專利名稱：栓菌ah28－2固態(tài)發(fā)酵生產漆酶的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種工業(yè)用酶的制備方法，確切地說是用栓菌AH28-2固態(tài)發(fā)酵生產漆酶的方法，屬于應用微生物的技術領域。
二、技術背景漆酶(Laccase，EC 1.10.3.2)是一種含銅的多酚氧化酶，能夠催化氧化多種酚類和非酚類化合物的氧化，同時伴隨著氧還原成水。漆酶廣泛存在于植物、細菌、昆蟲，特別是白腐真菌中。漆酶作用底物廣泛、催化效率高，在生物制漿和漂白、紡織染料的降解和轉化、紡織纖維的軟化細化、新型藥物開發(fā)、新型生物傳感器的研制及新型能源開發(fā)等領域具有潛在重要應用價值，近年來成為國際酶工程學和環(huán)境科學交叉領域研究的熱點之一[洪宇植，肖亞中等.Trametes sp.AH28-2漆酶A的誘導合成及其基因5′-端調控區(qū)的克隆與分析.生物工程學報，2005，21(4)548-552；繆靜，姜竹茂.漆酶的最新研究進展.煙臺師范學院學報(自然科學版)，2001，17(2)146-150；王華等.真菌漆酶及其在環(huán)境污染控制中的應用.環(huán)境科學技術，2003，26(4)58-60]。
目前，真菌漆酶大多采用人工合成培養(yǎng)基液態(tài)深層發(fā)酵進行制備，制備過程中需要添加芳香類化合物和/或重金屬離子作為誘導物，成本高，產量低；并且，毒性誘導物的引入使得發(fā)酵液后處理難度大，易造成環(huán)境污染，難以進行大規(guī)模工業(yè)化生產[肖亞中等.影響白腐真菌AH28-2菌株漆酶合成的因子和發(fā)酵條件.生物工程學報，2001，17(5)579-583；王佳玲等.白腐菌漆酶的研究進展.微生物學通報，1998，25(4)233-236；蘆國營等.固態(tài)發(fā)酵生產木質素酶研究進展.飼料工業(yè)，2005，26(10)29-33]。
固態(tài)發(fā)酵(Solid-state fermentation)技術是利用天然底物為碳源及能源，或利用惰性底物作固體支持物，在體系少水的條件下進行的發(fā)酵過程[徐福建等.固態(tài)發(fā)酵技術在資源環(huán)境中的應用.生物技術通報，2002，327-30]。與液體發(fā)酵工藝相比，固態(tài)發(fā)酵生產漆酶具有以下優(yōu)點(1)培養(yǎng)基簡單且來源廣泛，多為廉價的天然基質或工業(yè)生產的下腳料；(2)設備投資少，能耗低，發(fā)酵的產率較高；(3)酶合成無需毒性物質誘導，后加工處理方便，環(huán)境污染少。另外，固態(tài)發(fā)酵的過程一般不需要嚴格的無菌操作。因此，固態(tài)發(fā)酵技術是實施真菌漆酶綠色高效生產的重要途徑之一[吳其飛等.固態(tài)發(fā)酵新技術與反應器的研究進展.飼料工業(yè)，2003，24(8)43-47；徐福建等.固態(tài)發(fā)酵工程研究進展.生物工程進展，2002，22(1)44-48]。近年來，國外學者開展了相關初步研究(表1)。
表1固態(tài)發(fā)酵生產木質素酶

(S.Rodriguez Couto，MA.Sanroman.Application of solid-state fermentation to Ligninolyticenzyme production[J].Biochemical Engineering Journal，2005，22(3)211-219)國內學者對真菌漆酶的研究主要集中于液體發(fā)酵條件，以及漆酶的酶學性質等方面，固態(tài)發(fā)酵生產真菌漆酶鮮見報道，且實驗菌株以變色多孔菌(Polyporus versicolor)為主[王佳玲等.白腐菌漆酶的研究進展.微生物學通報，1998，25(4)233-236]。上世紀末，中科院廣州化學研究所纖維素開放實驗室以稻草為基本培養(yǎng)基，研究了外加營養(yǎng)碳源、氮源以及微量元素等對貝殼狀革耳菌(Panus conchatus)產漆酶的影響，最高酶活為60U/g(ABTS法)[王彩華等.貝殼狀革耳菌和黃孢平革菌固體培養(yǎng)酶系比較.微生物學報，1999，39(2)127-131；胡平平，付時雨等.