專利名稱：多孔體的制造方法以及使用該方法的多孔體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多孔體、特別是在以組織工程學(xué)、再生醫(yī)療工程學(xué)為中心的醫(yī)療領(lǐng)域中用作細(xì)胞的支架(scaffold)材料的多孔體的制造方法。
背景技術(shù)：
在組織工程學(xué)和再生醫(yī)療工程學(xué)的領(lǐng)域中，為了增殖細(xì)胞，通常使用支架材料，特別是近年來(lái)，作為支架材料，期待使用由生物體吸收性材料構(gòu)成的多孔體。如果是這樣的生物體吸收性的多孔體，則在其孔內(nèi)播種細(xì)胞使其增殖，并將其移植到生物體中，從而在生物體內(nèi)引起組織再生，并且，作為支架的生物體吸收性材料在生物體內(nèi)慢慢地被分解吸收。因此，可以將用于細(xì)胞增殖的支架直接與增殖細(xì)胞一起移植到生物體。
作為這樣的多孔體的制造方法，廣泛使用冷凍干燥法，作為通常的方法，公開(kāi)了例如將生物體吸收性聚合物溶解于二噁烷溶劑、并將其冷凍干燥而多孔化的方法(例如，參照專利文獻(xiàn)1)。但是，通過(guò)該方法得到的多孔體由于孔徑大小在100μm以下，因而難以得到例如適于細(xì)胞侵入到多孔體內(nèi)的孔徑大小100μm以上的多孔體。
此外，提出了在聚合物溶液中添加氯化鈉、砂糖等顆粒并冷凍干燥，通過(guò)水等洗滌來(lái)洗脫除去前述顆粒，從而使其多孔化的方法(例如參照專利文獻(xiàn)2、專利文獻(xiàn)3)。根據(jù)這些方法，由于存在有顆粒的部分變成孔，因而可得到與所使用的顆粒同等程度的孔徑大小的多孔體。但是，在這種方法中存在如下問(wèn)題由于必須進(jìn)行顆粒的洗脫，因而制造工序變繁雜，此外，由于聚合物溶液中顆粒的沉降，因而難以確保所得到的多孔體的孔分布的均勻性。進(jìn)而，為了提高孔徑大小的均勻性，必須使用粒徑均勻的顆粒，這導(dǎo)致高成本化。此外，由于難以完全除去顆粒，因而前述顆粒還可能會(huì)殘留在多孔體內(nèi)。這樣，在制造多孔體時(shí)，實(shí)現(xiàn)期望的孔徑大小、特別是大的孔徑大小(數(shù)百μm)是極其困難的。
此外，作為控制孔徑大小的方法，公開(kāi)了如下方法在冷凍干燥膠原溶液時(shí)，添加水和與水有相容性的有機(jī)溶劑，通過(guò)調(diào)整兩者的添加比例來(lái)控制孔徑大小的方法(例如，專利文獻(xiàn)4等)。但是，即便根據(jù)該方法，所得的孔徑大小也只有50～80μm左右，難以實(shí)現(xiàn)寬范圍的孔徑大小。此外，作為冷凍方法通常是采用液氮的急速冷凍法，存在孔徑大小變小的趨勢(shì)。
專利文獻(xiàn)1日本專利特開(kāi)平10-234844號(hào)專利文獻(xiàn)2日本專利特開(kāi)2001-49018號(hào)專利文獻(xiàn)3日本專利特表2002-541925號(hào)專利文獻(xiàn)4日本專利特開(kāi)平02-265935號(hào)發(fā)明內(nèi)容發(fā)明要解決的問(wèn)題因此，本發(fā)明的目的在于提供一種多孔體的制造方法，該方法可以調(diào)整孔徑的大小，特別是不僅是可以調(diào)整小孔徑大小，還可以調(diào)整大孔徑大小。
用于解決問(wèn)題的方法本發(fā)明的多孔體的制造方法的特征在于，包括制備混合溶液的工序，該混合溶液包含含丙交酯與己內(nèi)酯的共聚物的聚合物、對(duì)所述聚合物的溶解度相對(duì)低的溶劑、以及對(duì)所述聚合物的溶解度相對(duì)高并且與所述溶解度低的溶劑具有相容性的溶劑；冷凍處理所述混合溶液的工序；減壓干燥所述混合溶液的冷凍處理物的工序，其中，在所述混合溶液的制備工序中，改變對(duì)所述聚合物的溶解度相對(duì)低的溶劑在所述混合溶液中的含有率，并且在所述冷凍工序中，以300℃/hr以下的速度冷卻所述混合溶液，從而控制多孔體的孔徑大小。此外，以下，將對(duì)前述聚合物的溶解度相對(duì)低的溶劑稱為“不良溶劑”，將對(duì)前述聚合物的溶解度相對(duì)高的溶劑稱為“良溶劑”，本發(fā)明中，這些術(shù)語(yǔ)只是為了通過(guò)對(duì)前述聚合物的相對(duì)溶解度來(lái)區(qū)別前述兩者而使用的。
