專利名稱：一種誘導(dǎo)植物抗病促生的抑制素蛋白及基因序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說(shuō)是通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)手段，克隆了細(xì)極交鏈孢菌"/feman'a fe""/肌'mfl)的抑制素基因(pMO，并 表達(dá)出對(duì)植物具有抗病促生作用的抑制素蛋白(Prohibitin)。
背景技術(shù)：
抑制素基因(#6)是一種有效的腫瘤抑制基因，廣泛分布于細(xì)菌、 植物、酵母、原蟲(chóng)及哺乳類等各種生物細(xì)胞中。它所編碼的抑制素蛋白(Prohibitin)結(jié)構(gòu)高度保守、具有多種功能，既存在于線粒體內(nèi)膜上， 發(fā)揮分子伴侶作用，也存在于細(xì)胞核內(nèi)，具有負(fù)性轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，因而 對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、衰老以及細(xì)胞凋亡等諸多方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作 用。抑制素的命名源于歷史的原因，最早只發(fā)現(xiàn)了這些多功能蛋白的--種功能，即作為細(xì)胞增殖的抑制子的功能，所以將其命名為抑制素。抑制素是一類非常重要的蛋白， 一直以來(lái)對(duì)它的研究主要集中在醫(yī) 學(xué)領(lǐng)域，研究材料多為動(dòng)物細(xì)胞；植物中抑制素類似蛋白的研究在玉米、 水稻、煙草和擬南芥中也有報(bào)道，但其生物功能尚不清楚。最近，在矮 牽牛中有抑制素的報(bào)道，當(dāng)下調(diào)矮牽牛中抑制素的表達(dá)時(shí)，矮牽牛的葉 和花變小，并且形狀不規(guī)則；同時(shí)，抑制素基因沉默使矮牽?；ǖ募?xì)胞、 花期、呼吸作用均和對(duì)照有較大差異，說(shuō)明抑制素改變了矮牽牛的發(fā)育 和衰老。因此，抑制素在植物的發(fā)育和衰老中也起重要作用。目前，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)絲狀真菌抑制素的報(bào)道，也沒(méi)有將絲狀真菌產(chǎn) 生的抑制素用于誘導(dǎo)植物抗病性、提高植物免疫力的專利或報(bào)道。因此， 對(duì)交鏈孢菌抑制素及其新功能的發(fā)現(xiàn)將補(bǔ)充和完善對(duì)抑制素的研究，并 對(duì)生命現(xiàn)象進(jìn)行新的解釋，還有助于拓展其在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用，為人類充 分利用這一蛋白開(kāi)展有益的嘗試。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種對(duì)植物抗病促生、提高植物免疫力的抑制 素蛋白，從而拓展抑制素在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用。
本發(fā)明的主要技術(shù)方案是通過(guò)從細(xì)極交鏈孢菌的CDNA文庫(kù)中克 隆抑制素基因，將其在畢赤酵母和大腸桿菌中表達(dá)，得到有生物活性的 抑制素蛋白。本發(fā)明的抑制素蛋白具有對(duì)植物抗病促生、提高植物免疫力的作用。 具體技術(shù)方案如下(1) 采用Gateway⑧技術(shù)，構(gòu)建細(xì)極交鏈孢菌cDNA入門文庫(kù)和表達(dá) 文庫(kù)。通過(guò)LR重組把入門文庫(kù)轉(zhuǎn)換為表達(dá)文庫(kù)。(2) 采用細(xì)極交鏈孢菌激活蛋白免疫兔子，獲得抗體；采用免疫學(xué)方 法篩選細(xì)極交鏈孢菌cDNA表達(dá)文庫(kù)，篩選和克隆到一段包括起始密碼 子和終止密碼子在內(nèi)的849bp的完整編碼序列。在NCBI GenBank中比 對(duì)發(fā)現(xiàn)，在已知蛋白中，該核苷酸序列推測(cè)的氨基酸序列和酵母(SaccAaramyces cerev/s/ae)線粒體內(nèi)膜上的抑制素復(fù)合體(PhMp-Phb2p) 亞基高度同源，其一致性(Identities)為79%，相似性(Positives)為89%。 