固體培養(yǎng)條件下外加營養(yǎng)碳源及微量元素對貝殼狀革耳菌酶系產生的影響.纖維素科學與技術，2001，9(4)44-50；胡平平，付時雨等.固體培養(yǎng)條件下氮源對Panus conchatus酶系及漆酶同工酶的影響.纖維素科學與技術，2001，9(1)1-7；付時雨，余惠生.貝殼狀革耳菌在固體及液體培養(yǎng)過程漆酶同工酶的產生研究.纖維素科學與技術，1998，6(3)32-37]。王宏勛等報道，側耳屬白腐菌Pleurotus sp.在玉米稈和稻草稈基質上生長良好，但漆酶酶活很低；在木屑基質上生長較差，但漆酶酶活最高，可達4500U/g(ABTS法)[王宏勛等.不同秸稈基質中白腐真菌漆酶分泌動力學研究.華中科技大學學報(自然科學版)2005，33(8)90-93]。靖德兵等采用均勻設計和雙溫度培養(yǎng)法進行彩絨革蓋菌固體發(fā)酵生產木質素酶，研究發(fā)現(xiàn)在玉米漿和麩皮固體培養(yǎng)基上，少量Tween80有利于木質素酶的產生；在自然補給氧氣、濕度60％的條件下，經過20天的發(fā)酵，風干并粉碎發(fā)酵曲，所得粗酶粉的漆酶活力為1216U/g(鄰聯(lián)甲苯胺法)[靖德兵等.彩絨革蓋菌固體發(fā)酵生產木質素酶工藝優(yōu)化研究.微生物學通報，2004，31(5)19-23]。

發(fā)明內容
本發(fā)明使用申請人自主選育的新型漆酶高產菌株栓菌AH28-2進行固態(tài)發(fā)酵生產高酶活的漆酶。本方法包括種液制備、固體培養(yǎng)基的配制、滅菌、接種和發(fā)酵以及發(fā)酵后的后處理，其特征是按下述步驟進行a.種液制備將栓菌AH28-2菌絲體接種在經滅菌處理的綜合馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，25～30℃搖床培養(yǎng)三天，勻漿制成菌懸液。
b.發(fā)酵產酶將上述菌懸液以5～15％接種量接入固體培養(yǎng)基中，于20～28℃條件下發(fā)酵20～30天，環(huán)境濕度保持在40～70％。
c.漆酶制劑制備向發(fā)酵完畢的培養(yǎng)物中加入15～30倍質量的蒸餾水，2～6℃浸提3～8小時，過濾；濾液經丙酮沉淀去雜，超濾濃縮10～20倍后凍干。
所述的固體培養(yǎng)基有以下組分和質量份數(shù)油料作物秸桿3～5份糧食麩皮1～3份花生殼粉1～2份水 2～6倍。
所述的油料作物秸桿選自油菜秸桿、芝麻秸桿中的一種或兩種混合秸桿，將其破碎至長3cm以下即可使用，優(yōu)選油菜秸桿。
所述的糧食麩皮選自小麥麩皮、大米米糠等，可單獨使用，也可混合使用，優(yōu)選小麥麩皮。
花生殼粉過60目篩。
水即自來水，自然pH，按固體基質總質量的2～6倍加入。
優(yōu)選的固體培養(yǎng)基為油菜秸桿3～5份小麥麩皮1～3份花生殼粉1～2份水 2～6倍。
所述的后處理是發(fā)酵培養(yǎng)結束后向培養(yǎng)物中加入蒸餾水，加水量為初始固體基質質量的15～30倍，2～6℃下浸提3～8小時，過濾分離，濾液先經丙酮沉淀，去除雜質后超濾濃縮10～20倍，最后將濃縮液冷凍干燥即得塊狀漆酶制劑。
本發(fā)明操作簡單，所用固體基質均為廉價的農副產品，漆酶生產過程中無需添加水以外的其它物質，成本極為低廉；以秸桿等農副產品為生產原料，不僅能夠變廢為寶，為秸桿等廢棄物提供一條工業(yè)化應用的有效途徑，還可減少因焚燒造成的環(huán)境污染。本方法制備的漆酶酶活高，浸提液酶活達2100U/g干培養(yǎng)物，凍干后酶粉的漆酶活力在8000U/g(ABTS法)以上。
申請人自主選育的栓菌AH28-2(Trametes sp.AH28-2)已于2005年11月22日送中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏。保藏號為CCTCC NOM 205134。
四、具體實施方案1.栓菌AH28-2菌懸液(種液)的制備將在綜合馬鈴薯培養(yǎng)基(CPDA20％馬鈴薯汁、3‰KH2PO4、1.5‰MgSO4·7H2O、2％葡萄糖、0.04％VB1、2％瓊脂)斜面上4℃保存的栓菌AH28-2接種于已高溫滅菌的CPDA液體培養(yǎng)基(不加瓊脂)中，28℃、100～200rpm培養(yǎng)2～3天，3000rpm勻漿約10s制成菌懸液。
