專利名稱：一種用腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)酒用酸性脲酶的制備方法及應用的制作方法
技術領域：
一種用腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)酒用酸性脲酶的制備方法及應用，具體地說是利用腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)收集菌體，用溶菌酶和液氮研磨的方法將菌體細胞破碎，通過乙醇分級沉淀，獲得酒用酸性脲酶制品，屬于酶制劑、釀酒添加劑技術領域。
背景技術：
1985年證實了酒精飲料中的氨基甲酸乙酯具有致癌作用后，引起世界衛(wèi)生組織和各國的高度重視。1985年12月，加拿大政府率先頒布了各類酒中氨基甲酸乙酯的限量標準。之后，美國葡萄酒工業(yè)協(xié)會、日本等國也先后制定了酒中氨基甲酸乙酯的限量標準。
國內(nèi)外對酒中氨基甲酸乙酯的研究表明，酒中氨基甲酸乙酯形成的主要途徑為尿素途徑，我國黃酒及日本清酒中90％以上的氨基甲酸乙酯是來源于酒中所含尿素與乙醇的反應
而酒中尿素的主要來源為(1)由微生物代謝產(chǎn)生，即由精氨酸代謝產(chǎn)生的尿素。
(2)原輔材料和釀造過程的培養(yǎng)液成分中所含的尿素。
在研究了影響氨基甲酸乙酯形成的因素后發(fā)現(xiàn)，尿素濃度、乙醇濃度等是最主要的因素。各國學者們對降低酒中氨基甲酸乙酯的方法進行了深入的研究，通過去除或降低酒中的尿素含量，以達到控制氨基甲酸乙酯含量的目的。研究的主要方向為1.選育低產(chǎn)尿素的酵母菌；2.適當控制發(fā)酵條件；3.酒中添加適量的酒用酸性脲酶。
相比之下，向酒中添加酒用酸性脲酶最為簡便、實用，也是目前較常用的方法，這種方法具有顯著的優(yōu)點1.不改變原釀造酒的工藝條件，不影響正常生產(chǎn)。
2.不改變原酒的風味特性。這是由于添加量小，而且脲酶經(jīng)煎酒后失活。
3.降低酒中氨基甲酸乙酯的程度高，可達90％。
我國是世界上年產(chǎn)酒量最大的國家，有著十分悠久的釀酒歷史，不僅產(chǎn)量大，而且品種多，許多產(chǎn)品在國際上享有較高的聲譽。我國的紹興黃酒在日本及東南亞擁有廣泛的市場，但在1987年，日本有關部門提出紹興黃酒中氨基甲酸乙酯含量超標(大于100μg/L)，近年來，又在紹興黃酒出口貿(mào)易上遇到了氨基甲酸乙酯的問題，為了降低酒中氨基甲酸乙酯的含量，紹興黃酒集團至今仍需從日本進口酒用酸性脲酶。因此，為了人民的身體健康，也為了能更多的出口創(chuàng)匯，研究和生產(chǎn)我國自己的酒用酸性脲酶已成為當務之急。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是篩選一株能產(chǎn)適合酒用的酸性脲酶的微生物，通過細胞破碎，用乙醇分級沉淀等生化分離手段，最終獲得較純的酒用酸性脲酶，整個工藝流程收率為45％，酶的比活為138u/mg，最適溫度為75℃，溫度穩(wěn)定范圍75℃以下，最適pH5.5，穩(wěn)定pH范圍4.0～6.5。將該酶加入黃酒中，通過去除尿素，避免氨基甲酸乙酯的產(chǎn)生，起后修飾作用。
本發(fā)明的技術方案將腸桿菌接入含有糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中，同時添加氮源及營養(yǎng)物質(zhì)，以鹽酸調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基pH，發(fā)酵獲得菌體，用溶菌酶和液氮研磨的方法將菌體細胞破碎，用乙醇分級沉淀，獲得胞內(nèi)酶酒用酸性脲酶。工藝為A通過腸桿菌發(fā)酵，收集菌體(1)出發(fā)菌株采用腸桿菌(Enterobacter sp.)9043C12。該菌株已在《浙江農(nóng)業(yè)大學學報》22(5)493～498，1996公開。
(2)發(fā)酵培養(yǎng)基組成糖10g/L，氮源16g/L，營養(yǎng)物質(zhì)10g/L，NaCl5g/L，乙酸鈉2g/L，磷酸氫二鉀2g/L，尿素3g/L，MnSO40.1g/L，NiSO40.1g/L，用鹽酸調(diào)pH5.0～5.5，所述及的營養(yǎng)物質(zhì)為豆餅水解液和/或玉米漿。
