專利名稱：：表皮生長因子受體(egfr)的人單克隆抗體的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及用于治療和預防與EGFR的表達相關的疾病，特別是表達EGFR的腫瘤和自身免疫病的改進的抗體治療。
背景技術：
：EGF受體(EGFR)是一種170kDa的1型跨膜分子。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它的表達在許多人類腫瘤，包括頭和頸、乳腺、結腸、前列腺、肺和卵巢的癌中上調。過量表達的程度與不佳的臨床預后相關(Baselga，etal.(1994)Pharmac.Therapeut.64127-154；Modjtahedi，etal.(1994)Int.J.Oncology4277-296)。此外，它的表達通常伴隨者由表達EGFR的腫瘤細胞產(chǎn)生EGFR配體、TGF-α和EGF等，這表示自分泌循環(huán)參與這些細胞的進展(Baselga，etal.(1994)Pharmac.Therapeut.64127-154；Modjtahedi，etal.(1994)Int.J.Oncology.4277-296)。因此，阻斷這些EGFR配體和EGFR之間的相互作用可以抑制腫瘤生長和存活(Baselga，etal.(1994)Pharmac.Therapeut.64127-154)。EGFR的配體結合域的單克隆抗體(MAbs)可以阻斷EGF和TGF-α之間的相互作用以及因此同時阻斷細胞內信號傳遞途徑。產(chǎn)生了一些鼠單克隆抗體，這些抗體完成了這種體外阻斷，并且評估了這些抗體影響小鼠異種移植物模型中的腫瘤生長的能力(Masui，etal.(1986)CancerRes.465592-5598；Masui，etal.(1984)CancerRes.441002-1007；Goldstein，etal.(1995)Clin.CancerRes.11311-1318)。在移植了人腫瘤細胞后一天給藥時，大多數(shù)抗EGFRMAbs可有效防止無胸腺小鼠中的腫瘤形成(Baselga，etal.(1994)Pharmac.Therapeut.64127-154)。然而，當注射至攜帶建立了人腫瘤異種移植物的小鼠中時，這些鼠MAbs(如MAbs225s和528)僅僅導致部分腫瘤消退。完全消除腫瘤需要共同給予化療劑(Baselga，etal.(1994)Pharmac.Therapeut.64127-154；Fan，etal.(1993)CancerRes.534322-4328；Baselga，etal.(1993)J.Natl.CancerInst.851327-1333)。因此，盡管目前獲得的結果明確地確立了EGFR作為免疫治療的靶，它們也表明，鼠抗體不構成理想的治療劑。而且，用鼠抗體進行治療一般在患者中引發(fā)嚴重的免疫反應。為了避免小鼠抗體的免疫原性，理想的治療應該完全使用人抗體。作為達到這一目標的一個步驟，開發(fā)了225MAb(C225)的嵌合形式，其中小鼠抗體的可變區(qū)與人恒定區(qū)連接。盡管C225在建立的異種移植腫瘤的體內治療中表現(xiàn)出改進的抗腫瘤活性，這僅僅在高劑量下才能達到(Goldstein，etal.(1995)Clin.CancerRes.11311-1318)。目前正在臨床試驗中評估C255治療各種類型的實體瘤的作用(Baselga，J.(2000)J.Clin.Oncol.1854S-59S；Baselga，J.(2000)Ann.Oncol.11Suppl3187-190，2000)。因此，需要改進的抗EGFR的治療性抗體，所述抗體在低劑量給藥時有效治療和/或預防與EGFR的過量表達相關的疾病，并且在患者中不激發(fā)免疫反應。如前所述，單克隆抗體(MAb)在疾病的許多診斷和治療方法中起顯著作用，并且隨著開發(fā)完全的人抗體的技術的產(chǎn)生，成為更有吸引力的試劑?？贵w和抗體衍生物構成了目前正在開發(fā)的生物藥物的25％，并且其中的許多正在被開發(fā)為癌癥治療劑?？贵w組合了靶特異性和有效參與免疫系統(tǒng)的能力。這些特性和它們的長生物半衰期的組合向研究者們提示了抗體的治療潛能。最近這方面已經(jīng)達到了頂點，美國食品和藥品管理局(FDA)批準了用于癌癥治療的一些抗體。
發(fā)明內容本發(fā)明提供了用于治療和預防與EGFR的表達相關的疾病，特別是表達EGFR的腫瘤和自身免疫病的改進的抗體治療?？贵w得到了改進，因為它們是完全的人抗體(在此稱作″HuMAbsTM″)并且因此在患者中的免疫原性更低。與以前報道的其它抗EGFR抗體相比，這些抗體在較低的劑量下也是治療有效的(如有效防止表達EGFR的細胞的生長和/或功能)。此外，在某些實施方案中，抗體具有額外的優(yōu)點，即不激活補體(例如，不誘導補體介導的靶細胞裂解)，這減少了治療中的不良副作用。因此，在一種實施方案中，本發(fā)明提供了特異性結合于人表皮生長因子受體(EGFR)的分離的人單克隆抗體，以及含有一種所述抗體或所述抗體的組合的組合物。人抗體抑制(如阻斷)EGFR配體，如EGF和TGF-α與EGFR結合。例如，EGFR配體與EGFR的結合可以被抑制至少約10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，或100％，并且優(yōu)選導致EGFR介導的細胞信號傳遞的阻止。本發(fā)明的優(yōu)選人抗體抑制表達在人效應細胞(如多形核細胞、單核細胞、巨噬細胞和樹突細胞)存在下抑制表達EGFR的細胞生長和/或介導其殺滅(如裂解或吞噬)，但是它們不激活補體介導的表達EGFR的細胞的裂解。因此，本發(fā)明的人單克隆抗體可以用作體內和體外的診斷和治療劑。在此處示例的一種實施方案中，本發(fā)明的人抗體是具有IgG1重鏈和κ輕鏈的IgG1(例如IgG1k)抗體。然而，本發(fā)明也包括其它抗體同種型，如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgM，IgA1，IgA2，IgAsec，IgD和IgE。這些抗體可以是完整抗體或抗體的抗原結合片段，包括Fab，F(xiàn)(ab′)2，F(xiàn)v和鏈Fv片段。在一種特定的實施方案中，人抗體是由在其可變區(qū)分別包含SEQIDNO1和SEQIDNO3所示的核苷酸序列及其保守序列修飾的人IgG重鏈和人κ輕鏈核酸編碼。在另一種實施方案中，人抗體包括分別包含SEQIDNO2和SEQIDNO4所示的氨基酸序列及其保守序列修飾的IgG重鏈和κ輕鏈。在另一種特定的實施方案中，人抗體相當于抗體2F8或與抗體2F8結合于相同表位(如與其競爭)或具有相同結合特征的抗體。本發(fā)明的人抗體可以在宿主細胞，如含有編碼抗體重鏈和輕鏈的核酸的轉染瘤(如由永生化CHO細胞或淋巴細胞組成的轉染瘤)中重組產(chǎn)生，或者直接從表達抗體的雜交瘤(例如，包含了一個從轉基因非人動物如轉基因小鼠中獲得的與永生化細胞融合的B細胞，轉基因小鼠有一個包含一個人重鏈轉基因和一個輕鏈轉基因的基因組)直接獲得。在一個特定的實施方案中，抗體由此處稱作2F8的雜交瘤或含有在其可變區(qū)分別包含SEQIDNO1和SEQIDNO3所示的核苷酸序列及其保守序列修飾的人重鏈和人輕鏈核酸的宿主細胞(如CHO細胞)轉染瘤產(chǎn)生。在另一種實施方案中，本發(fā)明的人抗EGFR抗體的特征可以在于下列的一種或多種特性a)對EGFR受體的特異性；b)對EGFR的親和性，平衡親和常數(shù)(KA)至少為約107M-1，優(yōu)選為約108M-1，109M-1，更優(yōu)選為約1010M-1到1011M-1或更高；c)從EGFR的解離常數(shù)(KD)為約10-3s-1，優(yōu)選為約10-4s-1，更優(yōu)選為約10-5s-1，最優(yōu)選為約10-6s-1；d)調理表達EGFR的細胞的能力；或e)在約10ug/ml或更低的濃度(如體外)下，人效應細胞存在時具有抑制表達EGFR的細胞(如腫瘤細胞)生長和/或介導對該細胞的吞噬及殺滅的能力?？梢杂杀景l(fā)明的人抗體導向的表達EGFR的腫瘤細胞的例子包括，但不限于，膀胱、乳腺、結腸、腎、卵巢、前列腺、腎細胞、鱗狀細胞、肺(非小細胞)、或頭和頸腫瘤細胞。其它表達EGFR的細胞包括滑膜成纖維細胞和角質細胞，它們分別可以在關節(jié)炎和牛皮癬的治療中用作靶細胞。在另一種實施方案中，本發(fā)明的人抗體與EGFR抗原以至少約108M-1，更優(yōu)選為至少約109M-1或1010M-1的親和常數(shù)結合，并且可以在IC50為約1×10-7M或更低時，或在約10ug/ml或更低的濃度下體外抑制表達EGFR的細胞生長和/或介導人效應細胞如多形核細胞(PMNs)、單核細胞和巨噬細胞對表達EGFR的細胞的吞噬和殺滅。在另一種實施方案中，本發(fā)明的人抗體抑制EGFR介導的細胞信號傳遞。例如，抗體可以抑制EGFR配體(如EGF或TGF-α)誘導的EGFR的自磷酸化?？贵w也可以抑制自分泌EGF或TGF-α誘導的細胞激活或誘導人多形核細胞存在下的表達EGFR的細胞的裂解(ADCC)。表達EGFR的細胞包括，膀胱細胞、乳腺細胞、結腸細胞、腎細胞、卵巢細胞、前列腺細胞、腎細胞、鱗狀細胞、非小細胞肺細胞、滑膜成纖維細胞和角質細胞等。另一方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的抗體或抗原結合部分的核酸分子。包括本發(fā)明的抗體編碼核酸的重組表達載體和用這種載體轉染的宿主細胞，以及通過培養(yǎng)這些宿主細胞產(chǎn)生抗體的方法也包含在本發(fā)明中的范圍中，所述載體例如包含編碼由雜交瘤產(chǎn)生的抗體2F8的重鏈和輕鏈可變區(qū)和恒定區(qū)的核苷酸序列的表達載體。另一方面，本發(fā)明提供了從表達本發(fā)明的人抗EGFR抗體的非人動物如轉基因小鼠中得到的分離B細胞。優(yōu)選地，分離B細胞從用EGFR抗原的純化或富集制劑和/或表達EGFR的細胞免疫過的轉基因非人動物，如轉基因小鼠中獲得。優(yōu)選地，轉基因非人動物，如轉基因小鼠，有一個包含編碼本發(fā)明的抗體的全部或部分的人重鏈轉基因和一個人輕鏈轉基因的基因組。然后分離B細胞被永生化，提供EGFR的人單克隆抗體來源(如雜交瘤)。因此，本發(fā)明也提供了可以產(chǎn)生與EGFR特異性結合的人單克隆抗體的雜交瘤。在一種實施方案中，雜交瘤包含了一個從轉基因非人動物如轉基因小鼠中獲得的與永生化細胞融合的B細胞，轉基因小鼠有一個包含編碼本發(fā)明的抗體的全部或部分的一個人重鏈轉基因和一個輕鏈轉基因的基因組。本發(fā)明的特定雜交瘤包括2F8。而另一方面，本發(fā)明提供了轉基因非人動物，如轉基因小鼠(這里也稱作″HuMAb″)，它表達與EGFR特異性結合的單克隆抗體。在一種特定的實施方案中，轉基因非人動物是轉基因小鼠，它有一個包含編碼本發(fā)明的抗體的全部或部分的一個人重鏈轉基因和一個人輕鏈轉基因的基因組。轉基因非人動物可以用EGFR抗原的純化或富集制劑和/或表達EGFR受體的細胞來免疫。優(yōu)選地，轉基因非人動物如轉基因小鼠可以通過進行V-D-J重組和同種型轉換產(chǎn)生多種EGFR受體的人單克隆抗體同種型(如IgG，IgA和/或IgM)。同種型轉換可以通過經(jīng)典或非經(jīng)典同種型轉換完成。另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生特異性與EGFR反應的人單克隆抗體的方法。在一種實施方案中，此方法包括用EGFR抗原和/或表達EGFR受體的細胞的純化或富集制劑來免疫有一個包含編碼本發(fā)明的抗體的全部或部分的一個人重鏈轉基因和一個人輕鏈轉基因的基因組的轉基因非人動物如轉基因小鼠。然后獲得動物的B細胞(如脾B細胞)并與骨髓瘤細胞融合形成無限增殖的，分泌抗EGFR的人單克隆抗體的雜交瘤。另一方面，本發(fā)明的人抗EGFR抗體可以由另一種功能分子如另一種肽或蛋白(如Fab′片段)衍生，與其聯(lián)接或共表達。例如，本發(fā)明的一種抗體或抗原結合部位位可以與一種或多種其它分子實體如另一種抗體(如為產(chǎn)生雙特異性或多特異性抗體)、細胞毒素、細胞配體或抗原進行功能性聯(lián)接(如通過化學偶聯(lián)、基因融合、非共價締合或其它方式)。因此，本發(fā)明包括大量抗體偶聯(lián)物、雙特異性和多特異性分子，以及融合蛋白，它們都與表達EGFR的細胞結合，并且將其它分子導向于細胞，或結合于EGFR和其它分子或細胞。在一種特定的實施方案中，本發(fā)明包括雙特異性或多特異性分子，所述雙特異性或多特異性分子包含至少一個對EGFR(例如人抗EGFR抗體或其片段或模擬物)的第一結合特異性和對Fc受體，如人FcγRI或人Fcα受體，或抗原呈遞細胞(APC)上的另一種抗原的第二結合特異性。典型地，本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子包含至少一個抗體或其片段(如Fab，F(xiàn)ab′，F(xiàn)(ab′)2，F(xiàn)v或單鏈Fv)，優(yōu)選人抗體或其部分，或“嵌合的”或“人源化”的抗體或其部分(例如有一個來源于非人抗體(如鼠)的可變區(qū)，或至少一個互補決定區(qū)(CDR)，剩下的部分來源于人)。因此，本發(fā)明包括與人EGFR和Fc受體如人IgG受體，如Fcγ受體(FcγR)，如FcγRI(CD64)，F(xiàn)cγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)結合的雙和多特異性分子。其它Fc受體，如人IgA受體(如FcαRI)也可以作為靶。Fc受體優(yōu)選位于效應細胞如單核細胞、多形核細胞、巨噬細胞或激活的多形核細胞的表面。在一種優(yōu)選實施方案中，雙特異性和多特異性分子在受體的免疫球蛋白Fc(如IgG或IgA)結合點之外的位點與Fc受體結合。因此，雙特異性和多特異性分子的結合不被生理水平的免疫球蛋白阻斷。另一方面，本發(fā)明提供了包含與治療部分如細胞毒藥物、酶活性毒素或其片段、放射性同位素或小分子抗癌藥連接的本發(fā)明的人抗EGFR抗體或其片段的偶聯(lián)物?；蛘撸景l(fā)明的人抗體可以與所述治療劑和細胞毒性劑共同給藥，但不與它們連接。它們可以與所述試劑同時(如在單一組合物中或分開)或在給予所述試劑之前或之后共同給藥。所述試劑可以包括化療劑，如阿霉素(阿得里亞霉素)、順鉑硫酸博萊霉素、卡氮芥、苯丁酸氮芥和環(huán)磷酰胺羥基脲。本發(fā)明的人抗體也可以與放療聯(lián)合給予。另一方面，本發(fā)明提供了組合物，如藥物和診斷組合物/試劑盒，它包含可藥用的載體和特異性與EGFR結合的本發(fā)明的至少一種人單克隆抗體或其抗原結合部分。在一種實施方案中，組合物包含人抗體或其抗原結合部分的組合，優(yōu)選為每個抗體或抗原結合部分與獨特的表位的組合。例如，包含介導在效應細胞存在時高效殺滅靶細胞的人單克隆抗體的藥物組合物可以與另一種抑制表達EGFR細胞生長的人單克隆抗體組合。所以，此組合提供了適應提供最大治療益處的多種治療。包含至少一種本發(fā)明的人單克隆抗體或其抗原決定部位和至少一種本發(fā)明的雙特異性或多特異性分子的組合的組合物，如藥物組合物，也在本發(fā)明的范圍內。而另一方面，本發(fā)明提供了用上述的本發(fā)明的抗體或和相關組合物，抑制表達EGFR的細胞增殖和/或生長，和/或誘導表達EGFR的細胞的殺滅的方法。在一種實施方案中，此方法包括在人效應細胞存在下，在體內或體外將表達EGFR受體的細胞與本發(fā)明的一種人單克隆抗體或其組合接觸。此方法可以在如體外或來自體內的培養(yǎng)物(如包含表達EGFR和效應細胞的培養(yǎng)物)中應用。例如，一種包含表達EGFR的細胞和效應細胞的樣品可以在體外培養(yǎng)，并與本發(fā)明的抗體或其抗原結合部分(或本發(fā)明的雙特異性或多特異性抗體)組合。另外，此方法也可以在受試者中使用，如作為體內(如治療或預防)方案的一部分。對于用于與EGFR表達(如過量表達)相關的疾病的體內治療和預防，以治療有效劑量(例如導致生長抑制、表達EGFR的腫瘤細胞的細胞吞噬和/殺滅的劑量)，使用任何適當?shù)慕o藥途徑，如注射和本領域公知的基于抗體的臨床產(chǎn)品的其它給藥途徑給予本發(fā)明的人抗體?？梢允褂帽景l(fā)明的人抗體治療和/或預防的典型EGFR相關疾病包括，但不限于自身免疫病和癌癥。例如，可以治療和/或預防的癌癥包括膀胱、乳腺、結腸、腎、卵巢、前列腺、腎細胞、鱗狀細胞、肺(非小細胞)、頭和頸的癌癥?？梢灾委煹淖陨砻庖卟“?，例如，牛皮癬和炎癥性關節(jié)炎，如，類風濕性關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關的關節(jié)炎和牛皮癬關節(jié)炎。在一種實施方案中，還使用化療劑、放療或調節(jié)，例如增強或抑制Fc受體如Fcα受體或Fcγ受體的表達或活性的試劑。在治療中給予的典型細胞因子包括粒細胞集落刺激因子(G-CSF)，粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，γ干擾素(IFN-γ)和腫瘤壞死因子(TNF)。典型的治療劑包括抗腫瘤劑如阿霉素(阿得里亞霉素)、順鉑硫酸博萊霉素、卡氮芥、苯丁酸氮芥和環(huán)磷酰胺羥基脲等。為增加本發(fā)明的人抗EGFR抗體抗不高度表達EGFR的癌細胞的療效，可以與上調或影響EGFR表達的試劑，如導致腫瘤細胞上的EGFR上調和更均一表達的淋巴因子共同給予抗體。適于給藥的淋巴因子制劑包括γ干擾素、腫瘤壞死因子及其組合。這些可以靜脈內給藥。淋巴因子的適當劑量一般是10,000-1,000,000單位/患者。而另一方面，本發(fā)明為在體外或體內檢測樣品中的EGFR抗原的存在，如診斷EGFR相關疾病提供了方法。在一種實施方案中，它通過在允許抗體和EGFR之間形成復合物的條件下，將待檢驗樣品和對照樣品與本發(fā)明的人單克隆抗體(或其抗原結合部分)接觸而完成。然后檢測(如用ELISA)復合物的形成。當使用對照樣品和試驗樣品時，檢測兩種樣品中的復合物，樣品之間復合物形成的統(tǒng)計學顯著差異指示檢驗樣品中EGFR抗原的存在。本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點由下面的詳述和權利要求顯而易見。圖1表示來自小鼠20241的雜交瘤上清液與鼠單克隆抗EGFRMAbs225，528和AB5的競爭性ELISA。圖2表示來自小鼠20242和20243的人抗體上清液與鼠單克隆抗EGFRMAbs225，528和AB5的競爭性ELISA。圖3表示純化的人抗體與鼠單克隆抗EGFRMAbs225和528的競爭性ELISA。圖4A，4B，4C和4D表示HuMAbs(A)6B3，(B)5F12，(C)2F8，和(D)2A2的競爭性ELISA。圖5A和5B表示通過抗EGFRHuMAbs和鼠MAbs對EGF-生物素與EGFR的結合的抑制(ELISA形式)。圖6表示通過抗EGFRHuMAbs和鼠MAbs對EGF-生物素與A431細胞上EGFR的結合的抑制。圖7表示A431細胞上抗EGFRHuMAbs的滴度。圖8表示2F8抑制EGF結合純化和天然的EGFR的能力。2F8(菱形)、鼠225(正方形)、EGF(三角形)或人IgG1κ同種型對照(圓形)的效果是基于EGF-生物素與固定化EGFR的結合而測量的。如圖8中所描述，2F8能夠以17nM的IC50抑制EGF-生物素結合，該IC50顯著低于225(IC50為30nM)。圖9是表示抑制EGF和TGF-α結合A431細胞的能力。A431細胞來源于卵巢表皮樣癌并且在其細胞表面表達超過1×106個EGFR分子。使用流式細胞儀分析來測定對2F8結合A431細胞的抑制。在加入2F8前用5(空心柱)或50μg/ml(實心柱)配體預孵育細胞。沒有配體的抗體結合(PBS組)設定為100％。如圖所示，2F8有效阻斷EGF和TGF-α結合A431細胞。這些結果表明，2F8與配體在EGFR上的相同位點附近或在相同位點結合。圖10A和10B表示單克隆抗EGFR對A431細胞的自磷酸化的作用。如方法中指出，用不同抗體(10μg/ml)處理無血清的亞匯合A431細胞，用EGF(A)或TGF-α(B)刺激，并提取。通過SDS-PAGE分析EGFR磷酸化并且用抗磷酸酪氨酸抗體進行免疫印跡。圖11A，11B和11C表示通過抗EGFR人抗體抑制表達EGFR的腫瘤細胞系生長。用各種濃度的HuMAb2F8(正方形)，5C5(三角形)，6E9(十字)，2A2(菱形)，抗體陰性對照抗CTLA4(空心圓形)、抗體陽性對照225(實心圓形)或僅用培養(yǎng)基(對照)孵育表達EGFR的腫瘤細胞系A431(A)，HN5(B)和MDA-MB-468(C)7天。此后，用固定細胞的結晶紫染色評估細胞生長。生長抑制百分比計算為與僅僅使用對照的培養(yǎng)基中存在的蛋白量相比，孵育7天后剩余的蛋白量。數(shù)據(jù)表示三次重復測量，并且代表在不同日進行的3次實驗。圖12表示人PMN介導的抗體依賴性細胞毒性。按描述分離PMN。將51鉻標記的A431細胞鋪于96孔平底板中。以效應細胞∶靶細胞100∶1加入PMN，以不同濃度加入抗體。孵育過夜后，測量51Cr釋放。圖13表示在無胸腺鼠模型中用HuMAb2F8預防腫瘤形成。在第0天用200μlPBS中的3×106個腫瘤細胞對每組6只的各組小鼠進行脅腹皮下注射。隨后，在第1天(75μg/200μl)，第3天(25μg/200μl)，和第5天(25μg/200μl)(箭頭)用HuMAb2F8(實心正方形)腹膜內注射小鼠，用腹膜內注射人IgG1-κMAb作為對照(空心圓形)。數(shù)據(jù)表示為平均腫瘤體積+SEM，并且表示產(chǎn)生相似結果的3次實驗。圖14表示與鼠抗EGFRMAb(m225)相比，用HuMAb2F8清除建立的A431腫瘤異種移植物。在第0天用200μlPBS中的3×106個腫瘤細胞對小鼠進行脅腹皮下注射。在第10天，將小鼠隨機分配至治療組，并且在第12天(75μg/200μl)，第14天(25μg/200μl)，和第16天(25μg/200μl)(箭頭)用HuMAb2F8(實心正方形，2F8短期)或鼠抗-EGFRMAb225(實心三角形，m225短期)進行治療。此外，包括第12天接受75μg/200μlHuMAb2F8或m225，繼續(xù)在第14，16，19，22，26，29，33，36和40天接受25μg/200μlHuMAb2F8或m225的各組(空心正方形，2F8長期；空心三角形，m225長期)。數(shù)據(jù)表示為平均腫瘤體積+SEM，并且表示產(chǎn)生相似結果的3次實驗。黑色箭頭表示短期治療的治療天數(shù)，空心箭頭表示長期治療的治療天數(shù)。圖15A和15B表示具有指定CDR區(qū)的2F8的VH-和VL-區(qū)的序列。具體實施例方式本發(fā)明為治療和診斷以表皮生長因子受體抗原(這里稱作″EGFR″)的表達，特別是過量表達為特征的疾病提供了新穎的基于抗體的治療方法。本發(fā)明的治療使用與存在于EGFR上的表位相結合的分離的人IgG單克隆抗體或其抗原結合部分。