專利名稱：在芽孢桿菌中表達(dá)重組蛋白的發(fā)酵工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)，具體涉及分泌重組蛋白的基因工程芽孢桿菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化。
一般來說，利用基因工程手段生產(chǎn)特定的重組蛋白，我們期望目標(biāo)蛋白能夠分泌到胞外。外源蛋白分泌到胞外，避免了外源蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)集聚抑制宿主細(xì)胞的生長，和可能給宿主細(xì)胞帶來的毒害。許多外源蛋白要成為有生物活性的蛋白還需要經(jīng)過部分的修飾，而這些修飾作用有相當(dāng)部分是在分泌的過程中進(jìn)行的。能夠從發(fā)酵液中直接提取目標(biāo)產(chǎn)物，避免了破碎細(xì)胞和從混雜細(xì)胞碎片和內(nèi)容物的發(fā)酵液中提純產(chǎn)物，對于工業(yè)化生產(chǎn)來說，生產(chǎn)效率和成本及目標(biāo)產(chǎn)物的純度都將極大地得到優(yōu)化。
芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)有以下優(yōu)點(diǎn)1、能夠把有功能的蛋白質(zhì)分泌到胞外，2、非致病性，3、沒有明顯的偏愛密碼子(Harwood，C．R．(ed)，Bacillus，Plenum，New York，1989)。芽孢桿菌對生長環(huán)境要求不高，很容易達(dá)到較高細(xì)胞密度。這些優(yōu)越性為芽孢桿菌應(yīng)用于工業(yè)化大生產(chǎn)帶來了巨大優(yōu)勢。
表達(dá)系統(tǒng)確定后，培養(yǎng)基的成分就成為重組蛋白能否達(dá)到高表達(dá)水平的重要影響因素。生產(chǎn)重組蛋白的培養(yǎng)基可以是合成培養(yǎng)基，或是天然培養(yǎng)基。但都應(yīng)是液體培養(yǎng)基。一般地，培養(yǎng)基組成成分包括碳源，如葡萄糖；氮源，如酵母膏，蛋白胨，牛肉膏，尿素等；無機(jī)鹽，如Na+，K+，Mg2，Ca2+，檸檬酸鈉等。葡萄糖作為最通用的培養(yǎng)用碳源存在于培養(yǎng)基中。當(dāng)表達(dá)質(zhì)粒中帶有對葡萄糖濃度敏感的啟動子，如p43等時(shí)，重組蛋白能否達(dá)到高表達(dá)水平與培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度有很密切的關(guān)系。高濃度的葡萄糖會產(chǎn)生分解代謝產(chǎn)物阻遏現(xiàn)象，抑制基因表達(dá)(Milton H．Saier，Jr．，Biotechnology and Bioengineering 1998；V．58；No．2-3，pp．170-174)。若要消除或降低其副面影響，只有在發(fā)酵過程中采用低濃度流加葡萄糖的工藝，這就需要增加人力，物力來監(jiān)測葡萄糖濃度，控制流加速度，成本和人工的耗費(fèi)對工業(yè)化擴(kuò)大生產(chǎn)是不利的。
因此，在發(fā)酵培養(yǎng)基中采用其它碳源的成分來代替葡萄糖以改進(jìn)發(fā)酵工藝，提高重組蛋白的表達(dá)量及生產(chǎn)率的研究工作，是很有實(shí)用意義的。
為此，本發(fā)明的目的是提供一種在芽孢桿菌中表達(dá)重組蛋白的發(fā)酵工藝，其中在發(fā)酵培養(yǎng)基中采用淀粉作為主要碳源的成分，可以大大提高重組蛋白的生產(chǎn)率。
本發(fā)明提供一種在芽孢桿菌中表達(dá)重組蛋白的發(fā)酵工藝，其中在發(fā)酵培養(yǎng)基中通用的葡萄糖以另一種價(jià)廉方便的碳源淀粉代替。在整個(gè)培養(yǎng)過程中，淀粉不斷為枯草桿菌分泌的胞外酶分解成為寡糖片段，為菌體吸收利用，成為一種天然，無需調(diào)控的流加系統(tǒng)，不僅免除了人工流加碳源的繁瑣工藝，而且菌體的生長和表達(dá)水平均有很大的提高。
本發(fā)明所述宿主菌芽孢桿菌包括枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌或巨大芽孢桿菌等。由于本發(fā)明發(fā)酵培養(yǎng)基中采用淀粉代替葡萄糖，因此，可適用于表達(dá)質(zhì)粒中帶有如p43，HpaII等對葡萄糖敏感的啟動子。
本發(fā)明在芽孢桿菌中表達(dá)重組蛋白的發(fā)酵工藝，特別適用于發(fā)酵罐水平的發(fā)酵工藝。發(fā)酵工藝包括三個(gè)步驟a．一級種子培養(yǎng)將液氮保存的菌種接種至3mlLB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)液涂劃LB瓊脂平板至出現(xiàn)清晰單菌落，挑取一個(gè)單菌落接入3mlLB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
