIDNO:2或其片段；可用于設計核酸探針，以根據本領域內公知的方法從不同屬和種的菌株鑒定和克隆編碼具有阿拉伯糖呋喃糖苷酶活性的多肽的DNA。具體而言，根據標準的Southern印跡方法，可將這些探針用于與感興趣的屬或種的基因組或cDNA雜交，以鑒定和分離其中相應的基因。這些探針可明顯短于完整序列，但長度上應為至少15,優(yōu)選至少25,更優(yōu)選至少35個核苷酸。也可以使用較長的探針。DNA和RNA探針二者均可使用。通常將探針標記以探測相應的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)標記)。這些探針包含于本發(fā)明中。因而，可從由這些其它生物體制備的基因組DNA或cDNA文庫中篩選DNA，所述DNA與上述探針雜交并且編碼具有阿拉伯糖呋喃糖苷酶活性的多肽?？梢酝ㄟ^瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或通過技術人員公知的其它分離技術分離來自這些其它生物體的基因組或其它DNA?？梢詫碜晕膸斓腄NA或分離的DNA轉移至硝化纖維素(nitrocellulose)或其它合適的載體材料并且固定于其上。為了鑒定與SEQIDNO:l或其亞序列同源的克隆或DNA，將所述載體材料用在Sounthern印跡中。就本發(fā)明而言，雜交表示核酸序列在低至高的嚴緊條件下與標記的核酸探針；它的互補鏈；或它們的亞序列雜交，所述核酸探針對應于SEQIDNO:l所示核酸序列。可使用X射線片(X-rayfilm)檢測在這些條件下與核酸探針雜交的分子。在另一個令人感興趣的實施方案中，核酸探針是編碼SEQIDNO:2的(成熟)多肽的核酸序列，或其亞序列。在第三個令人感興趣的實施方案中，核酸探針是SEQIDNO:1。在第四個令人感興趣的實施方案中，核酸探針是SEQIDNO:1的成熟多肽編碼區(qū)。對于長度至少100個核苷酸的長探針，將低至高的嚴緊條件定義為在42°C,在5XSSPE、0.3%SDS、200fig/ml已剪切并且變性的鮭精DNA中，根據標準的Southern印跡進行處理預雜交和雜交，并且對于低嚴緊性為25%的曱酰胺、對于中嚴緊性為35%的曱酰胺或對于高嚴緊性為50%的曱酰胺。對于長度為至少100個核苷酸的長探針，使用2xSSC、0.2%SDS優(yōu)選至少在50°CC(氐嚴緊性)，更優(yōu)選至少在55°C(中嚴緊性)，甚至更優(yōu)選至少在65°C(高嚴緊性)將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將嚴緊條件定義為在比用Bolton和McCarthy的計算法(1962，尸raceed/"^o///zeA^/o"<a/Jcacfemyo/\SWe"ces"&448:1390)計算的Tj氐5。C至10°C,在0.9MNaCl,0.09MTris-HC1pH7.6,6mMEDTA,0.5%NP-40,1xDenhardt溶液，1mM焦碌酸鈉(sodiumpyrophosphate),1mM碌酸二氫鈉(sodiummonobasicphosphate),0.1mMATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，根據標準的Southern印跡步驟進行預雜交、雜交和雜交后洗滌。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將所述載體材料在6xSSC加0.1%SDS中洗滌一次15分鐘，并用6xSSC在比計算的Tm低5。C至10。C的溫度洗涂兩次，每次15分鐘。如上所述，本發(fā)明的多肽可以是具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽或其成熟多肽，其中一個或多個氨基酸已被另一個(其它)氨基酸取代，其中一個或多個氨基酸已缺失，和/或在其中已插入一個或多個氨基酸。優(yōu)選地，氨基酸改變對性質是不重要的，即保守的氨基酸取代，其不顯著影響蛋白質的折疊和/或活性；通常為1至大約30個氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端曱硫氨酸殘基；多至大約20-25個殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或其它功能來促進純化的小延伸，例如多組氨酸序列(polyhistidinetract)、抗原表位(antigenicepitope)或結合i或。保守取代的實例是在以下組之內堿性氨基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸組(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸組(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和曱硫氨酸)。通常不改變比活性(specificactivity)的氨基酸取代是本領域已知的，并且由例^口H.NeurathandR.L.Hill，1979，/w,77ze/Vote/m1，AcademicPress,NewYork4苗述。最普遍發(fā)生的交換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/丁hr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、AWGlu和Asp/Gly,及其反向的交換。通常，對于具有SEQIDNO:2的氨基酸1至328所示的氨基酸序列的多肽，優(yōu)選本發(fā)明的多肽具有其阿拉伯糖呋喃糖苷酶活性的至少20%。對于具有SEQIDNO:2的氨基酸1至328所示的氨基酸序列，特別優(yōu)選的多肽具有其阿拉伯糖^^喃糖苦酶活性的至少30%，如至少40%,例如至少50%,優(yōu)選至少60%，如至少70%，例如至少80%，更優(yōu)選至少90%,或至少95%。SEQIDNO:2所示的a-L-阿拉伯糖呔喃糖苦酶的大小約為35kDa。優(yōu)選本發(fā)明的多肽是大小為30到40kDa,更優(yōu)選為32到36kDa,最優(yōu)選35kDa的a-L-阿^i伯糖呋喃糖苷酶。SEQIDNO:2所示的a-L-阿拉伯糖呋喃糖芬酶屬于糖香水解酶家族62(GH62)。優(yōu)選本發(fā)明的多肽是屬于糖苷水解酶家族62(GH62)的a-L-阿拉伯糖呋喃糖苷酶。本公開中所用的糖苷水解酶家族(GH)的編號方式是按照在URL:http:〃afmb,cnrs-mrs.fr/cazy/CAZY/index.html的C4Zy-潛-活'/i爽嚴,器(Carbohydrate-ActiveEnzymesserver)上Coutinho,RM.禾口Henrissat，B(1999)的概念或者可選的Coutinho,RM.和Henrissat,B.1999;Themodularstructureofcellulasesandothercarbohydrate-activeenzymes:anintegrateddatabaseapproach(纖維素酶和其它糖活性酶的模塊結構整合的數據庫方法)。本發(fā)明的多肽可以獲得自任何屬的微生物。就本發(fā)明而言，用于本文與給定的來源有關的術語"獲得自"，意思是核酸序列編碼的多肽由所述來源產生，或由其中插入了來自所述來源的核酸序列的細胞產生。在優(yōu)選的實施方案中，所述多肽是胞外分泌的。本發(fā)明的多肽可以是真菌多肽，更優(yōu)選是絲狀真菌多肽，如枝頂孢霉屬(Jcrewom.wm)、曲霉屬(Js/e^7'〃W61)、》豆梗霉屬(」wwo6os/(i/MW)、隱3求菌屬(CVyptococci^1)、FW6osW簡、嫌孑包屬(Fwsan.訓)、腐質霉屬(//圃/co/a)、Afog"a/w^/ze、毛霉屬(Mwc。r)、毀絲霉屬(A^ce/z'op繞ora)、7Veoca〃/most,x、月7^孑包菌屬(iVeMrasjwra)、4以青霉屬(Paecf/om_yces)、青霉屬(戶em'c/〃/wm)、尸zV畫少cey、裂褶菌屬(6"c/2/zop/7jV/騰)、棵節(jié)菌屬(7^/araw少ces)、熱子囊菌屬(T72ermoowcM力、4炎孑包殼屬(r/n'e/av/a)、7b/_y/xc/flWwm或木審屬(Jh'c/zocferm(3)多肽。