本發(fā)明包括的其它分離的人單克隆抗體包括IgA，IgG1-4，IgE，IgM和IgD抗體。在一種實施方案中，人抗體在非人轉基因動物如轉基因小鼠中產(chǎn)生，可以通過進行V-D-J重組和同種型轉換產(chǎn)生多種EGFR的人單克隆抗體同種型(如IgG，IgA和/或IgE)。因此，本發(fā)明的各種方面包括抗體和抗體片段，其藥物組合物，以及非人轉基因動物，和產(chǎn)生這些單克隆抗體的B細胞、宿主細胞轉染瘤和雜交瘤。本發(fā)明也包括用本發(fā)明的抗體在體外或體內檢測表達EGFR或相關交叉反應生長因子受體的細胞，或抑制表達EGFR的細胞生長、分化和/或遷移的方法。為更容易理解本發(fā)明，首先定義一些術語。其它定義在詳述中逐漸闡明。術語“表皮生長因子受體”，“EGFR”和“EGFR抗原”在這里可以互換使用，包括人EGFR的變體、同種型和物種同源物。在一種優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的抗體與EGFR抗原的結合通過抑制或阻斷EGFR配體與EGFR的結合而抑制表達EGFR的細胞(如腫瘤細胞)生長。術語“EGFR配體”包括EGFR的所有(如生理)配體，包括EGF，TGF-α、肝素結合EGF(HB-EGF)、雙調蛋白(AR)和epiregulin(EPI)。在另一種優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的抗體與EGFR抗原的結合介導效應細胞吞噬和/或殺滅表達EGFR的細胞。這里用到的術語“抑制生長”(如指細胞)包括與不接觸抗EGFR抗體的相同細胞的生長相比，當與抗EGFR抗體接觸時細胞生長的任何可測量的減少，如使細胞生長抑制至少約10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，或100％。這里用到的術語“抑制結合”和“阻斷結合”(例如指抑制/阻斷EGFR配體與EGFR的結合)可以互換使用，并且包括部分和完全抑制/阻斷。EGFR配體與EGFR的抑制/阻斷優(yōu)選減少或改變當沒有抑制或阻斷時，EGFR配體與EGFR結合時發(fā)生的細胞信號傳遞的水平或類型。抑制和阻斷也包括與不接觸抗EGFR抗體的相同細胞的生長相比，當與抗EGFR抗體接觸時細胞生長的任何可測量的減少，如使細胞生長抑制至少約10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，或100％。這里用到的術語“抗體”包括完整的抗體及其任何抗原結合片段(即“抗原結合部分”)或單鏈?！翱贵w”是指包括至少兩條由二硫鍵內部連接的重(H)鏈和兩條輕(L)鏈的糖蛋白。每條重鏈包括一個重鏈可變區(qū)(這里縮寫為VH)和一個重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)由三個結構域，CH1，CH2和CH3組成。每條輕鏈由一個輕鏈可變區(qū)(這里縮寫為VL)和一個輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個結構域，CL組成。VH和VL區(qū)可以被進一步分為稱作互補決定區(qū)(CDR)的超變區(qū)，中間鑲嵌更保守的區(qū)域，叫做構架區(qū)(FR)。每條VH和VL由三個CDR和四個FR組成，從氨基端到羧基端以下列順序排列FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3，F(xiàn)R4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)包含一個與抗原相互作用的結合域?？贵w的恒定區(qū)可以介導免疫球蛋白與宿主組織或因子，包括免疫系統(tǒng)的各種細胞(如效應細胞)和經(jīng)典補體系統(tǒng)的第一成分(Clq)的結合。這里用到的術語抗體的“抗原結合部分”(或簡稱為“抗體部分”)是指保持與抗原(如EGFR)特異性結合能力的抗體的一個或更多片段。已經(jīng)介紹過抗體的抗原結合功能可以由全長抗體的片段來完成。在術語抗體的“抗原結合部位”范圍內的結合片段的例子包括(i)Fab片段，即由VL，VH，CL和CH1結構域組成的單價片段；(ii)F(ab′)2片段，即包含兩個由鉸鏈區(qū)的二硫橋連接的Fab片段的二價片段；(iii)由VH和CH1結構域組成的Fd片段；(iv)由抗體一個單臂的VL和VH結構域組成的Fv片段；(v)由一個VH結構域組成的dAb片段(Wardetal，(1989)Nature341544-546)；以及(vi)分離的互補決定區(qū)(CDR)。此外，盡管Fv片段的兩個結構域VL和VH由各自的基因編碼，它們可以用重組方法通過合成的接頭連接，合成接頭使它們可以作為單蛋白鏈產(chǎn)生，其中VL和VH區(qū)配對形成單價分子(稱作單鏈Fv(scFv)；見Birdetal(1988)Science242423-426；及Hustonetal.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA855879-5883)。這種單鏈抗體也意欲包括在術語抗體的“抗原結合部分”范圍中。這些抗體片段用本領域技術人員公知的傳統(tǒng)技術獲得，為使用而進行的片段篩選與完整抗體的方法相同。術語“表位”表示能夠特異性結合于抗體的蛋白決定簇。表位通常由化學活性表面分子基團，如氨基酸或糖側鏈組成，并且通常具有特異性三維結構特征，以及特異性電荷特征。構象性和非構象性表位的區(qū)別在于與前者的結合在變性溶劑存在下失去，而與后者的結合則不失去。術語“雙特異性分子”包括任何有兩個不同的結合特異性的試劑，如蛋白、肽、或蛋白或肽復合物，它們可以與(a)細胞表面抗原和(b)效應細胞表面的Fc受體結合或反應。術語“多特異性分子”或“異特異性分子”包括任何有兩個以上不同的結合特異性的試劑，如蛋白、肽、或蛋白或肽復合物。例如，所述分子可以與(a)細胞表面抗原和(b)效應細胞表面的Fc受體和(c)至少一個其它成分結合或反應。因此，本發(fā)明包括，但不局限于定向于細胞表面抗原如EGFR和其它靶，如效應細胞表面Fc受體的雙特異性、三特異性和其它多特異性分子。術語“雙特異性抗體”此外還包括雙抗體(diabodies)。雙抗體是二價的、雙特異性抗體，其中的VH和VL域在單肽鏈上表達，但使用的接頭太短，不允許在同一條鏈上的兩個結構域之間配對，因此迫使此結構域與另一條鏈上的互補結構域配對并產(chǎn)生兩個抗原結合位點(見，例如Holliger，P.etal.(1993)proc.Natl.Acad.Sci.USA906444-6448；Poljak，R.J.，etal.(1994)Structure21121-1123)。這里用到的術語“異抗體(heteroantibodies)”指兩個或更多抗體、抗體結合片段(如Fab)，其衍生物，或連接在一起的抗原結合區(qū)，至少其中的兩個有不同的特異性。這些不同的特異性包括對效應細胞上的Fc受體的結合特異性，以及靶細胞如腫瘤細胞上的抗原或表位的結合特異性。這里用到的術語“人抗體”，意欲包括有從人種系免疫球蛋白序列來源的可變和恒定區(qū)的抗體。本發(fā)明的人抗體可以包括不是由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(如由體外隨機或位點特異性誘變誘導的突變或體內的體細胞突變)。然而，這里用到的術語“人抗體”，并不包括CDR序列來源于另一種哺乳動物物種如小鼠的種系，被嫁接至人的構架序列中的抗體。這里用到的術語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”是指單分子組成的抗體分子制劑。單克隆抗體組合物表現(xiàn)出單結合特異性和對特定表位的親和性。因此，術語“人單克隆抗體”是指具有來源于人種系免疫球蛋白序列的可變和恒定區(qū)并表現(xiàn)出單結合特異性的抗體。在一種實施方案中，人單克隆抗體由包含一個從轉基因非人動物如轉基因小鼠中獲得的B細胞與永生化細胞融合產(chǎn)生的雜交瘤產(chǎn)生，轉基因小鼠有一個包含一個人類重鏈轉基因和一個人類輕鏈轉基因的基因組。這里用到的術語“重組人抗體”意欲包括所有用重組方法制備、表達、產(chǎn)生或分離的人抗體，如(a)從轉基因為人免疫球蛋白基因的動物(如小鼠)或由其制備的雜交瘤中分離的抗體(在下面的第一部分詳述)；(b)從經(jīng)轉化而表達抗體的宿主細胞，如轉染瘤分離的抗體，(c)由重組組合人抗體文庫分離的抗體，和(d)用其它涉及將人免疫球蛋白基因序列剪接到其它DNA序列的方法制備、表達、產(chǎn)生或分離的抗體。所述重組人抗體來源于人種系免疫球蛋白序列的可變和恒定區(qū)。然而在某些實施方案中，這種重組人抗體經(jīng)歷了體外誘變(或，當使用轉基因為人Ig序列的動物時，體內體細胞誘變)，因此重組抗體VH和VL區(qū)的氨基酸序列來源于人種系VH和VL序列并與其相關，可能在體內并不天然存在于人抗體種系的所有組成成分。這里用到的“異源性抗體”是與產(chǎn)生這種抗體的轉基因非人生物相聯(lián)系而定義的。此術語是指這樣一種抗體，它具有與存在于不構成轉基因非人動物的生物中的氨基酸序列或編碼核酸序列相對應，并一般是從轉基因非人動物以外的物種獲得的氨基酸序列或編碼核酸序列。這里用到的“異雜交(heterohybrid)抗體”指有不同生物來源的輕鏈和重鏈的抗體。例如，有一條人重鏈與一條鼠輕鏈締合的抗體是異雜交抗體。異雜交抗體的例子包括前面討論過的嵌合的和人源化抗體。這里用到的“分離抗體”意指基本上沒有其它具有不同抗原特異性抗體的抗體(如特異性與EGFR結合的分離抗體基本上沒有與EGFR之外的抗原特異性結合的抗體)。然而特異性與人EGFR的表位、同種型或變體結合的分離抗體對其它相關的如來自于其它物種的抗原(如EGFR物種同源物)可能有交叉反應性。此外，分離抗體可以基本上沒有其它細胞物質和/或化學物質。在本發(fā)明的一種實施方案中，有不同特異性的“分離”單克隆抗體的組合在一種明確的組合物中組合。這里用到的“特異性結合”是指抗體與預定的抗原結合。一般，抗體以至少約1×107M-1的親和性結合，與預定抗原結合的親和性至少比與預定抗原或密切相關抗原以外的非特異性抗原(如BSA，酪蛋白)的親和性大兩倍。短語“識別抗原的抗體”和“抗原的特異性抗體”在這里可以與術語“特異性與抗原結合的抗體”互換使用。這里用到的術語對IgG抗體的“高親和性”是指至少約107M-1，優(yōu)選為至少約108M-1，更優(yōu)選為至少約109M-1，更優(yōu)選為至少約1010M-1，1011M-1，1012M-1或更高，如直到1013M-1或更高的結合親和性。然而，“高親和性”結合對其它抗體同種型可以改變。例如，對IgM同種型的“高親和性”結合是指結合親和性至少為約1×107M-1。這里用到的術語“KA”意指特定抗體-抗原相互作用的締合常數(shù)。這里用到的術語“KD”意指特定抗體-抗原相互作用的解離常數(shù)。這里用到的術語“同種型”是指由重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體類型(如IgM或IgG1)。這里用到的術語“同種型轉換”是指抗體類型或同種型從一種Ig類型轉換到另一種其它Ig類型的現(xiàn)象。這里用到的術語“非轉換同種型”是指在沒有發(fā)生同種型轉換的情況下產(chǎn)生的重鏈同種型類型；編碼非轉換同種型的CH基因一般是功能性重排的VDJ基因下游的第一個CH基因。同種型轉換被分類為經(jīng)典或非經(jīng)典同種型轉換。經(jīng)典同種型轉換是通過涉及轉基因中至少一個轉換序列區(qū)的重組事件而發(fā)生的。非經(jīng)典同種型轉換可以通過例如在人σμ和人∑μ之間的同源重組(伴δ缺失)而發(fā)生。其它非經(jīng)典轉換機制，如轉基因間和/或染色體間重組及其它機制，可以發(fā)生并完成同種型轉換。這里用到的術語“轉換序列”是指那些負責轉換組合的DNA序列。“轉換供體”序列，一般是一個μ轉換區(qū)，將處在轉換重組過程中被去除的結構區(qū)的5′(上游)。“轉換受體”區(qū)將在將被去除的結構區(qū)和替代恒定區(qū)(如γ，ε等)之間。由于不存在重組經(jīng)常發(fā)生的特定位點，從結構一般不能預測最終的基因序列。這里用到的“糖基化模式”被定義為與蛋白，更具體地說是免疫球蛋白共價連接的糖單位模式。當本領域技術人員發(fā)現(xiàn)異源抗體的糖基化模式與轉基因的CH基因所來源的物種相比，與非人轉基因動物物種的糖基化模式更相似時，異源抗體糖基化模式的特征可以在于基本上與非人轉基因動物物種產(chǎn)生的抗體的上天然存在的糖基化模式相似。這里使用的應用于一種對象的術語“天然存在的”是指某種對象可以在自然中發(fā)現(xiàn)。例如，可以從天然來源中分離并沒有通過人在實驗室中進行有意的修飾的生物(包括病毒)中的多肽或多核苷酸序列就是天然存在的。這里用到的術語“重排的”是指一條重鏈或輕鏈免疫球蛋白基因座的一種構型，其中的V段在分別編碼基本上完整的VH或VL結構域的一種構象中緊鄰D-J或J段。重排的免疫球蛋白基因座可以通過與種系DNA比較而識別；重排基因座將有至少一個重組的七聚體/九聚體同源元件。這里用到的關于一個V段的術語“未重排的”或“種系構型”是指V段未重組因此不與D或J段緊鄰的構型。這里用到的術語“核酸分子”意欲包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈，但優(yōu)選雙鏈DNA。這里用到的關于編碼與EGFR結合抗體或抗體部分(如VH，VL，CDR3)的核酸的術語“分離的核酸分子”，意指其中編碼抗體或抗體部分的核苷酸序列不含編碼與EGFR以外的抗原結合的抗體或抗體部分的核苷酸序列的核酸分子，其它序列可以天然地側翼于人基因組DNA中的核酸。在一種實施方案中，人抗EGFR抗體或其部分包括2F8的核苷酸或氨基酸序列，以及分別具有SEQIDNOs1和3以及2和4所示序列的重鏈(VH)和輕鏈(VL)可變區(qū)。如此處所公開和要求保護的，SEQIDNOs1-4所示的序列包括“保守序列修飾”，即不顯著影響或改變由所述核苷酸序列編碼的抗體或含有所述氨基酸序列的抗體的結合特征的核苷酸和氨基酸序列修飾。所述保守序列修飾包括核苷酸和氨基酸取代、添加和缺失?？梢酝ㄟ^本領域的標準技術，如定點誘變和PCR介導的誘變等將修飾導入SEQIDNOs1-4中。保守氨基酸取代包括氨基酸殘基被具有相似側鏈的氨基酸殘基替代。本領域中已經(jīng)定義了具有相似側鏈的氨基酸殘基的家族。這些家族包括具有堿性側鏈的氨基酸(如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)，具有酸性側鏈的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸)，具有不帶電的極性側鏈的氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非極性側鏈的氨基酸(如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，具有β分支側鏈的氨基酸(如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳香側鏈的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，優(yōu)選用來自于同一側鏈家族的另一種氨基酸殘基替代人抗EGFR抗體中的非必須氨基酸殘基。或者，在另一種實施方案中，例如可以通過飽和誘變沿抗EGFR抗體編碼序列的全部或部分而隨機引入突變，并且篩選得到的修飾的抗EGFR抗體的結合活性。因此，由此處公開的(重鏈和輕鏈可變區(qū))核苷酸序列編碼的抗體和/或含有此處公開的氨基酸序列(即SEQIDNOs1-4)的抗體包括基本上由經(jīng)保守修飾的相似序列編碼的，或含有經(jīng)保守修飾的相似序列的抗體。下文提供了關于如何基于此處公開為SEQIDNos1-4的部分(即重鏈和輕鏈可變區(qū))序列產(chǎn)生所述基本相似的抗體的進一步討論。對于核酸，術語“基本同源”指兩個核酸或其指定序列，當最優(yōu)比對和比較時，在有適當?shù)暮塑账岵迦牒腿笔闆r下，至少約80％的核苷酸，通常至少約90到95％，更優(yōu)選至少約98％到99.5％的核苷酸是相同的。另外，在選擇性雜交條件下片段與其互補鏈進行雜交時也存在基本同源。兩個序列間的百分比同一性是一個關于序列間相同位置數(shù)量的函數(shù)(即同源％＝相同位置數(shù)/總位置數(shù)×100)，考慮在最優(yōu)比對兩個序列時需要引入的空位數(shù)量和每個空位的長度。序列比較和判斷兩個序列的百分比同一性可以用數(shù)學算法來完成，在下面的非限制實施例中描述。兩個核苷酸序列的百分比同一性可以用GCG軟件包(在http://www.gcg.com可以找到)中的GAP程序判斷，使用NWSgapdna.CMP矩陣，以及40，50，60，70，或80的空位權重和1，2，3，4，5或6的長度權重。兩個核苷酸或氨基酸序列之間的百分比同一性也可以用引入ALIGN程序(2.0版)中的E.Meyers和W.Miller算法判斷(CABIOS，411-17(1989))，使用PAM120權重殘基表，空位長度罰分為12，空位罰分為4。此外，兩個核苷酸或氨基酸序列之間的百分比同一性也可以用引入GCG軟件包(在http://www.gcg.com可以找到)中GAP程序中的Needleman和Wunsh算法判斷(J.Mol.Biol.(48)444-453(1970))，使用Blossum62矩陣或PAM250矩陣，以及16，14，12，10，8，6或4的空位權重和1，2，3，4，5或6的長度權重。本發(fā)明的核酸和蛋白質序列可以進一步用作“詢問序列”來進行對公共數(shù)據(jù)庫的檢索，如鑒定相關序列。這種檢索可以按Altschul，等在(1990)J.Mol.Biol.215403-10中所描述的，用NBLAST和XBLAST程序(2.0版)執(zhí)行。BLAST核苷酸檢索可以用NBLAST程序執(zhí)行，分數(shù)＝100，字長＝12，從而獲得與本發(fā)明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白檢索可以用XBLAST程序執(zhí)行，分數(shù)＝50，字長＝3，從而獲得與本發(fā)明的蛋白分子同源的氨基酸序列。為比較目的而獲得有空位的比對，有空位的BLAST可以按照Altschul等在(1997)NucleicAcidsRes.25(17)3389-3402中的描述來使用。當使用BLAST和有空位的BLAST程序時，可以使用各自程序(如XBLAST和NBLAST)的缺省參數(shù)。見http://www.ncbi.nlm.nih.gov。核酸可以在完整細胞、細胞裂解物或部分純化或基本純凈形式中存在。當用包括堿/SDS處理、CsCl顯帶、柱層析、瓊脂糖凝膠電泳和其它本領域中公知的標準技術將核酸從其它細胞成分或其它污染物如其它細胞的核酸或蛋白中純化出來時，核酸就是“分離的”或“表現(xiàn)為基本純凈”。見F.Ausubel，etal.CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenePublishingandWileyInterscience，NewYork(1987)。來自cDNA，基因組或混合物的本發(fā)明的核酸組合物盡管通常是天然序列(除修飾的限制位點等)，但可以依照標準技術進行突變而提供基因序列。對于編碼序列，這些突變可以按照需要影響氨基酸序列。具體而言，本發(fā)明考慮了與天然V，D，J，恒定區(qū)，轉換區(qū)和其它類似序列同源或由其衍生的DNA序列(“衍生”表示一個序列與另一個序列相同或由其修飾而來)。當核酸與另一個核苷酸序列置于功能關系時，就被“可操作性連接”。例如，如果啟動子或增強子影響一個編碼序列的轉錄，那么它就被可操作性連接到該序列。對于轉錄調節(jié)序列，可操作性連接表示被連接的DNA序列是鄰接的并且對連接讀框中的兩個鄰接的蛋白編碼區(qū)是必要的。對于轉換序列，可操作性連接提示該序列可以影響轉換重組。這里用到的術語“載體”意指可以將核酸轉運到與其連接序列的核酸分子。載體的一種類型是“質粒”，指可以將額外的DNA片段連接到其中的雙鏈DNA環(huán)。另一種類型的載體是病毒載體，其中額外的DNA片段可以與病毒基因組連接。某些載體可以在其引入的宿主細胞(如有細菌復制起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)中自主復制。其它載體(如非附加型哺乳動物載體)可以在導入宿主細胞時整合到宿主細胞的基因組中，與宿主基因組一起復制。此外，某些載體可以指導與其可操作性連接的基因的表達。這種載體在這里被稱作“重組表達載體”(或簡稱為“表達載體”)?？偟恼f來，應用在重組DNA技術中的表達載體通常以質粒形式存在。在本詳述中，“質?！焙汀拜d體”可以互換使用，因為質粒是最常使用的載體。然而，本發(fā)明意欲包括有相同功能的載體的其它表達形式，如病毒載體(如復制缺陷逆轉錄病毒，腺病毒和腺伴隨病毒)。這里用到的術語“重組宿主細胞”(或簡稱為“宿主細胞”)意指重組表達載體引入的細胞。必須理解這些術語并不僅指特定受試細胞，也指這些細胞的后代。由于突變或環(huán)境影響可能在后代中出現(xiàn)某些修飾，這些后代實際上可能不會與母體細胞相同，但仍然包括在這里用到的術語“宿主細胞“的范圍內。重組宿主細胞包括，例如CHO細胞和淋巴細胞。本發(fā)明的各種方面在下面的部分中有進一步詳述。I.人EGFR抗體的產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體(MAbs)可以用多種技術產(chǎn)生，包括傳統(tǒng)單克隆抗體方法學如Kohler和Milstein標準體細胞雜交技術，Nature256495(1975)。盡管優(yōu)選體細胞雜交技術，原則上也可以使用其它產(chǎn)生單克隆抗體的技術，如B淋巴細胞病毒或癌基因轉化。制備雜交瘤的優(yōu)選動物系統(tǒng)為鼠系統(tǒng)。小鼠中的雜交瘤產(chǎn)生是一個完善的程序。分離用于融合的免疫脾細胞的方案和技術是本領域中公知的。融合配偶體(如免疫骨髓瘤細胞)及融合程序也是公知的。在一種優(yōu)選實施方案中，針對EGFR的人單克隆抗體可以用攜帶部分人免疫系統(tǒng)而不是小鼠系統(tǒng)的轉基因小鼠產(chǎn)生。這些轉基因小鼠，這里稱作“HuMAb”，包含一個編碼未重排人重鏈(μ和γ)和κ輕鏈免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因微基因座，以及滅活內源性γ和κ鏈基因座的靶突變(Lonberg，N.Etal.(1994)Nature368(6474)856-859)。因此，此小鼠顯示小鼠IgM或κ的表達減少，并且由于免疫應答，引入的人重鏈和輕鏈轉基因經(jīng)歷了類型轉換和體細胞突變而產(chǎn)生高親和性人IgGκ單克隆抗體(Lonberg，Netal.