專利名稱：：一種體外定向進(jìn)化獲取高活力超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明體外定向進(jìn)化TEM-ie-內(nèi)酰胺酶獲取高活力超廣譜e—內(nèi)酰胺酶(extended-pectrumP-lactamases,ESBL)的方法，屬于醫(yī)藥生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體地說(shuō)主要采用了易錯(cuò)PCR和DNA改組這兩種定向進(jìn)化的策略，對(duì)本室構(gòu)建的一株含TEM-l基因的菌株進(jìn)行了改造。對(duì)突變菌株及其野生株進(jìn)行酶的底物譜酶及其總活力進(jìn)行比較，突變的底物譜擴(kuò)大，對(duì)突變菌株及其野生株進(jìn)行酶的底物譜酶及其總活力進(jìn)行比較，突變使原有的底物譜擴(kuò)大，對(duì)代表性的第三代e—內(nèi)酰胺抗生素CAZ,CTX由不能降解提高到比活為43IU/mg和78IU/mg。
背景技術(shù)：
：體外定向進(jìn)化作為近幾年發(fā)展起來(lái)的一種蛋白質(zhì)改造新策略，可以在未知目標(biāo)蛋白三維結(jié)構(gòu)信息和作用機(jī)制的情況下，通過(guò)對(duì)編碼基因的隨機(jī)突變、重組和定向篩選，獲得具有改進(jìn)功能或全新功能的蛋白質(zhì),使幾百萬(wàn)年的自然進(jìn)化過(guò)程在短期內(nèi)得以實(shí)現(xiàn)，因而是發(fā)現(xiàn)新的生物活性分子和反應(yīng)途徑的重要方法，已在短短幾年內(nèi)取得了令人矚目的成就。體外定向進(jìn)化兩種最常用技術(shù)是易錯(cuò)PCR技術(shù)及其DNA改組技術(shù)易錯(cuò)PCR技術(shù)是一種相對(duì)簡(jiǎn)單、快速廉價(jià)的隨機(jī)突變方法，通過(guò)改變PCR反應(yīng)條件，使擴(kuò)增的基因出現(xiàn)少量堿基錯(cuò)配，從而導(dǎo)致目的基因的隨機(jī)突變(NakaniwaT,TadaT,TakaoM,etal.Aninvitroevaluationofather-mostablepectatelyasebyusingerror-pronePCR.Enzymatic,2004，27:127-131.)。DNA改組由美國(guó)Stemmer于1994年首次提出對(duì)一組基因群體(進(jìn)化上相關(guān)的DNA序列)進(jìn)行重組創(chuàng)造新基因的方法(StemmerWP.RapidevolutionofaproteininvitrobyDNAshuffling.Nature,1994,370(6488):389-391.)。體外分子定向進(jìn)化策略證明進(jìn)化可以發(fā)生在自然界,也可以發(fā)生在試管中。TEM-l型日-內(nèi)酰胺酶是一類(lèi)能水解青霉素類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)和單酰胺類(lèi)抗生素內(nèi)酰胺環(huán)的酶，其特征是能水解第二代及其以下頭孢菌素e-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素酰胺環(huán)的酶。ESBL和廣譜e-內(nèi)酰胺酶(TEM-1、SHV-1)相比，其特征是能水解第三代以上頭孢菌素內(nèi)酰胺環(huán)的酶。絕大部分該類(lèi)酶是由質(zhì)粒介導(dǎo)的周質(zhì)酶，能分泌到細(xì)胞周質(zhì)中切斷信號(hào)肽成為成熟酶，水解0-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素。TEM-1酶基因在天然菌中廣泛存在，并已經(jīng)能夠在大腸桿菌中高效的表達(dá)(Sosa-PeinadoA，MustafiD,MakinenMW.OverexpressionandbiosyntheticdeuteriumenrichmentofTEM-lbeta-lactamaseforstructuralcharacterizationbymagneticresonancemethods,ProteinExprPurif.2000，19(2):235-245.)