在另一個優(yōu)選的實施方案中，多肽是棘孢曲霉04^e/^'〃wacw/eam力、泡盛曲霉(Aper^〃MJ1a而附on')、臭曲霉(A/erg7'〃MSybd油力、日本曲霉(/!1sperig7-//ws乂qpow/cus1)、^勾1#J|^4s/7erg/〃wsw/c/w/""s)、(Jsperg/Z/wsm'ger)、米曲霉(y^/erg/〃w5o/-_yzae)、^干孑包卄大鐮孑包(FMra〃'M附Z"c〃Wo/cfes1)、禾谷嫌孑包(Fwsan'MWcerea//s)、庫威嫌孑包(F"i^n'wmcraoAwe〃e/we)、大刀嫌孑包(F附ar/w附cw/morw附)、禾本牙牛嫌孑包(Fwsar/MW、禾赤嫌孑包(Fwsan'wmgra/w'www)、異孑包鐮孑包(Fws"〃'w附/ze&ras/xrww)、合5J欠木鐮孑包(尸wsar/w附、尖鐮孑包(Fwsan'wwoxys/orww)、多4支鐮孑包(Fwsan'w附re〃cw/atom)、斗分纟工鐮孑包(FMsa〃'wmrayewm)、才妻骨木鐮孑包(F^a〃.wws"mZwc/"wm)、月夫色嫌孑包(7^ar/wmsflrcoc/zraw—、擬分枝孑包嫌孑包(FwraWw附5pora的'c/n'o/(ies)、石克色嫌孑包(Fusan'ww、圓嫌孑包(Fws"Wwmtonz/oswm)、才以絲孑包嫌孑包(i^ky"r/wwWc/zc^/zec/o/day)、銀片嫌孑包(Fwsar/wmvg恥"afwm)、特異腐質審(i/wmZco/azVwo/e—、疏棉狀腐質零(7/讓z'co/"/<3"wgz>aya)、米黑毛霉(Mwcor附/e/ze/)、嗜熱毀絲霉(聊ce/Zo/綠ora決emopMa)、粗糙脈孑包菌(iVe,，racraMfl)、月交囊青霧(戶e"/"7/z'wmca/ww/a/謂)、產紫青審(尸ew/c/〃/簡/t^pwrage"w附)、哈茨木審(7Hc/70(imwa/z<arz/a"wm)、康亍木審(7Hc/iocferm(3Ao"/喂7)、長枝木霉(7Wc/20cfe，a/owg^rac/ziafww)、里氏木審(7Hc/2ode/7wareese/)或綠色木霉(7Wc/zc^rmavzW(ie)多狀。在最優(yōu)選的實施方案中，多肽源自發(fā)菌科(7Hc/zocoma"ae)內的菌抹；例如青霉菌屬CPem'c/〃/wm)內的菌林，例如膠嚢青霉菌種內的菌抹，特別是源自膠嚢青霉菌林CBS292.62?？衫斫獾氖菍τ谇笆龅木N，本發(fā)明包含完全和不完全階段(perfectandimperfectstates)兩種，和其它分類學的等同物(equivalent),例如無性型(anamorph)，而無論它們已知的種名。本領域熟練技術人員將輕易地識別適當等同物的同一性。這些具體的菌抹在許多培養(yǎng)物保藏中心對于公眾能夠輕易地取得，所述保藏中心諸如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心(DeutscheSammiungvonMikroorganismenimdZellkulturenGmbH)(DSM)、真菌菌種保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures)(CBS)和農業(yè)研究機構保藏中心北區(qū)研咒中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection，NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)。本發(fā)明分離的多肽來自特定的膠嚢青霉菌抹，所述菌抹可從真菌菌種保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures(CBS)，Uppsalalaan8,3584CTUtrecht，TheNetherlands(可選地，P.O.Box85167,3508ADUtrecht,TheNetherlands)取得，登錄號為CBS292.62。此外，可以使用上述的探針從其它來源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物來鑒定和獲得這些多肽。用于從天然生境(habitat)分離微生物的技術是本領域內公知的。隨后可通過相似地篩選其它微生物的基因組或cDNA文庫來獲得所述核酸序列。一旦用所述探針檢測到編碼多肽的核酸序列，就能夠使用本領域普通技術人員熟知的技術將所述序列分離或克隆(參見，例如，Sambrooke/a/.,1989,見上文)。由本發(fā)明的核酸序列編碼的多肽還包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中將另外的多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通過將編碼生融合的多肽。產生融合多肽的技術是本領域已知的，包括連接編碼多肽的編碼序列以使它們在閱讀框中，并且4吏融合多肽的表達在相同啟動子和終止子的控制下。核苦酸序列本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明所述多肽的分離的核酸序列。在一個令人感興趣的實施方案中，所述核酸序列與SEQIDNO:1的核香酸1至987所示的核酸序列具有至少80%同一性。優(yōu)選地，核酸序列與SEQIDNO:1的核苷酸1至987所示的核酸序列具有至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%，或者至少99%同一性。在本發(fā)明的另一個令人感興趣的實施方案中，所述核酸序列包含SEQIDNO:1的核苷酸1至987所示的氨基S交序列，其等位變體，或者其能夠編碼本發(fā)明多肽的片4殳。明顯地，所述核酸序列可以由SEQIDNO:1的核苷酸1至987所示的氨基酸序列組成。本發(fā)明還包含核酸序列，所述核酸序列編碼具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽或其成熟多肽，由于遺傳密碼的簡并性其不同于SEQIDNO:1。本發(fā)明還涉及SEQIDNO:l的亞序列，其編碼具有阿拉伯糖呋喃糖苷酶活性的SEQIDNO:2的片HSEQIDNO:l的亞序列是核酸序列，其包含于SEQIDNO:2的核苷酸l至987中，只是從5，端/3，端缺失一個或多個核香酸。本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明的多肽的分離的核酸序列，其在低嚴緊條件下，優(yōu)選在中嚴緊條件下，更優(yōu)選在高嚴緊條件下，與下述序列雜交(i)SEQIDNO:1的核普酸l至987所示的核酸序列的互補鏈，或(ii)(i)的具有至少100個核苷酸的亞序列。本發(fā)明還涉及(i)、(ii)和(iii)的互補鏈。用于分離或克隆編碼多肽的核S吏序列的技術是本領域內已知的，包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或其組合。可通過例如使用熟知的聚合DNA片段，從而實現從這種基因組DNA克隆本發(fā)明的核酸序列。參見，例^口，Innis&of/"1990,尸C7,'JGw/ofetojW^/zocfetmt/J/;/!'cfl"o",AcademicPress,NewYork。可以使用其它核酸擴增方法，例如連接酶鏈式反應(LCR)、連接活化轉錄(ligatedactivatedtranscription;LAT)和基于核酸序列的擴增(NASBA)?？梢詮哪z嚢青霉的菌林，或從其它或相關的生物體克隆核酸序列，并且可以是例如所述核酸序列的多肽編碼區(qū)的等位變體或種變體(speciesvariant)。分離的核酸序列可以，例如通過基因工程中使用的標準克隆步驟獲得，以將核酸序列從其天然位置轉移到不同的位點，并在該位點再生。