(1994)，supra；綜述于Lonberg，N.(1994)HandbookofExperimentalPharmacology11349-101；LonbergN.andHuszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.1365-93，和Harding，F(xiàn).AndLonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Aci764536-546)。HuMAb小鼠的制備在下面的第II部分和以下文獻中有詳細描述，Taylor，L.Etal.(1992)NucleicAcidsResearch206287-6295；Chen，J，etal.(1993)InternationalImmunology5647-656；Tuaillonetal.(1993)Proc.Natl.Acad.SciUSA903720-3724；Choietal.(1993)NatureGenetics4117-123；ChenJ.etal.(1993)EMBOJ.12821-830；Tuaillonetal.(1994)J.Immunol.1522912-2920；Lonbergetal.，(1994)Nature368(6474)856-859；Lonberg，N.9(1994)HandbookofExperiencePharmacology11349-101；Taylor，L.Etal.(1994)InternationalImmunology6；579-591；Lonberg，N.AndHszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.1365-93；Harding，F(xiàn).andLonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci764536-546；Fishwild，D.Etal.(1996)NatureBiotechnology14845-851，在此完整引入其全部內容作為參考。還可進一步參考都屬于Lonbergandkay，andGenPharmInternational的美國專利5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；和5,770,429；屬于Suranietal.的美國專利No.5,545,807；公開于1998年6月11日的國際公開WO98/24884；公開于1994年11月10日的WO94/25585；公開于1993年6月24日的WO93/1227；公開于1992年12月23日的WO92/22645；公開于1992年3月19日的WO92/03918，在此完整引入其公開內容作為參考。另外，實施例2中描述的HCO12轉基因小鼠可以用來產(chǎn)生人抗EGFR抗體。人抗體免疫為產(chǎn)生完全的人EGFR單克隆抗體，HuMAb小鼠可以用EGFR抗原的純化或富集制劑和/或表達EGFR的細胞免疫，如下面的文件中所描述，LonbergN.etal.(1994)Nature368(6474)856-859；Fishwild，D.etal.(1996)NatureBiotechnology14845-851及WO98/24884。小鼠優(yōu)選在首次融合時為6-16周齡。例如，EGFR抗原的純化或富集制劑(5-20μg)可以用來腹膜內免疫HuMAb小鼠。當用EGFR抗原的純化或富集制劑免疫不產(chǎn)生抗體時，也可以用表達EGFR的細胞如腫瘤細胞來免疫小鼠，從而促進免疫應答。用不同抗原積累的經(jīng)驗表明，當先用與完全弗氏佐劑混合的抗原進行腹膜內(IP)免疫，然后每隔一周(最多共6周)用與不完全弗氏佐劑混合的抗原進行腹膜內免疫，HuMAb轉基因小鼠有最好的免疫應答。免疫應答可以用免疫方案中由眼眶后取血得到的血漿樣品監(jiān)測。血漿可以用ELISA(如下面所描述)法篩選，有足夠抗EGFR人免疫球蛋白滴度的小鼠可以用來融合?？梢栽谔幩阑蛉〕銎⑴K之前對小鼠進行靜脈內加強免疫。預計每種抗原需要進行2-3次融合。每種抗原需要免疫幾只小鼠。例如，可以免疫總共12只HC07和HC012株的HuMAb小鼠。產(chǎn)生人EGFR單克隆抗體的雜交瘤的生成小鼠脾細胞可以根據(jù)標準實驗方案進行分離并用PEG與小鼠骨髓瘤細胞系融合。然后為產(chǎn)生抗原特異性抗體對產(chǎn)生的雜交瘤進行篩選。例如將從免疫小鼠得到的脾淋巴細胞單細胞懸液與P3X63-Ag8，653非分泌性小鼠骨髓瘤細胞(ATCC，CRL1580)數(shù)量的1/6用50％的PEG進行融合。將大約2×105個細胞平鋪在平底微量滴定板，然后在包含20％胎克隆血清，18％“653”條件培養(yǎng)基，5％origen(IGEN)，4mML-谷氨酰胺，1mML～谷氨酰胺，1mM丙酮酸鈉，5mMHEPES，0.055mM2-巰基乙醇，50單位/ml青霉素，50mg/ml鏈霉素，50mg/ml慶大霉素和1XHAT(Sigma；融合后24小時加入HAT)的選擇性培養(yǎng)基中孵育。兩周后，在HT替代HAT的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。然后對每個孔用ELISA法篩選人抗EGFR的單克隆IgM和IgG抗體。一旦雜交瘤廣泛生長，通常在10-14天后觀察培養(yǎng)基。重新平鋪抗體分泌性雜交瘤，再次篩選，如果仍然為人IgG抗EGFR單克隆抗體陽性，可以通過有限稀釋進行至少兩次亞克隆。然后在體外培養(yǎng)穩(wěn)定的亞克隆從而組織培養(yǎng)基中產(chǎn)生少量抗體從而進行鑒定。產(chǎn)生人EGFR單克隆抗體的轉染瘤的生成也可以使用例如本領域公知的重組DNA技術和基因轉染方法(Morrison，S.(1985)Science2291202)的組合在宿主細胞轉染瘤中產(chǎn)生本發(fā)明的人抗體。例如，在一種實施方案中，可以將目的基因，如人抗體基因連接至表達載體，例如真核細胞質粒中。然后可以將質粒引入宿主細胞，如細菌細胞(如大腸桿菌)中，然后使細胞生長?？梢杂萌芫高x擇和處理含有具有整合DNA的質粒的宿主細胞，以便除去細胞壁?？梢詫⒌玫降脑|球與永生化細胞，如骨髓瘤細胞融合(稱作“轉染”)。融合后，可以鑒定和選擇穩(wěn)定的細胞(轉染子)。這些細胞代表然后可以通過在腹水或組織培養(yǎng)物中生長而擴增，并且用于產(chǎn)生人抗體的轉染瘤。表達完整抗體的部分抗體序列的使用抗體主要通過位于六個重鏈和輕鏈互補決定區(qū)(CDRs)的氨基酸殘基與靶抗原相互作用。因此，CDRs中的氨基酸序列在各個抗體之間比在CDRs外的序列更多樣。因為CDR序列負責大多數(shù)抗體-抗原相互作用，可以通過構建包含來自于嫁接至來自于具有不同特性的不同抗體的構架序列上的特異性天然抗體的CDR序列的表達載體而表達模擬特異性天然抗體的特性的重組抗體(見，例如，Riechmann，L.etal.，1998，Nature332323-327；Jones，P.etal.，1986，Nature321522-525；和Queen，C.etal.，1989，Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.8610029-10033)?？梢詮陌N系抗體基因序列的公共DNA數(shù)據(jù)庫獲得所述構架序列。這些種系序列與成熟抗體基因序列不同，因為它們不包括完全組裝的可變區(qū)基因，所述基因是通過B細胞成熟過程中的V(D)J連接而形成的。種系基因序列也將不同于各個平均跨可變區(qū)的高親和性第二全部組成成分抗體的序列。例如，體突變在構架區(qū)的氨基末端部分相對不常見。例如，體突變在構架區(qū)1的氨基末端部分和構架區(qū)4的羧基末端部分相對不常見。此外，許多體突變不顯著改變抗體的結合特性。因此，為了重建具有相似于原始抗體的結合特性的完整重組抗體，并不必須獲得特定抗體的完整DNA序列(見1999年3月12日提交的PCT/US99/05535，在此引入作為參考)。跨CDR區(qū)的部分重鏈和輕鏈序列一般足夠用于此目的。用部分序列確定哪一種種系可變區(qū)和連接基因片段貢獻于重組抗體可變區(qū)基因。然后用種系序列填充可變區(qū)的缺少部分。重鏈和輕鏈前導序列在蛋白成熟中切割，并且不貢獻于最終抗體的特性。為此，必須使用相應的種系前導序列而表達構建體。為了加入缺少的序列，可以通過連接或PCR擴增將克隆的cDNA序列與合成的寡核苷酸結合。或者，可以將完整的可變區(qū)合成為一組短的、重疊的寡核苷酸并且通過PCR擴增結合，以產(chǎn)生完整的合成可變區(qū)克隆。這一過程具有某些優(yōu)點，如去除或引入特定的限制位點，或優(yōu)化特定的密碼子。用來自于雜交瘤的重鏈和輕鏈轉錄物的核苷酸序列設計一組重疊的合成寡核苷酸，以產(chǎn)生與天然序列具有相同氨基酸編碼能力的合成V序列。合成重鏈和κ鏈可以以三種方式不同于天然序列打斷重復核苷酸堿基串以促進寡核苷酸合成和PCR擴增；根據(jù)Kozak規(guī)則摻入最優(yōu)翻譯起始位點(Kozak，1991，J.Biol.Chem.266L19867019870)，以及將HindIII位點工程化至翻譯起始位點上游。對于重鏈和輕鏈可變區(qū)，最優(yōu)化的編碼鏈和相應的非編碼鏈序列在相應非編碼寡核苷酸大約中點分解為大約30-50個核苷酸。因此，對于每條鏈，寡核苷酸可以組裝為跨150-400個核苷酸的片段的重疊雙鏈組。然后用合并物作為模板來產(chǎn)生150-400個核苷酸的PCR擴增產(chǎn)物。一般地，單可變區(qū)寡核苷酸組將分解為兩個合并物，它們可以分別擴增以產(chǎn)生兩個重疊的PCV產(chǎn)物。然后通過PCT擴增結合重疊產(chǎn)物，以形成完整的可變區(qū)。也可能需要在PCR擴增中引入重鏈或輕鏈恒定區(qū)的重疊片段(包括κ輕鏈的BbsI位點或γ重鏈的AgeI位點)，從而產(chǎn)生可以容易克隆至表達載體構建體中的片段。然后將重新構建的重鏈和輕鏈可變區(qū)與克隆的啟動子、翻譯起始位點、恒定區(qū)、3’非翻譯區(qū)、聚腺苷酸化位點和轉錄終止位點序列結合，以形成表達載體構建體。重鏈和輕鏈表達構建體可以結合至共轉染、系列轉染、或分開轉染至宿主細胞中的單一載體中，所述宿主細胞然后融合形成表達兩條鏈的宿主細胞。用于構建人IgGκ的表達載體的質粒如下文所述。對質粒進行構建，以使PCR擴增的V重鏈和Vκ輕鏈cDNA序列可以用于重新構建完整的重鏈和輕鏈微基因。這些質粒可以用于表達完全的人或嵌合IgG1κ或IgG4κ抗體?？梢詷嫿ㄏ嗨频馁|粒用于表達其它重鏈同種型，或用于表達包含λ輕鏈的抗體。因此，在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明的人抗EGFR抗體，如2F8的結構特征被用于產(chǎn)生保留本發(fā)明的抗體的至少一種功能特性，例如結合于EGFR的結構相關的人抗EGFR抗體。更具體地，2F8的一個或多個CDR區(qū)可以與已知的人構架區(qū)和CDRs重組結合，以產(chǎn)生額外的、重組工程化的本發(fā)明的人抗EGFR抗體。因此，在另一種實施方案中，本發(fā)明提供了一種制備抗EGFR抗體的方法，包括制備包含以下成分的抗體(1)人重鏈構架區(qū)和人重鏈CDRs，其中至少人重鏈CDRs之一包含選自圖15所示CDRs的氨基酸序列的氨基酸序列(或SEQIDNO2中的相應氨基酸殘基)；和(2)人輕鏈構架區(qū)和人輕鏈CDRs，其中至少人輕鏈CDRs之一包含選自圖15所示CDRs的氨基酸序列的氨基酸序列(或SEQIDNO4中的相應氨基酸殘基)，其中抗體保留結合EGFR的能力?？梢允褂脴藴式Y合測定確定抗體結合EGFR的能力，如實施例中所示(如ELISA)。由于本領域中公知抗體重鏈和輕鏈CDR3結構域在抗體對抗原的結合特異性/親和性中起特別重要的作用，按上述方法制備的本發(fā)明的重組抗體優(yōu)選包含2F8的重鏈和輕鏈CDR3s。所述抗體可以進一步包含2F8的CDR2s。因此，本發(fā)明進一步提供了包含以下成分的抗EGFR抗體(1)人重鏈構架區(qū)，人重鏈CDR1區(qū)，人重鏈CDR2區(qū)，和人重鏈CDR3區(qū)，其中人重鏈CDR3區(qū)是圖15所示2F8的CDR3(或SEQIDNO2中的相應氨基酸殘基)；和(2)人輕鏈構架區(qū)，人輕鏈CDR1區(qū)，人輕鏈CDR2區(qū)，人輕鏈CDR3區(qū)，其中人輕鏈CDR3區(qū)是圖15所示2F8的CDR3(或SEQIDNO4中的相應氨基酸殘基)，其中該抗體結合EGFR?？贵w可以進一步包含2F8的重鏈CDR2和/或輕鏈CDR2?？贵w可以進一步包含2F8的重鏈CDR1和/或輕鏈CDR1。優(yōu)選地，上述工程化抗體的CDR1，2和/或3包含此處公開的2F8的精確氨基酸序列。然而，本領域技術人員將理解，從2F8的精確CDR序列有一些偏離，而仍然保留抗體有效結合EGFR的能力(如保守取代)也是可能的。因此，在另一種實施方案中，工程化的抗體可以由例如與2F8的一個或多個CDRs具有例如90％，95％，98％或99.5％同一性的一個或多個CDRs組成。除了簡單結合EGFR，工程化抗體，可以選擇如上文所述的工程化抗體對本發(fā)明抗體的其它功能特性的保留，如(1)與表達EGFR的活細胞結合；(2)與EGFR的高親和性結合；(3)與EGFR上的唯一表位結合(排除以組合形式使用的有互補活性的單克隆抗體將競爭與相同表位的結合的可能性)；(4)對表達EGFR細胞的調理作用。(5)在人效應細胞存在時介導對表達EGFR細胞的生長抑制、吞噬和/或殺滅。鑒定人單克隆抗體與EGFR的結合為鑒定本發(fā)明的人單克隆EGFR抗體的結合，可以用如ELISA法檢驗免疫小鼠血清。簡單地說，用PBS中0.25μg/ml的純化EGFR包被微量滴定板，然后用溶于PBS的5％牛血清白蛋白封閉。將EGFR免疫小鼠的血漿稀釋液加入每個孔并在37℃孵育1-2小時。用PBS/Tween洗滌微量滴定板，然后用堿性磷酸酶偶聯(lián)的山羊抗人IgGFc特異性多克隆試劑在37℃孵育1小時。在洗滌后，將微量滴定板用pNPP底物(1mg/ml)顯色，在405-650的OD值下分析。優(yōu)選使用顯色最高滴度的小鼠進行融合。上述ELISA分析也可用來篩選顯示與EGFR免疫原有陽性反應的雜交瘤。以高親和性與EGFR結合的雜交瘤將被亞克隆并進一步鑒定。保持親代細胞反應性的每個雜交瘤的一個克隆(通過ELISA)可以選作在-140℃儲存的5-10小管細胞庫，用于抗體純化。為純化人抗EGFR抗體，選定的雜交瘤可以在2升的滾瓶中生長，準備進行抗體純化。在用蛋白A-瓊脂糖(Pharmacia，piscataway，NJ)進行親和層析之前過濾并濃縮上清液?？梢杂媚z電泳檢查洗脫的IgG并用高壓液相層析保證純度。緩沖液可以交換為PBS，濃度可以采用1.43的消光系數(shù)由OD280判斷。單克隆抗體可以被等分并在-80℃下儲藏。為判斷選定的人抗EGFR單克隆抗體是否與唯一的表位結合，可以用能夠買到的試劑(Pierce，Rockford，IL)生物素化每種抗體?？梢杂蒙鲜鯡GFR包被的ELISA板進行未標記單克隆抗體和生物素化單克隆抗體競爭實驗。生物素化MAb可以用鏈親和素堿性磷酸酶探針檢測。為判斷純化抗體的同種型，可以進行同種型ELISA。用10μg/ml抗人Ig包被微量滴定板的孔在4℃下過夜。用5％BSA封閉后，將微量滴定板與10μg/ml的單克隆抗體或純化同種型對照在室溫下反應2小時。然后將孔與人IgG1或人IgM特異性堿性磷酸酶結合探針反應。按前面描述的方法進行顯影和分析。為證明單克隆抗體與表達EGFR的活細胞結合，可以使用流式細胞儀。簡言之，將表達EGFR的細胞系(在標準生長條件下生長)在包含0.1％Tween80和20％小鼠血清的PBS中與不同濃度的單克隆抗體混合，在37℃下孵育1小時。經(jīng)過洗滌，在與第一抗體染色相同的條件下將細胞與熒光素標記的抗人IgG抗體反應。FACScan儀可以利用光和散射屬性來控制單個細胞從而分析樣品。另一種使用熒光顯微鏡的測定可以(補充或替代)流式細胞儀測定。可以用前面描述的方法對細胞染色并用熒光顯微鏡檢測。這種方法允許看到單個細胞，但根據(jù)抗體密度可能會有靈敏度降低?？梢酝ㄟ^蛋白印跡法進一步檢驗抗EGFR人IgG與EGFR抗原的反應性。簡言之，可以制備表達EGFR的細胞的細胞提取物并進行十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳。在電泳之后，可以將分開的抗原轉移到硝酸纖維素膜上，用20％的小鼠血清封閉，并用被檢驗單克隆抗體探測?？梢杂每谷薎gG堿性磷酸酶及BCIP/NBT底物片(Sigmachem.Co.，St.Louis，MO)顯影檢測人IgG結合。人EGFR單克隆抗體的吞噬和細胞殺滅活性除了與EGFR特異性結合，人單克隆EGFR抗體介導吞噬和殺滅表達EGFR的細胞的能力也可以被檢驗。體外單克隆抗體活性檢驗將提供檢驗體內模型前的初步篩選。簡言之，從健康供體得到的多形核細胞(PMN)或其它效應細胞可以用FicollHypaque密度離心純化，然后進行污染紅細胞裂解。洗滌過的PMN可以以不同的效應細胞和腫瘤細胞比例(效應細胞腫瘤細胞)懸浮在補加10％熱滅活胎牛血清并與51Cr標記的表達EGFR的細胞混合的RPMI中。然后加入不同濃度的純化人抗EGFRIgG。不相關的人IgG可以作為陰性對照。檢驗可以在37℃下進行0-120分鐘?？梢酝ㄟ^測量釋放到培養(yǎng)物懸浮液中的51Cr來檢驗樣品的細胞裂解。也可以將抗EGFR單克隆抗體互相組合測量，以便判斷多種單克隆抗體是否可以加強細胞裂解。也可以在體內模型中(如在小鼠中)檢驗與EGFR結合的人單克隆抗體，判斷它們介導吞噬和殺滅表達EGFR的細胞如腫瘤細胞的效力。例如，這些抗體可以按以下標準選擇，這些標準并不是唯一的(1)表達EGFR的活細胞結合；(2)與EGFR的高親和性結合；(3)與EGFR上的唯一表位結合(排除以組合形式使用的有互補活性的單克隆抗體將競爭與相同表位的結合的可能性)；(4)對表達EGFR細胞的調理作用。(5)人效應細胞存在時介導對表達EGFR細胞的生長抑制、吞噬和/或殺滅。本發(fā)明的優(yōu)選人單克隆抗體符合一個或更多，優(yōu)選符合所有這些標準。在一種特定的實施方案中，人單克隆抗體以組合形式應用，如作為包括兩個或更多抗EGFR單克隆抗體或其片段的藥物組合物。例如，有不同但互補活性的人抗EGFR單克隆抗體可以在單個治療方法中結合，從而達到需要的治療或診斷效果。這種組合的一個例子是一種組合物，它包含介導在效應細胞存在時高效殺滅靶細胞的抗EGFR人單克隆抗體，并與另一種抑制表達EGFR的細胞生長的人抗EGFR單克隆抗體組合。II.產(chǎn)生人單克隆抗EGFR抗體的轉基因非人動物的產(chǎn)生而另一方面，本發(fā)明提供了轉基因非人動物，如可以表達與EGFR特異性，優(yōu)選以高親和性結合的人單克隆抗體的轉基因小鼠。在一種優(yōu)選實施方案中，轉基因非人動物，如轉基因小鼠(HuMAb小鼠)，有一個包含一個人重鏈轉基因和一個輕鏈轉基因的基因組。在一種實施方案中，轉基因非人動物如轉基因小鼠用EGFR抗原的純化或富集制劑和/或表達EGFR的細胞免疫。轉基因非人動物如轉基因小鼠優(yōu)選可以通過進行V-D-J重組和同種型轉換而產(chǎn)生人EGFR單克隆抗體的多種同種型(如IgG，IgA和/或IgE)。同種型轉換可以通過經(jīng)典或非經(jīng)典同種型轉換而發(fā)生。設計以異源抗體所有組成成分并應答外來抗原刺激的轉基因非人動物要求包含在轉基因動物中的異源免疫球蛋白轉基因在B細胞發(fā)育途徑中正確行使功能。在一種優(yōu)選實施方案中，異源重鏈轉基因的正確功能包括同種型轉換。因此，本發(fā)明的轉基因是為產(chǎn)生同種型轉換和下列內容的一項或多項而建立的(1)高水平和細胞類型特異性表達，(2)功能基因重排，(3)激活并應答等位基因排斥，(4)表達足夠的初級組成成分，(5)信號轉導，(6)體細胞超變，和(7)免疫應答中轉基因抗體基因座的顯性化。并不是前面的標準都需要滿足。例如，在那些轉基因動物的內源性免疫球蛋白基因座被功能性破壞的實施方案中，轉基因不需要激活等位基因排斥。此外，在轉基因包含一個功能性重排的重鏈和/或輕鏈免疫球蛋白基因的實施方案中，不需要第二條標準的功能基因重排，至少對于已經(jīng)重排的轉基因時如此。分子免疫學的背景知識可以參考fundamentalImmunology，2ndedition(1989)，PaulWilliamE.，ed.Ravenpress，N.Y.，在此引入作為參考。在某些實施方案中，用于產(chǎn)生本發(fā)明的人單克隆抗體的轉基因非人動物包含重排、未重排或重排和未重排組合的轉基因動物種系中的異源免疫球蛋白重鏈和輕鏈轉基因。每個重鏈轉基因包含至少一個CH基因。另外，重鏈轉基因可包含能夠支持編碼轉基因動物B細胞中的多個CH基因的異源性轉基因的同種型轉換功能的同種型轉換序列。這些轉換序列可以在作為轉基因CH基因來源的物種的種系免疫球蛋白基因座中天然存在，或者這些轉換序列可以從得到轉基因構建體的物種(轉基因動物)中的序列衍生而來。例如，如果摻入與小鼠重鏈基因座中天然存在的序列相同的轉換序列，用來產(chǎn)生轉基因小鼠的人轉基因構建體可以產(chǎn)生更高頻率的同種型轉換事件，正如假設的那樣，小鼠轉換序列經(jīng)優(yōu)化而與小鼠轉換重組酶系統(tǒng)作用，而人轉換序列則不是。轉換序列可以用傳統(tǒng)克隆方法分離和克隆，或可以按照已發(fā)表的免疫球蛋白轉換區(qū)序列相關序列信息從重疊合成寡核苷從頭合成(Millsetal.，Nucl.AcidsRes.15；7305-7316(1991)；Sidrasetal.，Intl.Immunol.1631-642(1989)，在此引入作為參考)。對于前面的每種轉基因動物，可以在轉基因動物很大比例的B細胞(至少10％)中發(fā)現(xiàn)功能性重排的異源性重鏈和輕鏈免疫球蛋白轉基因。用于產(chǎn)生本發(fā)明的轉基因動物的轉基因包括一個含有編碼至少一個可變基因片段、一個多樣性基因片段、一個連接基因片段和至少一個恒定區(qū)基因片段的DNA的重鏈轉基因。免疫球蛋白輕鏈轉基因含有編碼至少一個可變基因片段、一個連接基因片段和至少一個恒定區(qū)基因片段的DNA。編碼輕鏈和重鏈基因片段的基因片段與衍生它們的轉基因非人動物是異源性的，或者說它們與不包括轉基因非人動物的物種中編碼免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因片段的DNA相對應。在本發(fā)明一個方面，轉基因經(jīng)構建使各個基因片段未重排，或不重排，以便編碼一個功能性免疫球蛋白輕鏈或重鏈。這種未重排的轉基因支持在暴露于EGFR抗原時V，D和J基因片段(功能性重排)重組并優(yōu)選支持D區(qū)基因片段的全部或部分摻入轉基因非人動物中得到的未重排免疫球蛋白重鏈。在另一種實施方案中，轉基因包含一個未重排“微基因座”。這樣的轉基因一般包含C，D和J片段的基本部分和V基因片段的亞型。