，但是能夠降解CAZ等第三代以上頭孢菌素并能在大腸桿菌中高效的表達(dá)的TEM型酶基因卻很少。因此，采用定向進(jìn)化的方式獲取TEM-1酶的突變庫(kù)，通過(guò)抗生素篩選獲取能高效降解CAZ等第三代以上頭孢菌素的重組大腸桿菌不失為一種簡(jiǎn)便、高效的方法。定向進(jìn)化技術(shù)獲取的突變酶具有更廣的底物譜，比TEM-l酶更適合作為一種抗生素伴侶，用于預(yù)防及其治療因廣譜e-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素治療造成的腸道菌群失調(diào)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是為了解決上述問(wèn)題，提供一種采用定向進(jìn)化的方法，改造TEM-l酶基因使之表達(dá)產(chǎn)物對(duì)以CAZ為代表的第三代及其以上e-內(nèi)酰胺抗生素的活性提高，從而滿足將該酶開(kāi)發(fā)成為一種抗生素伴侶的需要。該方法能為任何一種e-內(nèi)酰胺酶提高其對(duì)特定底物活性提供范例。本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)方法(1)采用PCR技術(shù)，以篩選的耐e-內(nèi)酰胺抗生素的大腸桿菌總DNA為模板，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增獲取e-內(nèi)酰胺酶基因，插入pMD18T克隆載體上，轉(zhuǎn)入￡.co"JM109，測(cè)序鑒定為T(mén)EM-1基因。(2)配制易錯(cuò)PCR緩沖體系在普通PCR反應(yīng)底基礎(chǔ)上添加MnC12、MgC12、KC1、明膠、dCTP、dTTP等物質(zhì)。(3)把易錯(cuò)PCR產(chǎn)物及其pET24a表達(dá)載體用A^el、/力o1雙酶切后連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入f.co7/BL21(DE3)構(gòu)建易錯(cuò)PCR突變庫(kù)，采用抗生素篩選的方式獲取對(duì)頭孢他啶活性較高的菌株。(4)分別擴(kuò)增獲取活性提高的五株細(xì)菌的TEM-l突變基因，混合后用DNasel消化，純化回收50bp左右的DNA片段。(5)純化的片段互為引物擴(kuò)增，獲得含較多突變位點(diǎn)基因，用NdeI、xhol雙酶切后連接同樣雙酶切的pET24a表達(dá)載體連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入f.6'o/iBL21(DE3)，構(gòu)建DNA改組文庫(kù)，采用抗生素篩選的方式獲取對(duì)頭孢他啶活性最高的菌株。(6)含重組質(zhì)粒的f.co7/BL21(DE3)發(fā)酵，獲取的細(xì)菌溶于3倍體積的無(wú)菌PBS中進(jìn)行超聲破碎，獲取超聲上清。(7)超聲上清中突變TEM-1酶的純化采用親和層析法,Ni親和層析樹(shù)脂結(jié)合突變TEM-1酶融合的His尾，得到純度〉95%、高比活突變TEM-1酵。(8)本發(fā)明酶活力測(cè)定方法采用紫外吸收法測(cè)定酶對(duì)底物的水解率，0D洲,時(shí)測(cè)定CAZ吸光度的變化，計(jì)算酶活力單位。(9)本發(fā)明蛋白的含量測(cè)定采用Bradford法lg/L的牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)液，0W寸在加入樣品lh內(nèi)測(cè)吸光度。本發(fā)明的有益效果本案中采用易錯(cuò)PCR及其DNA改組技術(shù)在體外對(duì)TEM-1進(jìn)行定向進(jìn)化的實(shí)驗(yàn)。篩選的目的菌中TEM-1基因數(shù)個(gè)位點(diǎn)發(fā)生堿基突變，從而使表達(dá)突變酶比天然的TEM-1酶有更廣的底物譜，從而使純化得到的酶蛋白更符合抗生素伴侶的應(yīng)用。通常在基因工程提高目的蛋白產(chǎn)量的同時(shí)，該蛋白會(huì)出現(xiàn)低活性的情況。