克隆步驟可以包括切除和分離包含編碼多肽的核酸序列的期望的核酸片段，將該片段插入載體分子，并將該重組載體整合入宿主細胞，在所述宿主細胞中，將復制該核酸序列的多個拷貝或克隆。所述核酸序列可以是基因組的、cDNA、RNA、半合成的、合成的來源，或它們的任何組合。就本發(fā)明而言，兩個核酸序列之間的同一性程度如上所述確定。修飾編碼本發(fā)明多肽的核酸序列對于合成與所述多肽基本上相似的多肽可能是必需的。術語與所述多肽"基本上相似"指多肽的非天然存在的形式。這些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于從其天然來源分離的多肽，例如，比活、熱穩(wěn)定性、最適pH等方面不同的變體。可以在作為SEQIDNO:l的多肽編碼部分存在的核酸序列，例如其亞序列的基礎上，和/或通過引入如下核苷酸取代來構建變體序列所述取代不產生由核酸序列編碼的多肽的另外的氨基酸序列，但是其符合意欲產生酶的宿主生物體的密碼子選擇；或者所述核芬酸取代可產生不同的氨基酸序列。關于核芬酸取代的概述，參見，1"列^口，Fordefa/.,1991,尸roe/wJExpreMZ,o"Pw/"7yca^ow2:95-107。對于本領域技術人員顯而易見的是，這些取代能夠在對于分子功能重要的區(qū)域之外進行，并且仍然產生活性多肽。對于由本發(fā)明的分離的核酸序列編碼的多肽活性關鍵的并且因此優(yōu)選不進行取代的氨基酸殘基，可以根據本領域公知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(參見，例如，CunninghamandWells，1989，Sc/e"ce244:1081-1085)來鑒定。在后一4支術中，將突變引入到分子中的每個正電殘基處，并且測試所得突變分子的阿拉伯糖呋喃糖苷酶活性，以鑒定對于所述分子的活性關鍵的氨基酸殘基。底物-酶相互作用的位點也能夠通過分析三維結構測定，如通過核^磁共振分析、晶體學或光親和標記這樣的技術來測定(參見，例如，deVosWa/"1992,255:306-312;Smithefa/.,1992,Jow脂/。/Mo/織/"r腸/，224:899-904;Wlodaverefa/.,1992,F五5S丄W^y309:59-64)。核酸構建體本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的核酸序列的核酸構建體，所述核酸序列與一個或多個控制序列可操作地連接，所述控制序列能指導多肽在合適的宿主細胞中表達?？梢杂迷S多方式操作編碼本發(fā)明多肽的分離的核酸序列以提供多肽的表達。依賴于表達載體，在將核酸序列插入載體之前對其進行操作可能是理想的或必需的。使用重組DNA方法修飾核酸序列的技術是本領域熟知的。控制序列包括對本發(fā)明多肽的表達必需或有利的所有組分。對于編碼多肽的核酸序列，每個控制序列可以是天然的或是外源的。這樣的控制序列包括，但是不限于，前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列，和轉錄終止子。最少的情況下，控制序列包括啟動子，以及轉錄和翻譯終止信號?？刂菩蛄锌梢耘c接頭(linker)—起提供，以導入特定的限制酶位點，促進控制序列與編碼多肽的核S交序列的編碼區(qū)的連接?？刂菩蛄锌梢允呛线m的啟動子序列，其是由用于表達核酸序列的宿主細胞識別的核酸序列。啟動子序列含有介導多肽表達的轉錄控制序列。啟動子可以是在所選的宿主細胞中顯示轉錄活性的任何核酸序列，包括突變的、截斷的和雜合的啟動子，并且可以從編碼與宿主細胞同源或異源的胞外或胞內多肽的基因獲得。用于指導本發(fā)明的核酸構建體轉錄，特別是在細菌宿主細胞中轉錄的合適啟動子的實例是從下述獲得的啟動子大腸桿菌/"c操縱子、天藍色鏈霉菌(&re/tom少CM^///^)瓊脂糖酶基因(^<^)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sac丑)、地衣芽孢桿菌a-淀粉酶基因(amy丄)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產麥芽糖淀粉酶基因(flw少竭、解淀粉芽孢桿菌(x-淀粉酶基因(amy0)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(^"尸)、枯草芽孢桿菌x少"和矽/S基因和原核(3-內酰胺酶基因(Villa-Kamaroffefa/"1978，尸raceWwgsq/"AeiVa"owa/^4cacte，5We"ce5OS^75:3727-3731)，以及toc啟動子(DeBoerda/.，1983，戶rac^(i/"wAe7VaW0"a/爿cadem少。/5We"cas80:21-25)。另夕卜的啟動子在"Usefblproteinsfromrecombinantbacteria"in5Wewf訴cXmer/caw,1980,242:74-94中；和在Sambrooke/a/.，1989,見上文中有所描述。用于指導本發(fā)明的核酸構建體在絲狀真菌宿主細胞中轉錄的合適啟動子的實例是從下列酶的基因獲得的啟動子米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫才艮毛霉(W/z/zwm^w;m'e/ze/)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性a-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性a-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(g/^4)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構酶、構巢曲霉乙酰胺酶，和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(WO96/00787),以及NA2-tpi啟動子(來自黑曲霉中性a-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸異構酶基因的啟動子的雜合體)；和它們的突變的、截斷的和雜合的啟動子。在酵母宿主中，有用的啟動子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(ENO-l)、釀酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氳酶(ADH2/GAP)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。對于酵母宿主細胞其它有用的啟動子由RomanosWa/.，1992,8:423-488描述?？刂菩蛄幸部梢允呛线m的轉錄終止子序列，是由宿主細胞識別以終止轉錄的序列。所述終止子序列與編碼多肽的核酸序列的3，末端可操:作地連接。在所選宿主細胞中有功能的任何終止子可用于本發(fā)明中。對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構巢曲霉鄰氨基苯曱酸合酶、黑曲霉a-葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。對于酵母宿主細胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細胞色素C(CYCl)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氬酶。對于酵母宿主細胞其它有用的終止子由Romanos1992，見上文描述。控制序列還可以是合適的前導序列，其是對于宿主細胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導序列可操作地連接于編碼多肽的核酸序列的5，-末端。在所選宿主細胞中有功能的任何前導序列可用于本發(fā)明中。