在這種轉基因構建體中，不同的調節(jié)序列，如啟動子、增強子、類型轉換區(qū)、RNA加工的剪接供體和剪接受體、重組信號等，包含從異源性DNA衍生的相應序列。這些調節(jié)序列可以從摻入與本發(fā)明使用的非人動物相同或相關物種得到的轉基因。例如，人免疫球蛋白基因片段可以在轉基因中與嚙齒類動物免疫球蛋白增強子序列結合用于轉基因小鼠。另外，合成的調節(jié)序列可以摻入轉基因，其中這種合成調節(jié)序列與已知的哺乳動物基因組中天然存在的功能性DNA序列不同源。合成調節(jié)序列是根據(jù)共有序列規(guī)則而設計的，例如那些指定剪接受體位點或啟動子/增強子基序的允許序列的規(guī)則。例如，包含與天然存在的種系Ig基因座相比，具有非必需DNA部分(如間插序列；內含子或其部分)的至少一個內部(即不在該部分的末端)缺失的基因組免疫球蛋白基因座的一部分的微基因座。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方案中，用于產(chǎn)生人EGFR抗體的包含至少一個，一般2-10個，有時25-50或更多拷貝的WO98/24884實施例12所描述的轉基因(如pHC1或pHC2)的轉基因動物與含有WO98/24884實施例5，6，8或14所描述輕鏈轉基因的一個拷貝的轉基因動物雜交，其后代與WO98/24884實施例10所描述的JH缺失動物雜交，在此特意引入其內容作為參考。對于這三種性狀的每一種，動物都雜交到純合型。這些動物有如下基因型單拷貝(每單套染色體)的人重鏈未重排微基因座(在WO98/24884實施例12中有描述)，單拷貝(每單套染色體)的重排人K輕鏈構建體(在WO98/24884實施例14中有描述)，以及在每個內源性小鼠重鏈基因座去掉所有功能性JH片段的一個缺失(在WO98/24884實施例10中有描述)。這種動物與對于JH片段缺失為純合型的小鼠(WO98/24884實施例10)雜交，產(chǎn)生對JH缺失為雜合子(WO98/24884實施例10)且對人重鏈和輕鏈構建體為半合子的后代。給得到的動物注射抗原并用來產(chǎn)生抗這些抗原的人單克隆抗體。從這種動物分離的B細胞對于人重鏈和輕鏈是單特異性的，因為它們只包含每個基因的一個拷貝。此外，它們對于人或小鼠重鏈將是單特異性的，因為內源性小鼠重鏈基因拷貝由于WO98/24884實施例9和12介紹的跨JH缺失而都是非功能性的。此外，B細胞的絕大部分對于人或鼠輕鏈是單特異性的，因為單拷貝重排人κ輕鏈基因的表達將在絕大部分B細胞中等位和同種型排斥內源性小鼠κ和λ鏈基因的重排。優(yōu)選實施方案的轉基因小鼠的很大組成部分將產(chǎn)生免疫球蛋白，理想的是基本與天然小鼠相同。這樣，例如在內源性Ig基因被滅活的實施方案中，總免疫球蛋白水平將為約0.1到10mg/ml血清，優(yōu)選0.5到5mg/ml，最理想至少為1.0mg/ml左右。當一個可以實現(xiàn)將IgM轉換到IgG的轉基因被引入轉基因小鼠時，成年小鼠血清IgG與IgM的比例優(yōu)選為約10∶1。IgG與IgM的比例在未成熟小鼠中將低得多?？偟恼f來，大于約10％，優(yōu)選40-80％的脾和淋巴結B細胞專門表達人IgG蛋白。全部組成理想近似于非轉基因小鼠，通常至少10％，優(yōu)選25％到50％或更多。一般說來，至少將產(chǎn)生約1000個不同的免疫球蛋白(理想為IgG)，優(yōu)選104到106或更多，將主要由引入小鼠基因組不同V，J和D的區(qū)的數(shù)量決定。這些免疫球蛋白一般將識別約一半或更多高抗原性的蛋白，如葡萄球菌蛋白A。一般，免疫球蛋白將顯示對預選抗原至少約107M-1，優(yōu)選至少約109M-1，更優(yōu)至少1010M-1，1011M-1，1012M-1或更高，如最高到1013M-1或更高的親和性。在一些實施方案中，可能優(yōu)選產(chǎn)生有預定所有組成成分的小鼠來限制在對存在于預定抗原類型的抗體應答中的V基因選擇。有預定所有組成成分的重鏈轉基因可以包含例如在人預定抗原類型的抗體應答中優(yōu)選使用的人VH基因。另外，一些VH可能由于各種原因從定義的所有組成成分中被排除(如，不太可能編碼對預定抗原的高親和性V區(qū)；進行體細胞突變和親和性銳減(affinitysharpening)的傾向性??；或對特定人群是免疫原性的)。這樣，在包含各種重鏈或輕鏈基因片段的轉基因重排之前，這些基因片段可以通過如雜交或DNA測序被輕易識別為是從轉基因動物以外的生物中得到。本發(fā)明的轉基因小鼠可以按前面所描述的用EGFR抗原的富集或純化制劑和/或表達EGFR的細胞免疫。此小鼠將產(chǎn)生通過轉基因內轉換重組(順式轉換)進行類型轉換并表達與EGFR反應的免疫球蛋白的B細胞。這些免疫球蛋白可以是人序列抗體，其中重鏈和輕鏈多肽由可能包括體來源于細胞突變和V區(qū)重組連接的序列和種系編碼序列的人轉基因序列編碼；盡管由于體細胞突變和不同V-J和V-D-J重組結合可能出現(xiàn)其它非種系序列，這些人序列免疫球蛋白可以稱作與由人VL或VH基因片段和人JL或JH片段編碼的多肽序列基本等同。對于這樣的人序列抗體，每條鏈的可變區(qū)一般至少80％由人種系V，L，在重鏈中為D基因片段編碼；通常至少85％的可變區(qū)由轉基因中存在的人種系序列編碼；經(jīng)常90％或95％或更多的可變區(qū)由轉基因中存在的人種系序列編碼。然而，由于非種系序列由體細胞突變和VJ和VDJ連接而引入，人序列抗體將經(jīng)常有一些不像在小鼠種系中的人轉基因那樣由人V，D，或J基因片段編碼的可變區(qū)序列(恒定區(qū)序列少一些)。典型說來，這些非種系序列(或各個核苷酸位點)將在CDR或其附近，或在已知體細胞突變簇集的區(qū)域簇集。與預定抗原結合的人序列抗體可以從同種型轉換得到，這樣就產(chǎn)生了包含一個人序列γ鏈(如γ1，γ2a，γ2B，或γ3)和一個人序列輕鏈(如K)的人抗體。作為親和突變和抗原選擇B細胞的結果特別是作為第二(或在后)抗原攻擊的結果，這種同種型轉換的人序列抗體通常包含一個或多個體細胞突變，一般是在可變區(qū)存在并經(jīng)常在CDR的約10個殘基內。這些高親和性人序列抗體可以有至少約1×109M-1，一般最少5×109M-1，優(yōu)選高于1×1010M-1，并且有時5×1010M-1到1×1011M-1或更高的結合親和性。本發(fā)明的另一方面涉及從這些小鼠中得到的B細胞，它們可以用來產(chǎn)生表達以高親和性(如大于2×109M-1)與EGFR結合的人單克隆抗體。這樣，在本發(fā)明的另一種實施方案中，這些雜交瘤被用來產(chǎn)生包含一個對結合EGFR的親和常數(shù)(KA)至少為2×109M-1的免疫球蛋白的組合物，其中的上述免疫球蛋白包含一個由如下成分組成的人序列輕鏈(1)有一個與由人VL基因片段和一個人JL基因片段編碼的多肽序列基本同一的多肽序列的輕鏈可變區(qū)，及(2)有一個與由人CL基因片段編碼的多肽序列基本同一的多肽序列的輕鏈恒定區(qū)；及一個由如下成分組成的人序列重鏈(1)有一個與由人VH基因片段，任選D區(qū)和一個人JH基因片段編碼的多肽序列基本同一的多肽序列的重鏈可變區(qū)，及(2)有一個與由人CH基因片段編碼的多肽序列基本同一的多肽序列的重鏈恒定區(qū)。對EGFR高親和性的人單克隆抗體的產(chǎn)生可以用一種在具有一個包含整合人免疫球蛋白轉基因的基因組的轉基因小鼠中擴增人可變區(qū)基因片段所有所有組成成分的方法來促進，上述方法包括將一個包含在上述整合人免疫球蛋白轉基因中不存在的V區(qū)基因片段的V基因轉基因引入基因組。通常，V區(qū)轉基因是一個包含人VH或VL(VK)基因片段陣列的一部分的酵母人工染色體，可能在人基因組中天然存在或可能用重組方法分別剪接在一起，可能包括無序或省略V基因片段。通常YAC包括至少5個或更多功能性V基因片段。在這種變異中，可以產(chǎn)生用V所有組成成分擴增方法產(chǎn)生的轉基因小鼠，其中此小鼠表達包含一個由在V區(qū)轉基因存在的V區(qū)基因片段編碼的可變區(qū)序列和在人Ig轉基因上編碼的C區(qū)的免疫球蛋白鏈。通過V所有組成成分擴增方法，可以產(chǎn)生至少有5個不同V轉基因小鼠；可以產(chǎn)生包含至少24個或更多V基因的小鼠。一些V基因片段可以是非功能性的(如偽基因等)；這些片段可以保留或如果需要，可以由熟練的技術人員用重組方法去除。當小鼠種系被工程化為含有一個具有擴增V片段所有組成成分，基本上在包含J和C基因片段的人Ig轉基因中不存在的功能性YAC時，這種性狀可以被增殖并雜交到其它遺傳背景，包括有一個擴增的V片段所有組成成分的功能性YAC雜交到有不同人Ig轉基因的小鼠種系所在的背景。有一個擴增V片段所有組成成分的多功能性YAC可以雜交到一個種系而與一種人Ig轉基因(或多種人Ig轉基因)一起作用。盡管這里稱作YAC轉基因，這些轉基因在整合到基因組時可能基本缺乏酵母序列，如酵母中自主復制必需的序列；這些序列可以在酵母中復制后而不再必要時(即在引入小鼠ES細胞或小鼠前受精卵)由基因工程選擇性地去除(如限制性消化和脈沖電場凝膠電泳或其它適當方法)。增殖人序列免疫球蛋白表達特性的方法，包括雜交具有人Ig轉基因，也可任選具有含有擴增V片段所有組成成分的功能性YAC的轉基因小鼠。VH和VL基因片段都可在YAC上存在。轉基因小鼠可以雜交到實施者希望的任何背景，包括攜帶其它人轉基因，包括人Ig轉基因和/或編碼其它人淋巴細胞蛋白的轉基因的背景。本發(fā)明也提供了由具有擴增的V區(qū)所有組成成分的YAC轉基因的轉基因小鼠產(chǎn)生的高親和性人序列免疫球蛋白。盡管前面描述了本發(fā)明轉基因動物的優(yōu)選實施方案，但本發(fā)明也考慮了其它實施方案，可以分為4類I.包含一個未重排重鏈和重排輕鏈免疫球蛋白轉基因的轉基因動物；II.包含一個未重排重鏈和未重排輕鏈免疫球蛋白轉基因的轉基因動物；III.包含一個重排重鏈和未重排輕鏈免疫球蛋白轉基因的轉基因動物；IV.包含一個重排重鏈和重排輕鏈免疫球蛋白轉基因的轉基因動物；在這些轉基因動物分類中，優(yōu)選的優(yōu)先順序為II＞I＞III＞IV，其中內源性輕鏈基因(或至少K基因)通過同源重組(或其它方法)被剔除，以及I＞II＞III＞IV，其中內源性輕鏈基因沒有被剔除并且必需由等位排斥顯性化。III.與EGFR結合的雙/多特異性分子而在本發(fā)明的另一種實施方案中，人EGFR單克隆抗體或其抗原結合部分可以被衍生或連接到另一個功能性分子如另一種肽或蛋白(如Fab′片段)，產(chǎn)生與多個結合位點或靶表位結合的雙特異性或多特異性分子。例如，本發(fā)明的抗體或抗原結合部分可以與一種或多種其它結合分子，如另一種抗體、抗體片段、肽或結合模擬物功能性連接(例如通過化學偶聯(lián)，基因融合，非共價締合或其它方式)。因此，本發(fā)明包括含有至少一個對EGFR的第一結合特異性和一個對第二個靶表位有第二結合特異性的雙特異性和多特異性分子。在本發(fā)明的一種特定實施方案中，第二靶表位是Fc受體，如人FcδRI(CD64)或Fcα受體(CD89)。所以，本發(fā)明包括與表達FcγR，F(xiàn)cαR或FcεR的效應細胞(如單核細胞、巨噬細胞或多形核細胞(PMNs))和表達EGFR的靶細胞都可以結合的雙特異性和多特異性分子。這種雙特異性和多特異性分子將表達EGFR的細胞導向到效應細胞，并且如同本發(fā)明的人單克隆抗體，激發(fā)Fc受體介導的效應細胞活性，如吞噬表達EGFR的細胞，抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用(ADCC)，細胞因子釋放或產(chǎn)生超氧陰離子。除了抗Fc結合特異性和抗EGFR結合特異性，本發(fā)明的雙和多特異性分子可以進一步包括第三結合特異性。在一種實施方案中，第三結合特異性是抗體增強因子(EF)部分，如與參與細胞毒活性的表面蛋白相結合，并因此增加對靶細胞的免疫應答的分子?！翱乖鰪娨蜃硬糠帧笨梢钥贵w(包括ScFv)，功能性抗體片段或與某種分子如抗原或受體結合的配體，結果是增強了Fc受體或靶細胞抗原的結合決定簇的作用?！翱乖鰪娨蜃硬糠帧笨梢耘cFc受體或靶細胞抗原結合。另外，抗增強因子部分結合的實體可以不同于第一和第二結合特異性所結合的實體。例如，抗增強因子部分可以與細胞毒T細胞(如通過CD2，CD3，CD8，CD28，CD4，CD40，ICAM-1或其它對靶細胞產(chǎn)生增強的免疫應答的免疫細胞)結合。在一種實施方案中，本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子至少包含一個抗體，或一個其抗體片段，包括如Fab，F(xiàn)ab′，F(xiàn)(ab′)2FV或單鏈FV的結合特異性。此抗體也可以是輕鏈或重鏈二聚體，或任何其微型片段如Fv或如Ladner等在1990年8月7日授權的美國專利4,946,778中描述的單鏈結構，特意引入其內容作為參考。在一種實施方案中，本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子包含對效應細胞表面存在的FcγR或FcαR的結合特異性的人單克隆抗體，以及對靶細胞抗原，如EGFR的第二結合特異性。在一種實施方案中，對Fc受體的結合特異性是由人單克隆抗體提供的，其結合不由人免疫球蛋白(IgG)阻斷。這里用到的術語“IgG受體”是指染色體1上8個γ鏈基因的任何一個。這些基因編碼被分為三種Fcγ受體類型FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CDl6)的總共12個跨膜或可溶受體同種型。在一種優(yōu)選實施方案中，F(xiàn)cγ受體是一個人高親和性FcγRI。人FcγRI是一個72kD的分子，它表現(xiàn)對單體IgG的高親和性(108-109M-1)。這些優(yōu)選單克隆抗體的產(chǎn)生和鑒定由Fanger等在PCT申請WO88/00052和在美國專利4,954,617中有描述，其教導在這里引用作為參考。這些抗體在受體Fcγ結合位點以外的位點與FcγRI、FcγRII和FcγRIII結合。這樣，它們的結合基本不被生理水平的IgG阻斷。本發(fā)明中有用的特異性抗FcγRI抗體為MAb22，MAb32，MAb44，MAb62和MAb197。產(chǎn)生MAb32的雜交瘤可以從美國典型培養(yǎng)物保藏中心，ATCC，保藏號HB9469得到?？笷cγRIMAb22，MAb22的F(ab′)2片段可以從米德列斯公司(Annandale，N.J.)獲得。在其它實施方案中，抗Fcγ受體抗體是單克隆抗體22(H22)的人源化形式。H22抗體的產(chǎn)生和鑒定在Graziano，R.F.etal.(1995)J.Immunol155(10)4996-5002和PCT/US93/10384中有描述。產(chǎn)生H22抗體的細胞系于1992年11月4日，以HA022CL1的名稱保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CRL11177。在其它優(yōu)選實施方案中，對Fc受體的結合特異性由與人IgA受體如Fcα受體(FcαR(CD89))結合的抗體提供，其結合優(yōu)選不被人免疫球蛋白A(IgA)阻斷。術語“IgA”意欲包括染色體19上一個α基因(FcαRI)的基因產(chǎn)物。已知該基因編碼一些55到110Kda的可變剪接的跨膜同種型。FcαRI(CD89)在單核細胞/巨噬細胞，嗜酸性粒細胞和中性粒細胞上進行組成型表達，但不在非效應細胞群上表達。FcαRI對IgA1和IgA2都有中等的親和性(≈5×107M-1)，當暴露于細胞因子如G-CSF或GM-CSF時會增加(Morton，H.C.etal.(1996)CriticalReviewsinImmunology16423-440)。對識別為A3，A59，A62和A77，與FcαRI在IgA配體結合域以外結合的四種FcαRI已經(jīng)有了描述(Monteiro，R.C.etal.，1992，J.Immunol.1481764)。這里也描述了一個稱作14.1的對抗FcαRI的完全人單克隆抗體。FcαRI和FcγRI是用于本發(fā)明的優(yōu)選觸發(fā)受體，因為它們(1)主要在免疫效應細胞，如單核細胞、PMNs、巨噬細胞和樹突細胞上表達；(2)以高水平(如每細胞5,000-100,000)表達；(3)細胞毒活性的介導物(如ADCC，細胞吞噬)(4)介導增強的抗原呈遞，包括導向于它們的自身抗原。在其它實施方案中，本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子進一步包含識別，例如，結合于靶細胞抗原，如EGFR的結合特異性。在一種優(yōu)選實施方案中，通過本發(fā)明的人單克隆抗體提供結合特異性。這里用到的“效應細胞特異性抗體”是指與效應細胞Fc受體結合的抗體或功能性片段。在本發(fā)明中使用的優(yōu)選抗體與效應細胞Fc受體在內源性免疫球蛋白不結合的位點結合。這里用到的術語“效應細胞”是指參與與免疫應答識別和激活階段相對的免疫應答效應階段的免疫細胞?？梢宰鳛榉独拿庖呒毎ü撬韬土馨蛠碓吹募毎?，如淋巴細胞(如B細胞和包括細胞溶解T細胞(CTL)的T細胞)，殺傷細胞、天然殺傷細胞、巨噬細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、多形核細胞、粒細胞、肥大細胞和嗜堿性粒細胞。一些效應細胞表達特異性Fc受體并執(zhí)行特異性免疫功能。在一種優(yōu)選實施方案中，效應細胞可以誘導抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用(ADCC)，如可以誘導ADCC的中性粒細胞。例如，表達FcR的單核細胞和巨噬細胞參與靶細胞的特異性殺滅及向免疫系統(tǒng)的其它成分呈遞抗原，或與抗原呈遞細胞結合。在另一種實施方案中，效應細胞可以吞噬靶抗原、靶細胞或微生物。效應細胞上特定FcR的表達可以由體液因子如細胞因子調節(jié)。例如，F(xiàn)cγR的表達由γ干擾素(IFN-γ)上調。這種增強的表達增加了攜帶FcγRI的細胞對靶的細胞殺滅活性。效應細胞可以吞噬或裂解靶抗原或靶細胞?！鞍屑毎睉摫硎究梢员槐景l(fā)明的一種組合物(如人單克隆抗體，雙特異性或多特異性分子)導向的受試者(如人或動物)不需要的任何細胞。在一種優(yōu)選實施方案中，靶細胞為表達，優(yōu)選過量表達EGFR的細胞。表達EGFR的細胞一般包括腫瘤細胞，如膀胱、乳腺、結腸、腎、卵巢、前列腺、腎細胞、鱗狀細胞、肺(非小細胞)以及頭和頸腫瘤細胞。其它表達EGFR的細胞包括分別可以在關節(jié)炎和牛皮癬的治療中作為靶的滑膜成纖維細胞和角質形成細胞。盡管優(yōu)選人單克隆抗體，其它可以用于本發(fā)明的雙特異性或多特異性分子的抗體為鼠科的、嵌合的和人源化單克隆抗體。嵌合的小鼠-人單克隆抗體(即嵌合抗體)可以由本領域中已知的重組DNA技術產(chǎn)生。例如，用限制性酶消化編碼鼠(或其它物種)單克隆抗體分子Fc恒定區(qū)的基因，去掉編碼鼠Fc的區(qū)域，用編碼人Fc恒定區(qū)基因的相當部分替代。(見Robinsonetal，國際專利公開PCT/US86/02269；Akira，etal.，歐洲專利申請184,187；Taniguchi，M.，歐洲專利申請171,496；Morrisonetal.，歐洲專利申請173,494；Neubergeretal.，國際專利申請WO86/01533；Cabillyetal.美國專利.4,816,567；Cabillyetal.歐洲專利申請125,023；Betteretal.(1988Science2401041-1043)；Liuetal.(1987)PNAS843439-3443；Liuetal.，1987，J.Immunol.139；3521-3526；Sunetal.(1987)PNAS84214-218；Nishimuraetal.，1987，Canc.Res.47999-1005；Woodetal.(1985)Nature314446-449；和Shawetal.，1988，J.NatlCancerInst.801553-1559)?？梢酝ㄟ^用人Fv可變區(qū)的相當序列替代不直接參與抗原結合的Fc可變區(qū)序列使嵌合抗體進一步人源化。對人源化嵌合抗體的一般綜述可以見Morrison，S.L.，1985，Science2291202-1207以及Oietal.，1986，BioTechniques4214。這些方法包括從至少一條重鏈或輕鏈分離、操作和表達編碼所有或部分免疫球蛋白Fv可變區(qū)的核酸序列。這種核酸的來源在本領域的技術人員中是眾所周知的，例如，可以從產(chǎn)生抗GPIIbIIIa抗體7E3的雜交瘤獲得。編碼嵌合抗體或其片段的重組DNA然后可以被克隆到適當?shù)谋磉_載體。適當?shù)娜嗽椿贵w也可以用CDR替代而產(chǎn)生，見美國專利5,225,539；Jonesetal.1986Nature321552-525；Verhoeyanetal.1988Science2391534；和Beidleretal.1988J.Immunol.1414053-4060。特定人抗體的所有CDR都可以用至少一部分非人CDR替代或只有一些CDRs可以用非人CDR替代。只需要替代將人源化抗體結合到Fc受體所需要數(shù)目的CDRs。可以用非人抗體來源的CDR替代至少一部分人抗體CDR的方法對抗體進行人源化。Winter描述了一種用來制備本發(fā)明的人源化抗體的方法(英國專利申請GB2188638A，1987年3月26日提交)，在此特意引入其內容作為參考?？梢园搭}目為HumanizedAntibodiestoFcReceptorsforImmunoglobulinGonHumanMononuclearPhagocytes的國際申請WO94/10332所描述的，通過寡核苷酸定向位點誘變用非人CDRs替代人CDR。特定氨基酸被取代、去除或添加的嵌合人源化抗體也屬于本發(fā)明的范圍。特別是優(yōu)選人源化抗體在構架區(qū)有氨基酸取代，因而改善與抗原的結合。例如，在有小鼠CDRs的人源化抗體中，人構架區(qū)的氨基酸序列可以被位于小鼠抗體相應位置的氨基酸取代。已知這種取代可以在某種場合改善人源化抗體與抗原的結合。有氨基酸序列添加、去除或取代的抗體在這里稱作修飾的抗體或改變的抗體。術語修飾的抗體意欲包括這些抗體，如通過如去除、增加或取代抗體的一些部分而修飾的單克隆抗體、嵌合抗體和人源化抗體。例如，抗體可以通過去除恒定區(qū)并用準備增加抗體半衰期如血清半衰期、穩(wěn)定性或親和性的恒定區(qū)替代來修飾。只要雙特異性和多特異性分子有至少一個對FcγR特異的抗原結合區(qū)并觸發(fā)至少一種效應功能，那么任何修飾都在本發(fā)明的范圍內。本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子可以用化學技術(如見D.M.Kranzetal.(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA785807)，“polydoma”技術(見Reading的美國專利4,474,893)或重組DNA技術產(chǎn)生。