在本案中TEM-1酶不能降解第三代及其以上P—內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，而通過(guò)定向進(jìn)化的手段得到的突變酶能夠降解第三代及其以上e—內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，該技術(shù)的應(yīng)用避免了繁瑣的從天然基因庫(kù)篩選基因方法，加快了篩選的時(shí)間，降低了篩選的成本。TEM-1酶進(jìn)化技術(shù)也適用于其它類(lèi)型酶的進(jìn)化。本發(fā)明的材料1.限制性內(nèi)切酶AWeI、J力ol、DNaseI，T4連接酶、TaqDNA聚合酶、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司2.His'Tag親和樹(shù)脂購(gòu)自美國(guó)Novagen，Inc.(Madison,WI);3.Nitrocefin購(gòu)自英國(guó)OXOID公司;4.B培養(yǎng)基自己配置(蛋白胨1%，酵母粉0.5Xg，NaCL1%)圖h表達(dá)載體pET24-TEM-1的構(gòu)建圖。圖2:易錯(cuò)PCR文庫(kù)及其DNA改組文庫(kù)的構(gòu)建。圖3:重組質(zhì)粒酶切電泳圖；1:pET24-TEM-1質(zhì)粒雙酶切(A^el+Xhol);2:pET24-TEM-1質(zhì)粒單酶切(A^el);3:分子參照物。圖4:突變TEM-1酶純化產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳圖；1:純化的TEM-1酶；2:分子量標(biāo)準(zhǔn)。具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。實(shí)施例1:TEM-l基因的克隆(1)TEM-1片段的PCR擴(kuò)增以TEM-1基因?yàn)槟０?，設(shè)計(jì)引物，并加入酶切位點(diǎn)。提取上述產(chǎn)酶f.co"'的質(zhì)粒，以此為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為94r預(yù)變性4min，再按如下參數(shù)循環(huán)20次94。C變性lmin，58。C退火50s,72。C延伸lmin，最后1個(gè)循環(huán)72。C延伸10tnin。(2)PCR產(chǎn)物的純化采用低融點(diǎn)瓊脂糖(Lowmeltingpointagarose,LMPA)法回收。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%低融點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳后，切出含目的片段的膠塊，放入1.5mlEppendorf管中，加入TE約200y1,再加等體積的Tris飽和酚于70。C融化，10000rpm/min離心10min，等體積的酚氯仿，氯仿各抽提一次，加2倍體積的無(wú)水乙醇和1/10體積3mol/L乙酸鈉(pH5.2)沉淀DNA，根據(jù)回收片段的量溶于10u1水中，取lu1電泳檢測(cè)，-4°(:保存?zhèn)溆没蛑苯佑糜谶B接反應(yīng)。(3)連接反應(yīng)把經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物片段和pMD18T片段連接。連接反應(yīng)體系pMD18T載體片段2nlPCR片段2u110XT4連接酶Buffer2ulT4連接酶2.5U1ti1加雙蒸水至20y1混勻加完畢的連接反應(yīng)液，放置16"連接5h后，放置4。C備用或直接用于轉(zhuǎn)化反應(yīng)。(4)感受態(tài)細(xì)胞的制備用氯化鈣法制備感受態(tài)細(xì)胞。先用無(wú)菌接種環(huán)挑取f."WJM109菌種，劃線接種于不含抗生素的LB瓊脂平板，37'C培養(yǎng)16h左右。挑取單菌落，接種到3mlLB培養(yǎng)基中，37°C，250rpm/min振搖培養(yǎng),取0.5ml培養(yǎng)物接種于50mlLB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)3h至0D柳,為0.6-。再將細(xì)菌培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到無(wú)菌聚丙烯離心管中，冰浴10min，4°C、5000rpm/min離心10min，棄上清，以10ml冰浴的100mmol/LCaCl2、10mmol/LTrisCI(pH8.0)的溶液重懸沉淀。