發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明的多孔體的制造方法，通過(guò)改變混合溶液中的不良溶劑的含有率、并且以300℃/hr以下的速度冷卻混合溶液來(lái)冷凍前述混合溶液，可以容易地調(diào)整寬范圍的孔徑大小，此外，還可以實(shí)現(xiàn)形成比較均勻的孔。
如前述那樣，通過(guò)調(diào)整像水這樣的不良溶劑與像有機(jī)溶劑這樣的良溶劑的比例來(lái)調(diào)整孔徑大小是公知的(前述專利文獻(xiàn)4)。但是，本發(fā)明通過(guò)進(jìn)一步將冷凍處理時(shí)的冷卻速度設(shè)定在300℃/hr以下的速度，從而可以形成例如30～1800μm這樣的寬范圍的孔徑大小，并且還可以確保所形成的孔的均勻性。即，本發(fā)明人們發(fā)現(xiàn)，例如，即使是不良溶劑的含有率相同的混合溶劑，通過(guò)改變冷卻速度(300℃/hr以下)的設(shè)定，可以進(jìn)一步改變所形成的孔的尺寸，結(jié)果，通過(guò)不僅設(shè)定前述含有率還組合設(shè)定冷卻速度，可以進(jìn)一步擴(kuò)大孔徑大小的范圍。像這樣可以設(shè)定寬范圍的孔徑大小，特別是還可以實(shí)現(xiàn)100μm以上的孔徑大小，這是本發(fā)明人們首次發(fā)現(xiàn)的。另外，由于采用不使用顆粒的現(xiàn)有方法得到的多孔體的孔徑大小通常為10～80μm左右，因而本發(fā)明也可以說(shuō)是可以設(shè)定非常寬的范圍的。此外，由于如前述那樣不混合顆粒，因而也不存在因顆粒的沉降導(dǎo)致的分布不均勻、顆粒殘存等問(wèn)題。因此，根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)只設(shè)定不良溶劑的含有率和冷卻溫度，可以實(shí)現(xiàn)各種孔徑大小，例如可以得到相應(yīng)于多孔體用途的孔徑大小，因此可以說(shuō)是組織工程學(xué)和再生醫(yī)療等中非常有用的多孔體的制造方法。


圖1是表示本發(fā)明的實(shí)施例中混合溶液的含水率與所得多孔體的孔徑大小的關(guān)系的圖。
圖2是表示本發(fā)明的其它實(shí)施例中混合溶液的含水率與所得多孔體的孔徑大小的關(guān)系的圖。
圖3是表示本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中混合溶液的含水率與所得多孔體的孔徑大小的關(guān)系的圖。
圖4是前述實(shí)施例中的多孔體截面的照片。
圖5是表示本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中將多孔體植入生物體內(nèi)之后的細(xì)胞染色結(jié)果的照片。
具體實(shí)施例方式
如前所述，本發(fā)明的多孔體的制造方法的特征在于，該方法包括制備混合溶液的工序，該混合溶液包含含丙交酯與己內(nèi)酯的共聚物的聚合物、對(duì)所述聚合物的不良溶劑、以及與所述不良溶劑具有相容性的對(duì)所述聚合物的良溶劑；冷凍處理所述混合溶液的工序；減壓干燥所述混合溶液的冷凍處理物的工序，其中，在所述混合溶液的制備工序中，改變對(duì)所述聚合物的溶解度相對(duì)低的溶劑在所述混合溶液中的含有率，并且在所述冷凍工序中，以300℃/hr以下的速度冷卻所述混合溶液，從而控制多孔體的孔徑大小。
本發(fā)明中的共聚物如前述那樣，是丙交酯與己內(nèi)酯的共聚物，例如可以是無(wú)規(guī)聚合物、嵌段聚合物的任意一種。此外，前述共聚物還可以混合2種以上不同摩爾比的丙交酯-己內(nèi)酯共聚物來(lái)使用。另外，本發(fā)明中的共聚物可以只含有前述共聚物，還可以在不影響本發(fā)明的范圍內(nèi)進(jìn)一步包含其它聚合物、共聚物。
前述共聚物的分子量(重均分子量)沒(méi)有特別限制，例如為5000～2000000，優(yōu)選為10000～1500000，更優(yōu)選為100000～1000000。此外，丙交酯與己內(nèi)酯的摩爾比例如為90∶10～10∶90的范圍，優(yōu)選為85∶15～20∶80的范圍，更優(yōu)選為80∶20～40∶60的范圍。