特別是，可以用這里提供的實施例所描述的本領域中公知的方法偶聯(lián)作為組分的結合特異性，如抗FcR和抗EGFR結合特異性來制備本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子。例如，雙特異性和多特異性分子的每種結合特異性可以分別產(chǎn)生然后彼此偶聯(lián)。當結合特異性為蛋白或多肽時，可以用各種偶聯(lián)或交聯(lián)試劑進行共價偶聯(lián)。交聯(lián)試劑的例子包括蛋白A、碳二亞胺、N-琥珀酰亞氨基-S-乙酰-硫代乙酸酯(SATA)、5，5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、o-phenylenedimaleimide(oPDM)、N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)，及磺基琥珀酰亞基4-(N-馬來酰亞氨基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(sulfo-SMCC)(見例如，Karpovskyetal.(1984)J.Exp.Med.1601686；Liu，MAetal.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA828648)。其它方法包括由Paulus(BehringIns.Mitt.(1985)No.78，118-132)；Brennan等(science(1985)22981-83)，和Glennie等(J.Immunol.(1987)1392367-2375)所描述的方法。優(yōu)選的偶聯(lián)試劑為SATA和sulfo-SMCC，都可以從Pierce化學公司(Rockford，IL)獲得。當結合特異性為抗體(如兩個人源化抗體)時，它們可以用兩條重鏈C端鉸鏈區(qū)的巰基鍵連接。在一種特定優(yōu)選實施方案中，鉸鏈區(qū)被修飾為在偶聯(lián)前包含奇數(shù)個，優(yōu)選為一個巰基。另外，兩種結合特異性都可以在同一載體中編碼并在相同宿主中表達和裝配。當雙特異性和多特異性分子為MAb×MAb，MAb×Fab，F(xiàn)ab×F(ab′)2或配體×Fab融合蛋白時，此方法特別有用。本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子，如雙特異性分子，可以是單鏈分子，如單鏈雙特異性抗體，包含一個單鏈抗體和一個結合決定簇的單鏈雙特異性分子，或包含兩個結合決定簇的單鏈雙特異性分子。雙特異性和多特異性分子也可以是單鏈分子或可以包含至少兩個單鏈分子。制備雙和多特異性分子的方法在以下文獻中舉例描述，美國專利5,260,203；美國專利5,455,030；美國專利4,881,175；美國專利5,132,405；美國專利5,091,513；美國專利5,476,786；美國專利5,013,653；美國專利5,258,498；美國專利5,482,858。雙特異性和多特異性分子與它們的特異性靶相結合可以用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，放射免疫測定(RIA)，F(xiàn)ACS分析，生物測定(如生長抑制)或蛋白印跡測定來證實。每種測定方法一般都通過使用待測定復合物特異的標記試劑(如抗體)來檢測待測定蛋白-抗體復合物的存在。例如，F(xiàn)cR-抗體復合物可以用如識別并特異性與抗體-FcR復合物結合的酶連接的抗體或抗體片段來檢測。另外，可以用其它免疫測定的中的任何一種來檢測。例如，可以將抗體放射性標記并用于放射免疫測定(RIA)(例如，見Weintraub，B.，PrinciplesofRadioimmunoassays，SeventhTrainingCourseonRadioligandAssayTechniques，TheEndocrineSociety，March，1986，在此引入作為參考)。具有放射活性的同種型可以用如使用γ計數(shù)器或閃爍計數(shù)器或放射自顯影的方法檢測。IV.抗體偶聯(lián)物/免疫毒素另一方面，本發(fā)明的特征在于與治療部分，如細胞毒素、藥物或放射性同位素偶聯(lián)的人抗EGFR單克隆抗體或其片段。當與細胞毒素偶聯(lián)時，這些偶聯(lián)抗體就叫做“免疫毒素”。細胞毒素或細胞毒試劑包括任何對細胞有害(如殺滅細胞)的試劑，其例子包括紫杉醇、松胞菌素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、吐根堿、絲裂霉素、表鬼臼毒吡喃葡糖苷、表鬼臼毒噻吩葡糖苷、長春新堿、長春花堿、秋水仙堿、阿霉素、北豆根堿、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放線菌素D、1-脫氫表雄酮、糖皮質激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、心得安、嘌呤霉素及其類似物或同源物。治療試劑包括，但不局限于抗代謝物(如氨甲喋呤、6-巰基嘌呤、6-巰基鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟鳥嘧啶)，烷化劑(如二氯甲基二乙胺、thioepachlorambucil、美法倫、亞硝基脲氮芥(BSNU)和羅氮芥(CCNU)、cyclothosphamide、白消安、二溴甘露醇、鏈脲霉素、絲裂霉素C和順二氯二胺鉑(II)((DDP)順鉑)、anthracycline(如道諾紅霉素(以前稱作道諾霉素)和亞德里亞霉素)，抗生素(如放線菌素(以前稱作放射霉素)、博來霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC)，以及抗有絲分裂劑(如長春新堿、長春花堿)。本發(fā)明的抗體可以與放射性同位素如放射性碘偶聯(lián)，產(chǎn)生治療EGFR相關疾病的細胞毒放射性藥物。本發(fā)明的抗體偶聯(lián)物可以用來修飾某種生物反應，藥物部分并不限于經(jīng)典化療劑的范圍。例如，藥物部分可以是一種具有所需要生物活性的蛋白或多肽。這種蛋白可以包含如酶活性毒素或其活性片段，如紅豆因、蓖麻毒蛋白A、假單胞菌素、或白喉毒素；蛋白如腫瘤壞死因子或γ干擾素；或生物反應調節(jié)劑如，淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)，白介素-2(“IL-2”)，白介素-6(“IL-6”)，粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(“GM-CSF”)，粒細胞集落刺激因子(“G-CSF”)，或其它生長因子。將這種治療部分與抗體結合的技術非常熟悉，見，如Arnonetal.，“MonoclonalAntibodiesForImmunotargetingOfDrugsInCancerTherapy”，InMonoclonalAntibodiesAndCancerTherapy，Reisfeldetal.(eds.)，pp.243-56(AlanR.Liss，Inc.1985)；Hellstrometal.，″AntibodiesForDrugDelivery″，inControlledDrugDelivery(2ndEd.)，Robinsonetal.(eds.)，pp.623-53(MarcelDekker，Inc.1987)；Thorpe，″AntibodyCarriersOfCytotoxicAgentsInCancerTherapyAReview″，inMonoclonalAntibodies′84BiologicalAndClinicalApplications，Pincheraetal.(eds.)，pp.475-506(1985)；″Analysis，Results，AndFutureProspectiveOfTheTherapeuticUseOfRadiolabeledAntibodyInCancerTherapy″，inMonoclonalAntibodiesForCancerDetectionAndTherapy，Baldwinetal.(eds.)，pp.303-16(AcademicPress1985)，andThorpeetal.，″ThepreparationAndCytotoxicPropertiesOfAntibody-ToxinConjugates″，Immunol.Rev.，62119-58(1982)。V.藥物組合物另一方面，本發(fā)明提供了一種組合物，如藥物組合物，它包含一個或幾個本發(fā)明的人單克隆抗體或其抗原結合部分的組合，與可藥用的載體一起配制。在一種優(yōu)選實施方案中，此組合物包括多個(如兩個或以上)本發(fā)明的分離人抗體或其抗原結合部分的組合。優(yōu)選地，組合物的每個抗體或其抗原結合部分與獨特的、預選的EGFR表位相結合。在一種實施方案中，有補體活性的人抗EGFR單克隆抗體被組合應用，如作為包含兩個或更多人抗EGFR單克隆抗體的藥物組合物。例如，介導效應細胞存在時高效殺滅靶細胞的人單克隆抗體可以與另一種抑制表達EGFR的細胞生長的人單克隆抗體組合。在另一種實施方案中，此組合物包含一個或多個本發(fā)明的雙特異性或多特異性分子的組合(例如，包含至少一個對Fc受體的結合特異性和至少一個對EGFR的結合特異性)。本發(fā)明的藥物組合物也可用于聯(lián)合治療，即與其它試劑結合聯(lián)合。例如，聯(lián)合治療可以包括本發(fā)明的組合物和至少一種抗腫瘤試劑或其它傳統(tǒng)治療方法。這里用到的“可藥用載體”包括任何和所有生理相容的溶劑、分散劑、包衣、抗細菌和抗真菌試劑、等滲的和吸收延緩試劑等。優(yōu)選地，這種載體適合靜脈內、肌肉內、皮下、腸胃外、脊髓或表皮使用(如通過注射或滴注)。取決于給藥途徑，活性化合物，即抗體、雙特異性和多特異性分子可以用一種物質包被，使化合物不受酸和其它可能滅活此混合物的自然條件的影響。“可藥用鹽”是指保持母體化合物需要的生物活性并且不帶來任何不需要的毒性作用的鹽(見，例如Berge，S.M.，etal.(1977)J.Pharm.Sci.661-19)。這些鹽的例子包括酸加成鹽和堿加成鹽。酸加成鹽包括那些從如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、磷等無毒無機酸以及如脂肪酸單和二羧酸、苯取代烷酸、羥基烷酸、芳香酸、脂肪酸和芳香磺酸等無毒有機酸衍生的鹽。堿加成鹽包括從如鈉、鉀、鎂、鈣等堿金屬和N，N’-聯(lián)苯二亞胺、N-甲基葡糖胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因等無毒有機胺衍生的鹽。本發(fā)明的組合物可以通過許多本領域中公知的方法給藥。正如熟練的技術人員所鑒定的，給藥途徑和/或方式將由希望結果的不同而改變?；钚曰衔锟梢杂帽Ｗo化合物避免迅速釋放的載體制備，如包括植入物、經(jīng)皮貼劑、和微膠囊運送系統(tǒng)的控釋配方?？梢允褂萌缫蚁┮宜嵋蚁ァ⒕埕?、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯、和聚乳酸等生物可降解的和生物相容的多聚體。制備這種制劑的許多方法被授予專利并且在本領域的技術人員中是公知的。見如SustainedandControlledReleaseDrugDeliverySystems，J.R.Robinson，ed.，MarcelDekker，Inc.，NewYork，1978。為通過某種給藥途徑而給予本發(fā)明的化合物，必須將其包被于防止其被滅活的物質中或與這種物質共同給藥。例如，這種化合物可以用適當?shù)妮d體例如脂質體或稀釋劑而給予受試者。可藥用的稀釋劑包括鹽和水緩沖液包括水包油包水CGF乳狀液以及傳統(tǒng)脂質體(Strejanetal.(1984)J.Neuroimmunol.727)?？伤幱幂d體包括為臨時制備無菌注射液或分散劑所用的無菌水溶液或分散液和無菌粉末。這些針對藥用活性物質的媒介和試劑的使用在本領域中是公知的。除了與活性化合物不相容的傳統(tǒng)介質或試劑外，考慮了將其使用在本發(fā)明的藥物組合物中。此組合物中也可摻入補充的活性化合物。治療組合物在生產(chǎn)和儲存條件下一般必需是無菌和穩(wěn)定的。此組合物可以配制為溶液、微乳狀液、脂質體或其它適合高藥物濃度的有序結構。載體可以是包括如水、乙醇、多羥基化合物(例如，甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)，及其適當?shù)幕旌衔锏娜軇┗蚍稚⒔橘|?？梢酝ㄟ^例如使用包膜如卵磷脂、在分散時保持要求的顆粒大小及使用表面活性劑來保持適當?shù)囊簯B(tài)。在許多情況下，優(yōu)選在組合物中包括等滲劑如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化鈉。可以通過在組合物中加入延緩吸收的試劑如一硬脂酸鹽和明膠來延長注射組合物的吸收。無菌注射液可以通過在適當溶劑中加入要求的劑量的活性化合物和上面列舉的一種或幾種成分的組合，并按要求進行滅菌微量過濾。一般說來，分散劑通過將活性化合物加入一種包含上面所列舉的基本分散介質和要求的其它成分的無菌載體。對于制備無菌注射液的無菌粉末，優(yōu)選制備方法為真空干燥和冷凍干燥(低壓凍干)，產(chǎn)生活性成分粉末，再加上從前面無菌過濾的溶液得到的其它需要成分。調整劑量方案來提供最優(yōu)的需要反應(如治療反應)。例如，可以給予單個丸劑，可以隨時間給予一些分開的劑量，或由治療狀況的緊急程度按比例減少或增加劑量。為給藥方便和劑量統(tǒng)一，以劑量單位的形式配制腸胃外組合物非常有好處。這里用到的劑量單位形式是指作為受治療受試者的單位劑量的生理區(qū)分的單位；每個單位包含預定量的活性化合物，經(jīng)計算可以與要求的藥物載體協(xié)同作用，產(chǎn)生需要的治療效果。本發(fā)明劑量單位形式的規(guī)格由以下內容指定并直接依賴于(a)活性化合物的獨特特征和需要達到的特定療效及(b)本領域中固有的限制如治療所用化合物個體敏感性的限制?？伤幱每寡趸瘎┑睦影?1)水溶性抗氧化劑，如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、硫酸鈉等；(2)脂溶性抗氧化劑，如棕櫚酸抗壞血酸酯、丁基化羥基苯甲醚(BHA)，丁基化羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α生育酚等及(3)金屬螯合劑，如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。對于治療組合物，本發(fā)明包括適于口服、鼻腔、局部(包括頰和舌下)、直腸、陰道和/或腸胃外給藥的配方。這些配方可以方便地以單位劑型存在，可以用制藥領域公知的方法制備?？梢耘c載體物質組合而產(chǎn)生單劑型的活性成分的量將根據(jù)被治療者和特定給藥方式而不同?？梢耘c載體物質組合產(chǎn)生單劑型的活性成分的量將為產(chǎn)生療效的組合物的量。一般說來，以百分數(shù)計算，該量將為活性成分的約0.01-99％，優(yōu)選約0.1-70％左右，更優(yōu)選約1-30％。本發(fā)明適于陰道給藥的制劑也包括含有本領域中公知的適當載體的陰道栓、填塞物、油膏、凝膠、糊劑、泡沫或噴霧制劑。局部或經(jīng)皮給予本發(fā)明的組合物的劑型包括粉末、噴霧、軟膏、糊劑、油膏、洗液、凝膠、溶液、貼劑和吸入劑。活性化合物可以在無菌條件下與可藥用載體，以及可能要求的任何防腐劑、緩沖液或推進劑混和。這里用到的短語“腸胃外給藥”和“給藥于腸胃外”表示腸道和局部給藥以外的給藥方式，通常是注射、并包括但不限于靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、真皮內、腹膜內、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關節(jié)內、被膜下、蛛網(wǎng)膜下、脊髓內、硬膜外和胸骨內射輸注。在本發(fā)明的藥物組合物中使用的適合水或非水載體包括水、乙醇、多羥基化合物(例如，甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)，及其適當?shù)幕旌衔?、植物油，如橄欖油、及可注射有機酯，如亞油酸?？梢酝ㄟ^例如使用包被物如卵磷脂、在分散時保持要求的顆粒大小及使用表面活性劑來保持適當?shù)囊簯B(tài)。這些組合物也可以包含佐劑，如防腐劑、濕潤劑、乳化劑和分散劑。預防微生物的出現(xiàn)可以通過滅菌程序，以及通過引入各種抗細菌和抗真菌劑如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、酚山梨酸等。也可能在組合物中需要包括等滲試劑，如糖、氯化鈉等。另外，可以通過在組合物中加入延緩吸收的試劑如一硬脂酸鋁和明膠來延長可注射藥物形式的吸收。當本發(fā)明的化合物作為藥物給予人和動物時，它們可以單獨或作為含有與可藥用載體組合的例如0.01-99.5％(更優(yōu)選0.1-90％)的活性成分的藥物組合物。忽略選擇的使用途徑，可以以適當水合形式使用的本發(fā)明的化合物，和/或本發(fā)明的藥物組合物，可以通過本領域中的公知傳統(tǒng)方法被配方為可藥用劑型。本發(fā)明的藥物組合物中的實際劑量水平可以改變，從而獲得可以達到特定病人所需的治療反應的活性成分的量、組合物和給藥方式，而對病人無毒。選定的劑量水平將取決于各種藥代動力學因素包括本發(fā)明使用的特定組合物或其酯、鹽或酰胺的活性，給藥途徑、給藥時間、所使用的特定化合物的分泌速度、療程、其它與所使用的特定組合物聯(lián)合使用的藥物、化合物和/或物質、年齡、性別、體重、狀況、治療病人的一般健康和過去史等醫(yī)學領域中熟知的因素。本領域中有常規(guī)技術的醫(yī)生或獸醫(yī)可以輕易判斷并處方需要的藥物組合物的量。例如，醫(yī)生或獸醫(yī)可以以低于獲得需要的療效要求劑量的用于藥物組合物中的本發(fā)明的化合物劑量開始，并逐漸增加劑量，直到達到需要的療效?？傊?，本發(fā)明的組合物的適當劑量是有效產(chǎn)生療效的最低劑量的化合物的量。這種有效劑量一般將取決于前面所描述的因素。優(yōu)選給藥方式為靜脈內、肌肉內、腹膜內或皮下，優(yōu)選接近靶位點給藥。如果需要，治療組合物的的有效日劑量可以選擇作為2、3、4、5、6或更多亞劑量，在一天中的適當間隔，以單位劑型分別給藥。盡管本發(fā)明的化合物可以單獨給藥，優(yōu)選將化合物作為藥物配方(組合物)使用。治療組合物可以通過本領域中的公知醫(yī)學設備給藥。例如，在一種優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的治療組合物可以用無針皮下注射設備給藥，如在美國專利5,399,163，5,383,851，5,312,335，5,064,413，4,941,880，4,790,824或4,596,556中公開的設備。本發(fā)明中有用的公知植入物和組件的例子包括美國專利4,487,603，它公開了以控制速率分散藥物的可植入微量滴注泵；美國專利4,486,194，它公開了經(jīng)皮用藥的治療設備；美國專利4,447,233，它公開了以精確滴注速度運送藥物的藥物輸注泵；美國專利4,447,224，它公開了連續(xù)運送藥物的可變流量可植入滴注泵；美國專利4,439,196，它公開了一種有多室容器的滲透性藥物運送系統(tǒng)；以及美國專利4,475,196，它公開了一種滲透性藥物運送系統(tǒng)。在此引入這些專利文獻作為參考。許多其它的這種植入物、運送系統(tǒng)和組件在本領域中的技術人員中是公知的。在某些實施方案中，本發(fā)明的人單克隆抗體可以為保證體內適當分布而配方。例如，血腦屏障(BBB)排除了許多高度親水的化合物。為保證本發(fā)明的治療化合物穿過BBB(如果需要)，它們可以在例如脂質體中配制。關于生產(chǎn)脂質體的方法，見，如美國專利4,522,811；5,374,548及5,399,331。脂質體可以包括一個或多個選擇性運送到特定細胞或器官內的部分，這樣增強了導向性藥物運送(見，如V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29685)。作為例子的導向部分包括葉酸或生物素(見，如Lowetal的美國專利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawaetal.，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.1531038)；抗體(P.G.Bloemanetal.(1995)FEBSLett.357140；M.Owaisetal.(1995)Antimicrob.AgentsChemother.39180)；表面活性蛋白A受體(Briscoeetal.(1995)Am.J.Physiol.1233134)，可以包含本發(fā)明的制劑和發(fā)明分子成分的不同種類；p120(Schreieretal.(1994)J.Biol.Chem.2699090)；也見K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBSLett.346123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods4273。在本發(fā)明的一種實施方案中，本發(fā)明的治療化合物在脂質體中配制；在一種更優(yōu)的實施方案中，脂質體包含導向部分。在一種最優(yōu)實施方案中，脂質體中的治療化合物由濃集注射運送至腫瘤或感染附近的位點。組合物必須為液體，必需在可以容易注射的范圍內。必需在生產(chǎn)和儲存條件下保持穩(wěn)定，并且必需防止微生物如細菌和真菌污染。與未治療者相比，“治療有效劑量”優(yōu)選抑制至少約20％，更優(yōu)選至少約40％，甚至更優(yōu)選至少60％，還可更優(yōu)選至少約80％的腫瘤生長?；衔镆种瓢┌Y生長的能力可以在可預測人腫瘤療效的動物模型系統(tǒng)中評估。另外，組合物的這種特征可以通過采用本領域從業(yè)者公知的測定方法檢驗化合物的抑制，如體外抑制能力而評價。治療有效劑量的治療化合物可以減小腫瘤大小，或減輕使用者的癥狀。本領域中的一種常規(guī)方法以如目標病灶大小、受試者癥狀的嚴重性和特定的組合物或選擇的給藥途徑等因素為基礎，就可以判斷這些用量。組合物必需是無菌的，并且是液態(tài)的，處于組合物可以用注射運送的范圍。除了水以外，載體可以是等滲緩沖鹽溶液，乙醇，多羥基化合物(例如，甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)，及其適當?shù)幕旌衔??？梢酝ㄟ^例如使用包被物如卵磷脂、在分散時保持要求的顆粒大小及使用表面活性劑來保持適當?shù)囊簯B(tài)。