專利名稱：結(jié)合分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及經(jīng)歷了親和力成熟的功能性僅有重鏈的抗體多樣性庫(kù)(diverse repertoire)的制造及其用途。本發(fā)明也涉及類(lèi)別特異性僅有重鏈的抗體多樣性庫(kù)的制造和用途，也涉及具有抗體重鏈功能性優(yōu)選抗體重鏈結(jié)合功能性、恒定區(qū)效應(yīng)子活性及任選其他效應(yīng)子功能的多價(jià)多肽復(fù)合物的制造和用途。
本發(fā)明也涉及在轉(zhuǎn)基因小鼠中響應(yīng)抗原激發(fā)產(chǎn)生全功能性僅有重鏈的抗體的方法。本發(fā)明特別涉及產(chǎn)生任何種類(lèi)的人抗原特異性、高度親和力、僅有重鏈的抗體或多種混合物的方法，分離及表達(dá)全功能性VH抗原結(jié)合域的方法。
本發(fā)明也涉及產(chǎn)生包含重鏈功能性優(yōu)選重鏈效應(yīng)子活性及其他結(jié)合和效應(yīng)子功能的多價(jià)多肽復(fù)合物。
也描述了使用本發(fā)明方法產(chǎn)生的僅有重鏈的抗體及其他多價(jià)結(jié)合復(fù)合物及其用途。
背景技術(shù)：
在21世紀(jì)開(kāi)發(fā)的新藥中將存在很大比例的單克隆抗體或其變異體。單克隆抗體治療已經(jīng)被公認(rèn)為優(yōu)選途徑用于治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和克羅恩病且在癌癥治療中有很大進(jìn)展。用于治療心血管疾病及感染性疾病的基于抗體產(chǎn)品也在開(kāi)發(fā)之中。單克隆產(chǎn)品識(shí)別并結(jié)合靶配體(例如TNFα)上單一、明確的表位。用于治療的人單克隆抗體的制造依然依賴于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)。裝配包括兩個(gè)重鏈和兩個(gè)輕鏈的復(fù)合體(H2L2復(fù)合體)及接著翻譯后糖基化過(guò)程排除使用的細(xì)菌體系。通過(guò)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)制造抗體的生產(chǎn)成本和資金耗費(fèi)高且在缺乏可接受的其它療法時(shí)有限制基于抗體的療法潛力的風(fēng)險(xiǎn)。許多種轉(zhuǎn)基因生物能夠表達(dá)全功能性抗體。包括植物、昆蟲(chóng)、雛雞、山羊和牛，但是仍然沒(méi)有用于制造銷(xiāo)售的治療性產(chǎn)品。
可在大腸桿菌(E.coli)中制造功能性抗體片段但是除非在制造過(guò)程中進(jìn)行聚乙二醇化否則產(chǎn)物在血清中穩(wěn)定性通常較低。
雙特異性抗體復(fù)合物是基于工程Ig能夠結(jié)合相同或不同抗原上兩種不同表位的分子。雙特異性結(jié)合蛋白單獨(dú)或與其他結(jié)合劑聯(lián)用參入抗體顯示有希望的治療模式即獲得人免疫功能而具治療效果，例如清除病原體(Van Spriel等，(1999)J.Infect.Diseases，179，661-669；Tacken等，(2004)J.Immunol.，172，4934-4940；美國(guó)5,487,890)、癌的治療(Olennie和van der Winkel，(2003)Drug Discovery Today，8，503-5100)和免疫治療(Van Spriel等，(2000)Immunol.Today，21，391-397；Segal等，(2001)J.Immunol.Methods，248，1-6；Lyden等，(2001)Nat.Med.，7，1194-1201)。
制造方面問(wèn)題的復(fù)雜性在于雙特異性抗體產(chǎn)物以兩種或多種H2L2復(fù)合體為基礎(chǔ)。例如兩套或多套重鏈和輕鏈基因的共同表達(dá)可致形成高達(dá)10種不同的組合，其中僅有一種為所需的異源二聚體(Suresh等，(1986)Methods EnzymoL，121，210-228)。
為解決這種問(wèn)題，開(kāi)發(fā)了許多方法生產(chǎn)保留重鏈效應(yīng)子功能的哺乳動(dòng)物細(xì)胞全長(zhǎng)雙特異性IgG形式(BsIgG)。BsIgGs需要工程的″杵臼結(jié)構(gòu)(knob and hole)″重鏈以防止異源二聚體形成且利用相同L-鏈來(lái)避免L-鏈錯(cuò)配(Carter，(2001)J.Immunol.Methods，248，7-15)。也已經(jīng)描述了可選擇的化學(xué)交聯(lián)方法自各自識(shí)別不同抗原的抗體片段制備復(fù)合體(Ferguson等，(1995)Arthritis and Rheumatism，38，190-209)或?qū)⑵渌Y(jié)合蛋白例如膠原凝集素交聯(lián)到抗體片段制備復(fù)合體(Tacken等，(2004)J.Immunol.，172，4934-4940)。
開(kāi)發(fā)通常缺乏重鏈效應(yīng)子功能的雙抗體或微型抗體(BsAb)也克服異源二聚體過(guò)剩。這些包含參入VH和VL結(jié)合位點(diǎn)(scFv)的極微小單鏈抗體隨后折疊(fold)并二聚化(dimerise)從而形成二價(jià)雙特異性抗體，對(duì)其每個(gè)靶抗原為單價(jià)(Holliger等，(1993)PNAS，90，6444-6448；Muller等，(1998)FEBS Lett.，422，259-264)。在一個(gè)實(shí)例中，CH1和L-恒定域用作形成雙特異性微型抗體的異源二聚化域(Muller等，(1998)FEBS Lett.，259-264)。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了許多基于E.coli表達(dá)體系的重組方法產(chǎn)生BsAbs(Hudson，(1999)Curr.Opin.Immunol.，11，548-557)，可是生產(chǎn)臨床階段多價(jià)抗體材料的花費(fèi)和規(guī)?？磥?lái)仍是其臨床開(kāi)發(fā)的首要障礙(Segal等，(2001)J.Immunol.Methods，248，1-6)。
近來(lái)，BsAb概念已經(jīng)擴(kuò)展到包括雙-雙抗體、四價(jià)的雙特異性抗體，其中在各H鏈和L鏈上的VH和VL域已經(jīng)被scFv結(jié)合域的工程對(duì)(engineered pairs)取代。雖然這類(lèi)構(gòu)建體的基因工程(engineer)方面的難度很大，但仍可在培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中裝配這種構(gòu)建體而不出現(xiàn)過(guò)剩異源二聚體(Lu等，(2003)J.Immunol.Methods，279，219-232)。
本領(lǐng)域中已經(jīng)熟知免疫球蛋白結(jié)構(gòu)。大多數(shù)天然免疫球蛋白包含兩個(gè)重鏈和兩個(gè)輕鏈。重鏈通過(guò)大約位于每個(gè)重鏈中間的鉸鏈域之間的雙硫鍵互相結(jié)合。輕鏈與每個(gè)重鏈在鉸鏈域N末端一側(cè)上結(jié)合。每個(gè)輕鏈通過(guò)鉸鏈域附近雙硫鍵正常鍵合到其各自重鏈。
當(dāng)Ig分子正確折疊時(shí)，每個(gè)鏈折疊成許多由更線性多肽序列結(jié)合的特殊球狀區(qū)域。例如輕鏈折疊成可變域(VL)和恒定域(CL)。重鏈有鄰近輕鏈可變域的單一可變域VH、第一恒定域、鉸鏈域和兩個(gè)或三個(gè)另外的恒定域。重鏈(VH)和輕鏈(VL)可變域的相互作用導(dǎo)致抗原結(jié)合區(qū)(Fv)形成。通常VH和VL都需要抗原結(jié)合，盡管重鏈二聚體和氨基末端片段在沒(méi)有輕鏈時(shí)仍顯示保留有活性(Jaton等，(1968)Biochemistry，7，4185-4195)。
隨著新分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，在人B細(xì)胞增殖性疾病(重鏈疾病)和鼠模型系統(tǒng)中鑒別出僅有重鏈的抗體(缺乏輕鏈)的存在。重鏈疾病分子水平分析顯示基因組水平的突變和缺失可導(dǎo)致重鏈CH1域不適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)，引起僅有重鏈而缺乏結(jié)合輕鏈活性的抗體表達(dá)(參見(jiàn)Hendershot等，(1987)J Cell Biol.，104，761-767；Brandt等，(1984)MoL Cell.Biol.，4，1270-1277)。
對(duì)得自噬菌體文庫(kù)的分離的人VH域單獨(dú)研究顯示VH域的抗原特異性結(jié)合但是這些VH域證明溶解度低。而且建議選擇具噬菌體陣列上展示的特異性結(jié)合性質(zhì)的人VH域可形成工程抗體結(jié)構(gòu)單元(Ward等，(1989)Nature，341，544-546)。
使用其他脊椎動(dòng)物物種研究顯示作為天然基因突變結(jié)果的駱駝(camelids)產(chǎn)生功能性僅有IgG2和IgG3重鏈二聚體，由于缺乏CH1輕鏈結(jié)合區(qū)其不能結(jié)合輕鏈(HamersCasterman等，(1993)Nature，363，446-448)及例如鯊魚(yú)的物種產(chǎn)生僅有重鏈樣(heavy chain-only-like)結(jié)合蛋白家族，可能涉及哺乳動(dòng)物T-細(xì)胞受體或免疫球蛋白輕鏈(Stanfield等，(2004)Science，305，1770-1773)。
駱駝僅有重鏈的抗體的一個(gè)特征是提供相對(duì)于人VH域提高了溶解度的駱駝VH域。為改善溶解性可改造人VH域(參見(jiàn)Davies和Riechmann，(1996)Protein Eng.，9(6)，531-537；Lutz和Muyldermans，(1999)J.Immuno.Methods，231，25-38)或可通過(guò)體內(nèi)自然選擇獲得溶解性(參見(jiàn)Tonha等，(2001)J.Biol.Chem.，276，24774-24780)。盡管應(yīng)用提高親和力策略例如親和力熱點(diǎn)隨機(jī)化，可是得自噬菌體文庫(kù)的VH結(jié)合域中對(duì)抗原的內(nèi)在親和力依然保持在低微摩爾-高納摩爾范圍(Yau等，(2005)J.Immunol.Methods，297，213-224)。
駱駝VH抗體也具有修飾的CDR3環(huán)特征。這種CDR3環(huán)平均比非-駱駝抗體中發(fā)現(xiàn)的更長(zhǎng)，且認(rèn)為是影響整體抗原親和力和特異性的主要特征，其補(bǔ)償了駱駝僅有重鏈的抗體物種中VL域的缺失(Desmyter等，(1996)Nat.Struct.Biol.，3，803-811，Riechinann和Muyldermans，(1999)J.Immunol.Methods，23，25-28)。
近來(lái)對(duì)駱駝抗體的結(jié)構(gòu)研究表明依賴于V(D)J重組事件和體細(xì)胞突變的體內(nèi)成熟過(guò)程大大促進(jìn)了抗體多樣性(De Genst等，(2005)J.Biol.Chem.，280(14)，14114-14121)。
目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出在轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生僅有重鏈的抗體的方法(參見(jiàn)WO02/085945和WO02/085944)。轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物(優(yōu)選小鼠)經(jīng)抗原激發(fā)可產(chǎn)生任何可能種類(lèi)(IgM、IgG、IgD、IgA或IgE)和得自任何哺乳動(dòng)物(包括人)的功能性僅有重鏈的抗體。
正常的免疫球蛋白重鏈基因座包含多個(gè)V基因片段、許多D基因片段和許多J基因片段。每個(gè)V基因片段編碼V域中從N末端幾乎直至C末端。每個(gè)V域的C末端由D基因片段和J基因片段編碼。親和力成熟前的B細(xì)胞中VDJ重排提供VH結(jié)合域，然后與VL結(jié)合域形成抗原識(shí)別位點(diǎn)或結(jié)合位點(diǎn)。重鏈的CH1區(qū)和輕鏈的κ或λ區(qū)促進(jìn)了重鏈和輕鏈的相互作用。
為產(chǎn)生僅有重鏈的抗體，種系(germime)中重鏈基因座包含編碼部分或全部可能的恒定區(qū)的基因片段。在成熟期間，重排的VH結(jié)合域剪接到CH2恒定區(qū)編碼片段從而提供編碼缺乏CH1域的重鏈且因此提供不能連接于與免疫球蛋白輕鏈相連接的重鏈的重排基因。
僅有重鏈單克隆抗體可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)自脾的B細(xì)胞回收或通過(guò)噬菌體展示技術(shù)自B細(xì)胞mRNA回收(Ward等，(1989)Nature341，544-546)。得自駱駝或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的僅有重鏈的抗體具高度親和力。正常H2L2四聚體序列分析證明多樣性主要源自VDJ重排和體細(xì)胞高度突變的結(jié)合(Xu和Davies，(2000)Immunity，13，37-45)。表達(dá)的在駱駝內(nèi)或在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中產(chǎn)生的僅有重鏈mRNA序列分析支持這個(gè)觀察結(jié)果(Dc Genst等，(2005)J.Biol.Chem.，280，14114-14121)。
天然駱駝和人VH區(qū)的一個(gè)重要且共同的特征是每個(gè)區(qū)不依賴于與VL區(qū)的二聚化而作為單體(與抗原)結(jié)合以取得最佳溶解性和結(jié)合親和力。這些特征早就被認(rèn)為是特別適于產(chǎn)生阻滯劑和組織滲透劑。
同-二聚體或異二聚體也可通過(guò)僅有重鏈的抗體的酶切或合成途徑產(chǎn)生(Jaton等，(1968)Biochemistry，7，4185-4195和US2003/0058074A1)。但是單體抗體結(jié)合域的優(yōu)勢(shì)仍有利于改造作為治療性或診斷性試劑的多聚體蛋白質(zhì)。
通過(guò)噬菌體展示技術(shù)產(chǎn)生的人VH或駱駝VHH缺少作為體細(xì)胞突變所致改善特征的優(yōu)點(diǎn)及通過(guò)正?？贵w結(jié)合位點(diǎn)CDR3區(qū)中D和J區(qū)重組提供的其他多樣性(Xu和Davies，(2000)Immunity，13，37-45)。同時(shí)與人VH相比顯示溶解性優(yōu)勢(shì)的駱駝VHH在人體中有抗原性且必須通過(guò)駱駝免疫或通過(guò)噬菌體展示技術(shù)產(chǎn)生。