前述共聚物的制備方法沒(méi)有特別限制，可以使用現(xiàn)有公知的方法。通常，可以使作為起始原料的丙交酯與己內(nèi)酯通過(guò)開(kāi)環(huán)聚合進(jìn)行共聚，也可以由乳酸合成丙交酯(乳酸的環(huán)狀二聚體)后將其與己內(nèi)酯共聚。另外，使用了乳酸的丙交酯的合成方法也沒(méi)有特別限制，可以使用現(xiàn)有公知的方法。作為前述的丙交酯沒(méi)有特別限制，可以使用L-丙交酯、D-丙交酯以及這些的混合物(D，L-丙交酯)，此外，作為乳酸，可以使用L-乳酸、D-乳酸、這些的混合物(D，L-乳酸)。如此使用乳酸作為起始原料時(shí)，優(yōu)選將單聚體的乳酸換算成二聚體的丙交酯，換算后的丙交酯與己內(nèi)酯的摩爾比在前述的范圍內(nèi)。此外，作為己內(nèi)酯，可以舉出例如ε-己內(nèi)酯、γ-己內(nèi)酯、δ-己內(nèi)酯等，其中優(yōu)選ε-己內(nèi)酯。
本發(fā)明中，只要前述不良溶劑為對(duì)前述聚合物溶解度相對(duì)低的溶劑、前述良溶劑為對(duì)前述聚合物溶解度相對(duì)高并且與前述溶解度低的溶劑具有相容性的溶劑，就都沒(méi)有特別限制，通?？筛鶕?jù)所使用的聚合物的種類來(lái)設(shè)定。作為前述不良溶劑，通?？梢允褂盟⒁掖?、叔丁醇(tBuOH)等，作為前述良溶劑，可以使用對(duì)前述不良溶劑顯示相容性的1，4-二噁烷、碳酸二甲酯等有機(jī)溶劑等，特別優(yōu)選不良溶劑為水、良溶劑為1，4-二噁烷的組合。
以下，對(duì)本發(fā)明的多孔體的制造方法進(jìn)行具體的說(shuō)明。另外，關(guān)于孔徑大小的調(diào)整方法在后面敘述。
(混合溶液的制備工序)將聚合物、不良溶劑以及良溶劑混合，以此制備混合溶液。各溶劑的添加順序沒(méi)有特別限制。
前述混合溶液中的聚合物濃度沒(méi)有特別限制，通常為0.1～24質(zhì)量％的范圍，優(yōu)選為2～8質(zhì)量％的范圍，更優(yōu)選為3～5質(zhì)量％的范圍。對(duì)于前述混合溶液中的良溶劑的添加比例，可根據(jù)例如后述的不良溶劑的添加量來(lái)適當(dāng)決定，優(yōu)選前述聚合物與前述良溶劑的質(zhì)量比(聚合物良溶劑)為0.1∶99.9～24∶76，更優(yōu)選為2∶98～6∶94，特別優(yōu)選為4∶96。
如后述那樣，可以根據(jù)所形成的多孔體的期望的孔徑大小以及所采用的一定冷卻速度來(lái)適當(dāng)決定前述混合溶液中的不良溶劑的添加比例?；旌先芤褐械牟涣既軇舛葹槔绯^(guò)0且20質(zhì)量％以下，優(yōu)選為0.1～20質(zhì)量％，更優(yōu)選為6～12.5質(zhì)量％的范圍，特別優(yōu)選為6～12.25質(zhì)量％。此外，前述混合溶液中的聚合物濃度為3.6質(zhì)量％時(shí)，混合溶液中的不良溶劑濃度為例如超過(guò)0且12.5質(zhì)量％以下，優(yōu)選為6～12.5質(zhì)量％的范圍。前述聚合物與前述不良溶劑的質(zhì)量比(聚合物∶不良溶劑)沒(méi)有特別限制，例如為3.2∶20～4∶0.5的范圍。
(冷凍處理工序)以300℃/hr以下的速度冷卻前述混合溶液，使前述混合溶液冷凍。冷凍工序中，除了以前述范圍的速度進(jìn)行冷卻之外，沒(méi)有任何限制，例如，可以使用市售的冷凍干燥機(jī)進(jìn)行前述混合溶液的冷凍。作為前述冷凍干燥機(jī)，優(yōu)選為可控制冷凍速度的機(jī)器種類，例如可以使用商品名TF5-85ATANCS(寶制作所制造)等。
冷卻前述冷凍溶液時(shí)，優(yōu)選例如將前述混合溶液放入容器，從前述容器的底部冷卻前述混合溶液。像這樣，從容器的底部冷卻，則可以以一定速度從底部向上部方向均勻地冷卻前述混合溶液，可以均勻緩慢地冷凍前述混合溶液。具體地說(shuō)，優(yōu)選使用冷凍機(jī)或冷凍干燥機(jī)，將裝有前述混合溶液的前述容器放置于前述冷凍機(jī)的冷卻架上，并控制成以300℃/hr以下的相同的一定速度降低前述冷卻架的溫度。像這樣，以前述規(guī)定的速度降低冷卻架自身的溫度，則可以將放置于前述冷卻架的容器的底部冷卻，從而可以從混合溶液的底部向上部進(jìn)行冷卻。另外，作為前述容器沒(méi)有特別限制，可以列舉例如不銹鋼制容器。