對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的前導序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶和構巢曲霉丙糖磷酸異構酶。對于酵母宿主細胞合適的前導序列從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、釀酒酵母3」疇酸甘油酸激酶、釀酒酵母a因子和釀酒酵母醇脫氬酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)。控制序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是與核酸序列的3'末端可操作地連接的序列，并且在轉錄時，宿主細胞將其識別為將聚腺苷殘基添加至轉錄的mRNA的信號。在所選宿主細胞中有功能的任何聚腺普酸化序列可用于本發(fā)明中。對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的聚腺苷酸化序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構巢曲霉鄰氨基苯曱酸鄰氨基苯甲酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉a-葡糖普酶。對于酵母宿主細胞有用的聚腺苷酸化序列由GuoandSherman,1995,似o/ecw/arCW/w/ar歷o/ogy15:5983-5990描述?？刂菩蛄羞€可以是信號肽編碼區(qū)，其編碼與多肽的氨基末端相聯的氨基酸序列，并且指導編碼的多肽進入細胞的分泌途徑。核酸序列的編碼序列5，端可固有地包含信號肽編碼區(qū)，其與編碼分泌多肽的編碼區(qū)片段一起天然地連接在翻譯閱讀框中?？晒┻x擇的是，編碼序列5'端可含有對于所述編碼序列是異源的信號肽編碼區(qū)。異源信號肽編碼區(qū)在編碼序列不天然地含有信號肽編碼區(qū)時可能是必需的?；蛘撸庠葱盘栯木幋a區(qū)可以簡單地取代天然信號肽編碼區(qū)以增強多肽的分泌。然而，指導表達的多肽進入所選宿主細胞的分泌途徑的任何信號肽編碼區(qū)可在本發(fā)明中使用。對于細菌宿主細胞有效的信號肽編碼區(qū)是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼區(qū)芽孢桿菌屬NCIB11837產麥芽糖淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌a-淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草蛋白酶、地衣芽孢桿菌(3-內酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(w;7rr，^nS，w;^M)和枯草芽孢桿菌/ra丄另外的信號肽由SimonenandPalva，1993,7Vf/cra6/o/og/ca/7ev/ew557:109-137甘苗述。對于絲狀真菌宿主細胞有效的信號肽編碼區(qū)是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼區(qū)米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特異腐質霉纖維素酶和疏棉狀腐質霉脂肪酶。對于酵母宿主細胞有用的信號肽從釀酒酵母a因子和釀酒酵母轉化酶的基因獲得。其它有用的信號肽編碼區(qū)由Romanos""/.,1992,見上文，描述?？刂菩蛄羞€可以是前肽編碼區(qū)，其編碼位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽稱為酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情況下稱為酶原(zymogen))。前多肽通常是無活性的并且能夠通過前肽的催化或自催化切割從前多肽轉化成成熟活性多肽?？梢詮目莶菅挎邨U菌》威性蛋白酶(a;r五)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(w/^r)、釀酒酵母a因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜熱毀絲霉漆酶(WO95/33836)的基因獲得前肽編碼區(qū)。當信號肽和前肽區(qū)二者均出現在多肽的氨基末端時，將前肽區(qū)置于緊接著(nextto)多肽氨基末端，并且將信號肽區(qū)置于緊接著前肽區(qū)的氨基末端。同樣理想的是添加調節(jié)序列，其允許相對于宿主細胞的生長來調節(jié)多肽的表達。調節(jié)系統(tǒng)的實例是引起基因表達因響應化學或物理刺激物，包括調節(jié)化合物的存在而開啟或關閉的那些系統(tǒng)。原核系統(tǒng)中的調節(jié)系統(tǒng)包括/"c、toc和^操縱基因系統(tǒng)。在酵母中，可以使用ADH2系統(tǒng)或GAL1系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用TAKAa-淀粉酶啟動子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子作為調節(jié)序列。調節(jié)序列的其它實例是那些允許基因擴增的序列。在真核系統(tǒng)中，這些序列包括在氨曱蝶呤(methotrexate)存在下擴增的二氬葉酸還原酶基因，和以重金屬(withheavymetal)擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核酸序列將與調節(jié)序列可操作地連接。表達載體本發(fā)明還涉及重組表達載體，所述重組表達載體包含本發(fā)明的核酸序列、啟動子和轉錄和翻譯終止信號。上述的多種核酸和控制序列可以結合在一起以產生重組表達載體，所述表達載體可以包括一個或多個方便的限制位點以允許在這些位點插入或取代編碼多肽的核酸序列。可供選擇的是，可以通過在合適的用于表達的載體中插入包含所述序列的核酸序列或核酸構建體來表達本發(fā)明的核酸序列。在制備表達載體的過程中，將編碼序列置于載體中，從而將該編碼序列與合適的表達控制序列可操作地連接。重組表達載體可以是任何載體(例如，質?；虿《?，其能夠方便地進行重組DNA步驟，并且能夠產生核酸序列的表達。載體的選擇將通常依賴于載體與將引入該載體的宿主細胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環(huán)狀質粒。載體可以是自主復制載體，即，作為染色體外實體(entity)存在的載體，其復制獨立于染色體復制，例如，質粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用于確保自復制的手段(means)?；蛘?，載體可以是一種載體，當將其引入宿主細胞中時，整合到基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復制。此外，可以使用單獨的載體或質粒或兩個或更多個載體或質粒，其共同含有待引入宿主細胞基因組的完整DNA，或可以使用轉座子(transposon)。本發(fā)明的載體優(yōu)選地含有一個或多個選擇性標記，其允許簡單選擇轉化的細胞。選擇性標記是基因，其產物提供殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗性、對營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性(prototrophytoauxotrophs)等。細菌選4奪性標記的實例是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的da/基因，或賦予抗生素抗性，例如氨千青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性的標記。