b．二級種子培養(yǎng)將一級種子培養(yǎng)液接入50mlLB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
c．發(fā)酵罐培養(yǎng)將二級種子培養(yǎng)液接入1L發(fā)酵培養(yǎng)基中，在發(fā)酵罐中培養(yǎng)，發(fā)酵過程控制參數(shù)如下溫度25-40℃；pH5．0-8．5；通氣量0．2-1．6L／min；攪拌速率250-950r／min；溶氧控制在15-30％；種子接種量為1-10％。
在發(fā)酵罐培養(yǎng)流程中用的發(fā)酵培養(yǎng)基采用淀粉作為主要碳源的成分。發(fā)酵培養(yǎng)基的組成如下所示組分份(重量)蛋白胨 1-30酵母膏 1-30檸檬酸鈉0．1-5K2HPO41-5淀粉5-100將以上各組分混合，加水至重量1000份，高壓滅菌。
在下面本發(fā)明基于中國專利申請CN 99113885．6中報(bào)道的青霉素G?；?penicillin acylase，EC 3．5．1．11簡稱PGA)作為重組蛋白的一例，采用表達(dá)PGA的枯草芽孢桿菌基因工程菌株pga-SIBAS205，闡述通過優(yōu)化帶有重組蛋白基因的枯草桿菌菌株的生長及表達(dá)條件來提高重組蛋白的生產(chǎn)率。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明利用淀粉作為培養(yǎng)基中的主要碳源可以大大提高細(xì)胞密度和重組蛋白產(chǎn)量，而且淀粉在培養(yǎng)基中的濃度不會對細(xì)胞生長和重組蛋白的分泌構(gòu)成影響。與之相比，重組蛋白的分泌對培養(yǎng)基中存在的葡萄糖濃度十分敏感，較高濃度的葡萄糖會引起分解代謝產(chǎn)物阻遏而抑制重組蛋白的分泌。表1列出不同碳源對PGA分泌量的影響(重組細(xì)胞在含有或不含碳源的LB培養(yǎng)基中，37℃生長48小時(shí))。
表1不同碳源對PGA分泌量的影響
*和**參見表2中的附注培養(yǎng)基中淀粉的濃度范圍5g／L-100g／L。在發(fā)酵罐水平，淀粉濃度低于30g／L時(shí)，隨濃度增大，重組蛋白產(chǎn)率增大；而淀粉濃度在30g／L-60g／L之間，重組蛋白的生長及表達(dá)已經(jīng)區(qū)別不大。若盲目增大碳源濃度，其結(jié)果會使培養(yǎng)基粘稠，影響溶氧水平，對原材料也是一種浪費(fèi)。
又以青霉素G?；钢亟M蛋白為例，在相同表達(dá)系統(tǒng)的不同優(yōu)化條件下，重組蛋白的表達(dá)情況如表2所示。優(yōu)化后PGA的生產(chǎn)率比優(yōu)化前提高8．5-9．3倍。
本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)中國專利申請CN 99113885．6采用組成型表達(dá)的基因工程枯草桿菌作為重組蛋白生產(chǎn)菌，目標(biāo)蛋白產(chǎn)生速度快，生產(chǎn)菌傳代穩(wěn)定，生產(chǎn)工藝簡化，本發(fā)明在此基礎(chǔ)上，采用淀粉作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的主要碳源成分，又進(jìn)一步將重組蛋白的生產(chǎn)效率提高到一個(gè)新的水平。而且整個(gè)發(fā)酵過程條件比較粗放，不需要復(fù)雜的控制過程，十分有利于工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用。
本發(fā)明通過以下實(shí)施例作進(jìn)一步闡述，但并不限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例11、菌種枯草芽孢桿菌基因工程菌株pga-SIBAS205(參見CN99113885．6)。
2、培養(yǎng)基(1)種子培養(yǎng)基組成酵母膏 6．25g蛋白胨 10g氯化鈉 10g將以上各組分混合，加水至重量1000g，高壓滅菌。
(2)發(fā)酵培養(yǎng)基組成蛋白胨 15g酵母膏 25g檸檬酸鈉 1gK2HPO43g淀粉 30g將以上各組分混合，加水至重量1000g，高壓滅菌。
