專利名稱：Hla－drb中分辨度配型芯片的制備及應(yīng)用的制作方法
背景技術(shù)：
HLA抗原位于人的第6號染色體短臂的一個狹窄區(qū)域，是人體內(nèi)最復雜的遺傳多態(tài)性系統(tǒng)，在免疫調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用。HLA多態(tài)性檢測在醫(yī)學實踐和科研中具有十分重要意義，為器官、組織移植配型，疾病相關(guān)性研究，人類學及法醫(yī)學上的應(yīng)用等領(lǐng)域的發(fā)展提供了可靠的技術(shù)方法和有價值的資料。血清學方法是HLA-B抗原傳統(tǒng)的經(jīng)典分型方法，但是隨著對HLA研究的深入和對分型技術(shù)要求的不斷提高，以及越來越多的等位基因陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)和命名，血清學方法已經(jīng)無法獲得足夠的單特異性抗體，不能夠分辨出所有的特異性，而且標準抗血清的篩選技術(shù)復雜，難度大，人力物力消耗大，另外血清學方法之間存在較多，較強的交叉反應(yīng)，使HLAI、II類抗原亞型的分辨較為困難。
隨著生物學技術(shù)的不斷發(fā)展，基因分型已成為HLA分型的主要方法。近年來對I、II類抗原的基因分型研究取得了較大進展。其中PCR-SSP、PCR-SS0、PCR-SSCP(單鏈構(gòu)像多態(tài)性分析)3種分型方法對I類抗原的分型均獲得成功.但這些方法也存在一些明顯的不足，如PCR-SSP方法，主要依賴于PCR技術(shù)，對某一基因個體進行分型時往往要設(shè)計大量的引物，這將很難避免接下來的PCR過程中的污染問題而導致的假陽性，而且操作復雜，需要通過多次的電泳來判斷最后的結(jié)果，不適合大批量樣本的分型，使其在臨床上的應(yīng)用受到限制；PCR-SSCP法對分析小于400bpPCR擴增產(chǎn)物十分有效，但此法僅能探知基因變異的存在，而無法確定變異的確切位置及內(nèi)容，一般僅用作HLA匹配程度的分析，而不用來進行HLA的具體分型。
基因芯片是近年來興起的一項前沿生物技術(shù)，是對傳統(tǒng)生物技術(shù)如檢測、DNA雜交、分型和測序技術(shù)重大的飛躍和創(chuàng)新，是涉及到生物信息學，微電子技術(shù)，計算機科學，半導體技術(shù)等諸多自然學科的綜合性技術(shù)，在生命科學領(lǐng)域中顯出了巨大的潛能和誘人前景?；蛐酒侵笇⒃S多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，有規(guī)律的排列固定于支持物上，然后與待測的標記過的樣本基因進行特異性雜交，通過激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)對芯片進行掃描，并配以計算機系統(tǒng)對每一個探針上的熒光信號進行檢測，從而得出大量信息?；蛐酒哂懈叨燃珊筒⑿刑幚淼奶攸c，所需試劑和樣本量少，結(jié)果由計算機軟件自動分析，是解決HLA眾多等位基因分型的有效方法。由于HLA個體遺傳學差異的本質(zhì)是在編碼其抗原產(chǎn)物的基因水平上，所以分析HLA基因型無疑是對HLA型別分析的最準確的方法，其準確性遠高于血清與細胞學分型，并已逐漸取代了前兩者的位置，因此HLA抗原的DNA分型成為必然趨勢。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明采用寡核苷酸芯片分型方法，依據(jù)第十三屆國際組織相容性工作會議報告及相關(guān)文獻，同時考慮遺傳的連鎖不平衡，及強脊炎，幼年型糖尿病等與HLA密切相關(guān)的遺傳病等因素，選擇了中國人群基因頻率較高的等位基因，根據(jù)HLA-DR不同基因亞型的獨特序列，完成了探針的設(shè)計與篩選，最后設(shè)計了31條探針制成基因分型芯片，這些探針可完成中分辨度分辨，完全可以滿足臨床配型工作的需要。通過帶熒光標記的引物將待測樣本經(jīng)PCR擴增后所要目的片斷帶上熒光標記，帶有熒光標記的PCR產(chǎn)物與芯片上的探針雜交，根據(jù)雜交信號強弱及位置確定樣品的基因型。本發(fā)明在玻片上固定了31條探針，完全可以完成HLA基因分型、骨髓移植器官移植的HLA配型、與HLA有密切關(guān)系的遺產(chǎn)性疾病的人群篩查。
本發(fā)明的目的是針對HLA-DRB基因設(shè)計了一套探針(見表3)。將這些探針固定在環(huán)氧處理的芯片片基上，制成完整的HLA-DRB類基因寡核苷酸芯片，并提供包含實驗操作所必需的所有組分，組成了一套完整的試劑盒?？捎糜贖LA基因分型、骨髓移植器官移植的HLA配型、與HLA有密切關(guān)系的遺產(chǎn)性疾病的人群篩查。