VH結(jié)合域的參入比使用自VH和VL域改造的與特異性和親和力可能喪失有關(guān)的scFvs具有明顯的優(yōu)勢(shì)。為產(chǎn)生雙特異性或多特異性結(jié)合分子，得自相關(guān)基因家族例如T-細(xì)胞受體或鯊魚(yú)免疫球蛋白家族的VH結(jié)合域也可提供scFv方案的備擇方案。也可使用其他天然存在的結(jié)合蛋白及其域包括例如可溶性受體片段。
各種抗體的生理功能不同。例如IgG在成熟免疫應(yīng)答中發(fā)揮決定作用。IgM涉及補(bǔ)體固定和凝集作用。IgA是分泌物中Ig的主要類(lèi)別-眼淚、唾液、初乳、粘液中的-且因此在局部免疫中起作用。當(dāng)改造多價(jià)結(jié)合復(fù)合體時(shí)包括種類(lèi)特異性重鏈恒定區(qū)根據(jù)所需功能提供了體內(nèi)效應(yīng)子功能的治療利益。工程個(gè)體效應(yīng)子區(qū)也可導(dǎo)致功能性的添加和缺失(Van Dijk和van der Winkel，Curr.Opin.Chem.Biol.，(2001)8月5(4)，368-374)?？磥?lái)包含高度親和力VH結(jié)合域(人或駱駝或其他來(lái)源)的最適合的僅有重鏈的抗體的產(chǎn)生和選擇將得益于依賴于自隨機(jī)化噬菌體文庫(kù)選擇并不促進(jìn)體內(nèi)重組和親和力成熟方案的備擇方案。
因此包括IgA恒定區(qū)功能性將提高粘膜抗病原體功能(Leher等，(1999)Exp.Eye.Res，69，75-84)，同時(shí)IgG1恒定區(qū)功能性的存在提高體內(nèi)血清穩(wěn)定性。存在的重鏈CH2和CH3恒定域提供了如天然抗體中所見(jiàn)穩(wěn)定的二聚體作用基礎(chǔ)，且為翻譯后糖基化提供識(shí)別位點(diǎn)。如果使用雙特異性和多價(jià)復(fù)合體作為試劑和診斷劑，存在的CH2和CH3也促進(jìn)第二種抗體識(shí)別。
預(yù)先在鉸鏈區(qū)和人IgG1效應(yīng)子域前克隆分離的重排前駱駝僅有重鏈可變區(qū)序列，插入載體并在COS細(xì)胞中表達(dá)而產(chǎn)生抗體。在這種體外環(huán)境中表達(dá)抗體已經(jīng)經(jīng)過(guò)駱駝體內(nèi)類(lèi)型(同種型)轉(zhuǎn)換和親和力成熟(高突變)過(guò)程且可結(jié)合于抗原(Riechmann和Muyldermans，(1999)J.Immunol.Methods，231，25-38)。
為在各種臨床、工業(yè)和研究中應(yīng)用，本領(lǐng)域需要使體內(nèi)僅有重鏈的抗體多樣性和B-細(xì)胞應(yīng)答最大化，從而特別生產(chǎn)種類(lèi)特異性人僅有重鏈的抗體和功能性僅有VH重鏈結(jié)合域的功能性庫(kù)，其保留最大的抗原結(jié)合能力。
本領(lǐng)域也需要產(chǎn)生可溶的、二價(jià)的或多價(jià)的多肽結(jié)合復(fù)合體，單獨(dú)的或與效應(yīng)子(輕)鏈組合的包含至少部分的抗體重鏈且為生理學(xué)上穩(wěn)定的和具有效應(yīng)子功能。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種用于在轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生僅有VH重鏈或駱駝僅有VH(VHH)重鏈抗體的方法，包括哺乳動(dòng)物中異源VH或駱駝VH(VHH)重鏈基因座表達(dá)步驟，其中VH或駱駝VH(VHH)重鏈基因座包含不編碼CH1域的重鏈恒定區(qū)且如果表達(dá)，這種基因座能形成一種或多種確定類(lèi)別的僅有重鏈的抗體。
這種VH或駱駝VH(VHH)重鏈基因座可包含一種或多種駱駝或非駱駝V基因片段。優(yōu)選選擇或改造V基因片段從而提高溶解性。優(yōu)選的V基因片段得自人。
這種重鏈基因座的重鏈恒定區(qū)可包含Cα1和/或Cα2、Cε、Cδ、Cγ和/或Cμ重鏈恒定區(qū)基因。而且此重鏈基因座的重鏈恒定區(qū)可包含一種以上的下列重鏈恒定區(qū)Cα、Cα1、Cε、Cδ、Cγ、Cμ。
優(yōu)選的VH重鏈基因座包含含有至少一個(gè)人或駱駝V基因片段、至少一個(gè)D片段和至少一個(gè)J片段的可變區(qū)，其中人或駱駝V基因片段、D基因片段和J基因片段能夠重組而形成VDJ編碼序列。重鏈基因座優(yōu)選包含20個(gè)或更多的D基因片段和/或5個(gè)或更多J基因片段。優(yōu)選的D和J片段為脊椎動(dòng)物來(lái)源，優(yōu)選人。使用得自任何脊椎動(dòng)物D和J基因片段且優(yōu)選人D和J基因片段可獲得CDR3環(huán)。
VH重鏈基因座也可包含能夠直接將J基因片段與重鏈恒定區(qū)基因重組的重組序列(rss)。
異源重鏈基因座的重鏈恒定區(qū)為人源或脊椎動(dòng)物來(lái)源例如駱駝來(lái)源?；蛘哌@種恒定區(qū)可以并非免疫球蛋白重鏈來(lái)源。
優(yōu)選的本發(fā)明方法導(dǎo)致基本正常B細(xì)胞成熟。本發(fā)明也提供僅有重鏈的抗體或其片段，或根據(jù)本發(fā)明方法得到或可以得到多種僅有重鏈的抗體混合物。這種僅有重鏈的抗體可為單克隆抗體或其片段，例如人或駱駝VH結(jié)合域。本發(fā)明的VH結(jié)合域可缺乏延伸的駱駝樣CDR3環(huán)或可包含延伸的駱駝樣CDR3環(huán)。
本發(fā)明也提供包含本發(fā)明的異源重鏈基因座的載體且用這種載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
本發(fā)明也提供表達(dá)本文所述異源重鏈基因座的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物。優(yōu)選的本發(fā)明轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物產(chǎn)生包括輕鏈的抗體的能力降低。
本發(fā)明也提供了僅有重鏈的抗體或其片段在制備免疫治療藥物中的用途。本發(fā)明的僅有重鏈的抗體也可作為診斷劑、試劑、抗體酶或抑制劑。也提供包含本發(fā)明僅有重鏈的抗體或其片段和藥理學(xué)上適當(dāng)載體的藥用組合物。
本發(fā)明也提供產(chǎn)生并選擇僅有重鏈的抗體的方法，包括步驟(a)將抗原注射進(jìn)本文所述的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物中；(b)分離表達(dá)所需抗原特異性、僅有重鏈的抗體的細(xì)胞或組織；(c)由步驟(b)的細(xì)胞或組織產(chǎn)生雜交瘤；(d)任選從所述雜交瘤克隆僅有重鏈的抗體mRNA，以便以后在異源表達(dá)體系例如哺乳動(dòng)物、植物、昆蟲(chóng)、微生物、真菌或其它可行的體系中產(chǎn)生該抗體。
然后從步驟(C)的克隆的mRNA中鑒別和分離抗原特異性VH域產(chǎn)生VH結(jié)合域。
本發(fā)明VH結(jié)合域也可產(chǎn)生自(a)將抗原注射進(jìn)本文所述的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物中；(b)分離表達(dá)所需抗原特異性、僅有重鏈的抗體的細(xì)胞或組織；(c)從得自分離細(xì)胞或組織的mRNA克隆VH基因座；d)使用噬菌體或類(lèi)似文庫(kù)展示編碼的蛋白質(zhì)；(e)鑒定抗原特異性VH域；且(f)在細(xì)菌、酵母或其它可行的表達(dá)體系中單獨(dú)表達(dá)或作為融合蛋白表達(dá)VH域。
發(fā)明詳述發(fā)明人克服了先有技術(shù)的局限性并指出可以使轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，尤其是小鼠，產(chǎn)生“微基因座”從而生產(chǎn)血漿或B細(xì)胞分泌的種類(lèi)特異性，只有重鏈抗體，或只有重鏈抗體的不同種類(lèi)的混合物。然后這些可用于使用已建立的雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生能可靠供應(yīng)的種類(lèi)特異性、只有重鏈抗體，或者用作VH(VHH)結(jié)合域或僅有VH重鏈結(jié)合域，優(yōu)選一種沒(méi)有效應(yīng)子功能但保留結(jié)合功能的人源可溶的僅有VH重鏈結(jié)合域。
通常在不存在擴(kuò)展的CDR3環(huán)的情況下，通過(guò)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的只有重鏈抗體(包括駱駝抗體)顯示出由于V、D和J基因片段重排和體細(xì)胞突變而產(chǎn)生的高親和力。在離體血漿中可觀察到基本正常的B細(xì)胞成熟有高水平的只有重鏈抗體出現(xiàn)(條件是在重組基因座中出現(xiàn)的所有抗體種類(lèi)中剔除了CH1域)。B-細(xì)胞成熟和裝配的二聚體(例如IgG)或多聚體(IgM)的分泌不依賴輕鏈基因的存在和表達(dá)。
編碼一種從轉(zhuǎn)基因小鼠得到的雜交瘤分離的抗原特異性重鏈的抗原特異性mRNA的核酸序列分析證明重鏈抗體多樣性主要與VDJ重組有關(guān)。而且，本發(fā)明者指出抗體多樣性產(chǎn)生在僅有重鏈的抗體的功能抗原結(jié)合域的CDR3區(qū)域，而來(lái)自VH域中體細(xì)胞突變的貢獻(xiàn)相當(dāng)有限。使用這里描述的方法，可以在細(xì)菌系統(tǒng)克隆并表達(dá)功能VH域從而產(chǎn)生保留有全部抗原結(jié)合、特異性和親和力的VH結(jié)合域。另外，培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞系能分泌種類(lèi)特異性重鏈二聚體和多聚體。
本發(fā)明也指出可按程序改造轉(zhuǎn)基因小鼠從而生產(chǎn)響應(yīng)抗原激發(fā)的僅有重鏈的抗體的優(yōu)選種類(lèi)，例如僅有IgG或者僅有IgM或例如IgA、IgG和IgM的混合物。
發(fā)明者以前描述(參見(jiàn)WO02/085945和WO02/085944)了表達(dá)一種缺失CH1外顯子并通過(guò)人D和J片段連接兩個(gè)馬駝VHH基因的最小的人IgG重鏈恒定區(qū)基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠的生產(chǎn)。當(dāng)用抗原激發(fā)時(shí)，這些小鼠產(chǎn)生功能性、高親和力、抗原特異性僅有IgG重鏈抗體。通過(guò)串聯(lián)加入重鏈恒定區(qū)的基因構(gòu)鍵體的使用(條件是所有恒定區(qū)基因缺乏CH1區(qū)并且有時(shí)會(huì)存在CH4區(qū))在體內(nèi)經(jīng)過(guò)類(lèi)轉(zhuǎn)換可獲得僅有重鏈的抗體種類(lèi)的混合物(IgM和IgG)。
這里描述的改進(jìn)展示一種具有通過(guò)人D和J片段連接兩種馬駝VHH基因的相同IgG恒定區(qū)基因座和通過(guò)相同的人D和J片段連接兩種馬駝VHH基因的缺失CH1外顯子的人IgM恒定區(qū)基因座結(jié)構(gòu)的小鼠，也產(chǎn)生高分子量(多聚體)僅有IgM重鏈抗體和僅有IgG(二聚體)重鏈抗體。驚人的是基本正常B-細(xì)胞成熟和抗體產(chǎn)生依賴于CH1序列從每個(gè)存在于轉(zhuǎn)基因基因座中的重鏈恒定區(qū)全部缺失。而且，如果CH4外顯子存在不需要去除。
因此，例如，一種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物攜帶一種通過(guò)相同的人D和J基因片段連接兩種馬駝V基因片段的帶有功能CH1外顯子的人IgM重鏈基因座，和通過(guò)相同的人D和J基因片段連接兩種馬駝V基因片段的缺失CH1外顯子的IgG恒定重鏈區(qū)基因座，則該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)生相當(dāng)?shù)退降膬H有重鏈的抗體并且不顯示B-細(xì)胞成熟跡象。
按需要可以引入或不引入包括CH4域的其它效應(yīng)子域，以將效應(yīng)子特征引入所得僅有重鏈的抗體或從中去除。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)抗體的產(chǎn)生性表達(dá)(例如B-細(xì)胞成熟)可由存在于結(jié)構(gòu)中的任何V基因片段的使用引起。來(lái)源于B-細(xì)胞的抗體mRNA的分離和測(cè)序顯示D和J基因片段重組產(chǎn)生CDR3多樣性。所得的VH域的序列比較揭示體細(xì)胞突變，意味著在重組D和J基因片段中并且也在所得的表達(dá)的抗體mRNA的VH域發(fā)生親和力成熟。
優(yōu)選的構(gòu)建體加入選擇或改造用于改善溶解度和連接用于重組的D和J鏈簇和CDR3產(chǎn)生的V基因片段。優(yōu)選，VDJ序列連接于所選的串聯(lián)恒定效應(yīng)子域，每個(gè)缺失CH1外顯子。
本發(fā)明不限于人或駱駝種類(lèi)特異性的僅有重鏈的抗體或人VH結(jié)合域(優(yōu)選可溶的VH結(jié)合域)(單獨(dú)或連接于連接于所選的效應(yīng)子域)的生產(chǎn)和衍生化，還包括連接于D和J基因片段脊椎動(dòng)物來(lái)源(任選經(jīng)基因工程改造從而改善溶解性)的任何V基因片段的嵌合(chaemeric)組合(combination)的生產(chǎn)。優(yōu)選，V基因片段是人源的并且不是來(lái)自駱駝的V基因片段。所得的VH域可以不包含擴(kuò)展的駱駝樣CDR3環(huán)除非D和J片段來(lái)自駱駝。這導(dǎo)致展示CDR3多樣性和親和力成熟的VH域操作性連接于效應(yīng)子恒定區(qū)。后者確保在所選的親代轉(zhuǎn)基因脊椎動(dòng)物中功能性分泌和任選裝配，并且以后如果需要還可以提供可選擇的效應(yīng)子功能。
這些觀察結(jié)果對(duì)改進(jìn)和簡(jiǎn)化種類(lèi)特異性僅有重鏈的抗體和經(jīng)過(guò)體細(xì)胞突變加入親和力成熟的高親和力可溶的VH域的改造有重要意義。選擇的重鏈恒定區(qū)效應(yīng)子功能(缺失CH1)或它們的混合物的加入允許僅有重鏈的抗體的任何種類(lèi)或沒(méi)有另外抗體改造要求的僅有重鏈的抗體的任何混合物的產(chǎn)物。VH域可被細(xì)菌和其它微生物系統(tǒng)單獨(dú)表達(dá)，或作為加入效應(yīng)子域的功能性僅有重鏈的抗體由培養(yǎng)的雜交瘤或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分泌?？贵w和人源的VH結(jié)合域在健康護(hù)理領(lǐng)域作為藥物、診斷劑和試劑有廣泛應(yīng)用，同時(shí)還可應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、環(huán)境和工業(yè)。