對于酵母宿主細胞合適的標記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于絲狀真菌宿主細胞的選擇性標記包括但不限于aw必(乙酰胺酶)、arg^(鳥氨酸氨甲?；D移酶)、(草銨膦(phosphinothricin)乙酰轉移酶)、Z^gB(潮霉素磷酸轉移酶)、"/aD(硝酸還原酶)(nitratereductase),(乳清酸核苷-5，-磷酸脫羧酶)(orotidine-5，-phosphatedecarboxylase)、(石克酸腺普酰轉移酶)和frpC(鄰氨基笨甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它們的等同物。優(yōu)選用在曲霉屬細胞中的是構巢曲霉或米曲霉的aw^S和p，G基因和吸水一漣霉菌(5^e/tom少ce/y/gro^co/〖CM力的6ar基因。本發(fā)明的載體優(yōu)選含有元件，其允許載體穩(wěn)定地整合入宿主細胞基因組或允許載體獨立于基因組在細胞中自主復制。為了整合入宿主細胞基因組，載體可依賴編碼多肽的核酸序列或用于通過同源或非同源重組穩(wěn)定整合入基因組的任何其它載體元件?；蛘?，載體可以含有額外的核酸序列，用于指導通過同源重組整合入宿主細胞的基因組。額外的核酸序列使載體能夠在染色體中的精確位置整合入宿主細胞基因組。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應該優(yōu)選含有足夠數量的核酸，如100至1，500^咸基對，優(yōu)選400至1,500^威基對，并且最優(yōu)選800至1,500堿基對，其與相應的目標序列高度同源以增強同源重組的概率。整合元件可以是任何序列，其與宿主細胞基因組中的目標序列同源。此外，整合元件可以是非編碼或編碼的核酸序列。另一方面，可通過非同源重組將載體整合到宿主細胞基因組中。為了自主復制，載體可以進一步包含復制起點，其使載體能夠在所述的宿主細胞中自主地復制。細菌復制起點的實例是允許在大腸桿菌中復制的質粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復制起點，和允許在芽孢桿菌屬細菌中復制的質粒pUB110、pE194、pTA1060和pAM(31的復制起點。用于酵母宿主細胞的復制起點的實例是2微米復制起點，ARS1，ARS4，ARS1和CEN3的組合，和ARS4和CEN6的組合。復制起點可為具有突變的復制起點，所述突變使其功能在宿主細胞中為溫度敏感的(參見，例如，Ehrlich,1978，戶raceedz'wgso/AeiV加.o"a/爿C(3(i纖75Wewcast/5!/i75:1433)?？梢詫⒍嘤谝粋€拷貝的本發(fā)明的核酸序列插入宿主細胞以增加基因產物的產生。核酸序列拷貝數的增加可通過如下方法獲得將至少一個額外拷貝的序列整合入宿主細胞基因組，或將可擴增的選擇性標記基因納入核酸序列，其中可在合適的選擇劑(selectableagent)存在下通過培養(yǎng)細胞來選擇含有選擇性標記基因的擴增拷貝的細胞，并由此可選擇含有核酸序列的額外拷貝的細胞。用于連接上述元件以構建本發(fā)明重組表達載體的方法是本領域技術人員熟知的(參見，例如，Sambrook"a/.，1989,見上文)。宿主細月包本發(fā)明還涉及重組宿主細胞，所述重組宿主細胞包含本發(fā)明的核S吏序列，將其有利地用于多肽的重組產生中。將包含本發(fā)明核酸序列的載體？1入宿主細胞中，從而將該載體保留作為染色體整合體(chromosomalintegrant)或作為如前所述的自復制的染色體夕卜載體。宿主細胞的選擇將很大程度依賴于編碼多肽的基因和它的來源。宿主細胞可以是單細胞微生物，例如，原核生物，或非單細胞微生物，例j口，真一亥生物。有用的單細胞微生物是細菌細胞，例如革蘭氏陽性細菌，其包括但不限于，芽孢桿菌屬細胞，例如，嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌(Sa"7/wc/aw!7)、凝結芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌；或鏈霉菌屬細胞，例如，淺青紫鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌，或革蘭氏陰性細菌例如大腸桿菌和假單胞菌屬菌種。在優(yōu)選的實施方案中，細菌宿主細胞是遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細胞。在另一個優(yōu)選的實施方案中，芽孢桿菌屬細胞是嗜堿的芽孢桿菌屬。可通過如下方法實現將載體引入到細菌宿主細胞例如原生質體轉化(參見，例如，ChangandCohen，1979,7Wo/ecw/wGe"era/G^w"/c^168:111-115),寸吏用感受態(tài)纟田月包(參見,例i口，YoungandSpizizen，1961，Jowr"a/o/^ac/eWo/o^81:823-829或DubnauandDavidoff-Abelson,1971，Jowma/M/ecw/ar56:209-221),電穿孑L(參見，侈'J^口，ShigekawaandDower，1988,6:742-75l)或接合(參見，例如，KoehlerandThorne，1987,Towr"a/0/Bacfen》/，169:5771-5278)。宿主細胞可以是真核生物，例如哺乳動物、昆蟲、植物或真菌細胞。在優(yōu)選的實施方案中，宿主細胞是真菌細胞。"真菌，，用在本文包括以下門子嚢菌門(Ascomycota)、4旦子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)禾口才妾合菌門(Zygomycota)(A口由Hawkswortha/"J/mwoM/zaw/5&6y》D/"/owar_yo/77zeF柳g7',8thedition,1995，CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK所定義)以及卵菌門(Oomycota)(如Hawkswortha/.,1995，見上，HI頁中所引用)，和所有有絲分裂孢子真菌(mitosporicftingi)(Hawksworth"a/.,1995,見上)。在更優(yōu)選的實施方案中，真菌宿主細胞是酵母細胞。"酵母"用在本文包才舌產子嚢酵母(ascosporogenousyeast)(內孑包霉目(Endomycetales))、產4旦子酵母(basidiosporogenousyeast)和屬于半，、口菌類(FungiImperfecti)(芽孑包纟岡(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類在未來可能改變，就本發(fā)明而言，將酵母定義為如祝o/g^a"<iJc/7'v//7.eo/IfeaW(Skinner,F.A.，Passmore，S.M.,andDavenport,R.R.，eds,5bc.Jpp.5acfeWo/,5ympos7'w/^Sen'esNo.9,1980)中所述。在甚至更優(yōu)選的實施方案中，酵母宿主細胞是念珠菌屬、漢遜酵母屬(//a"化mz/a)、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍霉屬細月包。在最優(yōu)選的實施方案中，酵母宿主細胞是卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母或卵形酵母細胞。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，酵母宿主細胞是乳酸克魯維酵母(A:/z^veram;;c^/acto)細胞。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，酵母宿主細胞是細胞。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，真菌宿主細胞是絲狀真菌細胞。"絲狀真菌"包括真菌門(Eumycota)和卵菌門的亞門(如由Hawksworth"a/.