優(yōu)點及效果本發(fā)明的實施實現(xiàn)了對HLA-A，B，DRB，DQA，DQB基因快速、準確、高通量分型，可實現(xiàn)一張芯片多人份，滿足臨床器官移植的配型要求，適于臨床推廣，并可用于其他相關(guān)領(lǐng)域，具有重大的社會和經(jīng)濟效益。
實施方法下面結(jié)合


本發(fā)明的具體實施方法圖1芯片外觀1玻片表面處理環(huán)氧玻片處理普通玻片，洗液浸泡，清水沖洗，蒸餾水洗三遍，晾干備用。
2％3-glycidoxypropyltriethoxysilane乙醇溶液超聲2min混合，放入玻片1hr浸泡，95％乙醇洗兩次5min，自然晾干。
我們處理過的芯片在后續(xù)處理相同的情況下，與sigma的成品氨基片，醛基片及環(huán)氧玻片的最后雜交效果沒有區(qū)別，證明我們的處理方法可行。而且同樣條件下環(huán)氧玻片的雜交效果明顯優(yōu)于其他方法處理的玻片，至此我們建立了優(yōu)化環(huán)氧片基的制備方法，建立了優(yōu)化環(huán)氧片基用于基因芯片中核酸固定的條件。與其他處理片基方法相比，該種片基具有后處理簡單，交聯(lián)密度高，熒光背景低等優(yōu)點。
2引物設(shè)計及PCR條件在HLA-DRB座位的exon2區(qū)域分別設(shè)計上下游引物，，產(chǎn)物長度在274bp左右，序列如下正鏈5’-CCCCACAGCACGTTTCTTG-3’ ，反鏈5’-CCGCTGCACTGTGAAGCTCT-3’。標記PCR擴增條件為95℃5min，94℃30s、57℃30s、72℃1min，40個循環(huán)。擴增產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色檢測。方法同前選擇最佳條件，建立引入熒光標記的PCR體系。
3探針處理探針經(jīng)NH2-修飾后用于芯片點樣。通過NH2與環(huán)氧基的化學結(jié)合，探針固定在環(huán)氧片基上。將濃度為100umol/L的寡核苷酸探針與點樣緩沖液(0.2M NaOH)1∶1混合加在96孔板里，用點樣儀點成所需矩陣(見圖1)。從左往右，每五個點代表一條探針。點樣后封閉過夜，待其自然干燥后，130℃烘烤30min、95℃水浴1min、封閉待其自然干燥、-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 4雜交將10ul雜交buffer，18ulPCR產(chǎn)物與1ul鮭精DNA(鮭精DNA用來降低雜交背景)充分混合，將HLA-DRB的PCR產(chǎn)物用移液器加樣到相應(yīng)點樣區(qū)域，根據(jù)區(qū)域大小選擇合適大小的蓋玻片，蓋上蓋玻片。放入分子雜交儀雜交，雜交條件為40℃，1小時。
5洗滌取出芯片，5×洗脫液(20*SSC)洗脫，浸泡5分鐘；取出芯片，放入3×洗脫液中浸泡5分鐘ddH2O洗2次(每一步浸泡清洗后，都必須迅速離心)。將洗過的芯片置于室溫自然晾干，干燥后用ScanarryGX掃描。
6掃描通過分析軟件，將直觀的信號強弱轉(zhuǎn)化為信號比值，根據(jù)比值及具體位置上標記的探針序列，即可確定樣本的基因型。在圖2中，最左邊是陽性定位點，用于分析軟件識別行列和定位。當帶熒光標記的PCR產(chǎn)物與芯片上的探針雜交時，探針如果與PCR產(chǎn)物完全互補，則掃描出的雜交信號強，顏色在黃白之間；如果與PCR產(chǎn)物完全不互補，掃描出的信號弱，顏色為藍或無色；如果與PCR產(chǎn)物部分互補，則掃描出的信號和顏色介于兩者之間。通過特定分析軟件，將直觀的顏色強弱轉(zhuǎn)化為信號的比值，可以方便的得出分型結(jié)果。HLA配型芯片設(shè)計了陽性對照和陰性對照而且每個探針都有5次重復，使系統(tǒng)的可靠性、穩(wěn)定性、科學性得到了有效保證。
圖2雜交結(jié)果顯示，結(jié)果與對照實驗完全一致。
7結(jié)果芯片檢測結(jié)果用國際知名的one lambda公司的Micro SSPTM Allele Specfic DRB進行平行對照試驗?；蚍中徒Y(jié)果與用國際公認的one lambda試劑盒所得出的基因分型結(jié)果基本一致。對不一致的樣本進行了測序?qū)φ?，測序結(jié)果與芯片分析結(jié)果完全一致。
HLA配型芯片可分辨HLA-DRB抗原特異性19個，等位基因432個(見表3)。
表3基因芯片分辨HLA-DRB位點等位基因及其對應(yīng)的抗原特異性

注()內(nèi)為可分辨的等位基因數(shù)。