因此，將此基因命名為pW)(見(jiàn)序列表)。(3) PCR擴(kuò)增pM)基因，并在引物中引入限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)； 將pW)基因克隆到表達(dá)載體的相應(yīng)酶切位點(diǎn)中，在畢赤酵母或大腸桿菌 中表達(dá)細(xì)極交鏈孢菌的抑制素蛋白(見(jiàn)序列表)；純化表達(dá)的抑制素蛋白。(4) 用10-20ug/ml的蛋白溶液中浸泡植物種子或噴施植物葉片，生 物測(cè)定法測(cè)定交鏈孢菌抑制素蛋白的抗病促生活性。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果本發(fā)明的抑制素蛋白是由絲狀真菌細(xì)極交鏈孢菌的抑制素基因編碼 的，對(duì)植物具有明顯的抗病促生作用。與化學(xué)農(nóng)藥相比，本發(fā)明無(wú)毒、 不污染環(huán)境，可作為一種無(wú)公害的生物農(nóng)藥，對(duì)于保護(hù)生態(tài)環(huán)境，促進(jìn) 農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展有著重要意義。
具體實(shí)施方式
下面通過(guò)具體實(shí)例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明特點(diǎn)。 實(shí)施例1本實(shí)施例采用Gatcway@技術(shù)，構(gòu)建細(xì)極交鏈孢菌cDNA入門文庫(kù)和表達(dá)文庫(kù)。提取交鏈孢菌總RNA，純化mRNA;進(jìn)行cDNA—鏈合成、二鏈合 成，用色譜柱法分級(jí)cDNA片段。分級(jí)分離后得到的cDNA兩端連有attBl
和attB2序列，在BP重組酶的作用下有效的被重組入含有attPl和attP2 的質(zhì)粒載體中。重組后cDNA亞克隆兩邊的接頭變?yōu)閍ttL，它可以通過(guò)A -att重組系統(tǒng)中的LR重組反應(yīng)重組入其它載體中，從而使得文庫(kù)可以不 必經(jīng)過(guò)繁瑣的亞克隆操作，直接轉(zhuǎn)入其它載體用于進(jìn)一歩研究。構(gòu)建的 cDNA入門文庫(kù)經(jīng)檢測(cè)，入門文庫(kù)的滴度達(dá)到6X106，文庫(kù)總?cè)萘繛?.6 X107，其陽(yáng)性克性率為100%，平均插入片段大小大約為1.53Kb。通過(guò) LR重組把入門文庫(kù)轉(zhuǎn)換為表達(dá)文庫(kù)。表達(dá)文庫(kù)的滴度為1.53X 106，文 庫(kù)總?cè)萘繛?.2X106，其陽(yáng)性克性率為100%，平均插入片段大小大約為 1.62Kb。;實(shí)施例采用免疫學(xué)方法篩選交鏈孢菌cDNA表達(dá)文庫(kù)。 抗體探針是獲得未知基因的基本途徑，它可以直接用于分離產(chǎn)生目 的蛋白質(zhì)的重組克隆。因?yàn)楹芏嗑哂泄δ艿牡鞍踪|(zhì)的基因結(jié)構(gòu)及氨基酸 序列均是未知的，所以不能采用核酸探針篩選目的基因,但可采用能與表 達(dá)產(chǎn)物發(fā)生特異性結(jié)合的抗體篩選基因。采用細(xì)極交鏈孢菌激活蛋白免疫兔子，獲得激活蛋白抗體；采用免 疫學(xué)方法篩選交鏈孢菌cDNA表達(dá)文庫(kù)首先將要篩選的cDNA表達(dá)文 庫(kù)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，然后使用高特異性抗體進(jìn)行免疫篩選。經(jīng)過(guò) 篩選將近150000個(gè)克隆，得到180個(gè)可疑陽(yáng)性斑，經(jīng)過(guò)多次復(fù)篩，最終 得到9個(gè)陽(yáng)性克隆。其中一個(gè)陽(yáng)性克隆的插入片斷中包括起始密碼子和 終止密碼子在內(nèi)的849bp的完整編碼序列。在NCBI GenBank中比對(duì)發(fā) 現(xiàn)，在己知蛋白中，該核酸序列推測(cè)的氨基酸序列和酵母(&"tora，m cewW^e)線粒體內(nèi)膜上的抑制素復(fù)合體(Phblp-Phb2p)亞基高度同源， 其一致性為79%，相似性為89%。