最后冰浴20min，4°C、5000卬m/min離心10min，棄上清，以2ml冰浴預(yù)冷的lOOmmol/LCaCl2-甘油溶液重懸沉淀細(xì)胞，即為感受態(tài)細(xì)胞。(5)轉(zhuǎn)化及其鑒定將10u1連接反應(yīng)液加入200y1f.coh'JM109感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴45min，42'C水浴2min,重新放入冰浴2min,加LB培養(yǎng)基至lml，37°C、150rpm/min振搖培養(yǎng)lh，取200u1上述培養(yǎng)物，布于氨節(jié)青霉素、X-gal和IPTG的LB平板,經(jīng)37'C培養(yǎng)過(guò)夜，挑取白斑，再擴(kuò)大培養(yǎng),然后提取質(zhì)粒DNA,經(jīng)酶切電泳，核苷酸測(cè)序由寶生物公司完成，并核對(duì)核苷酸序列，確認(rèn)與NCBI公布的TEM-1型核苷酸序列一致，故將本克隆質(zhì)粒命名為pMD18T-TEM-l(見(jiàn)圖1)。實(shí)施例2:TEM-1基因易錯(cuò)PCR易錯(cuò)PCR:IOX易錯(cuò)PCR緩沖液內(nèi)含4.4咖oL/LMgC12，500mmoL/LKC1,100mmoL/LTris-HC1(pH7.4)，0.1M(w/v)明膠。10XdNTP混合物內(nèi)含2畫(huà)oL/LdGTP,2mmoL/LdATP，10mmoL/LdCTP，10國(guó)oL/LdTTP。5mmoL/LMnC12溶液。反應(yīng)體系體積10XTaqDNA聚合酶lu1IOX易錯(cuò)PCR緩沖液10u110XdNTPmix10u1dCTP、dTTPlOOmM各1u1模板DNA4w1上游引物liU下游引物lul超純水51u12.5國(guó)oL/LMgCL10u15,LvlMnCl二'10u1共100y1PCR反應(yīng)條件時(shí)間解鏈溫度95。C1min延伸溫度50°C1min退火溫度72°C3min反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，退火溫度72°C10min1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物的純化，使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化，用30P1去離子水洗脫產(chǎn)物。1%的瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下檢測(cè)，估算濃度。實(shí)施例3:易錯(cuò)PCR突變庫(kù)的構(gòu)建及其篩選(1)錯(cuò)配PCR產(chǎn)物純化同例1中第二步(2)錯(cuò)配PCR產(chǎn)物的限制性酶切用限制性內(nèi)切酶WeI和/力oI酶切純化錯(cuò)配PCR產(chǎn)物8u1勘I1n1腸I1u110X通用Buffer2ul去離子水8ul共20y1混合，37X:下保溫1小時(shí)，進(jìn)行2%的瓊脂糖凝膠電泳。(3)pET24a載體DNA的限制性酶切用限制性內(nèi)切酶/W/eI和i7oI酶切質(zhì)粒載體質(zhì)粒DNA4n1(約2yg)腸I1u1勘I1U110X通用Buffer2ul去離子水12ul混合，37。C下保溫1小時(shí)共20ul進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)線性質(zhì)粒。(4)酶切后質(zhì)粒的回收純化從凝膠中回收酶切質(zhì)粒的方法同例1中第二步。在紫外燈下觀察膠，注意用長(zhǎng)波照射，最后加入適量的蛋白酶K，消化Taq酶提高轉(zhuǎn)化效率。(5)酶切純化后PCR產(chǎn)物與pET24質(zhì)粒連接反應(yīng)方法同例1中第三步(6)￡coh'BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化方法同例l中第四、五歩感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化。