2.培養(yǎng)基的制備將干燥的油料作物秸桿破碎至長2厘米，備用。將干燥的花生殼粉碎過60目篩備用。
(1)取油菜秸桿2份，芝麻秸桿1份，小麥麩皮1份，花生殼粉1份，按固體基質質量的2～6倍量加入自來水，攪拌均勻，121℃滅菌40～60min，冷卻后即可接種。
(2)取油菜秸桿2份，芝麻秸桿2份，小麥麩皮2份，米糠1份，花生殼粉2份，以后操作同例(1)。
(3)取油菜秸桿3份，芝麻秸桿2份，小麥麩皮2份，花生殼粉1份，以后操作同例(1)。
(4)取油菜秸桿3份，小麥麩皮1份，花生殼粉1份，以后操作同例(1)。
(5)取油菜秸桿5份，小麥麩皮3份，花生殼粉2份，以后操作同例(1)。
(6)取油菜秸桿3份，小麥麩皮1份，花生殼粉2份，以后操作同例(1)。
(7)取油菜秸桿3份，小麥麩皮3份，花生殼粉1份，以后操作同例(1)。
(8)取油菜秸桿5份，小麥麩皮1份，花生殼粉2份，以后操作同例(1)。
(9)取油菜秸桿5份，小麥麩皮3份，花生殼粉1份，以后操作同例(1)。
(10)取油菜秸桿4份，小麥麩皮3份，花生殼粉1.5份，以后操作同例(1)。
3.接種與發(fā)酵培養(yǎng)將制備的菌懸液按5～15％質量分數(shù)接種于已滅菌的(1)～(10)的任一固體培養(yǎng)基中，20～28℃培養(yǎng)20～30天，至產酶高峰。
4.后處理在漆酶高峰期向培養(yǎng)物加入蒸餾水，加入量約為初始固體基質質量的15～30倍；2～6℃浸提3～8小時，八層紗布過濾，濾液經20％丙酮沉淀去雜后，超濾濃縮10～20倍，再經冷凍干燥即可得到塊狀漆酶制劑。
5.具體操作例1000毫升三角瓶中裝入20g油菜秸桿，6g小麥麩皮和4g花生殼粉，加入自來水100ml，攪拌均勻，121℃滅菌40min；冷卻后接8ml種液，24℃培養(yǎng)26天；向培養(yǎng)物中加入500ml蒸餾水，4℃浸提5h，浸提液漆酶活力達2100U/g干培養(yǎng)物；超濾濃縮15倍，經凍干，酶粉漆酶活力達8310U/g(ABTS法)。
權利要求
1.一種栓菌AH28-2固態(tài)發(fā)酵生產漆酶的方法，包括種液制備、固體培養(yǎng)基的配制、滅菌、接種和發(fā)酵以及發(fā)酵后的后處理，其特征在于按下述步驟進行a、種液制備將栓菌AH28-2菌絲體接種在經滅菌處理的綜合馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，25～30℃搖床培養(yǎng)三天，勻漿制成菌懸液；b、發(fā)酵產酶將上述菌懸液以5～15％接種量接入固體培養(yǎng)基中，于20～28℃條件下發(fā)酵20～30天，環(huán)境濕度保持在40～70％；c、漆酶制劑制備向發(fā)酵完畢的培養(yǎng)物中加入15～30倍質量的蒸餾水，2～6℃浸提3～8小時，過濾；濾液經丙酮沉淀去雜，超濾濃縮10～20倍后凍干。
2.根據權利要求1所述的生產漆酶的方法，其特征在于固體培養(yǎng)基的組分和質量份數(shù)如下油料作物秸桿3～5份糧食麩皮1～3份花生殼粉1～2份水 固體基質的2～6倍。
3.根據權利要求1或2所述的生產漆酶的方法，其特征在于固體培養(yǎng)基有以下組分和質量份數(shù)油菜秸桿3～5份小麥麩皮1～3份花生殼粉1～2份水 固體基質的2～6倍。
全文摘要
一種栓菌AH28－2固態(tài)發(fā)酵生產漆酶的方法，是將栓菌AH28－2菌株種液接種在經滅菌的固體培養(yǎng)基上于20～28℃條件下發(fā)酵培養(yǎng)20～30天。固體培養(yǎng)基由3～5份油料作物秸稈、1～3份糧食麩皮、1～2份花生殼粉和2～6倍質量的水組成，自然pH。發(fā)酵結束后加水浸提，經沉淀除雜、超濾濃縮和凍干得到塊狀漆酶，酶活在8000U/g(ABTS法)以上。
文檔編號C12N1/14GK101045918SQ20061014614
公開日2007年10月3日 申請日期2006年11月11日 優(yōu)先權日2006年1月5日
發(fā)明者肖亞中, 孫芹英, 房偉, 洪宇植, 張敏, 葛宏華 申請人:安徽大學