該基因被命名為pM。實(shí)施例3本實(shí)施例是巴斯德畢赤酵母(P/cfc'"中的表達(dá)及表達(dá)的 抑制素蛋白的純化。采用上游引物Pl: 5 ， GGAATTCATGGCCGCGATACCTACCTC 3，和 下游引物P2 : 5, TTGCGGCCGCTGACCTCAGGCCCAACAAGAAG 3，， PCR擴(kuò)增pM基因，在上游引物中引入位點(diǎn)，在下游引物中引入 iVo/I位點(diǎn)；經(jīng)測(cè)序確認(rèn)后克隆pW)基因于畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K， 然后轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115中，篩選出正確的轉(zhuǎn)化子；用甲醇誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn) p勵(lì)基因的表達(dá)，表達(dá)的抑制素蛋白分泌到培養(yǎng)液中。使用AktaExplorer蛋白分析儀分離純化表達(dá)的抑制素蛋白。發(fā)酵液 上1 ml的Hitrap DEAE柱，用步階梯度分步洗脫，A緩沖液(20 mM Tris-HCl， pH7.5)' B緩沖液(20 mM Tris-HCl， pH7.5， 2MNaCl)，流 速1 ml/min，收集40% B緩沖液洗脫的組分；將該收集樣上Superdex 75 分子篩柱濃縮蛋白，流速0.8 ml/min。分離純化蛋白時(shí)以含有空載體 pPIC9K的畢赤酵母GS115的發(fā)酵液為對(duì)照。實(shí)施例4本實(shí)施例是用生物測(cè)定法測(cè)定交鏈孢菌抑制素蛋白的抗病促生活性。種子發(fā)芽試驗(yàn)精選籽粒飽滿的小麥種子15粒于20ug/ml的蛋白溶 液中浸泡8小時(shí)后，置于直徑9cm的培養(yǎng)皿中，三次重復(fù)，于28。C培養(yǎng) 箱中進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，以空載體的分離純化樣品為對(duì)照，從第三天開(kāi)始每 天觀察種子的發(fā)芽情況。本發(fā)明抑制素對(duì)小麥的促生作用達(dá)6.8%。對(duì)煙草花葉病毒病的作用當(dāng)珊西煙長(zhǎng)到6片葉時(shí)，將中部的一個(gè) 葉片套袋覆蓋，其它葉面噴施20ug/ml交鏈孢菌抑制素蛋白，噴完蛋白 后將套袋摘除，5天后采取摩擦接種法接種病毒于套袋覆蓋的葉片上， 接種三天后，調(diào)查病斑數(shù)量。本發(fā)明抑制素對(duì)煙草花葉病毒病的防治效 果達(dá)58.6%。
序列表〈110〉中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所〈120〉 一種誘導(dǎo)植物抗病促生的抑制素蛋白及基因序列<130> 05-01<160〉 1<170〉 Patentln version 3. 1 <210> 1 <211〉 849 〈212〉 DNA<213〉 細(xì)極鏈格 包菌(Alternaria tenuissima) <400〉 1ATGGCCGCGA TACCTACCTC ACTCTTCCGC TGGGTCGTTC CTGCTGCCAT CGGCGCCAGC 60 GTGGTGCAGA GCTCCCTCTA CGACGTCAAA GGCGGAACCC GCGCCGTCAT CTTCGACCGT 120 CTGTCCGGAG TCAAGGAAAA 〔:GTCGTCAAC GAGGGCACAC ATTTCTTGGT CCCATGGCTG 180 CAACGGGCAA TTGTCTTCGA TGTCAGGACG AGGCCGAGGA ATATCAGCAC AACGACGGGA 240 TCCAAGGATT TGCAGATGGT CACACTTACA CTGAGGGTGT TGCATCGCCC GGAGGTCAAG 300 CAGCTGCCCA AGATCTACCA AAATCTCGGT CTCGACTACG ACGAGCGTGT TCTCCCCTCC 360 ATCGGTAACG AAGTCCTGAA AGCCATCGTT GCACAGTTCG ATGCCGCAGA ACTCATCACT 420 CAGCGAGAGG CCGTCTCCAA CCGCATCCGG ACCGATCTGC TCAAGCGCGC CAACGAGTTC 480 AACATTGCCC TCGAAGACGT CTCCATCACA CACATGACTT TCGGCAAAGA GTTCACCAAG 540 GCCGTCGAAG AGAAGCAGAT CGCACAACAA GAAGCCGAGC GCGCGCGCTT CATTGTAGAG 600