前述冷卻速度只要為300℃/hr以下則沒(méi)有特別限制，如后述那樣，可根據(jù)所形成的多孔體的期望的孔徑大小以及前述混合溶液的不良溶劑濃度來(lái)進(jìn)行適當(dāng)選擇。前述冷卻速度為例如3～300℃/hr的范圍，優(yōu)選為3～250℃/hr的范圍，更優(yōu)選為3～180℃/hr的范圍，特別優(yōu)選為5～180℃/hr的范圍。另外，如前述那樣使用冷凍機(jī)時(shí)，控制成以這樣的范圍的一定速度降低該冷卻架的溫度即可(以下相同)。
實(shí)施冷凍的混合溶液的溫度沒(méi)有特別限制，例如為所使用的溶劑的凝固點(diǎn)以上，優(yōu)選為10℃～室溫(例如20～37℃)，更優(yōu)選為10～20℃的范圍。特別是以300℃/hr的一定速度開(kāi)始冷卻時(shí)，優(yōu)選開(kāi)始冷凍處理時(shí)的混合溶液溫度為10℃附近。并且，在像這樣將開(kāi)始冷凍處理時(shí)的混合溶液的溫度設(shè)定在10℃附近時(shí)，應(yīng)該將前述混合溶液整體保持一定值(例如10℃)，優(yōu)選為將前述混合溶液放置在比前述開(kāi)始時(shí)的溫度(例如10℃)更高的溫度(例如+10℃)下，然后將其降溫至前述開(kāi)始時(shí)的溫度。此時(shí)，下降溫度所需要的時(shí)間沒(méi)有任何限制，可以為例如60分鐘左右(或者60分鐘以上的時(shí)間)。以一定速度冷卻之前，通過(guò)實(shí)施這樣的處理，可以再現(xiàn)性良好地制造多孔體。
前述最終冷凍處理溫度在例如低共熔點(diǎn)以下、優(yōu)選為-10℃以下、更優(yōu)選為-10～-50℃的范圍。前述最終冷凍處理溫度沒(méi)有特別限制，例如設(shè)定為-10℃左右時(shí)，可以進(jìn)一步降低用于冷卻的成本。
前述混合溶液的溫度達(dá)到最終冷凍溫度時(shí)，可以根據(jù)前述混合溶液的冷凍狀態(tài)來(lái)適當(dāng)繼續(xù)進(jìn)行最終冷凍溫度下的處理。其可以繼續(xù)進(jìn)行至前述混合溶液完全冷凍為止，例如繼續(xù)進(jìn)行超過(guò)0小時(shí)且12小時(shí)以下、優(yōu)選為1～3小時(shí)左右。
另外，用于冷凍干燥的混合溶液的量沒(méi)有特別限制，前述的條件是對(duì)將混合溶液放入容器時(shí)深度為0-5～1cm左右的液量特別優(yōu)選的條件。
(減壓干燥處理工序)通過(guò)將前述冷凍處理工序中所得到的混合溶液的冷凍處理物進(jìn)行減壓干燥，可以得到多孔體。減壓干燥的條件沒(méi)有特別限制，可以采用現(xiàn)有公知的方法來(lái)進(jìn)行。
接著，對(duì)多孔體的孔徑大小的控制方法進(jìn)行具體說(shuō)明。根據(jù)本發(fā)明的控制方法，例如以一定的冷卻速度對(duì)改變了不良溶劑的濃度的多個(gè)混合溶液進(jìn)行了冷凍處理時(shí)，如后述圖1所述那樣，孔徑大小隨不良溶劑的濃度而變化。進(jìn)而，設(shè)定了不同冷卻速度時(shí)，例如，孔徑大小的變化在各冷卻速度下顯示同樣的行為，即，顯示孔徑大小在某不良溶劑濃度范圍內(nèi)變大、在某濃度范圍內(nèi)變小的行為，但在相同濃度下的孔徑大小根據(jù)冷卻速度而不同。即，通過(guò)在改變不良溶劑濃度的基礎(chǔ)上改變冷卻速度，可以進(jìn)行更寬范圍的孔設(shè)定。因此，通過(guò)例如改變冷卻速度和不良溶劑濃度的條件來(lái)制作多孔材，并制作顯示前述速度、濃度與所得孔徑大小的關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而可以再現(xiàn)性良好地制造例如約30～1800μm范圍的期望的孔徑大小的多孔體。
當(dāng)混合溶液包含前述共聚物、良溶劑和不良溶劑，并且前述共聚物和良溶劑的質(zhì)量比為96∶4時(shí)，可以通過(guò)例如將前述混合溶液的不良溶劑濃度和冷卻速度設(shè)定為下表的條件，從而可以制得表中記載的孔徑大小(30～1800μm)的多孔體。