另外，可以通過在組合物中加入延緩吸收的試劑如一硬脂酸鋁和明膠使可注射組合物長期吸收。當活性化合物受到適當保護時可以口服，例如，同惰性稀釋劑或可同化的可食用載體一起口服。VI.本發(fā)明的用途和方法本發(fā)明的組合物(如人EGFR單克隆抗體及其衍生物/偶聯(lián)物)有體外和體內診斷和治療用途。例如，這些分子可以用于給予例如體外或來自體內的培養(yǎng)物中的細胞，或例如體內用于受試者，以治療、預防或診斷多種疾病。這里用到的術語“受試者”意欲包括人和非人動物。優(yōu)選的人類動物包括以EGFR表達特別是錯誤表達(如過量表達)為特征的疾病的病人。例如，本發(fā)明的方法和組合物可以用于治療有致腫瘤的疾病如以出現(xiàn)表達EGFR的腫瘤細胞，包括如膀胱、乳腺、結腸、腎、卵巢、前列腺、腎細胞、鱗狀細胞、肺(非小細胞)、以及頭和頸腫瘤細胞為特征的疾病的受試者。本發(fā)明的方法和組合物也可以用于治療其它疾病，如自身免疫疾病，癌癥，牛皮癬，或炎癥性關節(jié)炎，如類風濕性關節(jié)炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關的關節(jié)炎，或牛皮癬關節(jié)炎。本發(fā)明的術語“非人動物”包括所有脊椎動物，如哺乳和非哺乳動物，如非人靈長類動物、綿羊、狗、牛、雞、兩棲動物、爬行動物等。本發(fā)明的組合物(如人抗體、多特異性和雙特異性分子)首先可以體外進行與治療或診斷相關的結合活性的檢驗。例如，可以用下面實施例中描述的ELISA和流式細胞儀測定來檢測本發(fā)明的組合物。另外，可以測定這些分子觸發(fā)至少一種效應細胞介導的效應細胞活性，包括表達EGFR的細胞的裂解的活性。測定效應細胞介導的細胞裂解的方案在下面實施例中有描述。本發(fā)明的組合物(如人抗體、多特異性和雙特異性分子)在治療和診斷EGFR相關疾病中有額外作用。例如，可以使用人單克隆抗體、多特異性或雙特異性分子，例如在體內或體外引發(fā)一種或多種下列生物活性調理表達EGFR的細胞；介導人效應細胞存在下對表達EGFR細胞的吞噬或細胞裂解；抑制表達EGFR的細胞中EGF或TGF-α誘導的自磷酸化；抑制自分泌EGF或TGF-α誘導的表達EGFR的細胞的激活；或抑制表達EGFR的細胞生長，如以低劑量。在另一種實施方案中，本發(fā)明的人單克隆抗體不能誘導補體介導的細胞裂解，因此，在觸發(fā)補體激活的疾病，如痤瘡方面具有更少的副作用。痤瘡的主要原因是產(chǎn)生皮脂的濾泡中的角質化模式的改變。由于角質形成細胞表達EGFR，皮膚中EGFR信號傳遞過程的干擾可以改變?yōu)V泡中角質形成細胞的生長和分化，從而導致痤瘡形成。直接免疫熒光研究證明，在早期非炎性和非炎性痤瘡病變中具有經(jīng)典和替代的補體途徑的激活。在一種特定實施方案中，人抗體及其衍生物在體內應用于治療、預防或診斷多種EGFR相關疾病。EGFR相關疾病包括多種癌癥，如膀胱、乳腺、結腸、腎、卵巢、前列腺、腎細胞、鱗狀細胞、肺(非小細胞)以及頭和頸癌。其它EGFR相關疾病包括，自身免疫病、牛皮癬和炎癥性關節(jié)炎。本發(fā)明的組合物(如人抗體、多特異性和雙特異性分子)的給藥方法在本領域中是公知的。這種分子的適當劑量取決于受試者的年齡和體重以及使用的特定藥物。這種分子可以與放射性核素如131I，90Y，105Rh偶聯(lián)，見下面文獻中的描述，Goldenberg，D.M.etal.(1981)CancerRes.414354-4360，及歐洲專利0365997。本發(fā)明的組合物(如人抗體、多特異性和雙特異性分子)也可與抗感染劑偶聯(lián)。在另一種實施方案中，人抗EGFR抗體或其抗原結合片段可以與治療劑，如化療劑共同給藥，或可以與其它已知治療，如抗癌治療，如放療共同給予。所述治療劑包括，抗腫瘤劑等，所述抗腫瘤劑如阿霉素(阿得里亞霉素)、順鉑硫酸博萊霉素、卡氮芥、苯丁酸氮芥和環(huán)磷酰胺羥基脲，這些抗腫瘤劑自身僅僅在對患者為毒性或亞毒性的水平才有效。順鉑以100mg/m2劑量，每四周一次靜脈內給藥，阿霉素以60-75mg/m2劑量每21天一次靜脈內給藥。本發(fā)明的人抗EGFR抗體，或其抗原結合片段與化療劑的共同給藥提供了通過對人腫瘤細胞產(chǎn)生細胞毒性作用的不同機制而起作用的兩種抗癌劑。所述共同給藥可以解決由于發(fā)生藥物抗性或腫瘤細胞抗原性的改變導致的問題，所述藥物抗性或腫瘤細胞抗原性的改變使得它們不與抗體反應。靶特異性效應細胞，如與本發(fā)明的組合物(如人抗體、多特異性和雙特異性分子)連接的效應細胞也可作為治療試劑。用于定向的效應細胞可以是人白細胞如巨噬細胞、中性粒細胞或單核細胞。其它細胞包括嗜酸性細胞和其它有IgG或IgA受體的細胞。如果需要，效應細胞可以從被治療的受試者獲得。靶特異性效應細胞，可以作為生理可接受的溶液中的細胞懸浮液而給予。給予的細胞數(shù)可以為108-109，但將取決于治療目的不同而改變。總之，用量將足夠獲得在靶細胞如表達EGFR的腫瘤細胞的定位，并足夠通過如細胞吞噬完成細胞殺滅。給藥途徑也可變化。用靶特異性效應細胞的治療可以與其它去除靶細胞的方法結合進行。例如，用本發(fā)明的組合物(如人抗體、多特異性和雙特異性分子)和/或配備這些組合物的效應細胞的抗腫瘤治療可以與化療聯(lián)合使用。另外，聯(lián)合免疫治療可以用來指導兩個不同細胞毒性效應細胞群定位于腫瘤細胞排斥。例如，連接到抗FcγRI或抗CD3的抗EGFR抗體可以與IgG或IgA受體特異性結合劑結合使用。本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子也可以用來調節(jié)效應細胞上的FcγR或FcαR水平，如通過給細胞表面受體加帽或去除細胞表面受體?？笷c受體混和物也可用于此目的。有補體結合位點，如IgG1，-2或-3，或IgM上的補體結合部分的本發(fā)明的組合物(如人抗體、多特異性和雙特異性分子)也可在補體存在下使用。在一種實施方案中，對包含靶細胞及本發(fā)明的結合劑和適當效應細胞的細胞群的離體治療可以通過加入補體或含有補體的血清而得到補充。對包被本發(fā)明的結合劑的靶細胞的吞噬可以通過與補體蛋白結合而改善。在另一種實施方案中，包被本發(fā)明的組合物(如人抗體、多特異性和雙特異性分子)的靶細胞也可被補體裂解。在另一種實施方案中，本發(fā)明的組合物不激活補體。本發(fā)明的組合物(如人抗體、多特異性和雙特異性分子)也可與補體一起給藥。因此，包含人抗體、多特異性或雙特異性分子和血清或補體的組合物也在本發(fā)明的范圍內。這些組合物的優(yōu)勢在于補體緊鄰人抗體、多特異性或雙特異性分子。另外，本發(fā)明的人抗體、多特異性或雙特異性分子和血清或補體可以分開給藥。包含本發(fā)明的組合物(如人抗體、多特異性和雙特異性分子)和使用說明書的試劑盒也在本發(fā)明的范圍內。試劑盒還可包含至少一種額外的試劑，如補體，或一個或更多額外的本發(fā)明的人抗體(如，區(qū)別于第一個人抗體，與EGFR抗原的一個表位結合的具有補體活性的人抗體)。在另一種實施方案中，可以額外給予受試者調節(jié)，如增強或抑制Fcγ或Fcα受體的表達活性的試劑，例如，用細胞因子治療受試者。在用多特異性分子治療中優(yōu)選給予的細胞因子包括粒細胞集落刺激因子(G-CSF)，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，γ干擾素(INF-γ)和腫瘤壞死因子(TNF)。在另一種實施方案中，可以額外用淋巴因子制劑治療受試者。可以用淋巴因子制劑誘導不高度表達EGFR的癌細胞高度表達EGFR。淋巴因子制劑可以導致腫瘤細胞中更均質的EGFR表達，從而導致更有效的治療。適于給藥的淋巴因子制劑包括γ干擾素、腫瘤壞死因子及其組合。這些可以靜脈內給藥。淋巴因子的適當劑量是10,000-1,000,000單位/患者。本發(fā)明的組合物(如人抗體、多特異性和雙特異性分子)也可用于表達FcγR或EGFR的靶細胞，例如標記這些細胞。為了這種應用，可以將結合劑連接到可以檢測的分子。這樣，本發(fā)明提供了定位來自體內或體外，表達Fc受體如FcγR或EGFR的細胞的方法?？蓹z測的標記物可以是，如放射性同位素、熒光化合物和酶或酶輔因子。在一種實施方案中，本發(fā)明提供了檢測樣品中EGFR的存在或測量EGFR抗原量的方法，包括在允許抗體或其部分和EGFR形成復合物的條件下，將樣品和對照樣品與特異性與EGFR結合的人單克隆抗體或其抗原結合部分相接觸。然后檢測復合物的形成，其中樣品與對照樣品間復合物形成的不同提示樣品中存在EGFR抗原。在另一種實施方案中，本發(fā)明提供了體內或體外檢測表達Fc的細胞的存在或為其定量的方法。此方法包括(i)給予受試者偶聯(lián)于可檢測標記物的本發(fā)明的組合物(如多或雙特異性分子)或其片段；(ii)將受試者暴露于檢測該可檢測標記物的方法，以便識別包含表達Fc的細胞的區(qū)域。通過下面的實施例對本發(fā)明做了進一步說明，但這些例子不應作為進一步的限制。在此特意引入本申請中引用的所有附圖的內容和所有參考文獻、專利和公開的專利申請的內容作為參考。實施例材料和方法抗原用A431人表皮樣癌細胞系(CRL-1555，批號203945，ATCCManassas，Virginia)和獲得自SigmaChemicalCo(產(chǎn)品E3641批號109H4108和20K4079)的可溶性表皮生長因子受體(EGFR)免疫轉基因小鼠。在-20℃--80℃儲存可溶性EGFR直到使用。培養(yǎng)基制劑用(A)含有10％FBS，青霉素-鏈霉素(SigmaP-7539)和2-巰基乙醇(GibcoBRL21985-023)的高葡萄糖DMEM(MediatechCellgro#10013)培養(yǎng)A431細胞和骨髓瘤細胞。向雜交瘤生長培養(yǎng)基中加入額外的培養(yǎng)基補充物，包括Origin-雜交瘤克隆因子(Igen21001)，OPI補充物(Sigma0-5003)，HAT或HT(SigmaH0262，H0137)。(B)僅僅含有DMEM，抗生素和2-巰基乙醇的無血清培養(yǎng)基。用于免疫的細胞用于免疫的細胞在T-75細胞培養(yǎng)燒瓶的DMEM(見上文)上生長至匯合，用每燒瓶5-10ml的胰蛋白酶EDTA(Cellgrow，Cat#25-053-Cl)溶液收獲。在50ml完全培養(yǎng)基中重懸從燒瓶回收的細胞，然后通過在50ml無菌PBS中進行三個循環(huán)的離心(1000G)和重懸而洗滌。用懸浮于0.5ml無菌PBS中的1×107個細胞注射小鼠。EGFR以25μgEGFR/100μl的濃度將可溶性EGFR與溶于無菌PBS的Ribi佐劑(Sigma，M6536)混合。用溶于無菌PBS的可溶性EGFR進行最終的尾靜脈免疫。轉基因小鼠將小鼠飼養(yǎng)在過濾器籠中，并且在融合日評估具有良好的身體狀況。產(chǎn)生所選擇的雜交瘤的小鼠是雄性6-8周齡的(CMD)++；(HCo7)11952+；(JKD)++；(KCo5)9272+基因型(見表1)。表1*括號中是各個轉基因名稱，其后是隨機整合的轉基因的細胞系號。符號++和+表示純合或半合子；然而，由于小鼠是使用基于PCR的測定進行常規(guī)篩選的，所述測定不允許我們區(qū)分隨機整合的人Ig轉基因的雜合性和純合性，+符號可能給予實際上對這些元件為純合的小鼠。抗體體外和體內使用以下抗EGFRMAbs2F8(也稱作″Humax-EGFR″)，人IgGI抗-EGFR抗體(GenMAb，Utrecht，TheNetherlands)；產(chǎn)生m225的雜交瘤，小鼠IgG2a抗-EGFR抗體是從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Rockville，MD，HB-8508)獲得的；用作不相關IgG1抗體的不相關的人IgG同種型對照(GenMAb)；用作間接免疫熒光的第二抗體(Protos，SanFrancisco，CA)的異硫氰酸熒光素(FITC)偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG(H+L)的F(ab′)2片段，F(xiàn)ITC偶聯(lián)的F(ab′)2兔-α-人IgG(DAKO，Glostrup，Denmark)。在補加了10％胎牛血清(FBS)(Hyclone，Logan，Utah)和100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素(都來自于GibcoBRL)(pen/strep)的DMEM(GibcoBRL，LifeTechnologies，Paisley，Scotland)中培養(yǎng)2F8雜交瘤。在補加了15％FBS(Hyclone)和青霉素/鏈霉素(都來自于GibcoBRL)的RPMI1640(GibcoBRL)中培養(yǎng)m225雜交瘤。在37℃，含有5％二氧化碳的濕化氣氛中保持所有細胞系。用蛋白A親和層析隨后通過在HR200柱(Pharmacia，NewJersey)上進行大小排阻而純化人抗體。用蛋白G親和層析隨后通過在HR200柱上進行大小排阻而純化小鼠抗體。通過十二烷基硫酸鹽-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測定的所有抗體純度都＞95％。通過胃蛋白酶或β-巰基乙醇處理，然后通過蛋白-A/G純化而制備F(ab′)片段。通過SDS-PAGE測定的分離的F(ab′)片段的純度＞95％。細胞系從ATCC(Rockville，MD，CRL-155)獲得A431，即高度過量表達EGFR的表皮樣癌。在補加10％熱滅活的FBS(Hyclone)，50μg/ml鏈霉素，50IU/ml青霉素和4mML-谷氨酰胺(都來自于GibcoBRL)的RPMI1640培養(yǎng)基(GibcoBRL)中培養(yǎng)細胞。細胞生長至附著時，通過使用溶于PBS(LifeTechnologies，Paisley，Scotland)的胰蛋白酶-EDTA而使其脫離。在腫瘤模型中，總是在對數(shù)期使用細胞。在每個實驗之間對細胞檢驗穩(wěn)定的EGFR表達和支原體污染。融合程序從新安樂死的小鼠無菌獲得脾，并且置于培養(yǎng)板中的20-30ml冷無血清培養(yǎng)基(SFM)中。去除附著的組織，在SFM中洗滌脾兩次。通過在組織研磨器中的SFM中均質化而輕輕收獲脾細胞。以1000g離心細胞10分鐘，通過將脾細胞沉淀重懸在5ml冰冷的0.17MNH4Cl中2-5分鐘而裂解細胞沉淀中的紅細胞。然后用20mlSFM稀釋細胞混合物并且以1000g離心細胞10分鐘。將骨髓瘤細胞收獲于50ml的離心管中。然后通過以1000g離心并且重懸于30-40mlSFM中共三個循環(huán)而洗滌脾細胞和骨髓瘤細胞。細胞計數(shù)后，以1∶1-4∶1的脾細胞/骨髓瘤細胞比混合脾細胞和骨髓瘤細胞。通過離心沉淀脾細胞/骨髓瘤細胞混合物，通過吸取去除上清液。通過在45秒中向細胞沉淀中逐滴加入1-2mlPEG溶液(Sigma#P-7181)并且輕輕使溶液混合75秒而進行融合。通過在1分鐘內逐滴加入2mlSFM而緩慢稀釋PEG溶液。用另外的2mlSFM重復該過程，然后使溶液靜置1分鐘。然后在90秒中用額外的30mlSFM緩慢稀釋溶液。以1000g離心細胞10分鐘并且重懸于30MlHAT培養(yǎng)基。在含有3％Origin雜交瘤克隆因子的HAT補充培養(yǎng)基中將融合混合物稀釋至200-300ml，并且以＞200μl/孔(約10-15板/脾)分散至96孔板中。在第7天，通過用補加3％Origin的新鮮HT培養(yǎng)基替換每個孔中一半的培養(yǎng)基填充平板。其后用HT培養(yǎng)基每3-4天填充一次平板。ELISA試劑1.磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)，無Ca和Mg的D-PBS，HycloneD-PBS#SH30013.03，或SigmaP3813。2.PBS-T(洗滌緩沖液)，含0.05％Tween20的PBS，SigmaP-1379。3.PBS-T加1％BSA(SigmaA9647)。它作為封閉緩沖液和樣品緩沖液。4.ELISA板，NuncImuno板F96Maxisorp442404。5.抗人IgGγ鏈特異性抗體，JacksonImmunoRresearch#109-006-098。6.堿性磷酸酶標記的山羊抗人γ鏈特異性IgG，JacksonImmunoResearch#109-056-098。另一種選擇是用堿性磷酸酶標記的抗人κ，SigmaA3813。7.堿性磷酸酶標記的抗人IgGl或IgG3，SouthernBiotechnology#9050-04&9210-04，用于同種型特異性ELISA。8.對硝基苯基(pNPP)，SigmaN2765，或SigmaFasttablet試劑盒N-2770。9.pNPP底物和緩沖液-兩種選擇A.二乙醇胺緩沖液混合物97ml二乙醇胺，SigmaD-2286，加0.1gMgCl26H2O和800mlDi水。將pH調節(jié)至9.8，用Di水將終體積調節(jié)至1.0L。每20ml二乙醇胺緩沖液加入一片20mg的pNNP，SigmaN-2765。B.一組SigmaFastpNPP片將1片緩沖劑片和1pNPP片溶于20mlH2O。10.使用405nm過濾器的ELISA板讀數(shù)器。11.表皮生長因子受體(EGFR)，SigmaE3641，生物素標記的EGF(EGF-B)，MolecularProbesE-3477。12.生物素標記的抗EGFRMAbs或人抗體。13.用于陰性對照的非特異性人抗體，或純化的人IgG1κ，SigmaI-I3889。14.自動化的ELISA板洗滌器TitertekMAPC?？谷薎gG，κELISA為篩選用于產(chǎn)生人IgG，κ的MAbs，用1μg/ml抗人IgGγ鏈特異性抗體，JacksonImmunoResesarch#109-006-098在4℃下包被ELISA板過夜或更長時間。在板洗滌液中洗滌板，并且加入100μl/孔PBS-T加1％BSA。將板孵育至少15分鐘，并且向ELISA板孔中加入10-50μl細胞培養(yǎng)物上清液，每個板中的一些孔中加入IgG作為陽性對照，細胞培養(yǎng)基作為陰性對照。將板在室溫下孵育1-2小時，洗滌，并且加入溶于PBS-T加1％BSA的1∶5000的人κ抗體(SigmaA-3813)。將板在室溫下孵育1小時，在板洗滌液中洗滌4次，加入pNPP底物。將板孵育10-60分鐘，在ELISA板讀數(shù)器中405nm下讀出吸光度。用于檢測抗EGFR人抗體特異性的ELISA程序-抗體與EGFR包被的ELISA板的直接結合為證明抗EGFR抗體特異性結合于EGFR，用溶于PBS的濃度為0.4μg/ml的100μl/孔的EGFR4℃下包被NuncMaxisorp板過夜，或室溫下包被2小時。將板在PBS-T中洗滌3次，加入100μl/孔PBS-T加1％BSA以封閉塑料表面的非特異性位點，并且在加樣前孵育至少15分鐘。將待測樣品的稀釋液加入PBS-T加1％BSA。以100μl/孔加入樣品和標準品，在室溫下孵育1小時，在PBS-T中將板洗滌3次。加入100μl/孔含1∶3000-1∶5000稀釋的堿性磷酸酶標記的山羊抗人γ特異性抗體的PBS-T1％BSA?；蛘?，可使用堿性磷酸酶標記的抗人γ。將板在室溫下孵育1小時，洗滌4次，并且加入pNPP底物。在405nm讀出吸光度。用于檢測抗EGFR人抗體特異性的ELISA程序-ELISAEGF/EGFR阻斷測定為了證明抗EGFR抗體結合于EGFR并且還阻斷生物素標記的表皮生長因子與表皮生長因子受體(EGFR)的結合，用溶于PBS的濃度為0.4μg/ml的100μl/孔的EGFR4℃下包被NuncMaxisorp板過夜，或室溫下包被2小時。將板在PBS-T中洗滌3次，加入100μl/孔PBS-T加1％BSA以封閉塑料表面的非特異性位點，并且在加樣前孵育至少15分鐘。將待測樣品的稀釋液加入PBS-T加1％BSA。將上清液在PBS-T1％BSA中最少以1∶3稀釋，用于加入ELISA板。以100μl/孔加入樣品和標準品，在室溫下孵育30分鐘，加入20μl/孔濃度為0.5μg/ml的生物素標記的EGF，將板孵育1小時(將其加入已經(jīng)存在于板上的樣品溶液)?；蛘?，可以將樣品孵育1小時，洗滌，加入100μl/孔濃度為0.1μg/ml的EGF-生物素，并且孵育1小時。將板洗滌3次，加入100μl/孔含1∶2000稀釋的鏈親和素堿性磷酸酶的PBS-T1％BSA，并且孵育1小時。將板洗滌4次，并且加入pNPP底物。在405nm讀出吸光度。用于確定抗EGFR人抗體的表位特異性的競爭性ELISA-與商購鼠MAbs225，528，AB5和29.1的競爭進行該測定以確定哪一種MAbs最相似于抗體225，528，AB5和29.1。MAbs225，528和AB5阻斷EGF與其受體結合，并且體內抑制EGFR的內源性酪氨酸激酶活性。MAb29.1是結合于EGFR的糖殘基的非阻斷性MAb。用溶于PBS的濃度為0.4μg/ml的EGFR室溫下包被板至少2小時，或4℃下包被過夜，并且用100μl/孔PBS-T1％BSA洗滌并封閉。倒去封閉溶液，將100μl/孔PBS-T-1％BSA加入板左側的柱1-6，同時將1μg/ml(100μl/孔)的未標記的小鼠MAb加入板右側的柱7-12。將板在室溫下孵育1小時，將25μl細胞培養(yǎng)物上清液加入板每一半的相等位置，以便每一上清液加入一個具有PBS-T-1％BSA的孔和一個具有小鼠MAb的孔。將板孵育1小時，洗滌，并且加入堿性磷酸酶標記的抗人IgGFc抗體。將板孵育1小時。洗滌板并且加入底物。在405nm讀出吸光度。通過以下公式確定MAb的競爭百分比(無競爭的OD上清液-有MAb競爭的OD上清液/無競爭的OD上清液)×100。用于確定抗EGFR人抗體的表位特異性的競爭性ELISA-與生物素標記的人抗體的競爭性ELISA也進行競爭性ELISA測定以確定抗EGFR人抗體的特異性。用溶于PBS的濃度為0.4μg/ml的EGFR室溫下包被板至少2小時，或4℃下包被過夜。用100μl/孔PBS-T1％BSA洗滌并封閉板。將50μl(10-30μg/ml)未標記的人抗體或小鼠MAbs加入板柱頂層的孔，序貫轉移50μl，然后連續(xù)沿每個柱向下混合，以產(chǎn)生每種抗體的三倍稀釋液?；旌虾髲牡讓涌字袟壢?0μl。將板孵育1小時，向整個板中加入20μl/孔生物素化的抗EGFR人抗體或未標記的小鼠抗人EGFR抗體，以便競爭性抗體的終濃度為大約0.1-0.2μg/ml。將板在室溫下孵育1小時，洗滌，加入100μl/孔鏈親和素堿性磷酸酶(1∶2000在PBS-T-BSA中稀釋)或堿性磷酸酶標記的山羊抗小鼠IgG。將板孵育1小時，洗滌，并且加入底物。在405nm讀出吸光度。用于檢測抗EGFR人抗體的FACS程序-EGF/EGFR阻斷用該測定證明抗EGFR抗體結合于細胞表面的EGFR，并且通過該作用阻斷生物素標記的表皮生長因子(EGF-B)與表皮生長因子受體(EGFR)的結合。該基于FACS的方法使用表達約106EGFR分子/細胞的人表皮癌細胞系A431。用于EGFRFACS測定的材料1.在一個或多個T-175燒瓶中匯合的A431細胞(ATCCCRL1555)。