序列表3<110>天津醫(yī)科大學<120>HLA-DRB中分辨度配型芯片的制備及應(yīng)用<160>31<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點及Tm值設(shè)計<400>1TGGCAGCTTA AGTTTGAA 18<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點及Tm值設(shè)計<400>2AGCCTAAGAG GGAGTGTC 18<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點及Tm值設(shè)計<400>3GTACTCTACG TCTGAGTG 18<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點及Tm值設(shè)計<400>4GAGCAGGTTA AACATGAG 18<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點及Tm值設(shè)計<400>5GAGTACTCTA CGGGTGAG 18<210>6<211>18
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點及Tm值設(shè)計<400>6TGGCAGGGTA AGTATAAG 18<210>7<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點及Tm值設(shè)計<400>7GAAGCAGGAT AAGTTTGA 18<210>8<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點及Tm值設(shè)計<400>8GAGGAGGTTA AGTTTGAG 18<210>9<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點及Tm值設(shè)計<400>9CAGCAGGATA AGTATGAG 18<210>10<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點及Tm值設(shè)計<400>10GAGCTGCTTA AGTCTGAG 18<210>11<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點及Tm值設(shè)計<400>11GTTCCTGCAC AGAGACAT 18
<210>12<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點及Tm值設(shè)計<400>12GCGGTACCTG GACAGATA 18<210>13<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點及Tm值設(shè)計<400>13GTTCCTGGAG AGACACTT 18<210>14<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點及Tm值設(shè)計<400>14TTCCTGGAGA GATACTTCC 19<210>15<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點及Tm值設(shè)計<400>15ACCAGGAGGA GAACGTGC 18<210>16<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點及Tm值設(shè)計<400>16ATCACCAAGA GGAGTACG 18<210>17<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點及Tm值設(shè)計
<400>17CCAGGAGGAG CTCCTGCG 18<210>18<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點及Tm值設(shè)計<400>18CAGGAGGAGT TCCTGCGC 18<210>19<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點及Tm值設(shè)計<400>19CAGGAGGAGT TCGTGCGC 18<210>20<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點及Tm值設(shè)計<400>20GCCTAGCGCC GAGTACTG 18<210>21<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點及Tm值設(shè)計<400>21GCCTGATGAG GAGTACTG 18<210>22<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點及Tm值設(shè)計<400>22GCCTGCTGCG GAGCACTG 18<210>23<211>17<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點及Tm值設(shè)計<400>23AAGGACCTCC TGGAAGA 