表1冷卻速度3℃/hr不良溶劑濃度(質(zhì)量％) 孔徑大小(μm)6-930-2009.25-9.75 ＜200-40010 ＜400-80010.25 ＜800-1000冷卻速度5℃/hr不良溶劑濃度(質(zhì)量％) 孔徑大小(μm)6-9.5 30-2004.75-10＜200-40010.25-10.5 ＜400-80010.75 ＜800-120011-11.5＜1200-1500冷卻速度10℃/hr不良溶劑濃度(質(zhì)量％) 孔徑大小(μm)6-10 30-20010.25 ＜200-40010.5-10.75 ＜400-80011 ＜800-120011-11.75 ＜1200-1800冷卻速度180℃/hr不良溶劑濃度(質(zhì)量％) 孔徑大小(μm)6-10.2530-20010.5-11＜200-40011.25-12 ＜400-800
通過(guò)上述方式，可以得到本發(fā)明的多孔體。由于通過(guò)本發(fā)明的制造方法可以設(shè)定前述那樣寬范圍的孔徑大小，因而本發(fā)明的多孔膜可以根據(jù)孔徑大小而用于各種用途。特別是在用作培養(yǎng)細(xì)胞的支架材料時(shí)，優(yōu)選為比較大的孔徑大小的多孔體，例如孔徑大小為50～1000μm、優(yōu)選孔徑大小為100～1000μm的多孔體是有用的。此外還可以用作各種醫(yī)療多孔體。此外，本發(fā)明的多孔體的大小、形狀沒(méi)有特別限制，可根據(jù)用途來(lái)選擇。
另外，本發(fā)明的多孔體中的孔徑大小的測(cè)定方法沒(méi)有特別限制，可以采用現(xiàn)有公知的方法。
以下，通過(guò)實(shí)施例和比較例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體的說(shuō)明，但本發(fā)明并不限定于這些。
實(shí)施例1改變混合溶液中的含水率，以此制作多孔體，并證實(shí)了孔徑大小的控制。
將L-丙交酯與ε-己內(nèi)酯的組成比(摩爾比)為50∶50的丙交酯-己內(nèi)酯共聚物(P(LA/CL＝50/50))、1，4-二噁烷和水混合，制備29種含水率不同的混合溶液。另外，(P(LA/CL＝50/50))與1，4-二噁烷的混合比例(質(zhì)量比)為一定值(4∶96)，將前述混合溶液中的水的混合比例(含水率)改變?yōu)?、2、4、6、8、8.25、8.5、8.75、9、9.25、9.5、9.75、10、10.25、10.5、10.75、11、11.25、11.5、11.75、12、12.25、12.5、12.75、13、14、16、18、20質(zhì)量％。然后將這些混合溶液(20g)分別供給到不銹鋼培養(yǎng)皿(直徑5cm、深1.5cm，以下相同)中。
在冷凍干燥機(jī)(商品名TF5-85ATANCS寶制作所制造)內(nèi)(室溫)的冷卻架中放置前述不銹鋼培養(yǎng)皿，將前述冷卻架設(shè)定為10℃并放置1小時(shí)，然后以3℃/hr的速度將冷卻架的溫度冷卻至-50℃，在-50℃下放置180分鐘。另外，從10℃下處理開(kāi)始至-50℃下處理結(jié)束為止的時(shí)間合計(jì)為20小時(shí)。然后，在冷卻處理結(jié)束的同時(shí)，將冷凍干燥機(jī)內(nèi)的溫度調(diào)整至25℃并進(jìn)行減壓干燥處理，制作29種多孔體樣品。
從前述不銹鋼培養(yǎng)皿中取出圓板狀的多孔體樣品，在厚度方向的正中間切斷。通過(guò)以下方法對(duì)該切斷面進(jìn)行孔徑大小的測(cè)定(n＝5)。在電子顯微鏡下觀察前述切斷了的多孔體樣品的切斷面(0.5cm2)，從全體切斷面中選擇出孔徑大小比較大、出現(xiàn)頻率高的孔徑大小的孔，采用圖像分析軟件(NIH image)對(duì)所得的圖像進(jìn)行分析，計(jì)算出孔徑大小。
(比較例1)作為現(xiàn)有的方法，采用通過(guò)設(shè)定冷凍溫度來(lái)改變孔徑大小的方法，以此制作多孔體。將與前述實(shí)施例1相同的(P(LA/CL＝50/50))和1，4-二噁烷以4∶96的質(zhì)量比混合，制備混合溶液。將該混合溶液(20g)供給到不銹鋼培養(yǎng)皿中，將前述不銹鋼培養(yǎng)皿在冷凍庫(kù)內(nèi)以規(guī)定的冷卻溫度(-80、-30、-15℃)靜置4小時(shí)，將其冷凍。然后，將這些不銹鋼培養(yǎng)皿放置于冷凍干燥機(jī)(商品名Freeze dryer FDU-830EYELA公司制造)中進(jìn)行減壓干燥。另外，將前述混合溶液(20g)供給到不銹鋼培養(yǎng)皿中，使用液氮(-196℃)將其冷凍，然后同樣操作，進(jìn)行減壓干燥。由此制作4種多孔體樣品。所得的多孔體樣品的孔徑大小示于下述表2。