AAGGCAGAGC AAGAGCGGCA AGCAAACGTT ATCAG(;GCCG AG(;GTGAAGC CGAGGCTGCC 660GACACAATCT CAAAGGCAGT GGCAAAGAGT GGTGACGGTC TM;TGTTGAT TAGGCGCATT 720GAGACCCAGA AGGATATTGC GCAGATGCTG GCGAG〔;AACC CCAACGTCAG CTATCTGCCT 780GGTGGTAACT CTGGTGGCM CGGTGGCGGT TCAA(;TGGT(; GTAGCTTCTT GTTGGGCCTG 840AGGTCATGA 849Met Ala Ala 1lie Gly AlaThr Arg Als 35Val Asn Glu 50Veil Phe Asp 65Ser Lys AspPro Glu ValTyr Asp Glu 115丄丄e Val AJa 130Val Ser Asn 145Asn lie AlaGlu Phe ThrGlu Arg Ala 195Asn Val l丄e210 Lys Ala VpiI 225[le Pro Thr 5Ser Val Val 20Val lie PheGly Thr HisVal Arg Thr 70Leu Gin Met 85Lys Gin Leu 100Arg Val LeuGin Phe AspArg lie Arg 150Leu Glu Asp 165Lys Ala Va] 180Arg Phe lieArg Ala GluA丄a Lys Ser 230SerGinAspPhe55ArgValProProAla 135 ThrValGluValGly 215 GlyLeuSerArg40LeuProThrLysSer 120 AlaAspSerGluGlu 200 GluAspPheSer25LeuValArgLeulie 105 I]eGluLeulieLys 185 LysArg Trp 10 LeuSerPro TrpAsn lie 75 Thr匕eu 90Tyr GinG丄y AsnLeu JleLeu Lys 155 Thr His 170Gin lieAla GluA]a Glu AlaGly Leu Val 235Val ValAsp ValVal Lys45 Leu Gin 60Ser ThrArg Va]Asn Leu(;lu Val 125 Thr G]n 140Arg AlaMet ThrAla GinGin Glu 205 Alei Asp 220Leu liePro Ala Ala 15Lys Gly Gly 30Glu Asn ValArg Ala lieThr Thr Gly 80Leu His Arg 95Gly Leu Asp 110Leu Lys AlaArg GJ.lj AlaAsn Glu Phe 160Phe (;ly Lys 175Gin ()lu A]a 丄90Arg Gin AlaThr [le SerArg Arg 1 l.e 240 Glu Thr Gin Lys Asp lie Ala Gin Met Leu A]a Arg Asn Pro Asn Val244 250 255Ser Tyr Leu Pro Gly Gly Asn Ser Gly Gly Asn Gly Gly Gly Ser Ser260 265 270G]y Gly Ser Phe Leu Leu Gly Leu Arg Ser 275 280
權(quán)利要求