因此，第一方面，本發(fā)明提供一種用于轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物中僅有VH重鏈抗體的生產(chǎn)方法，該方法包含在那種哺乳動(dòng)物中表達(dá)一種異源VH重鏈基因座的步驟。優(yōu)選，VH重鏈基因座包含一種不編碼CH1域并且當(dāng)表達(dá)時(shí)基因座可形成完整的僅有重鏈的抗體的重鏈恒定區(qū)域的多樣性庫(kù)。
本發(fā)明的第一方面也提供一種用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物中駱駝僅有VH重鏈抗體的方法，該方法包含在那種哺乳動(dòng)物中表達(dá)一種駱駝VH重鏈基因座的步驟，其中VH重鏈基因座包含一種不編碼CH1域并且當(dāng)表達(dá)時(shí)基因座可形成加入VDJ重排和親和力成熟適應(yīng)抗原激發(fā)的完整的僅有重鏈的抗體的多樣性庫(kù)的重鏈恒定區(qū)域。
重鏈效應(yīng)分子可改造成無(wú)功能域，例如羧基段CH4域，條件是改造不影響阻止細(xì)胞表面裝配并因此B-細(xì)胞成熟的分泌機(jī)制。CH1外顯子單獨(dú)從異源基因座刪除或從基因座缺失。另外的特點(diǎn)可經(jīng)改造加入到基因座中，例如改善糖基化，或增加功能。
優(yōu)選，當(dāng)表達(dá)時(shí)，異源基因座可形成功能性IgA、IgE、IgG、IgD或IgM分子或它們的同種型。
因此，依據(jù)需要的抗體種類(lèi)以及基本正常的B-細(xì)胞成熟，設(shè)計(jì)異源重鏈基因座以產(chǎn)生僅有重鏈的抗體的優(yōu)選種類(lèi)或混合物。駱駝V、D和J基因片段和駱駝效應(yīng)子區(qū)域的使用將產(chǎn)生帶有駱駝特有特點(diǎn)的駱駝抗體，例如擴(kuò)展的CDR3環(huán)。包含隨機(jī)選擇或選擇或改造用于增強(qiáng)溶解度的V基因片段的人V、D和J基因片段的使用將產(chǎn)生功能性人僅有重鏈的抗體。
依據(jù)本發(fā)明得到的抗體與先有技術(shù)的抗體相比其優(yōu)點(diǎn)在于它們是基本上是單一或已知種類(lèi)并優(yōu)選是人源的抗體。體內(nèi)VDJ重組和親和力成熟共同使抗體具有高親和力。用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的完備方法可分離、鑒定和制備抗體及其片段。
異源重鏈基因座在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“異源的”是指如本文所述的一種核苷酸序列或一種基因座，對(duì)于其所在的哺乳動(dòng)物不是內(nèi)源性的。
在本發(fā)明的上下文中，“VH重鏈基因座”是指編碼包含一種或多種V基因片段、一種或多種D基因片段和一種或多種J基因片段，操作性連接于一種或多種重鏈效應(yīng)子區(qū)域(每種缺失CH1域)的VH域的最少的微型基因座。優(yōu)選抗體庫(kù)可變性的主要來(lái)源是CDR3區(qū)，該區(qū)通過(guò)選擇D和J基因片段并進(jìn)行V-D和D-J連接而形成。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是VH基因序列重排得到的抗體庫(kù)和多樣性通過(guò)多個(gè)D和J基因片段的使用可以最大化。使用一種不需要大量V基因片段或VL和Lc(輕鏈)免疫球蛋白基因座的最小的基因座(微基因座)的同時(shí)獲得以后的體細(xì)胞突變。
優(yōu)選，VH重鏈基因座包含來(lái)自任何脊椎動(dòng)物種屬的2到5個(gè)V(2、3、4或5)基因片段。
優(yōu)選的V基因片段是人源的，任選選擇或改造以改善溶解度。優(yōu)選的VH重鏈基因座包含2到40個(gè)(2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、30或40)或更多D基因片段。D基因片段可以來(lái)自任何脊椎動(dòng)物種屬但是最優(yōu)選的D基因片段是人D基因片段(正常地25個(gè)功能性D基因片段)。
優(yōu)選的VH重鏈基因座包含2到20個(gè)(2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18或20)或更多J基因片段。J基因片段可選自任何脊椎動(dòng)物種屬但是最優(yōu)選的J基因片段是人J基因片段(正常地6J基因片段)。
優(yōu)選的VH重鏈基因座包含2個(gè)或更多V基因片段，25個(gè)功能性人D基因片段和6個(gè)人J基因片段。
術(shù)語(yǔ)“V基因片段”包括來(lái)自一種脊椎動(dòng)物包括駱駝和人天然存在的V基因片段，該V基因片段任選經(jīng)選擇、突變或改造以改善特性，例如溶解度。V基因片段也在其它種屬例如鯊魚(yú)(見(jiàn)Kokubu等，(1988)EMBO.J.，7，3413-3422)中發(fā)現(xiàn)或進(jìn)化從而提供示例性結(jié)合蛋白的不同的VH-樣家族，例如，免疫球蛋白輕鏈VL組分或T-細(xì)胞受體VH組分的進(jìn)化中。
改善VH域的溶解度的優(yōu)選方法結(jié)合了合理的(決不僅僅是隨機(jī)的)手段并且在Davies和Reichinann，(1996)Protein Eng.，9(6)，531-537和Riechmann和Muyldermans，(1999)J.immunol.Methods，231，25-38中舉例說(shuō)明。通過(guò)親和力成熟和在接著VDJ重排的VH基因有利突變的加入，自然選擇在體內(nèi)也可發(fā)生。
依據(jù)本發(fā)明當(dāng)表達(dá)核酸時(shí)V基因片段必須可以和D基因片段、J基因片段和重鏈恒定(效應(yīng)子)區(qū)(它可能包含幾個(gè)外顯子但CH1外顯子除外)重組從而產(chǎn)生僅有VH重鏈抗體。
依據(jù)本發(fā)明的V基因片段也包括在它的范圍內(nèi)任何編碼同源物、衍生物或蛋白質(zhì)片段基因序列，該基因序列可以和依據(jù)本發(fā)明的D基因片段、J基因片段和重鏈恒定區(qū)(包含1個(gè)或多個(gè)外顯子但非CH1外顯子)重組從而產(chǎn)生這里定義的僅有VH重鏈抗體。
因此VH編碼序列可以來(lái)自自然發(fā)生來(lái)源或使用本領(lǐng)域熟練者熟悉的方法合成。
在本發(fā)明的上下文中“VH域”指的是當(dāng)與上述定義的D基因片段和J基因片段重組時(shí)V基因片段的表達(dá)產(chǎn)物。優(yōu)選，像這里使用的VH域保持溶解并且在不需要其它任何因子維持溶解度的生理性介質(zhì)中有活性。優(yōu)選，通過(guò)VDJ重組和體細(xì)胞突變改善可溶的VH域結(jié)合抗原的能力。不依賴駱駝種屬特有的擴(kuò)展的CDR3環(huán)的存在或缺失。VH域可以結(jié)合作為單體的抗原并且，當(dāng)結(jié)合效應(yīng)子恒定區(qū)時(shí)，依據(jù)使用的效應(yīng)子分子(例如IgG、IgA IgM等)的選擇和改造或二聚化和多聚化的選擇機(jī)制可以產(chǎn)生單特異性、雙特異性、多特異性、二價(jià)或多價(jià)形式，通過(guò)去除CH1外顯子排除了當(dāng)表達(dá)可溶的僅有重鏈的抗體合成物的部分時(shí)結(jié)合VL域的可能性(見(jiàn)Sitia等，(1990)Cell，60，781-790)。也可單獨(dú)改造VH域與不同蛋白域例如與毒素、酶和顯像劑從而產(chǎn)生用于靶向治療和診斷目的的融合蛋白。
在本發(fā)明的上下文中術(shù)語(yǔ)“D基因片段”和“J基因片段”包括D和J基因片段的天然存在序列。優(yōu)選的D和J基因片段來(lái)自與V基因片段來(lái)源相同的脊椎動(dòng)物。例如，如果V基因片段來(lái)自人那么溶解的或改造的D和J基因片段也優(yōu)選來(lái)自人?；蛘遃基因片段來(lái)自如駱駝而D和J基因片段來(lái)自人，反之亦然。
術(shù)語(yǔ)D基因片段和J基因片段也包括在它們范圍內(nèi)的衍生物、同源物和它們的片段只要所得的片段可以和像這里描述的重鏈抗體基因座的剩余組分重組從而產(chǎn)生這里描述的僅有重鏈的抗體。D和J基因片段也可來(lái)自自然發(fā)生來(lái)源或使用這里描述的本領(lǐng)域熟練者熟悉的方法合成。V、D和J基因片段可以重組并優(yōu)選經(jīng)過(guò)體細(xì)胞突變。
V、D和J基因片段優(yōu)選來(lái)自單個(gè)脊椎動(dòng)物種屬。這可以是任何脊椎動(dòng)物種屬但優(yōu)選人。
另外，依據(jù)本發(fā)明的異源的重鏈基因座包含編碼重鏈恒定區(qū)的DNA的區(qū)域倘若在體內(nèi)效應(yīng)子起作用(例如IgG、IgM、IgA、IgE、IgD或它們的同種類(lèi)型)。
本發(fā)明也提供通過(guò)本發(fā)明的方法得到或可得到的抗原特異性僅有重鏈的抗體。
重鏈恒定區(qū)操作上，在B細(xì)胞內(nèi)可以和V基因片段、D基因片段和J基因片段重組的自然發(fā)生或改造的基因片段編碼重鏈恒定區(qū)。優(yōu)選重鏈恒定區(qū)來(lái)自免疫球蛋白基因座。
依據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面，每個(gè)重鏈恒定區(qū)必需包含至少一個(gè)重鏈恒定區(qū)基因，該重鏈恒定區(qū)基因不表達(dá)功能性CH1域所以僅有重鏈的抗體的產(chǎn)生可以發(fā)生。每個(gè)重鏈恒定區(qū)也可包含一個(gè)或多個(gè)其他重鏈恒定區(qū)外顯子，在其他重鏈恒定區(qū)基因也不表達(dá)功能性CH1域的條件下該重鏈恒定區(qū)外顯子選自Cδ，Cγ1-4，Cμ，Cε和Cα1-2。依據(jù)優(yōu)選種類(lèi)或需要的抗體種類(lèi)的混合物選擇重鏈恒定區(qū)基因片段。任選異源重鏈基因座為Cμ-和Cδ-缺陷。
例如，已知M類(lèi)的Ig分子對(duì)激活巨噬細(xì)胞和補(bǔ)體途徑起重要作用。由于它的結(jié)合部位的極其近似，IgM對(duì)病原體包括病毒有高親和力。然而也已知IgM在快速免疫測(cè)定技術(shù)中難以使用而G類(lèi)的Ig在這些技術(shù)中容易使用。為了這種使用，選擇優(yōu)選的抗體種類(lèi)是有用的，例如IgG或IgM。
缺失CH1的異源重鏈Cγ基因座的全部或部分表達(dá)將產(chǎn)生任選的部分或全部IgG同種類(lèi)型，依賴異源IgG基因座中存在的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4同種類(lèi)型?；蛘咧劓溈砂珻δ基因。所得的IgE分子也可用于治療。
或者，可以得到抗體的選擇混合物。例如，當(dāng)重鏈恒定區(qū)包含Cα和Cμ基因時(shí)可得到IgA和IgM。
優(yōu)選依據(jù)本發(fā)明的重鏈恒定區(qū)是人源的，尤其當(dāng)重鏈抗體用于人治療應(yīng)用時(shí)。在重鏈抗體用于診斷或獸用目的時(shí)，重鏈恒定區(qū)優(yōu)選來(lái)自實(shí)施診斷或獸醫(yī)治療的脊椎動(dòng)物或哺乳動(dòng)物的靶組織。
當(dāng)表達(dá)時(shí)，重鏈恒定區(qū)缺乏功能性CH1域。CH1外顯子和任選地，Cμ和Cδ恒定區(qū)，可突變、刪除或取代。優(yōu)選，刪除CH1外顯子。例如，帶有功能性CH1域的IgM的存在抑制B-細(xì)胞成熟并因此限制產(chǎn)生性表達(dá)。
哺乳動(dòng)物本發(fā)明方法中使用的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物不為人。優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物為嚙齒目動(dòng)物例如兔、豚鼠、大鼠或小鼠。特別優(yōu)選小鼠。也可采用可選擇的其他哺乳動(dòng)物例如山羊、綿羊、貓、狗或其它動(dòng)物。
優(yōu)選轉(zhuǎn)基因動(dòng)物使用確定的卵母細(xì)胞注射技術(shù)及確定的ES細(xì)胞技術(shù)或克隆產(chǎn)生。
有利的是，如果根據(jù)本發(fā)明方法表達(dá)僅有重鏈的抗體，哺乳動(dòng)物內(nèi)源性免疫球蛋白重鏈和任選輕鏈基因座缺失或被沉默。
如上所述產(chǎn)生僅有重鏈的抗體的方法可特別用于產(chǎn)生人用治療用途的抗體，通常給予與抗體源物種不同的脊椎動(dòng)物物種抗體導(dǎo)致抗所給予抗體免疫應(yīng)答發(fā)生。
因此，在另一個(gè)方面本發(fā)明提供了表達(dá)異源重鏈基因座的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物。
可改造這種哺乳動(dòng)物使其產(chǎn)生包括輕鏈抗體的能力降低。
產(chǎn)生抗體細(xì)胞可得自本發(fā)明轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物且例如用來(lái)制備用于產(chǎn)生本文定義的僅有重鏈的抗體的雜交瘤。另外或可選擇性可自本發(fā)明轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物分離核酸序列且用于產(chǎn)生其VH域僅有重鏈的抗體或雙特異性/雙功能的復(fù)合體，所用DNA重組體技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的。
可選擇性或另外的，可通過(guò)本發(fā)明轉(zhuǎn)基因動(dòng)物免疫接種產(chǎn)生抗原特異性僅有重鏈的抗體。
因此在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用抗原免疫本發(fā)明轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物從而產(chǎn)生僅有重鏈的抗體的方法。
在本發(fā)明這種方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物為小鼠。
僅有重鏈的抗體及其片段在另一個(gè)方面中本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明方法可獲得的僅有重鏈的抗體及其功能性片段和衍生物。包括VH結(jié)合域的片段可通過(guò)酶切或溴化氰切割本發(fā)明僅有重鏈即缺乏輕鏈的抗體獲得(Jaton等，(1968)Biochemistry，7，4185-4195)。