(7)突變菌株的初步篩選選取選擇平板上的菌落，挑取部分菌落較大的菌株于接種于96孔板中，每孔含有200ulLB培養(yǎng)液中，培養(yǎng)過(guò)夜。(8)高活力菌株的篩選將在96孔板中培養(yǎng)過(guò)夜的突變庫(kù)菌株，于酶標(biāo)儀600mn處測(cè)定細(xì)菌密度值OD,，然后將培養(yǎng)板中的細(xì)菌加入10"g溶菌酶，離板機(jī)離心；分別取上清測(cè)定其對(duì)CAZ的活性，以CAZ作為酶水解底物，反應(yīng)體系為0.lml,緩沖體系為100mMPBS(pH8.5)CAZ的終濃度為0.05mM，每孔加入經(jīng)溶菌酶破碎并離心的突變菌上清液20yl，用酶標(biāo)儀測(cè)定260nm的光吸收值，選擇OD260/OD600值較大的克隆子，見(jiàn)圖2。實(shí)施例4:DNA改組突變庫(kù)的構(gòu)建及其篩選(1)重組基因的制備用限制性內(nèi)切酶AyeI和消化含有五種突變TEM-1基因的質(zhì)粒片斷，37'C作用3小時(shí)，酶切產(chǎn)物用膠回收試劑盒純化目的基因片段，TE溶解，1%的瓊脂糖凝膠電泳，估計(jì)DNA濃度，將各種片段等量混合。(2)DNaseI消化上述DNA混合物溶于10mMTris-HC1(pH7.4)IOX易錯(cuò)PCR緩沖液(500mMTris-HC1pH7.4,5mMMnC12)15。C平衡8min，2000倍稀釋的DNaseI15'C作用5分鐘，9(TC,10分鐘以終止反應(yīng)，2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收50bp左右的片段。45u110u1lu1(3)片段自組裝DNaseI消化片段lOXTaqDNA聚合酶緩沖液10XdNTP(2mM)上游引物下游引物lOXTaqDNA聚合酶超純水10u12u12ul1lU1ul1"83ul共100ulPCR反應(yīng)條件解鏈溫度95°Clmin延伸溫度5(TC1.5min退火溫度72°C3min反應(yīng)85個(gè)循環(huán)，退火溫度72°C10min2%的瓊脂糖凝膠電泳(4)DNA改組突變庫(kù)的構(gòu)建同實(shí)例3。實(shí)施例5:可溶性突變TEM-1酶的純化(1)超聲上清液的制備1L發(fā)酵菌液8OOOrpm/min,4°C、20min離心，收集沉淀，加10mlH20吹懸菌體后，冰浴進(jìn)行超聲破碎。超聲后的勻漿,20000rpm/min，4°C，離心30min，獲取超聲上清液。(2)可溶性突變TEM-1酶的純化取lmlNi2+-NTA瓊脂糖裝柱，用Bindingbuffer平衡。10ml含突變TEM-1酶超聲上清液經(jīng)0.45um濾膜過(guò)濾后，緩慢過(guò)柱，接著用50ml的Bindingbuffer洗柱，再用60ml的Washbuffer(0.5MNaCl，60mMimidazole,20mMTris-HCl，pH7.9)洗柱，最后用60mlEluteBuffer(1Mimidazole,0.5MNaCl,20mMTris-HCl,pH7.9)洗脫蛋白。(3)活性蛋白峰脫鹽、凍干用無(wú)菌雙蒸水平衡S印hadexG25柱(XK50/100)至pH和電導(dǎo)平衡。將活性峰上樣S印hadexG25柱(XK50/100),用無(wú)菌雙蒸水進(jìn)行洗脫，收集脫鹽峰。經(jīng)過(guò)脫鹽的0—內(nèi)酰胺酶活性峰用0.22um膜過(guò)濾除菌，上述無(wú)菌液按1-1.5ml/支分裝到無(wú)菌玻璃瓶中，-30'C冰凍后，裝入冷凍干燥機(jī)中凍干，得到的凍干純品SDS-PAGE電泳(見(jiàn)圖3)。(4)紫外吸收法測(cè)突變TEM-1酶活力測(cè)定酶對(duì)底物的水解率，OD^時(shí)測(cè)定CAZ,CTX吸光度的變化，計(jì)算酶活力單位。每升發(fā)酵液中得到5mg突變TEM-1酶，對(duì)CAZ酶比活為43IU/mg,對(duì)CTX酶比活為43IU/mg。見(jiàn)圖4。實(shí)施例6:突變TEM-1酶不同底物動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定突變TEM-1酶在CAZ，CTX底物濃度分別為42mM/L、63mM/L、84剛/L、105mm/L、126MM/L時(shí)，以反應(yīng)開(kāi)始的30s為反應(yīng)的初速度，求取,歷及其,cat值。