1.一種編碼抑制素蛋白的基因phb，其特征在于它是由細(xì)極交鏈孢菌(Alternaria tenuissima)產(chǎn)生的，其核苷酸序列為1ATGGCCGCGA TACCTACCTC ACTCTTCCGC TGGGTCGTTC CTGCTGCCAT CGGCGCCAGC61 GTGGTGCAGA GCTCCCTCTA CGACGTCAAA GGCGGAACCC GCGCCGTCAT CTTCGACCGT121 CTGTCCGGAG TCAAGGAAAA CGTCGTCAAC GAGGGCACAC ATTTCTTGGT CCCATGGCTG181 CAACGGGCAA TTGTCTTCGA TGTCAGGACG AGGCCGAGGA ATATCAGCAC AACGACGGGA241 TCCAAGGATT TGCAGATGGT CACACTTACA CTGAGGGTGT TGCATCGCCC GGAGGTCAAG301 CAGCTGCCCA AGATCTACCA AAATCTCGGT CTCGACTACG ACGAGCGTGT TCTCCCCTCC361 ATCGGTAACG AAGTCCTGAA AGCCATCGTT GCACAGTTCG ATGCCGCAGA ACTCATCACT421 CAGCGAGAGG CCGTCTCCAA CCGCATCCGG ACCGATCTGC TCAAGCGCGC CAACGAGTTC481 AACATTGCCC TCGAAGACGT CTCCATCACA CACATGACTT TCGGCAAAGA GTTCACCAAG541 GCCGTCGAAG AGAAGCAGAT CGCACAACAA GAAGCCGAGC GCGCGCGCTT CATTGTAGAG601 AAGGCAGAGC AAGAGCGGCA AGCAAACGTT ATCAGGGCCG AGGGTGAAGC CGAGGCTGCC661 GACACAATCT CAAAGGCAGT GGCAAAGAGT GGTGACGGTC TAGTGTTGAT TAGGCGCATT721 GAGACCCAGA AGGATATTGC GCAGATGCTG GCGAGGAACC CCAACGTCAG CTATCTGCCT781 GGTGGTAACT CTGGTGGCAA CGGTGGCGGT TCAAGTGGTG GTAGCTTCTT GTTGGGCCTG841 AGGTCATGA
2.按照權(quán)利要求1所述的基因編碼的抑制素蛋白，其氨基酸序列為:1MAAIPTSLiFRWVVPAAIGASWQSSIiYDVKGGTRAVIFDR41lsgvkenvvnegthflvpwlgraivfdvrtrprnistttg81skd:lgmvt:ltlrvlhrpevkq:lpkiyq虹gldydervlps121IGNEVLKAIVAQFDAAELITGREAVSNRIRtd1^KRANEF161nialedvs工thmtfgkeftkaveekqiaqqeaerarfive201kaeqerqanviraegeaeaadtiskavaksgdglvlirri241etqkdiaqmlarnpnvsylpggnsggngggssggsfllgl281
3. —種用于表達(dá)該抑制素蛋白的表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于該質(zhì)粒含有 權(quán)利要求1中所述的基因的DNA片斷。
4. 權(quán)利要求l所述的基因表達(dá)的抑制素蛋白的使用方法，其特征在 于含該抑制素蛋白的畢赤酵母或大腸桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)物、粗制品或精制 品，使用時(shí)用水稀釋至濃度為10-20微克/毫升。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種蛋白，其特點(diǎn)是從細(xì)極交鏈孢菌(Alternariatenuissima)的cDNA文庫(kù)中克隆到抑制素基因(phb)，并將其在畢赤酵母和大腸桿菌中表達(dá)，表達(dá)的抑制素蛋白(Prohibitin)對(duì)植物具有抗病促生作用。
文檔編號(hào)C12N15/31GK101148675SQ200610152200
公開(kāi)日2008年3月26日 申請(qǐng)日期2006年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月19日
發(fā)明者崢 劉, 劉文平, 寧 張, 曾洪梅, 楊秀芬, 董健伸, 袁京京, 趙明治, 邱德文 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所