一種優(yōu)選的功能性片段為抗原特異性、僅有重鏈結(jié)合域即VH結(jié)合域，其由在單V、D和J基因片段間重組然后體細(xì)胞突變所得VH基因座表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明這個(gè)方面，VH基因座可自例如分離自上述免疫的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的產(chǎn)生抗體細(xì)胞克隆。然后克隆序列可用噬菌體展示(Ward等，(1989)Nature，341，544-546)或用類(lèi)似展示文庫(kù)展示，例如使用基于酵母體系(Boder和Wittrup，(1997)Nat.Biotechnol，15，553-7)和鑒定的抗原特異性VH結(jié)合域。然后可單獨(dú)或作為融合蛋白在能放大規(guī)模(scalable)的細(xì)菌、酵母或其他表達(dá)體系中制備抗原特異性重鏈結(jié)合域。也可從通過(guò)免疫轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)典方法所得特征性雜交瘤克隆編碼VH結(jié)合域的序列。然后這些可用于產(chǎn)生VH結(jié)合域及其衍生物包括具有不同效應(yīng)子功能的工程的定義抗體種類(lèi)(例如IgE或IgA)及其變異體。
相應(yīng)的，本發(fā)明也提供了產(chǎn)生VH結(jié)合域的方法，包括步驟(a)分離表達(dá)所需抗原特異性、僅有重鏈的抗體的細(xì)胞或組織(優(yōu)選可溶的所需抗原特異性、僅有重鏈的抗體)；(b)自得自分離細(xì)胞或組織的mRNA克隆編碼VH結(jié)合域的序列；(c)使用噬菌體或類(lèi)似文庫(kù)展示編碼蛋白質(zhì)；(d)鑒定抗原特異性VH結(jié)合域；且(e)在細(xì)菌、酵母、哺乳動(dòng)物或其它可行的表達(dá)體系中單獨(dú)表達(dá)或作為融合蛋白表達(dá)VH結(jié)合域。
或者，可使用酶切或化學(xué)切割技術(shù)及接著從其它切割產(chǎn)物分離含有VH域片段而從本發(fā)明僅有重鏈的抗體產(chǎn)生含有VH域的片段。
自特征性雜交瘤分離VH結(jié)合域，使用噬菌體或其他展示體系可直接將得自mRNA克隆的VH結(jié)合域序列克隆進(jìn)表達(dá)載體而不借助其它選擇步驟。
結(jié)合效應(yīng)子區(qū)的僅有重鏈的抗體的產(chǎn)生體系包括適于大量培養(yǎng)技術(shù)的培養(yǎng)中哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如CHO細(xì)胞)、植物(例如玉米)、轉(zhuǎn)基因山羊、兔、牛、綿羊、小雞和昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)。其它產(chǎn)生體系包括病毒感染(例如昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)和細(xì)胞系中桿狀病毒)是細(xì)胞培養(yǎng)和種系方法的備擇方法。其它產(chǎn)生方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員也是熟知的。如果需要僅有重鏈IgA或IgM裝配，共表達(dá)的“J鏈”是有利的。用于產(chǎn)生駱駝僅有重鏈的抗體或單獨(dú)產(chǎn)生VH結(jié)合域的適當(dāng)方法也是本領(lǐng)域中已知的。例如駱駝VH結(jié)合域在細(xì)菌體系中產(chǎn)生且駱駝僅有重鏈同二聚體在雜交瘤和轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生(參見(jiàn)Reichmann和Muyldermans，(1999)J.Immunol.Methods，231，25-38)。
也適當(dāng)建立了使用噬菌體展示技術(shù)獲得工程人VH結(jié)合域的表達(dá)方法(Tanha等，(2001)J.Biol.Chem.，276，24774-24780及參考)。
從轉(zhuǎn)基因飛行昆蟲(chóng)系(fly lines)中昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)顯示產(chǎn)生血淋巴內(nèi)功能性僅有重鏈的抗體片段，性質(zhì)與通過(guò)哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的相同抗體一致(PCT/GB2003/0003319)。本發(fā)明也提供了根據(jù)本發(fā)明這個(gè)方面的方法能夠獲得的抗原特異性單體或二聚體的VH結(jié)合域。
本發(fā)明也提供包括異源重鏈基因座的多核苷酸序列、分離的編碼本發(fā)明僅有重鏈的抗體的多核苷酸及包含異源重鏈基因座的載體，或其片段，或分離的編碼本發(fā)明僅有重鏈的抗體多核苷酸。
本發(fā)明也提供了用本發(fā)明的異源重鏈基因座或其片段或分離的編碼僅有重鏈的抗體或抗體片段轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明抗原特異性VH結(jié)合域、以及與其連接的提供效應(yīng)子活性的效應(yīng)子部分的多肽復(fù)合體。此外，這種效應(yīng)子活性由重鏈恒定區(qū)提供且定位在分子氨基末端或羧基末端。這些多肽復(fù)合體保留有抗原特異性VH結(jié)合域賦予的生理學(xué)功能，也具其他靶向作用或效應(yīng)子部分的效應(yīng)子功能。這種多肽復(fù)合體可為功能性單體形式，或依賴于效應(yīng)子部分、二聚體、四聚體、五聚體、多聚體或結(jié)合不同VH結(jié)合域而賦予多價(jià)和多特異性的其他復(fù)合體間的設(shè)計(jì)及相互作用。VH結(jié)合域可存在于結(jié)合分子的氨基末端或羧基末端(參見(jiàn)

圖1的二聚體實(shí)例)。
如果效應(yīng)子部分包含結(jié)合域，其特異性可不同于抗原特異性VH結(jié)合域的特異性。這種排列的優(yōu)點(diǎn)為多肽復(fù)合體可促進(jìn)不同靶標(biāo)的交聯(lián)。例如雙特異性多肽復(fù)合體可用于促進(jìn)細(xì)胞-細(xì)胞相互作用及細(xì)胞/病原體相互作用。在此實(shí)施方案中，可利用本發(fā)明多肽復(fù)合體例如用來(lái)橋接兩種細(xì)胞類(lèi)型例如病原體和巨噬細(xì)胞(參見(jiàn)Biburger等，(2005)J Mol.Biol.，346，1299-1311)。VH結(jié)合域的用途優(yōu)選為在這種雙特異性設(shè)計(jì)中scFV結(jié)合域的用途。VH結(jié)合域具高度結(jié)合親和力且可用最小載體結(jié)構(gòu)將其結(jié)合進(jìn)這種多肽復(fù)合體中且相對(duì)于四聚體親代分子在設(shè)計(jì)上不需考慮維持scFVs特異性和親和力。若要構(gòu)建二聚體或多聚體多肽復(fù)合體，則加入二聚化域例如加入得自免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的CH2和CH3域(見(jiàn)圖2)。
本文所用術(shù)語(yǔ)“效應(yīng)子部分”包括在細(xì)胞上介導(dǎo)所需生物學(xué)效應(yīng)的任何部分。此效應(yīng)子部分優(yōu)選可溶的且可為肽、多肽或蛋白質(zhì)或可為非肽結(jié)構(gòu)。例如效應(yīng)子部分可為酶、激素、細(xì)胞因子、藥物、前體藥物、毒素特別是蛋白質(zhì)毒素，螯合結(jié)構(gòu)中放射性核素、結(jié)合域、二聚化域或相互作用域、顯像劑、白蛋白或抑制劑。
白蛋白可用作效應(yīng)子部分而改善抗原特異性VH結(jié)合域的穩(wěn)定性或藥物代謝動(dòng)力學(xué)和/或藥效學(xué)性質(zhì)(Sung等，(2003)J.interferonCytokine Res.，23(1)25-36)?；蛘?，效應(yīng)子部分可為聚乙二醇化的結(jié)構(gòu)或天然糖基化的結(jié)構(gòu)從而改善藥效學(xué)性質(zhì)。
這種效應(yīng)子部分可為鍵合到抗原特異性VH結(jié)合域的肽，或者其可化學(xué)性鍵合到抗原特異性重VH域，例如通過(guò)使用化學(xué)連接結(jié)構(gòu)例如馬來(lái)酰亞胺交聯(lián)劑?？蛇x擇的本發(fā)明的多肽復(fù)合體可為表達(dá)的融合蛋白。如此本發(fā)明也包括包括異源重鏈基因座多核苷酸序列，或者本發(fā)明的編碼僅有重鏈的抗體的分離的多核苷酸，其中多核苷酸進(jìn)一步包含在閱讀框內(nèi)編碼效應(yīng)子部分的一個(gè)或多個(gè)外顯子。這種外顯子可為多核苷酸的5’或3’末端。例如多核苷酸可以下述次序(following order)并在閱讀框內(nèi)包含VH和結(jié)合域\效應(yīng)子部分基因片段。
關(guān)于基因融合，可用編碼融合蛋白氨基酸序列的重組DNA構(gòu)建體與編碼位于相同閱讀框各個(gè)域的DNA達(dá)到各個(gè)域的連接。這種構(gòu)建體具有診斷和治療價(jià)值。對(duì)于診斷，這種效應(yīng)子域可為熒光蛋白質(zhì)(例如GFP)或酶(例如β-gal)?；蛘撸@種效應(yīng)子域可為增強(qiáng)結(jié)合于底物的tag(例如多組氨酸或生物素)，可為提供二抗結(jié)合位點(diǎn)或亮氨酸拉鏈或可利于結(jié)合熒光標(biāo)記的類(lèi)似結(jié)合基序的抗原。
多肽復(fù)合體本發(fā)明人也清楚可能產(chǎn)生包含單獨(dú)或與包含互補(bǔ)裝配域且具其他效應(yīng)子活性的分離效應(yīng)子(輕)鏈組合的至少部分抗體重鏈的二價(jià)或多價(jià)多肽復(fù)合體。本發(fā)明的多肽復(fù)合體保留重鏈恒定區(qū)賦予的生理功能及與效應(yīng)子鏈相關(guān)的另外的效應(yīng)子部分功能(圖3)。
因此在第三個(gè)方面，這種多肽復(fù)合體包含與一種或多種效應(yīng)子鏈(輕鏈)組合的重鏈。本發(fā)明的第二個(gè)方面提供了一種包含一對(duì)重鏈和一對(duì)效應(yīng)子鏈的多肽復(fù)合體，其中一對(duì)重鏈相互連接；一條效應(yīng)子鏈與一條重鏈相連，而另一條效應(yīng)子鏈與另一條重鏈相連；每個(gè)重鏈包含結(jié)合域、優(yōu)選包含至少CH2、CH3和任選CH4恒定區(qū)域的二聚化域和能夠結(jié)合于效應(yīng)子鏈互補(bǔ)裝配域的效應(yīng)子部分；效應(yīng)子鏈包含連接于效應(yīng)子部分的互補(bǔ)裝配域，其中裝配域和互補(bǔ)裝配域通過(guò)非共價(jià)相互作用互相連接。
優(yōu)選的重鏈中的效應(yīng)子部分不同于效應(yīng)子鏈中的效應(yīng)子部分。
任選的多肽復(fù)合體包括柔軟的鉸鏈樣域，該域位于CH3域(或CH4域，如果存在)的羧基末端并通過(guò)它與裝配域相連。優(yōu)選的多肽復(fù)合體包括天然鉸鏈域或柔軟的位于結(jié)合域和CH2域之間工程鉸鏈樣域。存在的鉸鏈區(qū)促進(jìn)所得多肽復(fù)合體中結(jié)合域和效應(yīng)子部分獨(dú)立發(fā)揮功能。
在第一條多肽重鏈中效應(yīng)子部分任選特異性不同于第二條多肽重鏈中效應(yīng)子部分的特異性。根據(jù)本發(fā)明，多肽復(fù)合體的效應(yīng)子部分可被結(jié)合域取代。優(yōu)選的結(jié)合域包含VH域(如本發(fā)明第一個(gè)方面所定義)或細(xì)胞受體結(jié)合域。所得四價(jià)二聚體結(jié)合蛋白(多肽復(fù)合體)可包含多達(dá)4個(gè)不同效應(yīng)子部分。優(yōu)選的在重鏈氨基末端的效應(yīng)子部分相同，且在羧基末端的也相同(但是識(shí)別不同抗原或表位到氨基末端)，促進(jìn)單個(gè)同二聚體的裝配。這種分子可確證捕獲病原體，通過(guò)包括適當(dāng)?shù)闹劓溣?例如IgG或IgM)提供的效應(yīng)子功能的優(yōu)勢(shì)。
根據(jù)本發(fā)明第三個(gè)方面，示例性多肽復(fù)合體有利于細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記、靶向作用或治療。例如效應(yīng)子分子包含定向于癌細(xì)胞表面標(biāo)記的抗原特異性VH結(jié)合域及包含結(jié)合域特定的前體藥物轉(zhuǎn)化酶(效應(yīng)子鏈)的效應(yīng)子部分?？乖禺愋訴H結(jié)合域結(jié)合于靶標(biāo)且使效應(yīng)子部分幾乎進(jìn)入靶標(biāo)從而在結(jié)合效應(yīng)子鏈上其在前體藥物(例如帶有CB1954的硝基還原酶)中可在靶標(biāo)上發(fā)揮生物功能。作為二聚化域的包括的免疫球蛋白重鏈效應(yīng)子功能也可利于消除靶細(xì)胞。
效應(yīng)子鏈效應(yīng)子鏈包含互補(bǔ)結(jié)合域和效應(yīng)子部分，其通過(guò)重鏈效應(yīng)子部分與重鏈連接從而形成裝配的多肽結(jié)合復(fù)合體。效應(yīng)子鏈互補(bǔ)裝配域可為效應(yīng)子部分或蛋白質(zhì)或融合或化學(xué)性連接于效應(yīng)子部分的可選擇配體的整體部分。裝配多肽結(jié)合復(fù)合體的重鏈結(jié)合于靶標(biāo)且使效應(yīng)子(輕)鏈部分幾乎進(jìn)入靶標(biāo)從而發(fā)揮靶標(biāo)的生物功能。
效應(yīng)子部分本文所用術(shù)語(yǔ)“效應(yīng)子部分”包括在細(xì)胞上介導(dǎo)所需生物效應(yīng)的任何部分。效應(yīng)子域可為細(xì)胞例如T-細(xì)胞、肽、多肽或蛋白質(zhì)或可為非肽結(jié)構(gòu)。例如效應(yīng)子域可為酶、藥物、前體藥物、毒素特別是蛋白質(zhì)毒素、螯合結(jié)構(gòu)中放射性核素或結(jié)合域。根據(jù)所需效應(yīng)，與互補(bǔ)裝配域相關(guān)效應(yīng)子部分可為細(xì)胞、蛋白質(zhì)、有機(jī)物或天然的無(wú)機(jī)物。
關(guān)于本發(fā)明所有上述方面中所用術(shù)語(yǔ)“結(jié)合域”包括任何生理性介質(zhì)中有活性的多肽域。在生理?xiàng)l件下這種結(jié)合域也必須具有結(jié)合于靶標(biāo)的活性。