(比較例2)作為現(xiàn)有的方法，采用通過(guò)聚合物含量來(lái)改變孔徑大小的方法，以此制作多孔體。將與前述實(shí)施例1相同的(P(LA/CL＝50/50))和1，4-二噁烷分別以2∶98、4∶96、6∶94的質(zhì)量比混合，制備混合溶液。然后在-60℃下使用干冰和乙醇冷凍混合溶液，除此以外，與前述比較例1同樣操作，采用冷凍干燥機(jī)(商品名Freeze dryer FDU-830EYELA公司制造)進(jìn)行減壓干燥，制作多孔體樣品。所得樣品的孔徑大小示于下述表2。
表2比較例1 冷凍溫度 孔徑大小(μm)-196℃ 12-80℃ 33-30℃ 56-15℃ 82比較例2 質(zhì)量比 孔徑大小(μm)2∶98 834∶96 566∶94 46前述混合溶液中的含水率和前述樣品的孔徑大小的關(guān)系示于圖1。此外，圖1中，以點(diǎn)線(圖中箭頭的范圍)表示前述比較例1和比較例2中得到的多孔體的孔徑大小范圍。如該圖1所示那樣，可知根據(jù)實(shí)施例1的方法，通過(guò)改變含水率并以相同的一定速度冷卻，可以調(diào)節(jié)多孔體的孔徑大小，并且可形成均勻的孔。特別是如前述表2所示那樣，根據(jù)通過(guò)冷凍溫度來(lái)調(diào)整孔徑大小的現(xiàn)有方法的比較例1，其只可以形成10～80μm左右的孔徑大小，根據(jù)通過(guò)聚合物含量來(lái)調(diào)整孔徑大小的現(xiàn)有方法的比較例2，其只可以形成40～80μm左右的孔徑大小，均無(wú)法形成90μm以上的大的孔徑大小。與此相對(duì)，根據(jù)實(shí)施例1，可以實(shí)現(xiàn)30～1800μm這樣的寬范圍的孔徑大小，并且其均勻性也優(yōu)異。
實(shí)施例2改變冷卻速度，以此制作多孔體，并證實(shí)了孔徑大小的控制。
使用L-丙交酯與ε-己內(nèi)酯的組成比為51∶49的P(LA/CL＝51/49)，除此以外，與前述實(shí)施例1同樣操作，制備多種含水率不同的混合溶液，并將前述混合溶液(20g)分別供給到不銹鋼培養(yǎng)皿中。然后將前述不銹鋼培養(yǎng)皿放置于冷凍干燥機(jī)(商品名TF5-85ATANCS寶制作所制造)的冷卻架上，將冷卻架的溫度降低至10℃(所需時(shí)間25分鐘)，放置60分鐘。放置后，以規(guī)定速度(180℃/hr、10℃/hr、5℃/hr、3℃/hr)將前述冷卻架冷卻至-50℃，在-50℃下處理180分鐘。并且，在冷卻處理結(jié)束的同時(shí)，將冷凍干燥機(jī)內(nèi)的溫度調(diào)整至25℃，進(jìn)行減壓干燥處理，制作多孔體樣品。對(duì)于這些多孔體樣品，與前述實(shí)施例1同樣測(cè)定孔徑大小(n＝2)。前述混合溶液中的含水率和前述樣品的孔徑大小的關(guān)系示于圖2。另外已經(jīng)證實(shí)使用組成比為51∶49的P(LA/CL)進(jìn)行與實(shí)施例1同樣的實(shí)驗(yàn)時(shí)，顯示同樣的行為。
如圖2所示那樣，以任意冷卻速度進(jìn)行冷卻時(shí)，多孔體的孔徑大小都隨著含水率的變化而發(fā)生變化，特別是孔徑大小變大的含水率的范圍也同樣。此外，通過(guò)改變冷卻速度，即便為相同含水率的混合溶液，也可以使孔徑大小發(fā)生變化，得到了如下趨勢(shì)冷卻速度越快，孔徑大小變得越小，冷卻速度越慢，孔徑大小變得越大。由以上可知，通過(guò)調(diào)整含水率和冷卻速度，可以容易地制造期望的孔徑大小，尤其可以制造難以用現(xiàn)有的方法制造的大孔徑大小的多孔體。此外，以冷卻速度180℃/hr得到的多孔體樣品的截面照片示于圖4。如該圖4所示可知，截面中孔均勻地分布，其孔徑大小的均勻性也優(yōu)異。
實(shí)施例3研究冷凍溫度的變化對(duì)孔徑大小的影響。
將冷卻速度設(shè)為180℃/hr，最終的冷卻溫度設(shè)為規(guī)定溫度(-20℃、-30℃、-40℃)，除此以外，與前述實(shí)施例2同樣操作，制作多孔體樣品，并測(cè)定孔徑大小(n＝3)。前述混合溶液中含水率和前述樣品的孔徑大小的關(guān)系示于圖3。