17<210>24<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點及Tm值設(shè)計<400>24TCCTGGAGCA GAGGCGGG 18<210>25<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點及Tm值設(shè)計<400>25GGCCGGGTGG ACAACTAC 18<210>26<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點及Tm值設(shè)計<400>26ACCGCGGCCC GCTTCTGC 18<210>27<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點及Tm值設(shè)計<400>27ACATCCTGGA AGACGAGC 18<210>28<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點及Tm值設(shè)計<400>28TGGAAGACAG GCGGGCCG 18<210>29<211>18
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點及Tm值設(shè)計<400>29GAAGACAGGC GGGCCCTG 18<210>30<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點及Tm值設(shè)計<400>30CTGGAAGACA AGCGGGCCG 19<210>31<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)多態(tài)性位點及Tm值設(shè)計<400>31AACTACGGGGCTGTGGAG 18。
權(quán)利要求
1 一種HLA-DRB基因中分辨度分型方法，其特征在于根據(jù)中國人群HLA-DRB類常見的基因位點以及臨床應(yīng)用中對分型分辨度的實際需要，設(shè)計特異性寡核苷酸中分辨度分型探針，制成基因分型芯片。采用帶熒光標記的引物，用合適的PCR方法擴增HLA-DRB類抗原上的多態(tài)性區(qū)域，產(chǎn)物與芯片上探針雜交。雜交結(jié)果經(jīng)熒光掃描并用特定軟件分析判斷陽性探針，以此確定樣品基因型，以及該方法的試劑組成和在臨床及科學研究中的應(yīng)用。芯片試劑盒組分如下檢測用片基、信號標記系統(tǒng)、寡核苷酸探針、引物、洗滌液、點樣液。
2 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，片基上每孔固相化的探針為寡核苷酸探針，其序列依據(jù)第十三屆國際組織相容性工作會議報告及相關(guān)文獻，同時考慮遺傳的連鎖不平衡，及強脊炎，幼年型糖尿病等與HLA密切相關(guān)的遺傳病等因素，選擇了中國人群基因頻率較高的等位基因，根據(jù)HLA-DRB不同基因亞型的獨特序列，完成了探針的設(shè)計與篩選，最后設(shè)計了HLA-DRB的39條探針制成基因分型芯片，其長度范圍在14-30個堿基，一般為18個堿基，其Tm值在滿足上述基因中等分辨度分型需要。
3 根據(jù)權(quán)利要求1所述的辦法，其各種引物是根據(jù)HLA-DRB基因序列特點設(shè)計，在HLA-DRB座位的exon2區(qū)域分別設(shè)計上下游引物，進行PCR，引物長度在18-25個堿基之間，分別用于上述基因的擴增。
4 根據(jù)權(quán)利要求書1所述的辦法，用于信號顯示的信號分子標記是針對HLA-DRB基因序列擴增的引物。
5 根據(jù)權(quán)利要求書4，用于信號顯示的信號分子為CY3。
6 根據(jù)權(quán)利要求書1所述方法，可應(yīng)用于醫(yī)院或血站對人群HLA-DRB基因所有座位進行分型，為組織配型和干細胞移植提供依據(jù)。也可應(yīng)用于科研單位、法醫(yī)領(lǐng)域為分析與HLA-DRB相關(guān)的遺傳疾病及個人識別提供依據(jù)。
全文摘要
根據(jù)中國人群HLA－DRB類常見的基因位點以及臨床應(yīng)用中對分型分辨度的實際需要，設(shè)計特異性寡核苷酸中分辨度分型探針，制成基因分型芯片。采用帶熒光標記的引物，用合適的PCR方法擴增HLA－DRB類抗原上的多態(tài)性區(qū)域，產(chǎn)物與芯片上探針雜交。雜交結(jié)果經(jīng)熒光掃描并用特定軟件分析判斷陽性探針，以此確定樣品基因型，以及該方法的試劑組成和在臨床及科學研究中的應(yīng)用。
文檔編號C12Q1/68GK1995382SQ20061001301
公開日2007年7月11日 申請日期2006年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月6日
發(fā)明者郭剛, 張瑞, 張鏡宇, 梁東春, 王寶利 申請人:天津醫(yī)科大學