這種結(jié)合域包括可介導(dǎo)結(jié)合或附著到細(xì)胞表面的域。本發(fā)明的多肽復(fù)合體中可使用的適當(dāng)?shù)挠驗(yàn)椴溉閯?dòng)物、原核細(xì)胞或病毒細(xì)胞粘附分子、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、受體拮抗劑或激動(dòng)劑、配體、細(xì)胞表面受體、調(diào)節(jié)因子、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)和肽、血清蛋白、分泌性蛋白、質(zhì)膜相關(guān)蛋白質(zhì)、病毒抗原、細(xì)菌性抗原、原生動(dòng)物抗原、寄生性抗原、脂蛋白、糖蛋白、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、凝固因子、工程單鏈Fvs等。優(yōu)選的結(jié)合域?yàn)榧棺祫?dòng)物VH域，更優(yōu)選哺乳動(dòng)物VH域例如人VH域。
結(jié)合域可包含駱駝VH(VHH)域或可包含得自非-駱駝的VH域。優(yōu)選的結(jié)合域?yàn)槿薞H域。由于為適應(yīng)體內(nèi)抗原激發(fā)經(jīng)VDJ重排和體細(xì)胞突變產(chǎn)生而具有更高親和力，與得自合成噬菌體文庫(kù)的VH結(jié)合域相比，VH結(jié)合域優(yōu)選得自轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或駱駝(如前面所述)的B-細(xì)胞來(lái)源。
如果效應(yīng)子部分包含結(jié)合域，優(yōu)選其具有與重鏈結(jié)合域不同的特異性。重排的優(yōu)點(diǎn)是多肽復(fù)合體可促進(jìn)不同靶標(biāo)交聯(lián)或結(jié)合靶細(xì)胞上的不同抗原(例如病原體)。
第一條重鏈中結(jié)合域可具有與第二條重鏈中結(jié)合域不同的特異性。以這種方式，多肽復(fù)合體至少為二價(jià)且能夠交聯(lián)不同靶標(biāo)，且效應(yīng)子域能夠在兩個(gè)靶標(biāo)均起作用。可通過(guò)結(jié)合四價(jià)重鏈和包含帶有不同特異性和功能性的效應(yīng)子域的效應(yīng)子鏈產(chǎn)生多價(jià)多肽復(fù)合體。同樣，第一條重鏈中效應(yīng)子部分可具有與第二條重鏈中效應(yīng)子部分不同的特異性，其允許捕獲超過(guò)一條具不同功能性的效應(yīng)子鏈。
結(jié)合于效應(yīng)子部分的互補(bǔ)裝配域當(dāng)重鏈與輕鏈相連時(shí)，本文所用術(shù)語(yǔ)“效應(yīng)子部分”和“互補(bǔ)裝配域”包括相互間可形成至少非共價(jià)連接的任何部分。例如效應(yīng)子部分和互補(bǔ)裝配域可為蛋白質(zhì)、肽片段或能夠形成蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的共有序列，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用例如可見(jiàn)于免疫球蛋白重鏈CH1域和免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)、亮氨酸拉鏈、VCAM和VLA-4、整聯(lián)蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、整聯(lián)蛋白和細(xì)胞表面分子例如CD54或CD102、ALCAMs和SRCR域、scFv和抗原或VH結(jié)合域和抗原之間。
重鏈重鏈的二聚化域包含免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)，此恒定區(qū)(CH外顯子)可賦予此多肽結(jié)合復(fù)合體其它生理功能。特別的是，根據(jù)抗體恒定域類(lèi)別或亞類(lèi)，免疫球蛋白重鏈恒定域除其它以外還可提供如補(bǔ)體結(jié)合作用、巨噬細(xì)胞活化和與Fc受體的結(jié)合。
如上述討論，已經(jīng)很好證明了表達(dá)的這種重鏈在體內(nèi)效應(yīng)子功能中具有重要作用。建立的細(xì)胞系可產(chǎn)生多肽復(fù)合體，具有有利的靶向和生物活性但是重鏈恒定區(qū)可為不需要的診斷性或治療性類(lèi)別，或者其可能不分泌適當(dāng)?shù)臄?shù)量。相應(yīng)的，本發(fā)明多肽復(fù)合體的重鏈恒定域可特異性改變或者局部或完全不產(chǎn)生或清除免疫球蛋白重鏈。
例如，已知M類(lèi)的Ig分子在巨噬細(xì)胞活化和補(bǔ)體途徑中起重要作用。由于幾乎進(jìn)入其結(jié)合位點(diǎn)，IgM具有高度病原體親和力，包括病毒。但是亦知IgM難以使用于快速免疫測(cè)定技術(shù)，而G類(lèi)的Ig可容易的使用于這些技術(shù)中。為這種用途，轉(zhuǎn)換重鏈類(lèi)別自μ至γ域是有利的。
重鏈Cγ基因座的單獨(dú)表達(dá)可產(chǎn)生IgG，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4同種型，部分也可活化補(bǔ)體。IgG抗體結(jié)合及活化巨噬細(xì)胞和粒性白細(xì)胞，且可穿過(guò)胎盤(pán)。
多種抗體類(lèi)別的其它應(yīng)用如前所述。
本發(fā)明多肽復(fù)合體的重鏈恒定區(qū)可為如上文定義的人、兔、大鼠或小鼠來(lái)源。優(yōu)選的其為人源。
也可單獨(dú)用本發(fā)明的多肽復(fù)合體通過(guò)使用沒(méi)有效應(yīng)子功能的二聚化域來(lái)封閉配體與受體的結(jié)合?？赏ㄟ^(guò)多特異性多肽復(fù)合體封閉多重受體(Multiple receptors)。
在本發(fā)明第四方面中，效應(yīng)子分子可包含二聚化域，從而使效應(yīng)子分子可與分離的效應(yīng)子分子結(jié)合。二聚化域可包含一種或多種CH2、CH3或CH4抗體恒定區(qū)域和/或J鏈。在本發(fā)明這種實(shí)施方案中，兩種或多種效應(yīng)子分子可結(jié)合產(chǎn)生效應(yīng)子分子二聚體或多聚體。這些效應(yīng)子分子可相同(使產(chǎn)生效應(yīng)子分子同二聚體或同多聚體)或不同(使產(chǎn)生效應(yīng)子分子異源二聚體或異源多聚體)。優(yōu)選的效應(yīng)子分子二聚體或多聚體為二價(jià)或多價(jià)。優(yōu)選的兩種或多種效應(yīng)子分子恒定區(qū)(即二聚化域)相同，因此降低產(chǎn)生不均一性的可能性。
根據(jù)本發(fā)明第四個(gè)方面，提供了包含包括第一條多肽重鏈和第二條多肽重鏈的二聚體的多肽復(fù)合體，其中每個(gè)多肽重鏈包含結(jié)合域和任選包含至少CH2、CH3和任選CH4抗體恒定域的二聚化域，和任選的效應(yīng)子部分，其中優(yōu)選在第一條多肽重鏈中結(jié)合域具有與第二條多肽重鏈中結(jié)合域相同的特異性，及這兩種多肽重鏈的恒定區(qū)(二聚化域)相同。
優(yōu)選第一條和第二條鏈具有相同的效應(yīng)子部分。
優(yōu)選的二聚化域包含至少CH2、CH3和任選的CH4抗體恒定域。
本發(fā)明的第四個(gè)方面也提供包含多個(gè)多肽重鏈二聚體和J鏈的多肽復(fù)合體，其中多個(gè)多肽重鏈二聚體通過(guò)J鏈裝配；每個(gè)多肽重鏈包含結(jié)合域和相同的μ、ε、α或γCH2、CH3和任選的CH4域；及在多肽復(fù)合體中至少有兩種具有不同特異性的結(jié)合域(參見(jiàn)圖4和5)。
如上述本發(fā)明第四方面所定義，每個(gè)重鏈恒定區(qū)優(yōu)選包含至少一個(gè)重鏈恒定區(qū)基因，其表達(dá)產(chǎn)物沒(méi)有功能性CH1域從而產(chǎn)生僅有重鏈的抗體。每個(gè)重鏈恒定區(qū)也可包含一種或多種附加的選自包括Cδ、Cγ1-4、Cμ、Cε和Cα1-2的基團(tuán)的重鏈恒定區(qū)基因，條件是附加的重鏈恒定區(qū)基因也不表達(dá)功能性CH1域。根據(jù)優(yōu)選的所需抗體種類(lèi)的類(lèi)別或混合物選擇重鏈恒定區(qū)基因。
優(yōu)選在表達(dá)的IgA和IgM中僅有兩種不同特異性的結(jié)合域。
在一個(gè)實(shí)施方案中，每個(gè)重鏈包括CH4域，恒定域?yàn)棣劣蚯叶嚯膹?fù)合體包括J鏈。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，每個(gè)重鏈包括CH4域，恒定域?yàn)棣逃蚯铱贵w包括J鏈。
多肽復(fù)合體的裝配本發(fā)明多肽復(fù)合體的調(diào)節(jié)域排列使其以很多可能變化的排列次序構(gòu)建。在多肽復(fù)合體的域結(jié)構(gòu)和氨基酸序列中的這種轉(zhuǎn)變可通過(guò)適當(dāng)突變或相應(yīng)DNA編碼序列的適當(dāng)區(qū)域的半合成和置換獲得。置換或附加域可得自相容的重組DNA序列。例如重鏈可包括天然鉸鏈或工程的柔性多肽域，其位于結(jié)合域和CH2域的氨基末端之間，也位于效應(yīng)子域和重鏈(CH3或CH4)的C-末端之間。
本發(fā)明多肽復(fù)合體中重鏈表達(dá)為融合蛋白。本發(fā)明這個(gè)方面的多肽復(fù)合體中效應(yīng)子鏈可表達(dá)為融合蛋白或可通過(guò)化學(xué)方法裝配，或者如果細(xì)胞可自血液或組織中分離則或可進(jìn)行體內(nèi)捕獲(例如白蛋白)。
在基因融合下，可使用編碼融合蛋白的氨基酸序列與編碼位于相同閱讀框內(nèi)多種域的DNA達(dá)到各種域的連接。
如果以融合蛋白部分存在，效應(yīng)子部分可位于互補(bǔ)裝配域氨基末端或羧基末端。
或者，可通過(guò)如本領(lǐng)域中已知的正常肽化學(xué)方法而不通過(guò)合成融合蛋白的方法裝配效應(yīng)子鏈中的域。
可通過(guò)肽鍵或通過(guò)化學(xué)鍵連接。例如效應(yīng)子部分可為鍵合到互補(bǔ)裝配域的肽，或者其可化學(xué)性鍵合到互補(bǔ)裝配域例如通過(guò)使用化學(xué)連接結(jié)構(gòu)例如馬來(lái)酰亞胺交聯(lián)劑。
效應(yīng)子部分可位于重鏈中任何區(qū)域。例如效應(yīng)子部分可位于重鏈C末端或在結(jié)合域與多肽復(fù)合體的CH2域或鉸鏈域之間。由于可能干擾效應(yīng)子功能和二聚化域，優(yōu)選裝配域不位于CH2和CH3之間。優(yōu)選效應(yīng)子部分經(jīng)肽的柔性接頭或鉸鏈樣區(qū)連接于重鏈的氨基末端或羧基末端從而促進(jìn)效應(yīng)子部分的獨(dú)立結(jié)合/發(fā)揮功能。
多核苷酸、載體和宿主細(xì)胞本發(fā)明也提供了編碼任何一種本發(fā)明多肽復(fù)合體的重鏈的多核苷酸序列，也提供了包含一種或多種上述多核苷酸的載體和用編碼本發(fā)明多肽復(fù)合體重鏈轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。多核苷酸優(yōu)選包括使表達(dá)的重鏈以同二聚體分泌進(jìn)入宿主細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的序列。宿主細(xì)胞可為任何來(lái)源，包括細(xì)菌和酵母細(xì)胞，但是優(yōu)選脊椎動(dòng)物宿主細(xì)胞，更優(yōu)選哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。
用編碼包含對(duì)不同靶向特異的結(jié)合域的重鏈的第二種載體轉(zhuǎn)染相同宿主細(xì)胞導(dǎo)致兩種構(gòu)建體共表達(dá)及同二聚體和異二聚體混合物的裝配。同二聚體將顯示對(duì)同族抗原的特異性且異二聚體將結(jié)合兩個(gè)抗原。
本發(fā)明也提供了用至少一條本發(fā)明多肽復(fù)合體的效應(yīng)子鏈編碼的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。這種宿主細(xì)胞可為任何來(lái)源，包括細(xì)菌和酵母細(xì)胞，但是優(yōu)選脊椎動(dòng)物宿主細(xì)胞，更優(yōu)選哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞?？蛇x擇的效應(yīng)子鏈可使用本領(lǐng)域已知方法合成。
本發(fā)明也提供用編碼至少一條本發(fā)明多肽復(fù)合體重鏈的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。這種宿主細(xì)胞可為任何來(lái)源，包括細(xì)菌和酵母細(xì)胞，但是優(yōu)選脊椎動(dòng)物宿主細(xì)胞，更優(yōu)選哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞?？蛇x擇的重鏈可使用本領(lǐng)域已知方法合成。
本發(fā)明也提供了用編碼本發(fā)明多肽復(fù)合體的至少一條重鏈和至少一條效應(yīng)子鏈的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。這種宿主細(xì)胞可為任何來(lái)源，包括細(xì)菌和酵母細(xì)胞，但是優(yōu)選脊椎動(dòng)物宿主細(xì)胞，更優(yōu)選哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞?？蛇x擇的這些鏈可使用本領(lǐng)域已知方法獨(dú)立或裝配合成。
另外本發(fā)明提供了表達(dá)本發(fā)明的至少一種重鏈同二聚體或異二聚體多肽復(fù)合體的轉(zhuǎn)基因生物體。這種轉(zhuǎn)基因生物體可為非人脊椎動(dòng)物或哺乳動(dòng)物，植物或昆蟲(chóng)。
本發(fā)明也提供了產(chǎn)生種類(lèi)特異性僅有重鏈的抗體及其VH域的方法，根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面通過(guò)用抗原免疫本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因生物體而制得。
在本發(fā)明這個(gè)方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，生物體為小鼠。