(3)發(fā)酵條件接種量6％，初始pH5.0～5.5，30～34℃恒溫靜置培養(yǎng)28h。
(4)收集菌體將發(fā)酵液以8000r/min、4℃離心10min后，棄上清，將菌體用去離子水洗滌兩次。
B用溶菌酶和液氮研磨進行細胞破碎(1)溶菌酶處理將菌體按質(zhì)量體積比1∶5溶于高滲緩沖液SMM中，溶菌酶的加入量為0.6mg/mL，30℃水浴處理13h。以8000r/min、4℃離心10min后，用pH5.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液復溶離心收集的沉淀，以8000r/min、4℃離心10min后，收集上清液。
(2)液氮研磨溶菌酶處理后收集上清液后，將余下的沉淀加入適量液氮，快速研磨，待液氮揮發(fā)后，再次加入適量液氮進行研磨，反復三次，用pH5.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液復溶研磨后的菌體，以8000r/min、4℃離心10min后，收集上清液。
C用乙醇分級沉淀(1)合并B中收集的上清液加入-20℃乙醇，使乙醇終濃度為30％進行醇沉，以5000r/min、4℃離心(I)10min后，棄沉淀，取上清液。
(2)取上清液加入-20℃乙醇，使乙醇終濃度為50％進行醇沉，以5000r/min、4℃離心(II)10min后，取沉淀，棄上清。
(3)沉淀加少量pH5.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液溶解，以10000r/min、4℃離心(III)10min后，棄沉淀，取上清，即為酸性脲酶酶液。
D酸性脲酶在黃酒中的應用酸性脲酶按0.05u/mL的加量在30℃以下加入黃酒中，24h尿素去除率達到70％以上。
酶活定義在常壓、37℃、pH4.5的條件下，每min分解尿素產(chǎn)生1μmol銨離子的酶量為1個酶活單位。
黃酒中的尿素測定方法應用二乙酰-肟的方法，在波長為527nm的條件下，以超純水作為空白，測定尿素標準溶液的OD值，與以OD值相對應的濃度作圖，繪制標準曲線。在相同條件下測定黃酒的OD值，再通過回歸方程計算其含量。
本發(fā)明的有益效果發(fā)酵生產(chǎn)酒用酸性脲酶可以擴大，提取方法容易擴大生產(chǎn)，該酸性脲酶能在酒中穩(wěn)定發(fā)揮作用，尿素去除率高，在黃酒中，加入酒用酸性脲酶后尿素去除率能達到70％以上。本發(fā)明可以不改變原釀造酒的工藝條件，不改變酒的風味，是目前較理想的去除酒中尿素的方法。


圖1酒用酸性脲酶制備工藝示意圖。
具體實施例方式
實施例1將腸桿菌(Enterobacter sp.)9043C12斜面接入種子液，擴大培養(yǎng)后，再按接種量6％接入20L發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基組成如說明書所述。初始pH5.0～5.5，30～34℃靜置培養(yǎng)28h，把發(fā)酵液在8000r/min下4℃離心10min收集到菌體80g，用2L去離子水洗滌兩次后，在400mlSMM高滲緩沖液中復溶，加入溶菌酶240mg，30℃水浴處理13h。8000r/min條件下4℃離心10min，用400mLpH5.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液復溶離心收集的沉淀，8000r/min條件下4℃離心10min后，收集上清液。余下的沉淀，加入適量液氮，快速研磨，待液氮揮發(fā)后，再次加入適量液氮進行研磨，反復三次，用400mLpH5.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液復溶研磨后的菌體，8000r/min下4℃離心10min后，收集上清液。將兩次收集的800mL上清合并，加入342.7mL-20℃乙醇沉淀，5000r/min條件下4℃離心10min后，再取上清加入457.3mL-20℃乙醇進行醇沉，5000r/min條件下4℃離心10min后，取沉淀，沉淀加80mLpH5.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液溶解，10000r/min條件下4℃離心10min后，得到上清約80mL，即為濃縮的酸性脲酶粗酶液，冷凍干燥后得2g酶粉。在100mL黃酒中加入0.69mg酶粉，24h后尿素含量從35.2mg/L降到10.3mg/L測定尿素去除率為70.6％。