3、發(fā)酵(1)種子培養(yǎng)a)一級種子培養(yǎng)液氮保存的菌種接種至3ml試管LB(含卡那霉素10ug／ml)中，37℃，250r／min培養(yǎng)16-18小時(shí)。培養(yǎng)液劃LB瓊脂平板(含卡那霉素10ug／ml)，37℃培養(yǎng)24小時(shí)。取滅菌牙簽挑取一個(gè)單菌落，接入3mlLB培養(yǎng)基中(含卡那霉素10ug／ml)，37℃，250r／min培養(yǎng)16-18小時(shí)。
b)二級種子培養(yǎng)將種子液以5％接種量接入含有50ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，用八層滅菌紗布覆蓋瓶口，37℃，250r／min培養(yǎng)16-18小時(shí)。
(2)發(fā)酵罐培養(yǎng)將二級種子50ml接入含有1L發(fā)酵培養(yǎng)基的B．Braun 1．2L全自動發(fā)酵罐中培養(yǎng)48小時(shí)，pH5．0-8．5。通氣量0．2-1．6L／min，攪拌速率250-950r／min。溶氧控制在15-30％。在泡沫較多的情況下，滴加少量消泡劑泡敵。37℃，培養(yǎng)48小時(shí)。結(jié)果見表2，與優(yōu)化前相比，優(yōu)化后菌體密度提高2．39倍，PGA的生產(chǎn)率提高8．5倍。
實(shí)施例21、菌種枯草芽孢桿菌基因工程菌株pga-SIBAS205(參見CN99113885．6)。
2、培養(yǎng)基(1)種子培養(yǎng)基組成同實(shí)施例1。
(2)發(fā)酵培養(yǎng)基組成蛋白胨20g酵母膏20g檸檬酸鈉 3gK2HPO44g淀粉 60g將以上各組分混合，加水至重量1000g，高壓滅菌。
3、發(fā)酵步驟同實(shí)施例1。結(jié)果見表2，與優(yōu)化前相比，菌體密度提高2．77倍，PGA的生產(chǎn)率提高9．3倍。
表2 PGA在枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中不同優(yōu)化條件下的表達(dá)情況
*細(xì)胞密度的檢測將菌液稀釋一定倍數(shù)，以蒸餾水為空白對照，測定600nm光密度。使光密度測定值在0．1-0．7之間，再以光密度測定值乘以稀釋倍數(shù)，即為A600。
**青霉素G?；富盍挝籙。
青霉素G酰化酶活力測定，采用NIPAB法10μl酶液加入490μl磷酸緩沖液(0．05mol／L，pH 7．5)，37℃溫浴。再加入1ml 37℃預(yù)熱的0．9mg／ml NIPAB溶液(6-硝基-3-苯乙酰胺基苯甲酸)。反應(yīng)4分鐘，加入1ml 95％乙醇終止反應(yīng)，測定405nm吸光度的變化。
空白對照10μl酶液為磷酸緩沖液代替。
酶活力定義為1分鐘內(nèi)水解產(chǎn)生1μmol的6-硝基-3-氨基-苯甲酸所需青霉素?；傅牧繛?單位。
酶活力計(jì)算公式為酶活力濃度(U／ml)=7×A40權(quán)利要求
1.一種在芽孢桿菌中表達(dá)重組蛋白的發(fā)酵工藝，包括一級種子培養(yǎng)，二級種子培養(yǎng)及發(fā)酵罐培養(yǎng)三個(gè)步驟，其特征在于在發(fā)酵罐培養(yǎng)步驟用的發(fā)酵培養(yǎng)基中采用淀粉作為主要碳源的成分。
2.如權(quán)利要求1所述的發(fā)酵工藝，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成如下組分 份(重量)蛋白胨 1-30酵母膏 1-30檸檬酸鈉 0．1-5K2HPO41-5淀粉 5-100將以上各組分混合，加水至重量為1000份。
3.如權(quán)利要求1所述的發(fā)酵工藝，其特征在于所述芽孢桿菌是枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌或巨大芽孢桿菌。
4.如權(quán)利要求3所述的發(fā)酵工藝，其特征在于所述芽孢桿菌是枯草芽孢桿菌。
全文摘要
一種在芽孢桿菌中表達(dá)重組蛋白的發(fā)酵工藝,采用淀粉作為發(fā)酵培養(yǎng)基主要碳源的組分,可以大大提高重組蛋白的生產(chǎn)率。帶有重組蛋白基因的枯草芽孢桿菌基因工程菌株生長條件和表達(dá)條件在優(yōu)化條件下,重組蛋白的生產(chǎn)率可以比未優(yōu)化條件下提高8.5—9.3倍。且培養(yǎng)基成本低廉,發(fā)酵工藝簡單易行,將之應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn),具有廣闊前景。
文檔編號C12P21/00GK1291655SQ0011986
公開日2001年4月18日 申請日期2000年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月1日
發(fā)明者楊晟, 黃鶴, 袁中一 申請人:中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所