，1995,見上文，所定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌通常的特征在于由殼多糖(chitin)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它復雜多糖組成的菌絲體壁。通過菌絲延伸進行營養(yǎng)生長，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母例如釀酒酵母的營養(yǎng)生長則通過單細胞菌體的出芽生殖(budding)進行，而碳分解代謝可以是發(fā)酵的。在甚至更優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是下述菌屬的細胞，但不限于此枝頂孢霉屬、曲霉屬、鐮孢屬、腐質霉屬、毛霉屬、毀絲霉屬、脈孢菌屬、青霉屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬(7b/，ypoc/aAwm)或木霉屬。在最優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是泡盛曲霉、臭曲霉、曰本曲霉、構巢曲霉、黑曲霉或米曲霉細胞。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、-琉色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢或鑲片鐮孢細胞。在甚至最優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌親本細胞是鑲片鐮孢細胞(Nirenbergsp.nov)。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是特異腐質霉、疏棉狀腐質霉、米赫毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、產紫青霉、土生梭孢霉、哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉或綠色木霉細胞。可以將真菌細胞通過涉及原生質體形成、原生質體轉化和細胞壁重建的方法以本身公知的方式轉化。用于轉化曲霉屬宿主細胞的合適方法在EP238023禾口Yeltonefa/,，1984,iVoceeci/wgsq/"f/e7Va"owa/o/Sc/ewcas81:1470-1474中描述。用于轉化鐮孢屬菌種的合適方法由Malardier"1989，78:147-156和WO96/00787描述?？梢允褂糜扇缦挛墨I描述的方法轉化酵母BeckerandGuarente，T/Abelson，J.N.andSimon,M丄,editors,GW(ietoIfeos^C7e"幼'csawdM/ecw/<3r所o/c^，AfeAody/"￡"z_ywo/ogy，Volume194，pp182-187,AcademicPress,Inc.,NewYork;Itoa/.，1983,Towma/Bacfen-(9/(9gy153:163;andHinnen/.,1978，尸raceW"gs7V加'owa/v4cactew_yo/Scz'ewces75:1920。產生方法
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：本發(fā)明還涉及用于產生本發(fā)明多肽的方法，其包括(a)培養(yǎng)來自青霉屬的菌抹，以產生包含所述多肽的上清；和(b)回收所述多肽。優(yōu)選地，所述菌抹是膠嚢青霉菌種的菌株。本發(fā)明還涉及用于產生本發(fā)明的多肽的方法，其包括(a)在有益于產生多肽的條件下培養(yǎng)如上所述的重組宿主細胞；和(b)/人細胞和/或培養(yǎng)基中回收所述多肽。在本發(fā)明的產生方法中，使用本領域熟知的方法在適合于產生所述多肽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。例如，可以通過在合適培養(yǎng)基中在允許表達和/或分離所述多肽的條件下進行的搖瓶培養(yǎng)，和實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補料分批或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細胞。使用本領域已知的方法在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，所述營養(yǎng)培養(yǎng)基包含碳源和氮源和無機鹽。合適的培養(yǎng)基能夠從商業(yè)供應商獲得或可以根據公布的組成制備(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中，就能夠從所述培養(yǎng)基中直接回收該多肽。如果多肽不分泌，則可從細胞裂解物(lysate)中將其回收?？梢允褂帽绢I域已知的對于所述多肽是特異性的方法來檢測多肽。這些檢測方法可以包括特異性抗體的使用、酶產物的形成，或酶底物的消失。例如，可以使用酶試驗(enzymeassay)測定如本文所述的多肽的活性?？梢允褂帽绢I域已知的方法回收產生的多肽。例如，可以通過常規(guī)方法從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收多肽，所述常規(guī)方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。本發(fā)明的多肽可以通過多種本領域已知的方法純化，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型(preparative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，石克酸銨沉淀)、SDS-PAGE或提耳又(參見，例如，尸rate/"P,yca"o"，J.-C.JansonandLarsRyden,editors,VCHPublishers,NewYork,1989)。酶在植物中的表達編碼感興趣的多肽，如本發(fā)明的阿拉伯糖呋喃糖苷酶的DNA序列，可以在下述轉基因植物中轉化和表達。轉基因植物可以是雙子葉的(dicotyledonous)或單子葉的(monocotyledonous),簡稱為雙子葉植物(dicot)或單子葉植物(monocot)。單子葉才直物的實例是草(grasses),如草地早熟禾(meadowgrass)(藍草(bluegrass),早熟禾屬CPoa));飼用牧草(foragegrass)如羊茅屬CFeWwca)、黑麥草屬(丄o"MW);寒i也型4丈草(temperategrass),3口Agrostis;和谷類，例i口，小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。雙子葉植物的實例是煙草(tobacco)，豆類(legumes)，如羽扇豆(lupins)，馬鈴薯，壽唐-紺菜(sugarbeet)，3宛豆，豆(bean)和大豆(soybean)和十字花f牛的(cruciferous)植物(十字花科(familyBrassicaceae》,如花挪菜(cauliflower),油菜籽(oilseed忸口6)和緊密相關的模型生物體擬南芥(^^^^0戸^Aa//a"a)。植物部分的實例是莖(stem)、愈傷組織(callus)、葉(leaf)、根(root)、果實(fruit)、種子(seed)和塊莖(tuber)，以及包含這些部分的獨立組織，例如，表皮(epidermis)、葉肉(mesophyll)、薄壁組織(parenchyma)、維管組織(vasculartissue)、分生組織(meristem)。在本上下文中，具體的植物細胞區(qū)室(compartments)，^口口十纟錄體(chloroplast)、質夕卜體(apoplast)、纟戔斗立體(mitochondria)、液泡(vacuole)、過氧化物酶體(peroxisome)禾口纟田胞質(cytoplasm)也被認為是植物部分。