權利要求
1.一種用腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)酒用酸性脲酶的制備方法，其特征在于包括如下步驟將腸桿菌接入含有糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中，同時添加氮源及營養(yǎng)物質(zhì)，以鹽酸調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基pH，發(fā)酵獲得菌體；用溶菌酶和液氮研磨的方法進行細胞破碎；用乙醇分級沉淀，獲得其胞內(nèi)酶酒用酸性脲酶；其工藝為A通過腸桿菌發(fā)酵，收集菌體(1)出發(fā)菌株采用腸桿菌(Enterobacter sp.)9043C12；(2)發(fā)酵培養(yǎng)基組成糖10g/L，氮源16g/L，營養(yǎng)物質(zhì)10g/L，NaCl 5g/L，乙酸鈉2g/L，磷酸氫二鉀2g/L，尿素3g/L，MnSO40.1g/L，NiSO40.1g/L，用鹽酸調(diào)pH5.0～5.5，所述的營養(yǎng)物質(zhì)為豆餅水解液和/或玉米漿；(3)發(fā)酵條件接種量6％，初始pH5.0～5.5，30～34℃恒溫靜置培養(yǎng)28h；(4)收集菌體將發(fā)酵液以8000r/min、4℃離心10min后，棄上清，將菌體用去離子水洗滌兩次；B用溶菌酶和液氮研磨進行細胞破碎(1)溶菌酶處理將菌體按質(zhì)量體積比1∶5溶于高滲緩沖液SMM中，溶菌酶的加入量為0.6mg/mL，30℃水浴處理13h，以8000r/min、4℃離心10min后，用pH5.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液復溶離心收集的沉淀，以8000r/min、4℃離心10min后，收集上清液；(2)液氮研磨溶菌酶處理后收集上清液后，將余下的沉淀加入適量液氮，快速研磨，待液氮揮發(fā)后，再次加入適量液氮進行研磨，反復三次，用pH5.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液復溶研磨后收集的沉淀，以8000r/min、4℃離心10min后，收集上清液；C用乙醇分級沉淀(1)合并B中收集的上清液，加入-20℃乙醇，使乙醇終濃度為30％進行醇沉，以5000r/min、4℃離心(I)10min后，棄沉淀，取上清液；(2)取上清液加入-20℃乙醇，使乙醇終濃度為50％進行醇沉，以5000r/min、4℃離心(II)10min后，取沉淀，棄上清；(3)沉淀加少量pH5.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液溶解，以10000r/min、4℃離心(III)10min后，棄沉淀，取上清，即為酸性脲酶液。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所用的鹽酸為30％濃度的HCl。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述的糖為葡萄糖。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述的氮源為豆餅水解液、玉米漿、尿素、硫酸銨中的一種或多種。
5.用權利要求1方法制備的酒用酸性脲酶的應用，其特征在于酸性脲酶按0.05u/mL的加量在30℃以下加入黃酒中，24h后尿素去除率達到70％以上。
全文摘要
一種用腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)酒用酸性脲酶的制備方法及應用，屬于酶制劑、釀酒添加劑技術領域。本發(fā)明涉及利用腸桿菌(Enterobacter sp.)9043C
文檔編號C12H1/00GK1955282SQ20061009663
公開日2007年5月2日 申請日期2006年10月12日 優(yōu)先權日2006年10月12日
發(fā)明者田亞平, 趙光鰲, 徐巖, 王玉美, 徐晨 申請人:江南大學