如該圖3所示可知，冷卻速度為180℃/hr時(shí)，相應(yīng)于含水率的孔徑大小的行為不會(huì)因?yàn)樽罱K冷卻溫度的變化而產(chǎn)生大的變化，不受前述冷卻溫度的影響。由此可以說(shuō)，只要設(shè)定為-20℃的冷卻溫度，則無(wú)需過(guò)度的冷卻，可實(shí)現(xiàn)低成本化。
實(shí)施例4將制成的多孔體植入大鼠體內(nèi)，證實(shí)了前述多孔體的細(xì)胞·組織的侵入性。
與前述實(shí)施例1同樣操作，使用規(guī)定含水率(8.5質(zhì)量％、9.75質(zhì)量％、10.25質(zhì)量％)的混合溶液來(lái)制作多孔體，并切成12×15mm的大小，制成樣品。所得樣品的孔徑大小為8.5質(zhì)量％的樣品為130μm、9.75質(zhì)量％的樣品為310μm、10.25質(zhì)量％的樣品為790μm。另外，前述樣品的厚度分別為5mm左右。將這些樣品植入大鼠背部的皮下，2周后和4周后，對(duì)前述樣品進(jìn)行H-E染色(蘇木精-伊紅染色)，證實(shí)了組織對(duì)前述樣品的侵入狀態(tài)。
其結(jié)果如圖5的照片(4周)所示那樣，在具有大孔徑大小的多孔體樣品(孔徑大小310μm、790μm)中，可看到特別顯著的細(xì)胞侵入。如此，根據(jù)本發(fā)明的制造方法，可以得到適于細(xì)胞的載體(支架)的大孔徑大小的多孔體，因而可以說(shuō)對(duì)醫(yī)療領(lǐng)域極其有用。
工業(yè)上的可利用性這樣根據(jù)本發(fā)明，可以將多孔體的孔徑大小設(shè)定在寬范圍內(nèi)。因此本發(fā)明可以設(shè)定符合目的的孔徑，如細(xì)胞的支架材料等用途，、可以說(shuō)是以再生醫(yī)療為首的醫(yī)療領(lǐng)域中極其有用的制造方法。
權(quán)利要求
1.一種多孔體的制造方法，其特征在于，該方法包括制備混合溶液的工序，該混合溶液包含含丙交酯與己內(nèi)酯的共聚物的聚合物；對(duì)所述聚合物的溶解度相對(duì)低的溶劑；以及對(duì)所述聚合物的溶解度相對(duì)高并且與所述溶解度低的溶劑具有相容性的溶劑，冷凍處理所述混合溶液的工序，減壓干燥所述混合溶液的冷凍處理物的工序，其中，在所述混合溶液的制備工序中，改變對(duì)所述聚合物的溶解度相對(duì)低的溶劑在所述混合溶液中的含有率，并且在所述冷凍工序中，以300℃/hr以下的速度冷卻所述混合溶液，從而控制所制造的多孔體的孔徑大小。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多孔體的制造方法，其中，以300℃/hr以下的相同的一定速度冷卻所述混合溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多孔體的制造方法，其中，在所述冷凍工序中，將所述混合溶液放入容器中，從所述容器的底部冷卻所述混合溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的多孔體的制造方法，其中，在所述冷凍工序中，在混合溶液的冷卻中使用冷凍機(jī)，將裝有所述混合溶液的所述容器放置于所述冷凍機(jī)的冷卻架上，并控制成以300℃/hr以下的相同的一定速度降低所述冷卻架的溫度。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的多孔體的制造方法，其中，所述容器為不銹鋼制容器。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多孔體的制造方法，其中，所述冷凍工序中的冷卻速度為3～180℃/hr的范圍。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多孔體的制造方法，其中，對(duì)所述聚合物的溶解度相對(duì)低的溶劑為水。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多孔體的制造方法，其中，對(duì)所述聚合物的溶解度相對(duì)高的溶劑為1，4-二噁烷。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多孔體的制造方法，其中，所述混合溶液中的所述溶解度相對(duì)低的溶劑的含有率為6～12.5質(zhì)量％的范圍。