在DMEM加10％FCS中培養(yǎng)A431細胞。2.胰蛋白酶-EDTA溶液，SigmaT-3924。3.生物素標記的EGF。制備約5μg/ml的儲液，使用10μl/孔。4.圓底96孔板。5.無菌OBS。6.PBS加1％BSA加0.02％疊氮化鈉(FACS緩沖液)。7.PE標記的鏈親和素，SigmaS3402。在FACS緩沖液中1∶20稀釋。8.PE標記的或FITC標記的FCγ特異性抗人IgG，Pharminigen34164X，34165X。9.用擺動桶和96孔板的適配器(Beckman)進行低速離心。10.FACS11.BDFACS管。程序通過胰蛋白酶EDTA處理收獲A431細胞。去除組織培養(yǎng)燒瓶中的培養(yǎng)基，用10-20ml無菌PBS或HBSS短暫沖洗燒瓶。當細胞開始從塑料表面脫離時，用10ml的移液管輕輕從塑料表面吸出細胞，并且產(chǎn)生沒有太多細胞團塊的單細胞懸浮液。將細胞轉移至含有20-30ml細胞培養(yǎng)基(含F(xiàn)BS)的50ml試管中，以1000g離心10分鐘，通過離心并且在冷FACS緩沖液中重懸細胞而洗滌兩次。通過尼龍網(wǎng)過濾細胞溶液以去除細胞團塊(BDFACS管的頂部具有用于此目的裝置)。對細胞進行計數(shù)，調整體積，以便每ml具有1-5×106個細胞。以200,000細胞/孔將細胞分配至圓底96孔板中，并且以1000g離心約1分鐘，然后倒去液體(細胞應該保留在孔底)。將板在冰上或4℃下保持。在分開的96孔板中，通過從10μg/ml起始并且降低至4.5ng/ml而制備抗體的三倍稀釋系列，從而制備FACS緩沖液中的抗體樣品稀釋液。將10μl每種抗體稀釋液、同種型對照和緩沖液對照加入圓底板中。將抗體樣品和對照與細胞混合，并且在冰上孵育30分鐘。將10μl生物素標記的EGF加入抗體細胞溶液并且再孵育30分鐘。通過離心并且重懸于FACS緩沖液中而洗滌細胞三次。加入50μl/孔鏈親和素PE，混合，并且再冰上孵育30分鐘。將細胞洗滌三次并且重懸于50μlFACS緩沖液中。將每孔的內容物轉移到含有300-400μlFACS緩沖液的試管。通過FACS在FL-2通道中分析5000-10000個細胞。用MCF對抗體濃度作圖。人或動物來源的材料A431人表皮樣癌細胞系(CRL-1555，批號203945，ATCCManassas，Virginia)。胰蛋白酶EDTA(CellgrowCat#25-053-CI)。P3X63ag8.653骨髓瘤細胞系ATCCCRL1580，批號F-15183。Origin-雜交瘤克隆因子(Igen21001)。OPI補充物(SigmaO-5003)。胎牛血清(SH30071批號#sALE10321，和AGH6843)來自于Hyclone，Logan，Utah。Origen冷凍培養(yǎng)基(Igen，#210002)。ELISA為了測定人抗體與EGFR的結合，使用了ELISA，其中將EGFR(Sigma，StLouis，M)在96孔微量滴定板(Greiner，F(xiàn)rickenhausen，Germany)上的PBS中以1μg/ml的濃度包被過夜。用濃度為100μl/孔的ELISA緩沖液(PBS/.05％Tween20和1％雞血清(GibcoBRL))封閉板后，加入在ELISA緩沖液中稀釋的單克隆抗體，并且在37℃下孵育1小時。隨后將板洗滌3次，并且用過氧化物酶標記的山羊抗人IgGFc特異性抗體(Jackson，WestGrace，P)37℃下孵育1小時。用ABTS(RocheDiagnostics，Mannheim，Germany)對該測定顯影30分鐘。在415nm下用微量滴定板讀數(shù)器(Biotek，Winooski，Canada)測量吸光度。至于阻斷研究，將板用ELISA緩沖液中的50μl封閉試劑預孵育10分鐘，然后加入50μl完全的人抗體。對于測定小鼠血清中的人IgG，在96孔微量滴定板(Greiner)中的PBS中用兔抗人κ，輕鏈(DAKO)將ELISA板包被過夜。用100μl/孔ELISA緩沖液(PBS/.05％Tween20和1％雞血清)封閉板后，加入在ELISA緩沖液中稀釋的小鼠血清，并且在37℃下孵育1小時。隨后將板洗滌3次，并且用過氧化物酶標記的兔F(ab′)2片段抗人IgG(DAKO)37℃下孵育1小時。用ABTS(Roche)對該測定顯影30分鐘。在415nm下用微量滴定板讀數(shù)器(Biotek，Winooski，Canada)測量吸光度。流式細胞術用MAb在4℃下將過量表達EGFR的腫瘤細胞孵育30分鐘。在補加了1％牛血清白蛋白(Roche)和0,01％疊氮化物的磷酸鹽緩沖的鹽水中洗滌3次。用山羊抗小鼠抗體的FITC-偶聯(lián)的F(ab′)2片段或兔抗人IgG抗體的FITC-偶聯(lián)的F(ab′)2片段進行計數(shù)-染色。對于抑制實驗，用EGF或TGF-α將細胞4℃下預孵育10分鐘。在FACScan流式細胞儀(Becton-Dickinson，SanJose，CA)上分析樣品。磷酸化研究用低血清條件(0.5％)處理24孔板(NUNC，Kamstrup，Denmark)中A431細胞的亞匯合培養(yǎng)物。向孔中加入不同的抗體稀釋液并且在37℃下和5％二氧化碳中孵育30分鐘。用或不用5ng/mlEGF(Prepotech，RockyHill，NJ)在37℃下和5％二氧化碳中刺激細胞5分鐘。按Tomicetal.(Tomicetal，1995)所述，用每孔100μl裂解緩沖液制備細胞提取物。通過鈉SDS-PAGE和抗磷酸酪氨酸抗體(PY20，TransductionLaboratories，Kentucky)、山羊抗小鼠IgG-HRP抗體(TransductionLaboratories)免疫印跡，和ECL檢測分析50μlA431細胞提取物。為用TGF-α(Prepotech，RockyHill，NJ)進行刺激，用低血清培養(yǎng)基(0.5％)處理24孔板(Nunc)中A431細胞的亞匯合培養(yǎng)物過夜。以10或0μg/ml的固定劑量加入抗體，并且按上述進行孵育。用遞增量的TGF-α刺激細胞。按上述內容處理細胞。體外細胞生長抑制用非放射性抑制測定評估完全的人抗體的細胞生長抑制特征。簡言之，將100μl2×104/ml的A431細胞加入平底組織培養(yǎng)板中并且置于細胞培養(yǎng)孵育器中。2小時后加入100μl抗體稀釋液并且放回細胞培養(yǎng)孵育器中。將細胞孵育6-7天，倒去上清液，向每個孔中加入溶于PBS的100μl0.25％戊二醛。室溫下孵育45分鐘后，用脫礦質水將孔洗滌兩次。加入50μl溶于脫礦質水的1％結晶紫，并且室溫下孵育15分鐘。用脫礦質水將板洗滌兩次后，在板振蕩器上用100％甲醇使板顯影30分鐘。使用帶有650nm參考過濾器的550nm過濾器，采用微量滴定板讀數(shù)器測量吸光度。重復三次測量抑制。用三份特定抗體濃度的平均吸光度除以沒有加入抗體的孔的平均吸光度，然后乘100，從而確定相對細胞增殖百分比。效應細胞分離通過對Repp，etal.(1991)Blood78885-889中所述進行略微修改的方法分離外周血白細胞。簡言之，將用肝素抗凝的血液層疊在ficoll梯度上。離心后，從中間相收獲效應細胞，并且通過低滲裂解去除剩余的紅細胞。用Cytospin制劑評估高于95％的分離細胞純度。通過臺盼藍排斥確定的細胞存活率超過95％。ADCC測定在51鉻釋放測定(Valerius，etal.(1993)Blood，82931-939)中評估完全的人抗體裂解腫瘤細胞的能力。分離的人白細胞用作效應細胞源。簡言之，用100μCi51Cr孵育腫瘤靶2小時。用培養(yǎng)基洗滌3次后，將5×103個靶細胞加入含有50μl分離的效應細胞和不同濃度敏化MAb的圓底組織培養(yǎng)板，并且在培養(yǎng)基中稀釋。終體積為200μl，效應細胞與靶細胞的比例(E∶T)為80∶1。將該測定在37℃下孵育過夜，并且通過離心終止。在上清液中以三份測量鉻釋放。細胞毒性百分比用以下公式計算通過向靶細胞中加入ZAP-oglobin(10％終濃度)而測定最大51Cr釋放，并且在缺乏敏化抗體和效應細胞的條件下測量基礎釋放。在這些測定條件下僅僅觀察到非常低水平的抗體介導的非細胞毒性(無效應細胞)(＜5％特異性裂解)。使用SPR技術進行親和性測量使用BIAcore300(Biacore，Upsula，Sweden)測定抗EGFR抗體的結合親和性。根據(jù)制造商的說明，將從Sigma購買的由A431細胞純化的EGFR固定在CM5芯片上。用不同濃度的抗體F(ab′)片段進行測量。用BIAevaluation軟件(3.1版)測定締合常數(shù)和解離常數(shù)。小鼠和腫瘤模型從Harlan(Horst，TheNetherlands)購Balb/c裸鼠(NuNu)。用8-12周齡的雌性小鼠進行所有描述的實驗。將小鼠飼養(yǎng)在中心實驗室動物設施(Utrecht，TheNetherlands)中的轉基因小鼠設施中，并且通過Utrecht大學動物倫理委員會批準該實驗。當參與實驗時，每周兩次檢查小鼠的毒性癥狀和包括活動水平、皮膚異常、腹瀉和一般表現(xiàn)的不適。使用了充分確立的皮下(s.c.)腫瘤模型。簡言之，將高水平表達EGFR的A431細胞接種在小鼠右側，劑量為3×106個細胞。腫瘤生長至均勻，并且可以容易通過游標卡尺測量。腫瘤體積報道為長×寬×高(以mm3)表示。根據(jù)研究方案腹膜內注射(i.p.)單克隆抗體。通過流式細胞術和免疫組化在體內傳代后測量腫瘤細胞的穩(wěn)定EGFR表達。為了確定藥代動力學，用2F8抗體對有和無腫瘤的小鼠進行腹膜內注射。注射前和注射后6周每周通過尾靜脈取出血樣。通過人IgGELISA分析樣品。統(tǒng)計學分析成組數(shù)據(jù)報道為平均值±平均值的標準誤(SEM)。組間差異通過未配對(或適當時配對)斯氏t檢驗進行分析。表示出顯著性水平。顯著性采用p＜0.05的水平。實施例1用于產(chǎn)生抗EGFR人抗體，也稱作“HuMAbs”的Cmu靶小鼠的產(chǎn)生CMD導向載體的建立質粒pICEmu包含一個跨mu基因，從Balb/C基因組λ噬菌體文庫中獲得的鼠Ig重鏈基因座的EcoRI/XhoI片段(Marcuetal.Cell22187，1980)。此基因組片段被亞克隆到質粒pICEM19H的XhoI/EcoR位點(Marshetal；Gene32，481-485，1984)。包含在pICEmu的重鏈序列從mu內含子增強子3′的EcoRI位點向下游延伸到mu基因最后一個跨膜外顯子下游約1kb的XhoI位點；然而，通過在大腸桿菌中傳代，許多mu轉換重復區(qū)域被去除。導向載體按如下方法建立。將一個1.3kb的HindIII/SmaI片段從pICEmu切除并亞克隆到HindIII/SmaI消化的pBluescript(Stratagene，LaJolla，CA)。此pICEmu片段從位于Cmul5′端約1kb的HindIII位點延伸到Cmul內部的SmaI位點。產(chǎn)生的質粒用SmaI/SpeI消化，然后插入一個約4kb的從pICEmu得到的，從Cmul3′的SmaI位點延伸到最后一個Cmu外顯子下游的XbaI位點的SmaI/XbaI片段。產(chǎn)生的質粒pTAR1在SmaI位點被線性化，插入一個neo表達盒。該盒包含一個在小鼠磷酸甘油激酶(pkg)啟動子(XbaI/TaqI片段；Adraetal.(1987)Gene6065-74)轉錄控制下并包含pkg聚腺苷酸化位點(PvuII/HindIII片段；Boeretal.(1990)BiochemicalGenetics28299-308)的neo基因。該盒從質粒pKJ1(Tybulewiczetal.(1991)Cell651153-1163有描述)得到，neo盒作為EcoRI/HindIII片段被切除并亞克隆到EcoRI/HindIII消化的pGEM-7Zf(+)而產(chǎn)生pGEM-7(KJ1)。Neo盒從pGEM-7(KJ1)通過EcoRI/SalI消化被切除，為平端，并被亞克隆到質粒pTAR1的SmaI位點，與基因組Cmu序列方向相反。產(chǎn)生的質粒被NotI線性化，插入一個單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶(tk)盒，這樣可以允許有同源重組的ES克隆富集，如Mansouretal.(1988)Nature336348-352的描述。該盒包含了其兩端為小鼠pgk啟動子和聚腺苷酸化位點的tk基因編碼序列，如Tybulewiczetal.(1991)Cell651153-1163的描述。產(chǎn)生的CMD導向載體包含與重鏈基因座總共約5.3kb的同源性，并設計產(chǎn)生在第一個Cmu外顯子的唯一SmaI位點插入neo表達盒的突變mu基因。導向載體在電穿孔到ES細胞之前，用在質粒序列內部切割的PvuI線性化。靶ES細胞的產(chǎn)生和分析AB-1ES細胞(McMahon，A.P.andBradley，A.，(1990)Cell621073-1085)在有絲分裂不活躍的SNL76/7細胞飼養(yǎng)層(ibid.)上生長，基本如(Robertson，E.J.(1987)，TeratocarcinomasandEmbryonicStemCellsaPracticalApproach(E.J.Robertson，ed.)OxfordIRLPress，p.71-112)所描述。線性化的CMD導向載體通過Hasty等描述的方法(Hasty，P.R.Etal.(1991)Nature350243-246)被電穿孔到AB-1細胞中。被電穿孔的細胞以1-2×106個細胞/平皿的密度被平鋪到100mm的平皿。24小時后，將G418(200mg/ml活性成分)和FIAU(5×10-7M)加入培養(yǎng)基，抗藥克隆允許培養(yǎng)8-9天。挑選克隆，用胰蛋白酶消化，分為兩部分，并進一步擴展。然后從每個克隆得到的細胞的一半被冷凍，另一半為進行載體和靶序列之間的同源重組而進行分析。DNA分析通過DNA印跡雜交執(zhí)行。按Laird等描述的方法(Laird，P.W.etal.，(1991)NucleicAcidsRes.194293)將DNA從克隆中分離。分離的基因組DNA用SpeI消化并用一個與mu內含子增強子和mu轉換區(qū)之間的序列雜交的915bp的SacI片段即探針A探測。探針A檢測野生型基因座的一個9.9kb的SacI片段和mu基因座的一個與CMD導向載體同源重組(neu表達盒包含一個SpeI位點)的7.6kb的鑒別帶。在DNA印跡分析篩選的1132個抗G418和FIAU克隆中，3個顯示出了提示mu基因座同源重組的7.6kb的SpeI帶。用酶BglI，BstXI和EcoRI進一步消化這3個克隆，證明載體被同源性整合到mu基因中。當與探針A雜交后，用BglI，BstXI或EcoRI消化的野生型DNA的印記分別產(chǎn)生15.7，7.3和12.5kb的片段，而靶mu等位基因的存在分別由7.7，6.6，和14.3kb的片段提示。由SpeI消化檢測的所有3個陽性克隆表現(xiàn)出預期的鑒別neo盒插入Cmul外顯子的BglI，BstXI和EcoRI限制片段。具有突變mu基因的小鼠的產(chǎn)生將這三個編號為264，272和408的靶ES克隆融化并按Bradley在TeratocarcinomasandEmbryonicStemCellsaPracticalApproach(E.J.Robertson，ed.)OxfordIRLPress，p.113-151)中描述的方法注射入C57BL/6J胚泡。將被注入的胚泡轉移到假孕雌性小鼠中產(chǎn)生表現(xiàn)從引入ES細胞和宿主胚泡細胞衍生的細胞混合的嵌合小鼠。ES細胞對嵌合體的貢獻可以由黑色C57BL/BJ背景上的從ES細胞系衍生的灰色皮毛顏色數(shù)量用肉眼估計?？寺?72和408只產(chǎn)生低百分比的嵌合體(即低百分比灰色色素)，但克隆264產(chǎn)生高百分比的雄性嵌合體。這些嵌合體與C57BL/J6雌鼠雜交并產(chǎn)生灰色后代，提示ES細胞基因組的種系轉移。對靶mu基因的篩選是通過對尾部解剖得到的DNA用BglI消化進行DNA印跡分析而執(zhí)行的(如前面所描述的ES細胞DNA分析)。約50％的灰色后代除了野生型的15.7kb帶，也表現(xiàn)出7.7kb的雜交BglI帶，證明了靶mu基因的種系轉移。mu基因功能性滅活的轉基因小鼠的分析為判斷neo盒插入到Cmul是否滅活了Ig重鏈基因，將一只克隆264的嵌合體與一只JHD突變純合小鼠雜交，JHD突變由于去除JH基因段而導致重鏈表達失活(Chenetal，(1993)Immunol.5647-656)。產(chǎn)生四只灰色后代。從1月齡的這些動物中得到血清并用ELISA測定鼠IgM的存在。四只后代中的兩只完全缺失IgM(見表2)。從尾部解剖得到的DNA用BglI消化并與探針A雜交，以及通過用StuI消化并與一個475bp的EcoRI/StuI片段(ibid)雜交，DNA印跡分析測定的四只動物的基因型證明，不能表達血清IgM的動物重鏈基因座中的一個等位基因有JHD突變，另一個有Cmul突變。JHD突變的雜合小鼠顯示野生型水平的血清Ig。這些資料證明Cmul突變滅活mu基因的表達。表2表2表示由ELISA檢測的，有CMD和JHD突變(CMD/JHD)的小鼠，JHD突變雜合子小鼠(+/JHD)，野生型(129SV×C57BL/6J)F1小鼠(+/+)及B細胞缺陷JHD突變純合小鼠(JHD/JHD)的血清IgM水平。實施例2HCO12轉基因小鼠的產(chǎn)生HCO12人重鏈轉基因HCO12轉基因通過共同注射80kb的pHC2插入片段(Tayloretal.，1994，Int.Immunol.，6579-591)和25kb的pVx6插入片段產(chǎn)生。質粒pVx6按如下方法建立。一個包含種系人VH1-18(DP-14)基因以及約2.5kb的5′側翼和5kb的3′側翼基因組序列的8.5kb的HindIII/SalIDNA片段被亞克隆到質粒載體pSP72(Promega，Madison，WI)產(chǎn)生質粒p343.7.16。一個包含種系人VH5-51(DP-73)基因以及約5kb的5′側翼和1kb的3′側翼基因組序列的7kb的BanHI/HindIIIDNA片段被克隆到基于pBR322的質粒克隆載體pGP1f(Tayloretal.1992，NucleicAcidsRes.206287-6295)產(chǎn)生質粒p251f。從pGP1f衍生的一個新克隆載體pGP1k(SEQIDNO13)被EcoRV/BamHI消化并與一個包含種系人VH3-23(DP-47)基因以及約4kb的5′側翼和5kb的3′側翼基因組序列的10kb的EcoRV/BamHIDNA片段連接。產(chǎn)生的質粒p112.2RR.7被BamHI/SalI消化并與p251f的7kb的純化BamHI/SalI插入片段連接。產(chǎn)生的質粒pVx4用XhoI消化并與p343.7.16的8.5kb的XhoI/SalI插入片段連接。獲得了一個VH1-18基因與另外兩個V基因方向相同的克隆。然后這個稱為pV×6的克隆被NotI消化，按Hogan等的描述(B.Hoganetal.，ManipulatingtheMouseembryo，ALaboratoryManual，2ndedition，1994，ColdSpringHarborLaboratoryPress，Plainview，NY)，純化的26kb插入片段與純化的pHC2的80kbNotI插入片段以1∶1的摩爾比共同注射到半天的(C57BL/6J×DBA/2J)F2胚胎原核中。從注入的胚胎發(fā)育的小鼠建立了三個包含從Vx6和HC2得到的序列的獨立轉基因小鼠系。這些系被指定為(HCO12)14881，(HCO12)15083，(HCO12)15087。然后將這三個系的每一個與包含例1中描述的CMD突變、JKD突變(Chenetal.1993，EMBOJ.12811-820)和(Kco5)9272轉基因(Fishwildetal.1996，NatureBiotechnology14845-851)的小鼠雜交。產(chǎn)生的小鼠在破壞內源性小鼠重鏈和κ輕鏈基因座為純合的背景下表達人重鏈和κ輕鏈轉基因。實施例3抗EGFR的人單克隆抗體的產(chǎn)生用兩株不同的小鼠產(chǎn)生EGFR反應性人單克隆抗體。株((CMD)++；(JKD)++；(HCo7)11952+/++；(KCo5)9272+/++)(此處也稱作“HCO7小鼠”)和株((CMD)++；(JKD)++；(HCo12)15087+/++；(KCo5)9272+/++)(此處也稱作“HCO12小鼠”)。這些株的每一個對于內源性重鏈(CMD)和κ輕鏈(JKD)基因座的破壞都是純合的。兩株也都含有人κ輕鏈轉基因(HCo7)，各個動物對插入#11952是半合子或純合的。兩株的區(qū)別在于所使用的人重鏈轉基因。小鼠對HCO7或HCO12轉基因是半合子或純合的。CMD突變在上述實施例1中描述。(HCo12)15087小鼠的產(chǎn)生描述于實施例2。JKD突變(Chenetal.1993，EMBOJ.12811-820)和(KCo5)9272(Fishwildetal.1996，NatureBiotechnology14845851)以及(HCo7)11952小鼠描述于美國專利Nos5,770,429和5,545,806(Lonberg&Kay，6/23/98)。所使用的免疫方案列于下表3。用A431細胞免疫小鼠兩次，然后用Ribi佐劑中的可溶性抗原免疫小鼠。第三次免疫后通過ELISA測定EGFR特異性血清滴度。融合前，進行三次不同的免疫，完成最終的加強。包括用10μg溶于50μlPBS的抗原通過尾靜脈進行兩次或三次序貫靜脈內(iv)加強，或用25μg溶于Ribi佐劑的EGFR進行兩次序貫腹膜內(i.p.)加強(見表3)。在融合中所使用的三只小鼠是包括HCo7和HCo12基因型的更大的小鼠隊列的一部分。免疫方案表3用于前兩次注射的免疫策略，即2-10×106個活A431細胞i.p.，得到不佳的抗EGFR滴度(見表2)。然而，當用溶于Ribi佐劑的25μg/小鼠可溶性EGFR免疫這些小鼠三次時，血清滴度增加30倍以上。這些結果明確證明，在細胞表面表達大量EGFR的細胞在激發(fā)初次免疫應答方面非常有效，該初次免疫應答用僅僅一劑溶于佐劑的純化抗原就顯著增強。用10μg溶于PBS的可溶性EGFR在第4，3和2天對小鼠20243進行iv尾靜脈加強，從而完成融合前的最終加強。可溶性EGFR中的TritonX-100導致對小鼠尾的刺激。因此，為減少刺激的可能性，小鼠20242僅僅在第4和3天接受可溶性EGFR的兩次i.v.靜脈加強，并且小鼠20241在第4和3天接受溶于Ribi佐劑中的25μgEGFR的兩次i.p.免疫。這三次融合得到46種人γ，κ抗原陽性雜交瘤(見表4)。接受佐劑i.p.加強的小鼠20241產(chǎn)生35種抗原特異性人γκ抗體。表4實施例4雜交瘤制備將P3X63ag8.653骨髓瘤細胞系(ATCCCRL1580，批號F-15183)用于融合。將原始的ATCC管瓶解凍并且鋪展在培養(yǎng)物中。從該鋪展物中制備冷凍管瓶的儲液。融合前1-2周將一個新管瓶中的細胞解凍。