此外，任何植物細胞，無論什么組織來源，都被認為是植物部分。同樣地，植物部分，如分離以促進本發(fā)明的應用的具體組織和細胞也^皮認為是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和種皮(seedcoat)。同樣包含于本發(fā)明范圍內的還有這些植物、植物部分和植物細胞的子代。表達感興趣的多肽的轉基因植物或植物細胞可以依照本領域已知方法構建。簡而言之，通過如下方法構建所述植物或植物細胞將編碼感興趣的多肽的一個或多個表達構建體并入植物宿主基因組，并且繁殖所得的修飾植物或植物細胞成為轉基因植物或植物細胞。便利地，表達構建體是包含編碼感興趣的多肽的基因的DNA構建體，所述基因與在選擇的植物或植物部分中表達該基因所必需的合適的調節(jié)序列可操作地連接。此外，表達構建體可以包含對于鑒定整合了表達構建體的宿主細胞有用的選#^生標記，和將該構建體引入到所述^f直物中所必需的DNA序列(后者依賴于使用的DNA引入方法)。調節(jié)序列的選擇，例如啟動子和終止子序列和任選地信號或轉運序列的選擇，舉例來說，基于期望何時、何處以及如何表達酶而確定。例如，編碼本發(fā)明酶的基因的表達可以是組成型的或誘導型的，或可以是發(fā)育、階段或組織特異性的，并且基因產物可以靶向特定的細胞區(qū)室、組織或植物部分例如種子或葉。調節(jié)序列由例如Tagueda/.，P/a"fP/z;^'o/ogy86:506,1988所述。對于組成性表達，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1和稻月幾動蛋白1啟動子(Franckefa/"1980,CW/21:285-294,ChristensenAH,SharrockRAandQuail1992.Maizepolyubiquitingenes:structure,thermalperturbationofexpressionandtranscriptsplicing,andpromoteractivityfollowingtransfertoprotoplastsbyelectroporation./Vow/^Mo.18，675-689.;Zhang"W，McElroyD.andWuR1991，Analysisofrice5'regionactivityintransgenicriceplants,尸/a"/Ce〃3，1155-1165)。器官特異性啟動子可以是例如來自貯藏庫組織(storagesinktissue)例如種子、馬鈴薯塊莖和果實的啟動子(Edwards&Coruzzi,19卯，j朋.iev.Gew".24:275-303)，或來自代謝庫組織(metabolicsinktissue)例如分生組織的啟動子(Itoda/.，1994,P/a^Mo/.24:863-878)，種子特異性啟動子諸如來自稻的谷蛋白(glutelin)、谷醇溶蛋白(prolamin)、J求蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)啟動子(Wu等，尸/awfCe〃P/z;w'o/ogy39:885-889(1998))，來自豆球蛋白(legumin)B4和蠶豆(Wc/a/W")的未知的種子蛋白基因的蠶豆啟動子(Conrad等，1998，Towma/o/尸/a"/P/^w'o/ogy152:708-711)、來自種子油體蛋白(oilbodyprotein)的啟動子(Chen等，1998，PlantandCellPhysiology39:935-941)，來自歐洲油菜CSra^fca"opws)的貝i藏蛋白napA啟動子，或本
技術領域：
^^知的任何其他種子特異性的啟動子，例如，在WO91/14772中所描迷的。此外，啟動子可為葉特異性的啟動子，如來自稻或番茄的啟動子(Kyozuka等，1993,P/aWP/zyw'o/ogy102:991-1000)，'J、球藻病毒(chlorellavirus)腺噪呤曱基轉移酶(adeninemethyltransferase)基因啟動子(Mitra和Higgins,1994,P/a"f7Wo/ecw/"r所o/ogy26:85-93),或來自稻的a/rfP基因啟動子(Kagaya等,1995，Mo/ecw/<argewera/gew幼.cs248:668-674),或傷口誘導的啟動子，如馬鈴薯pin2啟動子(Xu等，1993，P/aWMo/ecw/wSz'ofogy22:573-588)。同樣地，所述啟動子可通過非生物的處理誘導，所述非生物的處理諸如溫度、干旱或鹽度變化，或通過外源施用的激活所述啟動子的物質誘導，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、才直物激素(planthormones)^口乙丈希、脫落酉交(abscisicacid)、赤霉酸(gibberellicacid)禾口重金屬。啟動子增強子元件可以用于實現本發(fā)明酶在植物中的較高表達。例如，啟動子增強子元件可以是內含子，將其置于啟動子和編碼酶的核酸序列之間。例如XueM/.，見上，公開了使用稻肌動蛋白l基因的第一內含子以增強表達。選擇性標記基因和表達構建體的任何其它部分可以選自本領域內可用的那些。將DNA構建體根據本領域已知的常規(guī)技術并入植物基因組，所述常規(guī)技術包括土壤桿菌屬(4ra^cten'Mw)介導的轉化、病毒介導的轉化、顯微注射(microinjection)、粒子轟擊、生物射彈轉化和電穿孔(Gasser&a/.,1990，5We"ce244:1293;Potrykus,1990，腸/rec/wo/，8:535;Shimamoto"a/.，1989,淑匿338:274)。目前,才艮癌土土裏4干菌(v4gro^"en'wmfwwey^c/e"力介導的基因轉移(genetransfer),是產生轉基因雙子葉植物的優(yōu)選方法(為了參考，見Hooykas和Schilperoort,1992，尸/a"fMo/ecw/w19:15-38)，而且它也可以用于轉化單子葉植物，雖然對于這些植物其他的轉化方法是常用的。目前，除了土壤桿菌方法之外，產生轉基因單子葉植物的優(yōu)選的方法，是用粒子(用轉化DNA涂覆的微觀的金或鴒粒子)轟擊胚愈傷組織(embryoniccalli)或發(fā)育中的胚(developingembryos)(Christou，1992,尸/朋fJbwr"a/2:275-281;Shimamoto，1994,Cw^rewfC^/m.o"5/o奴/zwo/c^5:158-162;Vasiletal.,1992,歷o/rec/z"o/ow10:667-674)。轉化單子葉植物的可供選擇的方法，是基于原生質體轉化，如由Omirulleh等，1993，P/a"fMo/ecw/w歷o/ogy21:415-428所描述的。轉化之后，根據本領域熟知的方法選擇具有并入的表達構建體的轉化體并且再生成為完整植物。通常設計轉化方法用于通過如下方法在再生期間或在后續(xù)世代中選擇性消除選擇基因例如，使用帶有兩種獨立的T-DNA構建體的共轉化或通過特異性重組酶位點特異性地切除選擇基因。阿拉伯糖吹喃糖苦酶的用途本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多肽，即阿拉伯糖呋喃糖苷酶的組合物，以及所述多肽的用途，或包含所述多肽的組合物的用途。本發(fā)明的多肽，即阿拉伯糖呋喃糖苷酶，或包含阿拉伯糖呋喃糖苷酶的組合物，可以在各種工業(yè)應用中使用，例如用于生物質轉化，如用于由包含生物質的纖維素生產燃料乙醇的過程中，用于由淀粉生產燃料和/或可飲用乙醇的過程中，用于啤酒生產的淀粉糖化(mashing)過程中，用于飼料組合物中，或用于面包制造的面團中。材料和方法阿拉伯糖購自Merck(Darmstadt，德國)。水溶性和不溶于水的小麥阿拉伯糖基木聚糖由Megazyme(Bray，CountyWicklow，愛爾蘭)獲得。酶可使用基本分子技術(Sambrook等，1989,Mo/ecw/arC/om>g，爿Lo^onato^jWbwwa/，第二片反，ColdSpringHarbor,NewYork,Christgau等，1995,Curr.Genet.27,135-141,Ausubel等，2003，Curr.Prot.Mol.Biol"JohnWiley&Sons,Cambridge,USA)克隆a-阿拉伯糖呋喃糖苷酶。