用于健康護(hù)理應(yīng)用產(chǎn)生的抗體和多肽復(fù)合體需要大規(guī)模的制造體系，上述詳細(xì)討論了其實(shí)例。這種體系包括適于大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的植物(例如玉米)、轉(zhuǎn)基因牛和綿羊、雛雞和昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)。其他產(chǎn)生體系包括病毒感染(例如昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)和細(xì)胞系中桿狀病毒)細(xì)胞培養(yǎng)和種系方法也為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
這些方法和本領(lǐng)域已知的其他適當(dāng)方法可用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽結(jié)合復(fù)合體?？墒褂眠@些方法產(chǎn)生同二聚體和/或異二聚體。
本發(fā)明的僅有重鏈的抗體和多肽復(fù)合體的用途本發(fā)明的僅有重鏈的抗體和多肽結(jié)合復(fù)合體有許多用途。
例如，本發(fā)明的僅有重鏈的抗體和多肽復(fù)合體包含雙特異性和多特異性多肽復(fù)合體。這些復(fù)合體特別有利于例如治療性用于治療和預(yù)防感染性疾病。
本發(fā)明的僅有重鏈的抗體和多肽結(jié)合復(fù)合體有利于細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記、靶向作用、治療和診斷。
在單抗體治療中，病原體逃避(pathogen escape)，例如由于突變導(dǎo)致失去單一結(jié)合位點(diǎn)將喪失抗體的治療效應(yīng)。產(chǎn)生的異二聚體多肽復(fù)合體識(shí)別相同病原體上不同抗原可克服這種問(wèn)題。在本發(fā)明多肽復(fù)合體中具有不同特異性的至少兩種結(jié)合域的用途也可用于提高細(xì)胞-細(xì)胞相互作用和細(xì)胞/病原體相互作用。
在這種實(shí)施方案中，本發(fā)明多肽復(fù)合體可用作例如在兩種細(xì)胞類(lèi)型例如病原體和巨噬細(xì)胞，或腫瘤細(xì)胞和T-細(xì)胞之間的橋接(bridge)多肽復(fù)合體?？蛇x擇的該多肽復(fù)合體可識(shí)別相同病原體上兩種或多種表位，通過(guò)由重鏈恒定區(qū)單獨(dú)提供的效應(yīng)子功能。
或者，雙特異性多肽結(jié)合復(fù)合體可使用在體內(nèi)的靶細(xì)胞和組織，接著可使用于捕獲循環(huán)的效應(yīng)子分子或顯像劑。例如雙特異性腫瘤靶向劑可使用到捕獲前途前體藥物轉(zhuǎn)化復(fù)合物(pro-drug convertingcomplexes)從而局限性轉(zhuǎn)化前體藥物為活性劑。依賴于選擇的結(jié)合域，與效應(yīng)子劑結(jié)合的雙特異性或多特異性結(jié)合復(fù)合體也可用于結(jié)合并破壞一種或多種病原體?？蛇x擇的識(shí)別相同病原體上不同抗原的兩種或多種結(jié)合域的存在提供臨床利益且降低了病原體逃避和病原體內(nèi)突變導(dǎo)致藥物過(guò)量的可能性。
本發(fā)明根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面提供了僅有重鏈的抗體或其片段，根據(jù)本發(fā)明第二個(gè)方面提供了多肽鏈和復(fù)合體，且根據(jù)本發(fā)明第三個(gè)方面提供了效應(yīng)子鏈和多肽復(fù)合體。所有均適于人的藥物用途，且如此本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的僅有重鏈的抗體、多肽鏈、效應(yīng)子鏈或多肽復(fù)合體的藥用組合物。本發(fā)明也提供了本發(fā)明的僅有重鏈的抗體、多肽鏈、效應(yīng)子鏈或多肽復(fù)合體在制備用于預(yù)防和/或治療疾病藥物中的用途。依賴于給藥方法和藥物效應(yīng)，可共同或單獨(dú)制備重鏈和效應(yīng)子鏈。
在給予患者前典型制備藥用組合物和藥物。
例如特別如果其為凍干，僅有重鏈的抗體或多肽復(fù)合體可與穩(wěn)定劑混合。加入糖(例如甘露醇、蔗糖或海藻糖)典型的賦予冷凍干燥期間穩(wěn)定性，且優(yōu)選的穩(wěn)定劑為甘露醇。人血清白蛋白(優(yōu)選重組體)也可作為穩(wěn)定劑加入。也可使用糖類(lèi)混合物例如蔗糖和甘露醇、海藻糖和甘露醇等。
可向組合物中加入緩沖液例如Tris緩沖液、組氨酸緩沖液、甘氨酸緩沖液或優(yōu)選的磷酸鹽緩沖液(例如含有磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉)。加入緩沖液使pH優(yōu)選為7.2-7.8，且特別的pH約為7.5。
為冷凍干燥后重組，可使用無(wú)菌注射用水。也可能用包含人血清白蛋白(優(yōu)選重組體)的含水組合物重建凍干塊(lyophilised cake)。
通常使用純化形式的僅有重鏈的抗體和多肽復(fù)合體連同藥理學(xué)適當(dāng)?shù)妮d體。
由此本發(fā)明提供了用于治療患者的方法，包括給予患者本發(fā)明的藥用組合物。優(yōu)選患者為人，可為兒童(例如幼兒或嬰兒)、青少年或成人但通常為成人。
本發(fā)明也提供了本發(fā)明僅有重鏈的抗體、多肽鏈、效應(yīng)子鏈或多肽復(fù)合體作為藥物的用途。
本發(fā)明也提供了本發(fā)明僅有重鏈的抗體、多肽鏈、效應(yīng)子鏈或多肽復(fù)合體在制造治療患者藥物中的用途。
這些用途、方法和藥物優(yōu)選用來(lái)治療一種下列疾病或紊亂傷口愈合，細(xì)胞增殖性疾病包括腫瘍、黑素瘤、肺、結(jié)腸直腸、骨肉瘤、直腸、卵巢肉瘤、頸部、食管、乳房、胰腺、膀胱、頭部和頸部及其他實(shí)體腫瘤，骨髓組織增殖性疾病例如非白血性白血病、非霍奇金淋巴瘤、白細(xì)胞減少、血小板減少癥、血管發(fā)生疾病、卡波西肉瘤，自身免疫性/炎性疾病包括變態(tài)反應(yīng)癥、炎性腸病、關(guān)節(jié)炎、銀屑病和呼吸道炎癥、哮喘、免疫疾病和器官移植排異反應(yīng)，心血管和脈管病包括高血壓、水腫、心絞痛、動(dòng)脈粥樣硬化、血栓形成、敗血病、休克、再灌注損害和局部缺血，神經(jīng)疾病包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、阿爾茨海默病、腦損害、肌萎縮的側(cè)生硬化癥和疼痛，發(fā)育障礙，代謝疾病包括糖尿病、骨質(zhì)疏松癥和肥胖癥，AIDS和腎臟病，感染包括病毒感染、細(xì)菌感染、真菌感染和寄生蟲(chóng)感染，與胎盤(pán)相關(guān)的病癥及其他癥并用于免疫療法。
在另外的方面，本發(fā)明提供本發(fā)明僅有重鏈的抗體或多肽結(jié)合復(fù)合體作為診斷劑、預(yù)后劑或治療性顯像劑的用途。另外本發(fā)明提供單獨(dú)或與一種或多種本發(fā)明效應(yīng)子(輕)鏈結(jié)合的本發(fā)明重鏈同二聚體或異二聚體作為治療性顯像劑、細(xì)胞化學(xué)試劑或診斷劑的用途。
本發(fā)明提供本文所述僅有重鏈的抗體或其片段作為細(xì)胞內(nèi)結(jié)合劑或抗體酶的用途。優(yōu)選的僅有重鏈的抗體片段為可溶性抗原特異性VH結(jié)合域。
本發(fā)明也提供本發(fā)明抗原特異性單鏈抗體或VH結(jié)合域作為酶抑制劑或受體阻滯劑的用途。優(yōu)選的僅有重鏈的抗體片段為可溶的抗原特異性VH結(jié)合域。
本發(fā)明也提供融合到效應(yīng)子分子的VH域作為治療性顯像劑、診斷劑、抗體酶或試劑的用途。
附圖簡(jiǎn)述圖1A和1B顯示包含結(jié)合域(VH)二聚化域(任選CH2、CH3和CH4)及效應(yīng)子部分(EM)。結(jié)合域和效應(yīng)子部分可定位在二聚化域的氨基末端或羧基末端。
標(biāo)示了柔性接頭(←)和鉸鏈(∫)區(qū)圖2A和2B顯示結(jié)合域的不同構(gòu)型及通過(guò)其他結(jié)合域置換效應(yīng)子部分。A.優(yōu)選選項(xiàng)，因?yàn)楫a(chǎn)生同二聚體。不需要分離產(chǎn)物。B.產(chǎn)生同二聚體和異二聚體的混合物。需要分離產(chǎn)物。
圖3顯示與效應(yīng)子鏈結(jié)合的重鏈多肽復(fù)合體。效應(yīng)子鏈包含互補(bǔ)結(jié)合域(CBD)和效應(yīng)子部分(EM)。CBD由重鏈的EM識(shí)別。CBD與效應(yīng)子融合或是效應(yīng)子的一部分，例如酶、毒素、螯合劑、顯影劑。效應(yīng)子鏈可獨(dú)立于重鏈合成。
圖4顯示與J鏈結(jié)合的二價(jià)分泌型IgA。
圖5顯示經(jīng)J鏈裝配的多價(jià)僅有重鏈IgM樣多肽復(fù)合體。
圖6顯示產(chǎn)生表達(dá)IgG基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠并用抗原激發(fā)后產(chǎn)生功能性僅有重鏈的抗體和VH域的策略。
圖7顯示產(chǎn)生表達(dá)IgM基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠并用抗原激發(fā)后產(chǎn)生功能性僅有重鏈的抗體和VH域的策略。
圖8顯示產(chǎn)生表達(dá)IgA基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠并用抗原激發(fā)后產(chǎn)生功能性僅有重鏈的抗體和VH域的策略。
圖9使用VHH1和VHH2引物以及人Cγ2引物對(duì)其基因座中帶有的恒定區(qū)中具駱駝剪接突變的小鼠的骨髓cDNA進(jìn)行PCR而去除CH1，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列對(duì)比。結(jié)果顯示CH1未被清除。
圖10-13VH/駱駝VH(VHH)構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)。1-n代表任何數(shù)量的VH基因，或D或J片段。人基因座的正常補(bǔ)體為51個(gè)V基因，25個(gè)功能性D片段(附加2個(gè)沒(méi)有功能的片段)及6個(gè)J片段。在Cμ(IgM)或Cε(IgE)區(qū)的情況下，沒(méi)有H區(qū)且在CH3和M1之間有另外的外顯子。VH基因突變而提供如共有域(public domain)中溶解性。
VH基因、D和J片段及C外顯子優(yōu)選人，但是可源自任何其他物種包括駱駝。后者情況下駱駝VH(VHH)由于天然可溶而不突變。
圖14用于產(chǎn)生對(duì)E.coli HSP70的僅有重鏈IgG的小鼠免疫接種方案和抗體測(cè)定。
圖15得自轉(zhuǎn)基因小鼠脾細(xì)胞流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析和免疫組化結(jié)果。
圖16DKTP免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠的ELISA分析結(jié)果和抗體文庫(kù)的序列分析結(jié)果。
圖17在免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠中體細(xì)胞突變和VDJ重排的實(shí)例。
圖18用含有A5抗體應(yīng)激質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Tet-on細(xì)胞系上免疫染色測(cè)定結(jié)果。
圖19轉(zhuǎn)基因小鼠系血清的蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果。
圖20人IgM混合通過(guò)IgM附加IgG基因座小鼠產(chǎn)生的人單鏈IgM的大小分級(jí)分離。
圖21單鏈IgM和抗人TNFα產(chǎn)生的IgG抗體的ELISA分析結(jié)果。
圖22顯示具有對(duì)HSP70和αGAG結(jié)合親和力的同二聚體質(zhì)粒的產(chǎn)生策略。
圖23CHO細(xì)胞中同二聚體多肽復(fù)合體的功能性表達(dá)。
圖24證明同二聚體多肽復(fù)合體同時(shí)功能性結(jié)合于αGAG和HSP70。圖式代表二價(jià)、雙特異性抗體。第二種可變區(qū)(直接抗gag的VHH2)克隆到含有其他特異性的僅有重鏈的抗體(直接抗HSP70的VHH1)的羧基末端。CH3和VHH2之間的鉸鏈區(qū)被聯(lián)結(jié)子置換，其中所有半胱氨酸被脯氨酸置換(箭頭)。用Gag包被ELISA板，用1％牛奶/1％BSA的PBS溶液封閉，首先用雙抗體培養(yǎng)基(1∶2稀釋)然后用BI21細(xì)胞裂解物(含有HSP70)(1∶2稀釋)孵育。Elute結(jié)合蛋白和樣品緩沖液＝2-巰基乙醇且在8％凝膠上跑電泳。用抗Gag的多克隆/單克隆抗體、雙抗體和HSP70染色。αGag兔多克隆/豬α兔-AP(藍(lán)色)。αHSP70單克隆/山羊α人IgG-HRP(棕色)。α雙抗體山羊α人IgG-HRP(棕色)。泳道1Gag/雙抗體/BI21細(xì)胞裂解物。泳道2Gag/培養(yǎng)基(為雙抗體陰性對(duì)照)/BI21。泳道3-牛奶-BSA/雙抗體/BI21。泳道4-牛奶-BSA/培養(yǎng)基/BI21。泳道5Gag/雙抗體/-牛奶-BSA。泳道6Gag/培養(yǎng)基/-牛奶-BSA。
圖25顯示產(chǎn)生同二聚體多肽復(fù)合體，任選與具有IgG效應(yīng)子功能的效應(yīng)子鏈結(jié)合的策略。
圖26顯示產(chǎn)生同二聚體多肽復(fù)合體，任選與具有IgG效應(yīng)子功能的效應(yīng)子鏈結(jié)合的策略。
通用技術(shù)除非另有定義，本文所用所有技術(shù)或科學(xué)方法具有與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的(例如在細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)、雜交技術(shù)和生物化學(xué)中)通常理解相同的意義。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用為分子、遺傳、生物化學(xué)方法(普遍參見(jiàn)Sambrook等，Molecular CloningA LaboratoryManual(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南)，第二版.(1989)Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.和Ausubel等，ShortProtocols in Molecular Biology(精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南)(1999)第四版，John Wiley & Sons，Inc.)和化學(xué)方法。另外優(yōu)選Harlow & Lane，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor，N.Y，為標(biāo)準(zhǔn)免疫技術(shù)。