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多孔體的制造方法，其中，在丙交酯與己內(nèi)酯的共聚物中，丙交酯與己內(nèi)酯的摩爾比為90∶10～10∶90的范圍。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多孔體的制造方法，其中，在所述冷凍工序中，所述混合溶液的最終冷凍處理溫度在低共熔點(diǎn)以下。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多孔體的制造方法，其中，在所述冷凍工序中，所述混合溶液的最終冷凍處理溫度在-10℃以下。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的多孔體的制造方法，其中，所述混合溶液的最終冷凍處理溫度在-50～-10℃的范圍。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的多孔體的制造方法，其中，在所述冷凍工序中，在最終冷凍處理溫度下，以超過(guò)0小時(shí)且12小時(shí)以下的范圍內(nèi)處理所述混合溶液。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多孔體的制造方法，其中，所述冷凍工序中，開(kāi)始冷凍處理時(shí)的所述混合溶液的溫度為10℃～室溫的范圍。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的多孔體的制造方法，其中，開(kāi)始冷凍處理時(shí)的所述混合溶液的溫度為10℃。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多孔體的制造方法，其中，所述混合溶液中的所述聚合物濃度為0.1～24質(zhì)量％的范圍。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多孔體的制造方法，其中，所述聚合物與對(duì)所述聚合物的溶解度相對(duì)高的溶劑的質(zhì)量比為0.1∶99.9～24∶76的范圍。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的多孔體的制造方法，其中，所述聚合物與對(duì)所述聚合物的溶解度相對(duì)高的溶劑的質(zhì)量比為4∶96。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多孔體的制造方法，其中，所述聚合物與對(duì)所述聚合物的溶解度相對(duì)低的溶劑的質(zhì)量比為3.2∶20～4∶0.5的范圍。
21.一種多孔體，其通過(guò)權(quán)利要求1所述的多孔體的制造方法制得。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的多孔體，其平均孔徑大小為30～1800μm的范圍。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的多孔體，該多孔體為培養(yǎng)細(xì)胞的支架材料。
24.根據(jù)權(quán)利要求21所述的多孔體，該多孔體為醫(yī)療用多孔體。
全文摘要
本發(fā)明提供一種多孔體的制造方法，該方法可以調(diào)整孔徑的大小，特別是不僅是可以調(diào)整小孔徑大小，還可以調(diào)整大孔徑大小。制備混合溶液，其包含含丙交酯與己內(nèi)酯的共聚物的聚合物、對(duì)所述聚合物的溶解度相對(duì)低的溶劑、以及對(duì)所述聚合物的溶解度相對(duì)高并且與所述溶解度低的溶劑具有相容性的溶劑，在冷凍干燥所述混合溶液來(lái)制造多孔體時(shí)，改變所述混合溶液中對(duì)所述聚合物的溶解度相對(duì)低的溶劑的含有率，并且在冷凍處理時(shí)，以300℃/hr以下的速度冷卻所述混合溶液，從而控制多孔體的孔徑大小。由此，可得到孔徑大小為30～1800μm的多孔體。
文檔編號(hào)C12N11/08GK101068865SQ20068000134
公開(kāi)日2007年11月7日 申請(qǐng)日期2006年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月18日
發(fā)明者棧敷俊信, 井手純一, 花木尚幸, 松浦洋治 申請(qǐng)人:株式會(huì)社Jms