棘孢曲霉和疏棉狀嗜熱霉(77ze^7wowyc^/朋wg/"osw力分別產生的單組分內切-l,4-(3-糖苷酶制備物Shearzyme(GH10)和PentopanMono(GH11),為NovozymesA/S(Bagsvasrd,丹麥)的商業(yè)產品。特定的阿拉伯糖基木聚糖寡糖的制備包含連接于末端(1—3)的阿拉伯糖基的寡糖可以用下述方法制備將0.1M乙酸緩沖液(100mL)，pH6.0中不溶于水的小麥阿拉伯糖基木聚糖(lg)與6.67gShearzyme(木聚糖酶GH10)'kg"不溶于水的小麥阿拉伯糖基木聚糖在30。C溫育2小時。包含連接于內部(1—3)的阿拉伯糖基的寡糖可以用下述方法制備將O.lM乙酸緩沖液(100mL),pH6.0中不溶于水的小麥阿拉伯糖基木聚糖(lg)與0.03gPentopanMono(木聚糖酶GH11)'kg"不溶于水的小麥阿拉伯糖基木聚糖在3CTC溫育2小時。包含連接于內部(l—2)的阿拉伯糖基的寡糖可以用下述方法制備將0.1M乙酸緩沖液(100mL),pH6.0中不溶于水的小麥阿拉伯糖基木聚糖(lg)與0.03gPentopanMono(木聚糖酶GH11)'kg"不溶于水的小麥阿拉伯糖基木聚糖在30。C溫育2小時。為了終止酶反應，將混合物加熱至100°C10分鐘。阿拉伯糖木糖-寡糖(arabinoxylo-oligosaccharides)在旋轉蒸發(fā)儀中濃縮，并用^-NMR定量。最佳反應條件的確定用雙因子Box-Behnken響應面設計模板(Montgomery,2001)評估源自膠嚢青霉的GH62a-L-阿拉伯糖呋喃糖苷酶的最佳反應條件。每個模板包含pHO"和反應溫度P0々0。C)的11種不同組合，具有3個中心點。水溶性小麥阿拉伯糖基木聚糖(0.002g)溶于去離子水中(2ml)。隨后在每個試驗中，將溶液與O.lg酶蛋白.kg"水溶性小麥阿拉伯糖基木聚糖DM溫育。在反應正好24小時后取出樣品，并立即加熱至IO(TC10分鐘以終止酶反應。隨后將樣品在20,000g離心10分鐘，用HPAEC分析測定上清中阿拉伯糖的水平。才艮道的值以mg.g"小麥阿拉伯糖基木聚糖DM表示。a-L-阿拉伯糖呋喃糖苷酶的作用模式將源自膠嚢青霉的GH62a-L-阿拉伯糖呋喃糖苷酶力。入0.1M乙酸緩沖液(lmL)中的水溶性小麥阿拉伯糖基木聚糖(O.Olg)、包含連接于末端(1—3)的阿拉伯糖基的寡糖(0.01g)、包含連接于內部(1—3)的阿拉伯糖基的寡糖(0.01g)，或者包含連接于內部(1—2)的阿拉伯糖基的寡糖(0.01g),pH6.0，40°C，2小時。IO(TCIO分鐘使酶反應失活。樣品在旋轉蒸發(fā)儀中濃縮并用^-NMR分析。HPAEC將水解產物(10施用于DionexBioLC系統(tǒng)，所述系統(tǒng)配有與CarboPacPA1預柱(4x50mm)組合的DionexCarboPacPA1保護柱(4x250mm)(DionexCorporation,Sunnyvale,CA，USA)。用10mMKOH均一濃度地(isocratically)分離阿拉伯糖15分鐘，流速1mL'min"。用脈沖電化學檢測器以脈沖安培檢測模式檢測阿拉伯糖。如下設置電極電壓的程序+0.1V(t=0-0.4s)至-2.0V(t=0.41-0.42s)至0.6V(t=0.43s)，最后為-0.1V(t=0.44-0.50s)，并將1=0.2-0.4s之間得到的信號積分。使用阿拉伯糖(每個組分的濃度0.0025-0.1g.L力作為標準。'H-NMR分析所有降解產物從99.9%D20凍干兩次，并重新溶解于99.9%D20中。一些水解物經過透析(Spectra/Por膜截留分子量1000),在光譜分析之前去除游離的阿拉伯糖。在VarianMercury-VX設備中于30。C記錄'H-NMR光譜，所述設備以400MHz操作并配有4核自動轉換4果頭(4-nucleusauto-switchableprobe)。在128-512掃描點(scans)收集數據，用HDO信號作為參比信號(4.67ppm)。實施例實施例1小麥阿拉伯糖基木聚糖包含阿拉伯糖呋喃糖苷作為連接于內部木糖(A)的3-位的單取代物，和分別連接于雙取代木糖的3-(B)和2-位(C)的阿拉伯糖呋喃糖芬。產生的每個底物只包含3種阿拉伯糖呋喃糖苷鍵中的一種。用5HNMR研究阿拉伯糖呋喃糖香酶對這些底物的活性。表1.膠嚢青霉阿拉伯糖呋喃糖苷酶(GH62)對所選阿拉伯糖基木聚糖聚合物的活性，在pH6，40。C溫育2小時。_IS鍵活性—單取代(1—3)xx雙取代(1—2)-雙取代(1—3)-單取代(1—2),x單取代(1—3)內部_55_阜取代(l—3)末端xx一xx指水解超過75%,x(x)指水解50-75%,x指水解25-50%，和(x)指水解5-25%。-指沒有可纟企測到的水解。實施例2將可溶性小麥阿拉伯糖基木聚糖與0.1g酶蛋白每千克DM來自膠嚢青霉(GH62)的a-L-阿拉伯糖呋喃糖苷酶，在pH6、40。C溫育24小時。測定釋放的阿拉伯糖為139mg阿拉伯糖每g水溶性小麥阿拉伯糖基木聚糖，作為三次測定的平均值。確定最佳的pH和溫度反應條件分別為pH4-6和30-50°C。在此范圍內沒有^^測到活性的明顯變化。完整的阿拉伯糖基木聚糖單取代阿拉伯糖基木聚糖權利要求1.阿拉伯糖呋喃糖苷酶，其為a)具有如SEQIDNO2所示成熟肽的氨基酸序列的多肽，或者可通過一個或多個氨基酸的取代、缺失，和/或插入由其獲得的多肽；b)(a)或(b)中所述多肽的類似物，其i)與所述多肽具有至少80％的同源性，ii)是所述多肽的等位變體，c)由核酸序列編碼的多肽，所述核酸序列在高嚴緊條件下與編碼成熟多肽的SEQIDNO2的核酸序列的互補鏈，或其具有至少100個核苷酸的亞序列雜交。2.權利要求1的阿拉伯糖呋喃糖苷酶，其源自青霉菌的菌抹，優(yōu)選膠嚢青霉，更優(yōu)選膠嚢青霉菌抹CBS292.62。3.核酸序列，其包含編碼權利要求1或2任一項的阿拉伯糖呋喃糖苷酶的核酸序列。4.核酸序列，其包含a)編碼SEQIDNO:2所示的阿拉伯糖呋喃糖苷酶的DNA序列，b)類似物DNA序列，其具有ii)與所述DNA序列具有至少80%的同源性，或者iii)在高嚴緊條件下與所述DNA序列的互補鏈或其具有至少100個核苷酸的亞序列雜交，iv)是其等位變體，或者a)或b)的互補鏈。5.核酸序列，其與SEQIDNO:1所示的DNA序列具有至少80%的同源性，或者a)在高嚴緊條件下與所述DNA序列的互補鏈，或其具有至少100個核香酸的亞序列雜交，b)是其等位變體，或者a)或b)的互補鏈。6.包含權利要求3、4或5任一項的核酸序列的核酸構建體，所述核酸序列與一個或多個控制序列可操作地連接，所迷控制序列能指導阿拉伯糖呋喃糖苷酶在合適的表達宿主中表達。7.包含權利要求6的核酸構建體的重組表達載體。8.包含權利要求7的核酸構建體的重組宿主細胞。9.生產阿拉伯糖呋喃糖苷酶的方法，其包括在有益于阿拉伯糖呋喃糖苷酶產生的條件下培養(yǎng)權利要求8的宿主細胞，和回收所述阿拉伯糖呋喃糖苷酶。10.—種組合物，其包含根據權利要求1或2任一項的阿拉伯糖呋喃糖苷酶。11.根據權利要求1或2任一項的阿拉伯糖呋喃糖苷酶在面團中的用途。12.根據權利要求1或2任一項的阿拉伯糖呋喃糖苷酶在乙醇方法中的用途。13.根據權利要求1或2任一項的阿拉伯糖呋喃糖苷酶在淀粉糖化方法中的用途。14.根據權利要求1或4任一項的阿拉伯糖呋喃糖苷酶在產生飼料組合物的方法中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及具有α-L-阿拉伯糖呋喃糖苷酶活性的分離的多肽和編碼所述多肽的分離的核酸序列。本發(fā)明還涉及包含所述核酸序列的核酸構建體、載體和宿主細胞，以及用于產生和使用多肽的方法。文檔編號C12N15/56GK101184845SQ200680018387公開日2008年5月21日申請日期2006年5月24日優(yōu)先權日2005年5月24日發(fā)明者托馬斯·哈曼,漢尼·R·索倫森,萊內·蘭格申請人:諾維信公司