用含有10％FBS，青霉素-鏈霉素(Sigma，P-7539)和5.5×10-5M2-巰基乙醇(GibcoBRL，21985-023)的高葡萄糖DMEM(Mediatech，Cellgro#10013)培養(yǎng)A431細胞和骨髓瘤細胞。向雜交瘤生長培養(yǎng)基中加入額外的培養(yǎng)基補充物，包括3％Origin-雜交瘤克隆因子(Igen，21001)，OPI補充物(Sigma，O-5003)，1.1×10-3M草酰乙酸，4.5×10-4M丙酮酸鈉，和24國際單位/L牛胰島素，HAT(Sigma，H0262)1.0×104M次黃嘌呤，4.0×10-7M氨基喋呤，1.6×10-5M胸苷，或HT(Sigma，H0137)1.0×10-4M次黃嘌呤，1.6×10-5M胸苷。從Hyclone，Logan，Utah獲得表征的胎牛血清(SH30071批號#sAJE10321和AGH6843)。無血清培養(yǎng)基僅僅含有DMEM，抗生素和2-巰基乙醇。來自于所有三只小鼠的脾大小正常，并且產(chǎn)生約2×107-1×108個脾細胞。融合脾細胞。融合后7-10天進行人IgGκ抗體的起始ELISA篩選。在可溶性EGFR包被的ELISA板上篩選人IgG，κ陽性孔。將抗原陽性雜交瘤轉移到24孔板上并且最終轉移至組織培養(yǎng)燒瓶中。通過有限稀釋亞克隆EGFR特異性雜交瘤以確定單克隆性。通過將細胞冷凍于DMEM10％FBS加10％DMSO(Sigma，D2650)或Origen冷凍培養(yǎng)基(Igen，#210002)中保存幾個發(fā)育階段的抗原陽性雜交瘤。在-80℃或在LN2中儲存細胞。隨后評估最初的EGFR特異性雜交瘤的表位特異性及它們阻斷EGF結合于EGFR受體的能力。以前已經(jīng)證明了小鼠單克隆抗EGFR抗體225和528結合于EGFR，阻斷EGF與EGFR的結合，并且在動物和人研究中是抗癌免疫治療劑。因此，以競爭性ELISA形式使用這些抗體和非阻斷性抗體，從而鑒定具有免疫治療特征的人抗體。實施例5結合測定用BIAcore3000(Biacore，Upsula，Sweden)測定對雜交瘤2F8的結合親和性。按照制造商的說明，將購自Sigma的從A431細胞純化的EGFR固定在CM5芯片上?？贵w2F8的平衡常數(shù)(KA)為5.47(±0.52)×108M-1。實施例6競爭性ELISA測定在24孔板中建立抗原陽性雜交瘤之后立即將競爭性ELISA測定用作起始的定量測定。概言之，強競爭(80-100％)表示抗體結合于相同表位或緊鄰于競爭性抗體的抗原區(qū)。小于50％的較弱競爭表明抗體及其競爭劑結合于不緊鄰的抗原區(qū)。用來自于未克隆雜交瘤的上清液進行起始測定，其中的許多含有一種以上雜交瘤/孔。用最初的孔的亞克隆進行隨后的測定。圖1和圖2表示(圖1和圖2中的數(shù)據(jù)是基于與MAb225的競爭程度而排列的)，即使使用粗細胞培養(yǎng)物上清液，可以鑒定抗體與225和528抗體結合于相似或相同的表位。從該實驗中可以看出，來自于小鼠20241或來自于小鼠20242和20243的抗體的競爭性結合模式中的不同分布。例如，來自于#20241小鼠的前7種抗體(圖1)與MAb225和528強烈競爭。來自于20241的其余抗體與225和528抗體中度或微弱競爭。來自于20242和20243小鼠的5種抗體(1H6，2F8，1A8，5C5，和8E1)表現(xiàn)出與抗體225的強競爭，與MAb528無競爭或微弱競爭(圖2)。來自于小鼠20242和20243的抗體2F6，8A12，5F12，6B3和6D9與MAb225和528競爭，但與225抗體的競爭更強。來自于這些小鼠的其它抗體不與商購MAbs競爭或微弱競爭。用亞克隆的細胞產(chǎn)生的純化抗體證實了這些起始的競爭性ELISA結果。圖3和4表示，抗體5F12和6B3與MAb225和528強烈競爭，并且證明彼此互相競爭。該數(shù)據(jù)表明，這些抗體結合于相同表位或225或528結合位點緊鄰的EGFR區(qū)?？贵w2F8與MAb225中度競爭，并且不與抗體528顯著競爭(圖3和4)。然而，抗體2F8，6B3和5F12表現(xiàn)出強交叉競爭。該數(shù)據(jù)表明，抗體2F8與225和528抗體結合于不同的表位，并且結合于HuMAbs6B3和5F12所結合的表位附近或重疊的EGFR受體區(qū)?？贵w2A2和6E9不與任一種MAb競爭，并且結合于與225和528抗體MAbs的結合位點無關的EGFR表位(圖3和4)。實施例7EGF/EGFR阻斷測定在EGF/EGFR阻斷測定中進一步評估抗原陽性亞克隆。這些測定包括與MAb225和/或528強烈競爭的抗體亞克隆，以及與225或528微弱競爭或無競爭的抗體亞克隆。將一些抗體鋪展在培養(yǎng)基中，并且通過蛋白A層析純化。圖5和6表示抗體2F8，5F12和6B3在ELISA中是225抗體的中度至強競爭劑，是EGF與EGFR結合的強阻斷劑。這在以ELISA形式進行的測定中是很明顯的或通過人A431表皮樣癌細胞上的FACS而很明顯。在兩種測定中，人抗體與MAb22效果相同或更佳?？贵w2F8，5F12，6B3和6E9在A431細胞表面上也具有相似的結合特征(圖7)。體外EGF/EGFR阻斷和ELISA競爭研究證明，2F8，5F12和6B3抗體與已經(jīng)證明是免疫治療劑的其它的抗EGFR鼠和人抗體具有相似特性(Sato，etal.(1983)Mol.Biol.Med.511-529；Gill，etal.(1984)J.ofBiol.Chem.259(12)7755-776G)。2F8抗體在各種評估中總體上相當于6B3和5F12，或比其更佳。實施例8用EGF受體的人單克隆抗體抑制EGF/TGF-α結合于EGF受體用流式細胞術，ELISA，和配體誘導的自磷酸化的抑制而進行抑制研究。鼠MAbs225或525用作陽性對照。將一種不相關的人IgG同種型對照用作同種型對照。選擇一種單一的人抗體2F8用于所有的其它研究。該抗體在此處也稱作″Humax-EGFRTM″。圖8表示EGF以濃度依賴性方式阻斷2F8的能力。2F8和m225阻斷至相同程度，而EGF的阻斷能力較低。圖9進一步表明2F8的阻斷能力，它有效抑制EGF和TGF-α結合于A431細胞(來源于卵巢表皮樣癌，并且在其表面表達1×106以上EGFR分子的細胞)。使用流式細胞儀分析來測定對2F8結合A431細胞的抑制。在加入2F8前用5(空心柱)或50μg/ml(實心柱)配體預孵育細胞。沒有配體的抗體結合(PBS組)設定為100％。這些結果表明，2F8與配體在EGFR上的相同位點附近或在相同位點結合。實施例9用EGF受體的人單克隆抗體抑制腫瘤細胞激活為評估2F8抑制腫瘤細胞激活的能力，檢驗了2F8對EGF觸發(fā)的細胞應答，如內在酪氨酸激酶活性和伴隨的細胞增殖的激活。EGF或TGF-α結合于EGFR之后的最先發(fā)生的事件之一是誘導受體的自磷酸化。與A431細胞一起孵育EGF導致EGFR(Mr170,000)的酪氨酸磷酸化(圖10A)。盡管2F8本身不激活受體激酶活性，該抗體以劑量依賴性方式阻斷EGF觸發(fā)的EGFR酪氨酸磷酸化，在16.6nM的濃度下具有完全抑制(抗體∶EGF摩爾比，20∶1，圖10A)。用抗體和TGF-α處理細胞，表明2F8在66nM的濃度下完全阻斷酪氨酸磷酸化(抗體∶TGF-α摩爾比，7,3∶1，圖10B)。EGF/TGF-α與受體的結合導致細胞激活，反映于細胞增殖。因此，評估了2F8對腫瘤細胞(A431，MDA-MD-468和HN5細胞)生長的抑制作用。在沒有外源性EGF存在下進行這些實驗。小鼠抗體用作對照。Humax-EGFR以濃度依賴性方式抑制A431細胞生長，最大抑制50％，該水平相似于小鼠抗體225所獲得的水平(圖14)。對照抗體對細胞增殖無作用(圖14)。用兩種其它細胞系以相似水平也獲得了生長抑制(HN5和MDA-MB468，B和C)。由于沒有向培養(yǎng)物中加入外源性EGF，這些結果表明2F8阻斷自分泌刺激，并因此抑制自分泌EGF/TGF-α誘導的腫瘤細胞激活的能力。實施例10EGF受體的人單克隆抗體誘導ADCCADCC是由抗體識別腫瘤細胞所觸發(fā)的強效免疫效應機制。為了評估人PMN細胞在2F8存在下殺滅A431細胞，用51Cr加載細胞，隨后用抗體和效應細胞(PMN)孵育過夜。孵育后，測量鉻釋放。如圖14所示，2F8能夠使用人PMN誘導抗A431細胞的ADCC。2F8能夠介導PMN誘導的45％的A431靶細胞的裂解，該比例高于用MAb425所觀察到的結果(圖14)。重要的是，盡管能夠募集免疫效應細胞和誘導ADCC，2F8不能誘導補體介導的腫瘤細胞裂解。實施例11EGF受體的人單克隆抗體防止腫瘤形成為表明HuMAb2F8防止無胸腺鼠模型中腫瘤形成的能力，在第0天用200μ1PBS中的3×106個腫瘤細胞對每組6只的各組小鼠進行脅腹皮下注射。隨后，在第1天(75μg/200μl)，第3天(25μg/200μl)，和第5天(25μg/200μl)(箭頭)用HuMAb2F8(實心正方形)腹膜內注射小鼠，用腹膜內注射人IgG1-κMAb作為對照(空心圓形)。數(shù)據(jù)表示為平均腫瘤體積+SEM，并且表示產(chǎn)生相似結果的3次實驗。圖14表示與鼠抗EGFRMAb(m225)相比，用HuMAb2F8清除建立的A431腫瘤異種移植物。在第0天用200μlPBS中的3×106個腫瘤細胞對小鼠進行脅腹皮下注射。在第10天，將小鼠隨機分配至治療組，并且在第12天(75μg/200μl)，第14天(25μg/200μl)，和第16天(25μg/200μl)(箭頭)用HuMAb2F8(實心正方形，2F8短期)或鼠抗-EGFRMAb225(實心三角形，m225短期)進行治療。此外，包括第12天接受75μg/200μlHuMAb2F8或m225，繼續(xù)在第14，16，19，22，26，29，33，36和40天接受25μg/200μlHuMAb2F8或m225的各組(空心正方形，2F8長期；空心三角形，m225長期)。數(shù)據(jù)表示為平均腫瘤體積+SEM，并且表示產(chǎn)生相似結果的3次實驗。黑色箭頭表示短期治療的治療天數(shù)，空心箭頭表示長期治療的治療天數(shù)。等同方案本領域的技術人員將認識到，或可以用常規(guī)實驗確定這里描述的本發(fā)明的特定實施方案的許多等同方案。這些等同方案將包含在下列權利要求的范圍內。引入?yún)⒖荚诖艘玫乃袑＠?，未授權的專利申請和其它文獻在此全文引入作為參考。序列表<110>Genmab，Inc.etal.<120>表皮生長因子受體(EGFR)的人單克隆抗體<130>GMI-020PC<150>US60/298,172<151>2001-06-13<160>4<170>FastSEQforWindowsVersion4.0<210>1<211>375<212>DNA<213>人(Homosapiens)<400>1caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactc60tcctgtgcagcgtctggattcaccttcagtacctatggcatgcactgggtccgccaggct120ccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatgggatgatggaagttataaatactat180ggagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtat240ctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagagatggt300attactatggttcggggagttatgaaggactactttgactactggggccagggaaccctg360gtcaccgtctcctca375<210>2<211>125<212>PRT<213>人<400>2GlnValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlyValValGlnProGlyArg151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerThrTyr202530GlyMetHisTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045AlaValIleTrpAspAspGlySerTyrLysTyrTyrGlyAspSerVal505560LysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyr65707580LeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgAspGlyIleThrMetValArgGlyValMetLysAspTyrPhe100105110AspTyrTrpGlyGlnGlyThrLeuValThrValSerSer115120125<210>3<211>321<212>DNA<213>人<400>3gccatccagttgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcacc60atcacttgccgggcaagtcaggacattagcagtgctttagtctggtatcagcagaaacca120gggaaagctcctaagctcctgatctatgatgcctccagtttggaaagtggggtcccatca180aggttcagcggcagtgaatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcct240gaagattttgcaacttattactgtcaacagtttaatagttacccgctcactttcggcgga300gggaccaaggtggagatcaaa321<210>4<211>107<212>PRT<213>人<400>4AlaIleGlnLeuThrGlnSerProSerSerLeuSerAlaSerValGly151015AspArgValThrIleThrCysArgAlaSerGlnAspIleSerSerAla202530LeuValTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAlaProLysLeuLeuIle354045TyrAspAlaSerSerLeuGluSerGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGluSerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerSerLeuGlnPro65707580GluAspPheAlaThrTyrTyrCysGlnGlnPheAsnSerTyrProLeu859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysValGluIleLys10010權利要求1.一種結合于人EGFR的分離的人單克隆抗體，其中該抗體與另一種抗體結合EGFR上的相同表位，所述另一種抗體包含具有SEQIDNO2所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有SEQIDNO4所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。2.權利要求1的人抗體，包含具有SEQIDNO2所示的氨基酸序列或與SEQIDNO2具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，以及具有SEQIDNO4所示的氨基酸序列或與SEQIDNO4具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。3.權利要求1或2的人抗體，包含具有SEQIDNO2所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，以及具有SEQIDNO4所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。4.權利要求1或2的人抗體，包含具有圖15B所示的CDR3氨基酸序列的重鏈CDR3區(qū)，以及具有圖15A所示的CDR3氨基酸序列的輕鏈CDR3區(qū)。5.前述權利要求之任一項的人抗體，其中該抗體是IgG1，IgA，IgE，IgM，IgG4或IgD抗體。6.權利要求5的人抗體，其中該抗體是IgG1抗體。7.權利要求6的人抗體，其中該抗體是抗體2F8。8.權利要求1-6之任一項的人抗體，其中該抗體是Fab片段或單鏈抗體。9.前述權利要求之任一項的人抗體，其中該抗體抑制EGFR配體結合人EGFR。10.權利要求9的人抗體，其中該抗體使EGFR配體與人EGFR的結合阻斷至少約50％。11.權利要求9或10的人抗體，其中該EGFR配體是EGF或TGF-α。12.前述權利要求之任一項的人抗體，其中該抗體以至少約108M-1的平衡締合常數(shù)(KA)結合于人EGFR。13.權利要求12的人抗體，其中該抗體以至少約109M-1的平衡締合常數(shù)(KA)結合于人EGFR。14.前述權利要求之任一項的人抗體，其中該抗體不激活補體。15.前述權利要求之任一項的人抗體，它抑制EGF或TGF-α誘導的EGFR自磷酸化。16.前述權利要求之任一項的人抗體，它結合于表達EGFR的細胞并且(a)抑制該細胞的生長，(b)誘導人效應細胞存在下的細胞裂解(ADCC)或(c)不誘導補體介導的細胞裂解。17.權利要求16的人抗體，其中該表達EGFR的細胞是(a)選自膀胱細胞、乳腺細胞、結腸細胞、腎細胞、卵巢細胞、前列腺細胞、腎細胞、鱗狀細胞和非小細胞肺細胞的腫瘤細胞，(b)滑膜成纖維細胞或(c)角質形成細胞。18.前述權利要求之任一項的人抗體，其中該抗體由包含與永生化細胞融合的B細胞的雜交瘤產(chǎn)生，此B細胞由轉基因非人動物獲得，此轉基因動物具有含有人重鏈轉基因和人輕鏈轉基因的基因組，或者該抗體由包含編碼人重鏈和人輕鏈的核酸的轉染瘤產(chǎn)生。19.一種雜交瘤，包含與永生化細胞融合的B細胞，此B細胞由轉基因非人動物獲得，此轉基因動物具有含有人重鏈轉基因和人輕鏈轉基因的基因組，其中該雜交瘤產(chǎn)生可檢測量的權利要求1-18之任一項的抗體或其抗原結合部分。20.一種轉染瘤，包含編碼人重鏈和人輕鏈的核酸，其中該轉染瘤產(chǎn)生可檢測量的權利要求1-18之任一項的抗體或其抗原結合部分。21.權利要求20的轉染瘤，包含編碼人重鏈可變區(qū)和人輕鏈可變區(qū)的核酸，所述的人重鏈可變區(qū)具有SEQIDNO1所示的核苷酸序列，所述的人輕鏈可變區(qū)具有SEQIDNO3所示的核苷酸序列。22.一種表達權利要求1-18之任一項的抗體的轉基因非人動物，其中此轉基因非人動物具有含有人重鏈轉基因和人輕鏈轉基因的基因組。23.一種制備權利要求1-18之任一項的抗體的方法，包括將分離自轉基因非人動物的B細胞與骨髓瘤細胞融合，以形成永生化的分泌該抗體的雜交瘤細胞，其中所述轉基因非人動物具有含有人重鏈轉基因和人輕鏈轉基因的基因組，并且用EGFR或表達EGFR的細胞免疫過，以便由該動物的B細胞產(chǎn)生抗體。24.一種雙特異性分子，包含權利要求1-18之任一項的人抗體和對人抗原呈遞細胞(APC)或對人Fc受體的結合特異性。25.權利要求24的雙特異性分子，其中該Fc受體是人FcγRI或人Fcα受體。26.權利要求24或25的雙特異性分子，它與Fc受體在該受體的免疫球蛋白結合位點以外的位點結合。27.一種組合物，包含權利要求1-18之任一項的人抗體和可藥用載體。28.一種組合物，包含權利要求1-18之任一項的兩種或更多種人抗體或其抗原結合部分的組合，其中每種所述抗體或其抗原結合部分與EGFR的不同表位結合。29.一種組合物，包含權利要求1-18之任一項的人抗體和一種化療劑。30.一種免疫毒素，包含連接于細胞毒性劑的權利要求1-18之任一項的人抗體。31.一種抑制表達EGFR的細胞生長的體外方法，包括將細胞與有效量的權利要求1-18之任一項的抗體相接觸，使得表達EGFR的細胞的生長被抑制，其中該抗體抑制EGFR配體結合人EGFR。32.一種誘導表達EGFR的細胞的細胞裂解的體外方法，包括在效應細胞存在下，將表達EGFR的細胞與權利要求1-18之任一項的抗體相接觸，從而發(fā)生表達EGFR的細胞的細胞裂解。33.權利要求31或32的方法，其中該細胞選自膀胱細胞、乳腺細胞、結腸細胞、腎細胞、卵巢細胞、前列腺細胞、腎細胞、鱗狀細胞和非小細胞肺細胞、滑膜成纖維細胞和角質形成細胞。34.權利要求1-18之任一項的人抗體在制備用于治療或預防由EGFR表達介導的疾病的藥物中的用途。35.權利要求34的用途，其中該疾病是癌癥或自身免疫病。36.權利要求35的用途，其中該癌癥選自膀胱癌、乳腺癌、結腸癌、腎癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌以及頭和頸癌，并且該自身免疫病涉及表皮過度增殖或是炎癥性關節(jié)炎。37.權利要求34-36之任一項的用途，其中該人抗體與針對Fc受體的結合特異性或與細胞毒素偶聯(lián)。38.權利要求34-37之任一項的用途，其中所述的治療或預防進一步包括共同給予另一種治療劑。39.權利要求38的用途，其中該治療劑選自阿霉素(阿得里亞霉素)、順鉑、硫酸博萊霉素、卡氮芥、苯丁酸氮芥和環(huán)磷酰胺羥基脲。40.含有權利要求1-18之任一項的人抗體和另一種治療劑的產(chǎn)品，該產(chǎn)品作為用于共同給藥以治療或預防由EGFR表達介導的疾病的聯(lián)合制劑。41.檢測樣品中EGFR抗原或表達EGFR的細胞存在的方法，包括在允許抗體或其部分與EGFR之間形成復合物的條件下，將樣品與權利要求1-18之任一項的抗體相接觸；以及檢測復合物的形成。42.一種表達載體，包含編碼權利要求1-18之任一項的人抗體的輕鏈、重鏈或輕鏈和重鏈兩者的可變區(qū)的核苷酸序列。43.權利要求42的表達載體，進一步包含編碼與EGFR結合的人抗體的輕鏈、重鏈或輕鏈和重鏈兩者的恒定區(qū)的核苷酸序列。44.權利要求42或43的表達載體，包含編碼重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的核酸，所述的重鏈可變區(qū)具有SEQIDNO1所示的核苷酸序列，所述的輕鏈可變區(qū)具有SEQIDNO3所示的核苷酸序列。45.包含權利要求42-44之任一項的表達載體的轉染瘤。全文摘要公開了特異性與人EGFR結合的分離的人單克隆抗體及相關的基于抗體的組合物和分子。人抗體可以由能夠通過進行V－D－J重組產(chǎn)生人單克隆抗體的多個同種型和通過進行V－D－J重組和同種型轉換產(chǎn)生人單克隆抗體同種型的轉基因小鼠產(chǎn)生。也公開了包含人抗體的藥物組合物、產(chǎn)生人抗體的非人轉基因動物和雜交瘤，以及使用人抗體的治療和診斷方法。文檔編號C12P21/00GK1966525SQ20061014841公開日2007年5月23日申請日期2002年6月13日優(yōu)先權日2001年6月13日發(fā)明者J·范德溫克爾,M·A·范迪克,A·F·格里特森,E·哈爾克申請人:根馬布股份公司