在產(chǎn)生本發(fā)明二價(jià)和多價(jià)多肽復(fù)合體、單一重鏈抗體及其片段中可使用任何適當(dāng)?shù)闹亟MDNA技術(shù)。構(gòu)建包含編碼每個(gè)多肽復(fù)合體鏈或抗體鏈的DNA序列的典型表達(dá)載體例如質(zhì)粒。為免疫球蛋白酶和化學(xué)片段并分離所得片段可使用任何適當(dāng)建立的技術(shù)。
本發(fā)明也提供包括用于表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠中僅有重鏈的抗體的構(gòu)建體的載體，及本發(fā)明多肽復(fù)合體的構(gòu)建和表達(dá)的載體。
應(yīng)理解可構(gòu)建含有編碼超過(guò)多肽鏈的DNA序列的單個(gè)載體。例如編碼兩種不同重鏈的DNA序列可插入在相同質(zhì)粒上不同位置。
可選擇的編碼每個(gè)多肽鏈的DNA序列可獨(dú)自插入質(zhì)粒，從而產(chǎn)生許多構(gòu)建的質(zhì)粒，每個(gè)編碼一種特定的多肽鏈。優(yōu)選質(zhì)粒與插入的序列相容。
然后使用每個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞從而每個(gè)宿主細(xì)胞含有編碼多肽復(fù)合體中每條多肽鏈的DNA序列。
在細(xì)菌體系中可用于克隆的適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體包括質(zhì)粒例如ColE1、pcR1、pBR322、pACYC 184和RP4，噬菌體DNA或這些的任何衍生物。
在酵母體系中克隆使用的適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體包括基于2微米來(lái)源的質(zhì)粒。
含有適當(dāng)哺乳動(dòng)物基因啟動(dòng)子序列的任何質(zhì)?？墒褂迷诓溉閯?dòng)物體系克隆。昆蟲(chóng)或桿狀病毒(bacculoviral)啟動(dòng)子序列可用于昆蟲(chóng)細(xì)胞基因表達(dá)。這種載體包括得自例如pBR322、牛絨毛狀瘤病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、DNA病毒及牛痘病毒的質(zhì)粒。
為表達(dá)多肽復(fù)合體或抗體可使用適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，包括細(xì)菌、酵母和真核細(xì)胞例如昆蟲(chóng)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，轉(zhuǎn)基因植物、昆蟲(chóng)、哺乳動(dòng)物和其他無(wú)脊椎動(dòng)物或脊椎動(dòng)物表達(dá)體系。
本發(fā)明的多肽復(fù)合體和單一重鏈抗體應(yīng)理解本發(fā)明術(shù)語(yǔ)“多肽復(fù)合體”、“單一重鏈抗體”及“異源重鏈基因座”也包括得自任何來(lái)源的同源多肽和核酸序列，例如相關(guān)細(xì)胞同源物、其他物種的同源物及其變異體或衍生物。
因此本發(fā)明包括變異體、多肽復(fù)合體和本文所述抗體的同源物或衍生物。
在本發(fā)明上下文中，同源序列其中至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％相同，優(yōu)選至少98％或99％相同，包括氨基酸序列，在氨基酸水平至少30，優(yōu)選50、70、90或100個(gè)氨基酸。雖然同源性也可依據(jù)類(lèi)似性考量(即具有類(lèi)似化學(xué)性質(zhì)/功能的氨基酸殘基)，但是在本發(fā)明上下文中優(yōu)選依據(jù)序列鑒定表達(dá)同源性。
本發(fā)明也包括為產(chǎn)生本發(fā)明多肽復(fù)合體和抗體中使用而構(gòu)建的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
在相同宿主細(xì)胞中表達(dá)各個(gè)鏈后，其可恢復(fù)而提供活化形式的全部多肽復(fù)合體或僅有重鏈的抗體。
考慮在本發(fā)明優(yōu)選形式中，各個(gè)重鏈經(jīng)宿主細(xì)胞處理從而形成利于自其分泌的全部多肽復(fù)合體或抗體。優(yōu)選的效應(yīng)子鏈分別通過(guò)宿主細(xì)胞或合成方法產(chǎn)生。
用于制備重組抗體多肽復(fù)合體的技術(shù)在上述參考文獻(xiàn)中描述，且也參見(jiàn)于例如EP-A-0 623 679、EP-A-0 368 684和EP-A-0 436 597。
轉(zhuǎn)基因生物體的免疫接種在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于制備產(chǎn)生本發(fā)明抗體的方法，包括給予本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因生物體抗原。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)生的抗體和多肽復(fù)合體包括多克隆和單克隆抗體及其片段。如果需要多克隆抗體，可通過(guò)已知技術(shù)用抗原和免疫動(dòng)物血清免疫轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠、兔、山羊、馬等)，收集和處理。如果含有多克隆抗體血清含有其他抗原的抗體，可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的免疫親和色譜等技術(shù)純化感興趣的多克隆抗體。本領(lǐng)域也已知產(chǎn)生和處理多克隆抗血清的技術(shù)。
本發(fā)明多肽結(jié)合復(fù)合體和抗體的用途本發(fā)明的多肽復(fù)合體和抗體包括其片段的可應(yīng)用于體內(nèi)治療性和預(yù)防性應(yīng)用、體外和體內(nèi)診斷應(yīng)用、體外測(cè)定和試劑應(yīng)用等。
本發(fā)明多肽復(fù)合體和抗體的治療及預(yù)防用途涉及給予上述受試哺乳動(dòng)物例如人。
給予哺乳動(dòng)物的基本純化的多肽復(fù)合體和抗體包括其片段的優(yōu)選至少90％-95％的同源性，作為藥物用途特別是哺乳動(dòng)物為人時(shí)最優(yōu)選98％-99％或更高的同源性。一旦部分純化局部或所需同源性，本文所述多肽復(fù)合體和僅有重鏈的抗體可用于診斷或治療(或體外使用)或顯像或使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知方法進(jìn)行測(cè)定。
通常本發(fā)明的多肽復(fù)合體和抗體以純化形式連同藥理學(xué)上適當(dāng)載體使用。典型的，這些載體包括水溶液或醇/水溶液、乳狀液或混懸液，其可包括鹽和/或緩沖介質(zhì)。胃腸道外載體包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉和乳酸鹽林格氏液。
如果需要保持多肽復(fù)合體為混懸液，可選擇作為增稠劑的適當(dāng)生理學(xué)可接受賦形劑，例如羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、明膠和海藻酸鹽。
靜脈內(nèi)載體包括例如基于林格氏葡萄糖的液體和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑和電解質(zhì)補(bǔ)充劑。也可存在防腐劑及其他添加劑例如抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體(Mack(1982)Remington′s PharmaceuticalSciences，第16版)。
本發(fā)明的多肽復(fù)合體和抗體包括其片段的可單獨(dú)作為藥用組合物使用或與其他藥物聯(lián)用。包括各種免疫治療藥物例如環(huán)孢霉素、氨甲喋呤、阿霉素、順鉑或免疫毒素。可選擇的多肽復(fù)合體可與在效應(yīng)位點(diǎn)轉(zhuǎn)化前體藥物的酶結(jié)合使用。
藥物組合物可包括多種細(xì)胞毒素或其他藥物“雞尾酒”結(jié)合本發(fā)明選擇的抗體或甚至結(jié)合本發(fā)明選擇抗體的組合。
給予本發(fā)明藥用組合物的途徑可為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何常規(guī)途徑。為了治療包括但不局限于免疫治療，本發(fā)明的多肽復(fù)合體或抗體可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法給予任何患者。給藥可通過(guò)任何適當(dāng)模式包括胃腸外、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)皮膚、經(jīng)肺途徑給藥，也或者適當(dāng)?shù)耐ㄟ^(guò)導(dǎo)管直接輸注。給藥劑量和頻率根據(jù)患者年齡、性別和病情、聯(lián)用的其他藥物、禁忌癥及其他參數(shù)由臨床醫(yī)生考慮。
本發(fā)明多肽復(fù)合體和抗體可凍干保存且用前在適當(dāng)載體中重建?？刹捎靡阎膬龈珊椭亟夹g(shù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解冷凍干燥和重建可導(dǎo)致不同程度的功能喪失且使用水平應(yīng)由于補(bǔ)償而調(diào)整。
另外本發(fā)明多肽復(fù)合體和抗體可用作診斷目的。例如本文所述抗體可對(duì)抗抗原產(chǎn)生或增加，在疾病狀態(tài)特定表達(dá)或自疾病狀態(tài)其水平變化。
為某些目的例如診斷或追蹤目的，可加入標(biāo)記。適當(dāng)?shù)臉?biāo)記包括但不限于任何下列的放射性標(biāo)記、NMR自旋標(biāo)記及熒光標(biāo)記。標(biāo)記檢測(cè)方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
可給予含有本發(fā)明多肽復(fù)合體和抗體的組合物或其混合劑用于預(yù)防和/或治療。
含有本發(fā)明多肽復(fù)合體和抗體的組合物可用在預(yù)防和治療設(shè)備中以幫助轉(zhuǎn)化、滅活、殺滅或清除哺乳動(dòng)物中選擇的靶向細(xì)胞群。另外本文所述多肽復(fù)合體和抗體的選定組分可體外使用或體外選擇性殺滅、耗盡或其他有效清除來(lái)自細(xì)胞的異源收集物的靶向細(xì)胞群。
實(shí)施例1在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，制備轉(zhuǎn)基因小鼠以表達(dá)重鏈基因座，其中兩個(gè)馬駝(llama)VHH外顯子連接于人重鏈多變(D)和連接(J)片段，接著是Cμ、Cδ、Cγ2、Cγ3人恒定區(qū)基因和人重鏈免疫球蛋白3′LCR。人Cγ2和Cγ3基因包括G→A剪接突變(splice mutation)。存在的Frt位點(diǎn)使單拷貝轉(zhuǎn)基因小鼠通過(guò)Flp介導(dǎo)的重組由多拷貝轉(zhuǎn)基因陣列產(chǎn)生。但是具有G→A剪接突變的轉(zhuǎn)基因基因座序列顯示異常剪接但是未完全清除CH1(圖9)。
構(gòu)建體為克服這種問(wèn)題，使用標(biāo)準(zhǔn)方法篩選基因組黏粒文庫(kù)得到含有VH基因的克隆。基于其序列隨機(jī)選擇一種(或多種)不同種系VHs(在人VH’s中有5屬類(lèi))。根據(jù)IMGT編號(hào)在42、49、50和52位引入親水性氨基酸密碼子(Lefranc等，(1999))。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)程序例如使用定做的接頭或同源重組直接克隆將VH基因結(jié)合進(jìn)BAC載體中。
從人基因組Pac文庫(kù)RPCI-11(BACPAC Recource Center，美國(guó))中選擇兩種克隆含有人重鏈D和J片段、Cμ(IgM)和Cδ(IgD)的克隆1065N8及含有Cγ3(IgG3)基因的克隆1115N15。使用來(lái)自不同人基因組文庫(kù)(Incyte Genomics，CA，美國(guó))的Bac克隆11771作為Cγ2(IgG2)基因和免疫球蛋白重鏈LCR的來(lái)源(Mills等，(1997)J.Exp.Med.，15；186(6)845-58)。
使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將Cγ3和Cγ2分別亞克隆入pFastBac載體(Invitrogen)。同樣，可從這些BACs(IgA、IgE)克隆任何其它的Ig恒定區(qū)。使用每個(gè)恒定區(qū)CH1外顯子側(cè)翼序列通過(guò)同源重組取得CH1外顯子的完全缺失(Imam等，(2001))。任選可在Cμ轉(zhuǎn)換區(qū)前引入frt位點(diǎn)從而通過(guò)用標(biāo)準(zhǔn)方法例如與rosa-flp小鼠雜交在體內(nèi)用flp重組酶處理而從多拷貝基因座產(chǎn)生單拷貝基因座(圖10)。
通過(guò)常規(guī)限制消化和連接或通過(guò)同源重組(或二者混用)或其它任何克隆技術(shù)將分離的VH基因、D和J片段及C和LCR外顯子克隆進(jìn)一個(gè)BAC中。
然后可構(gòu)造進(jìn)一步的構(gòu)建體。
僅有IgM的基因座為獲得IgM構(gòu)建體(圖11)，一種或多種VHs基因(優(yōu)選工程人VH基因從而提供可溶性或駱駝VHH基因)，接著將人D和J重鏈片段及Cμ克隆進(jìn)BAC。方法學(xué)參見(jiàn)上述。這樣僅有Cμ區(qū)克隆進(jìn)終BAC。
IgM附加IgG基因座，(Cδ任選)為獲得IgM附加IgG構(gòu)建體(圖12)，一種或多種VH基因(優(yōu)選工程人VH片段從而提供可溶性或駱駝VHH基因)，接著將人D和J重鏈片段、Cμ(沒(méi)有CH1但有CH4外顯子)，(任選Cδ)及修飾的人Cγ2和Cγ3基因和3’LCR克隆進(jìn)BAC。為產(chǎn)生僅有IgG基因座，在標(biāo)準(zhǔn)克隆步驟(如上述)期間引入loxP位，且BAC在294Cre E.coli菌株中生長(zhǎng)(Buscholz等)，cre介導(dǎo)的重組生成產(chǎn)生僅有IgG的基因座的細(xì)菌。進(jìn)一步構(gòu)造細(xì)節(jié)參見(jiàn)上述。