見(jiàn)表1表l突變TEM-l酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)表底物濃度TEM酶Kcat(S—')KmKcat/Km(MM'L—')(nM)(MM*L—')(M—1L)TEM-l突變株CAZ0.02642101561.35X106TEM-l突變株CTX0.0264350675.22X10權(quán)利要求1.一種體外定向進(jìn)化獲取高活力超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)采用PCR技術(shù)，以篩選的耐β-內(nèi)酰胺抗生素的大腸桿菌總DNA為模板，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增獲取β-內(nèi)酰胺酶基因，插入pMD18T克隆載體上，轉(zhuǎn)入E.coliJM109，測(cè)序鑒定為T(mén)EM-1基因。(2)配制易錯(cuò)PCR緩沖體系在普通PCR反應(yīng)底基礎(chǔ)上添加MnCl2、MgCl2、KCl、明膠、dCTP、dTTP等物質(zhì)。(3)把易錯(cuò)PCR產(chǎn)物及其pET24a表達(dá)載體用NdeI、XhoI雙酶切后連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)構(gòu)建易錯(cuò)PCR突變庫(kù)，采用抗生素篩選的方式獲取對(duì)頭孢他啶活性較高的菌株。(4)分別擴(kuò)增獲取活性提高的五株細(xì)菌的TEM-1突變基因，混合后用DNaseI消化，純化回收50bp左右的DNA片段。(5)純化的片段互為引物擴(kuò)增，獲得含較多突變位點(diǎn)基因，用NdeI、XhoI雙酶切后連接同樣雙酶切的pET24a表達(dá)載體連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)，構(gòu)建DNA改組文庫(kù)，采用抗生素篩選的方式獲取對(duì)頭孢他啶活性最高的菌株。(6)含重組質(zhì)粒的E.coliBL21(DE3)發(fā)酵，獲取的細(xì)菌溶于3倍體積的無(wú)菌PBS中進(jìn)行超聲破碎，獲取超聲上清。(7)超聲上清中突變TEM-1酶的純化采用親和層析法，Ni親和層析樹(shù)脂結(jié)合突變TEM-1酶融合的His尾，得到純度＞95％、高比活突變TEM-1酶。2.根據(jù)權(quán)利1所述的體外定向進(jìn)化獲取高活力超廣譜e-內(nèi)酰胺酶的方法，其特征在于可適用所有e-內(nèi)酰胺酶基因的定向進(jìn)化。3.根據(jù)權(quán)利1所述的體外定向進(jìn)化獲取高活力超廣譜e-內(nèi)酰胺酶的方法，其特征在于采用的易錯(cuò)PCR反應(yīng)體系中添加了MnCl2、MgCl2、KC1、明膠、dCTP、dTTP等物質(zhì)，導(dǎo)致PCR反應(yīng)的堿基錯(cuò)配率較高。4.根據(jù)權(quán)利1所述的體外定向進(jìn)化獲取高活力超廣譜e-內(nèi)酰胺酶的方法，其特征在于采用的DNA改組技術(shù)來(lái)源基因?yàn)榻?jīng)TEM-1基因的易錯(cuò)PCR反應(yīng)，并篩選系列對(duì)CAZ活性升高的基因。全文摘要本發(fā)明體外定向進(jìn)化獲取高活力超廣譜β內(nèi)酰胺酶的方法，屬于醫(yī)藥生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體地說(shuō)主要采用了易錯(cuò)PCR和DNA改組這兩種定向進(jìn)化的策略，對(duì)本室構(gòu)建的一株含TEM-1基因的菌株進(jìn)行了改造。對(duì)突變菌株及其野生株進(jìn)行酶的底物譜酶及其總活力進(jìn)行比較，突變使原有的底物譜擴(kuò)大，對(duì)代表性的第三代β-內(nèi)酰胺抗生素頭孢他啶(Ceftazidime，CAZ)，頭孢噻肟(Cefotaxime，CTX)由不能降解提高到比活為43IU/mg和78IU/mg。文檔編號(hào)C12N15/10GK101104858SQ20061010129公開(kāi)日2008年1月16日申請(qǐng)日期2006年7月10日優(yōu)先權(quán)日2006年7月10日發(fā)明者呂建新申請(qǐng)人:溫州醫(yī)學(xué)院