IgM附加IgG基因座，(Cδ任選)為獲得IgM附加IgG構(gòu)建體(圖13)，一種或多種VHs基因(優(yōu)選工程人VH片段從而提供可溶性或駱駝VHH基因)，接著將人D和J重鏈片段、Cμ(帶有CH1和CH4)，(任選Cδ)及修飾的人Cγ2和Cγ3基因和3’LCR克隆進(jìn)BAC。為產(chǎn)生僅有IgG基因座，在標(biāo)準(zhǔn)克隆步驟(如上述)期間引入loxP位，且BAC在294Cre E.coli菌株中生長(zhǎng)(Buscholz等)，cre介導(dǎo)的重組生成產(chǎn)生僅有IgG的基因座的細(xì)菌。
轉(zhuǎn)基因小鼠，繁殖和基因分型通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)受精卵顯微注射或經(jīng)胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)將終BAC引入到轉(zhuǎn)基因小鼠中。
用5′和3′末端基因座探針通過(guò)尾部DNA的DNA印跡分析(Southern 1975)檢查轉(zhuǎn)基因基因座完整性和拷貝數(shù)。創(chuàng)始鼠(founder)作為在μMT-/-背景中的品系繁殖。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)PCR分析使用基因座不同區(qū)域各自的引物完成基因分型。得自轉(zhuǎn)基因小鼠的BM cDNA的RT-PCR產(chǎn)物序列分析，其中Cγ2和Cγ3的整個(gè)CH1外顯子缺失(其中一種具有(HLL品系)而另一種沒(méi)有Cμ和Cδ基因)，顯示這種轉(zhuǎn)基因座不僅能夠VDJ重組，而且IgG轉(zhuǎn)錄物類(lèi)似于在馬駝和駱駝HCAbs中所見(jiàn)。
免疫組化在OCT化合物中鑲嵌脾。在丙酮中固定冷凍的5μm冷凍切片且如前面所述單或雙標(biāo)記(Leenen等，1998)。采用單克隆抗體抗B220/RA3-6B2、抗-CD11c/N418(Steimnan等，1997)，作為雜交瘤培養(yǎng)上清液。過(guò)氧化物酶偶聯(lián)山羊抗人-IgG和抗-人IgM得自Sigma。第二步驟試劑為過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗-大鼠Ig(DAKO，Glostrup，丹麥)或抗-侖鼠Ig(Jackson lmmunoResearch Laboratories，West Grove，PA)和山羊抗-大鼠Ig堿性磷酸酶(Southern Biotechnology，Bimmngam，AL，美國(guó))。
圖15顯示在μMT-/-背景中來(lái)自μMT-/-、WT和HLL及HLL-MD轉(zhuǎn)基因小鼠中5μm冷凍脾切片的免疫組化分析。切片用B細(xì)胞的抗B220(藍(lán)色)和樹(shù)狀突細(xì)胞的抗-CD 11c/N418(棕色)染色。箭頭顯示小簇B細(xì)胞的定位。
流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析在PBS中自淋巴器官制備單細(xì)胞懸液，如前所述(Slieker等.1993)。4℃下在96孔板中約1×106個(gè)細(xì)胞與抗體在PBS/0.5％牛血清白蛋白(BSA)中孵育30分鐘。在PBS/0.5％BSA中洗滌細(xì)胞兩次。對(duì)于每個(gè)樣品，每3×104數(shù)使用FACScan分析儀評(píng)分(Becton Dickinson，Sunnyvale，加拿大)。使用CellQuest 1.0版計(jì)算機(jī)軟件分析FACS數(shù)據(jù)。在Becton Dickinson FACS Calibur上進(jìn)行四色分析。下列mAbs得自BD Pharmingen(San Diego，加拿大)FITC偶聯(lián)的抗B220-RA3-6B2、PE偶聯(lián)的的抗CD19。在圖15的底格中展示了用抗-CD 19和抗-B 220染色的脾細(xì)胞FACS掃描數(shù)據(jù)。
圖的左側(cè)為通過(guò)將HLL品系與FlpeR轉(zhuǎn)基因品系雜交的體內(nèi)FLP重組的圖像，以及提供支持的重組體脾細(xì)胞的FACS掃描數(shù)據(jù)，顯示在直接產(chǎn)生的原始HLL-MD品系中可見(jiàn)B細(xì)胞獲救。右側(cè)為與CagCre轉(zhuǎn)基因品系雜交的體內(nèi)Cre重組圖像，以及單拷貝重組體的脾細(xì)胞的FACS數(shù)據(jù)。
免疫接種和雜交瘤產(chǎn)生(圖14)制造含有包括兩個(gè)馬駝VHH域、人D和J區(qū)及IgG2和3恒定區(qū)(沒(méi)有CH1域)的僅有重鏈的抗體基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠。
8周齡小鼠用大腸桿菌熱休克蛋白70(hap 70)免疫。分別在第0、14、28、42天皮下注射及在第50天腹腔注射20μg或5μg的抗原和Specol佐劑(IDDLO，Lelystadt，NL)。在第0、14和45天取血。三次加強(qiáng)免疫后，3分之1的用Hsp70免疫的HLL-MD1小鼠中檢測(cè)到低滴度抗原特異性抗體(圖14)。
進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞株系融合從而生成在單克隆雜交瘤細(xì)胞系中產(chǎn)生的抗hsp70蛋白的單克隆抗體。這種抗-HSP 70HCAb包括馬駝VHH片段，其最接近與人IgHD3-10片段(檢索號(hào)X13972)和人IgHJ4-02片段(檢索號(hào)X86355)重組的D區(qū)(VHH 2)。與種系構(gòu)建(germ line configuration)相比雖然沒(méi)有高頻率，但是VHHs幾乎沒(méi)有引起氨基酸改變的突變，參見(jiàn)圖9A。RT-PCR分析也顯示，在雜交瘤中僅有一種產(chǎn)生性的IgH轉(zhuǎn)錄物，表明沒(méi)有其他轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生。αHSP70 IgG2抗體作為僅有重鏈二聚體分泌(變性凝膠下蛋白質(zhì)印跡(二聚體)和非變性凝膠下蛋白質(zhì)印跡(單體)環(huán)境，圖14)。使用Glonal細(xì)胞TM-HY試劑盒(StemCell Technologies，UK)根據(jù)廠家說(shuō)明書(shū)在第56天融合脾細(xì)胞與Sp2-O-Ag14骨髓瘤細(xì)胞(R.Haperen饋贈(zèng))。
用TNFα免疫含有僅有重鏈的抗體基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠，其包括兩個(gè)馬駝VHH域、人D和J區(qū)、人IgM和IgG及3恒定區(qū)(均無(wú)CH1域，圖12)，從而獲得HC-IgM抗體。在標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)定中三分之一小鼠顯示出陽(yáng)性血清。標(biāo)準(zhǔn)骨髓瘤融合產(chǎn)生陽(yáng)性IgM雜交瘤(圖16)。瓊脂糖凝膠6B凝膠過(guò)濾后在非還原條件下層析柱每級(jí)流分在還原條件下裝柱且用α人IgM-HRP檢測(cè)(圖20)。非還原條件下分級(jí)分離顯示HC-IgM作為多聚體抗體分泌且與人對(duì)照IgM(HC-IgM中減去輕鏈和CH1分子量后)大小相同。還原條件下每個(gè)柱流分的凝膠過(guò)濾顯示預(yù)期的(圖20)的單體。
血清Ig ELISA在涂鋪EDTA的試管中收集15-25周齡小鼠血液，室溫(RT)下離心15’且用PBS1∶5稀釋上清液。用5mg/ml山羊抗人IgG(YESBiotechnology)或山羊抗人IgM(Sigma)包被96孔板2小時(shí)，用PBS洗滌，室溫下用封閉溶液(1.5％BSA/1.5％奶粉/0.1％tween 20/PBS)封閉1小時(shí)且用PBS洗滌3次。裝入梯度稀釋的血清樣品和標(biāo)準(zhǔn)品(人IgG2或人IgM(Sigma，Zwijndrecht，NL))且孵育2-4小時(shí)，在加入第二種抗體(1∶2000稀釋的偶聯(lián)到HRP的山羊抗人IgG或山羊抗人(Sigma，Zwijndrecht，NL))前用PBS洗滌板6次。所有稀釋均用封閉液完成。室溫下孵育1-2小時(shí)后且用PBS洗滌，加入POD底物(Roche)。
圖16顯示了檢測(cè)自IgG2噬菌體文庫(kù)的抗原特異性可溶sdAbs的ELISA。可溶sdAbs在包被抗原的板上用作一抗，然后是小鼠α-myc抗體和HRP偶聯(lián)的山羊α-小鼠抗體。使用POD作為底物。底部圖示用限制性內(nèi)切酶Hinf I的克隆酶解圖譜，顯示編碼抗B.Pertusts的sdAb的5個(gè)不同插入片段。
抗體文庫(kù)構(gòu)建和篩選使用Ultraspec RNA分離體系(Biotecx Laboratories Inc，Houston，Texas，美國(guó))自DKTP免疫的單拷貝僅有IgG小鼠的脾(圖12，cre處理后)分離總RNA。使用寡dT制備cDNA。使用特異性引物vh1后Sfi I引物(Dekker等，2003)聯(lián)用hIgG2hingrev引物(5′-AATCTGGGCAGCGGCCGCCTCGACACAACATTTGCGCTC-3′)通過(guò)PCR擴(kuò)增編碼VHHDJ的DNA片段。這種擴(kuò)增的VHHDJs(～400bp)用Sfi I/Not I消化、凝膠純化且克隆進(jìn)Sfi I/Not I消化的噬菌粒載體pHEN-1。
轉(zhuǎn)化進(jìn)TG1電感受態(tài)細(xì)胞，產(chǎn)生人單域抗體文庫(kù)。使用吸附在塑料(用未稀釋疫苗包被的免疫試管)上的疫苗抗原淘選兩輪。進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的限制性分析和序列測(cè)定。
僅有重鏈基因座的RT-PCR然后用IgG2和IgG3特異性引物從淋巴集結(jié)得到cDNA形式的RT PCR產(chǎn)物，并通過(guò)測(cè)定產(chǎn)物序列來(lái)研究HLL-MD基因座是否作為正?；蜃诋a(chǎn)生多樣抗體庫(kù)中發(fā)揮作用。圖17顯示自非免疫小鼠(左邊部分)和免疫小鼠(右邊部分)克隆體細(xì)胞突變的部分實(shí)例。這些小鼠僅有IgG基因座，并用大腸桿菌hsp70、百日咳溶菌產(chǎn)物、破傷風(fēng)類(lèi)毒素免疫?；疑幱盀樽訣RKCCV起始的IgG2鉸鏈區(qū)。
雖然對(duì)淋巴集結(jié)的RT-PCR分析顯示使用兩個(gè)VH，所有已測(cè)序抗體都重排了VH2。通過(guò)選擇D和J片段并進(jìn)行V-D和D-J連接形成的CDR3區(qū)是抗體庫(kù)可變性的來(lái)源。人J片段的使用與人重排中所見(jiàn)的類(lèi)似，最常用的是JH4和JH6片段。
這種分析顯示所用的兩種VHs、不同人D及所有人J片段構(gòu)成了多樣性抗體庫(kù)(repertoire)。也通過(guò)將每個(gè)重排基因與其種系負(fù)體即轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體中原始VH做比較，顯示存在IgG3轉(zhuǎn)換的B細(xì)胞和發(fā)生了體細(xì)胞突變(參見(jiàn)圖17)。因此人僅有重鏈IgG抗原受體可提供B細(xì)胞成熟必需信號(hào)。
免疫染色圖18顯示另外用含有A5抗體的應(yīng)答質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞系上Tet-之一的免疫染色結(jié)果(Dekker等.2003)。上面顯示在細(xì)胞質(zhì)中多西環(huán)素誘導(dǎo)的A5抗體的產(chǎn)生(紅色)及用DAPI染色的細(xì)胞核(藍(lán)色)。下面顯示核中表達(dá)rtTA的細(xì)胞為經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生A5的細(xì)胞(上面)。用一種帶有下列顯示序列的抗rtTA的人HCAb(綠色)完成染色。使用這種FITC偶聯(lián)的山羊抗人IgG作為第二個(gè)步驟。通過(guò)Dekker等，2003先前所述檢測(cè)A5。rTTA抗體為帶有下列序列的IgG3
241AGACTCT80 R L301CCTGTGCAGCCTCTGGAAGCATCTTCAGTATCAATGCCATGGGCTGGTACCGCCAGGCTC100S C A A S G S I F S I N A M G W Y R Q A361CAGGGAAGCAGCGCGAGTTGGTCGCAGCTATTACTAGTGGTGGTAGCACAAGGTATGCAG120P G K Q R E L V A A I T S G G S T R Y A421ACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGC140D S V K G R F T I S R D N A K N T V Y L481AAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTTTGATCTCTATGGTTC160Q M N S L K P E D T A V Y Y C L I S M V541GGGGAGCCCGTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGAGCTCA180R G A R F D Y W G Q G T L V T V S S E L601AAACCCCACTT200K T P LIgG3鉸鏈起始于氨基酸198ELKTPL。比較參看圖17中IgG2鉸鏈區(qū)。
蛋白質(zhì)印跡分析圖19顯示cre處理(即IgM缺失，僅余留IgG)后含有IgM附加IgG基因座(圖10)的不同轉(zhuǎn)基因小鼠系的血清蛋白質(zhì)印跡。在還原(圖19右面)和非還原(圖19左面)條件下通過(guò)prot G和凝膠分級(jí)分離純化血清。對(duì)照為背景KO小鼠和正常人血清樣品。注意在兩種凝膠間大小差別顯示人僅有重鏈IgG為二聚體。
圖19中顯示信號(hào)用抗人IgG抗體通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)。
通過(guò)IgM附加IgG基因座小鼠產(chǎn)生人IgM的大小分級(jí)與作為對(duì)照的人血清樣品混合后，在非還原條件下通過(guò)凝膠過(guò)濾將IgM附加IgG小鼠的血清(圖13)分級(jí)分離。結(jié)果顯示于圖20。柱上復(fù)合體分子量從左至右每個(gè)泳道(代表每種流分)逐級(jí)下降。通過(guò)凝膠電泳在還原條件下分析流分(每個(gè)泳道)。
在許多由用人TNFα免疫的含有IgM附加IgG(圖13)基因座小鼠制備的雜交瘤上進(jìn)行ELISA分析。結(jié)果顯示于圖21。圖21中頂部?jī)尚杏每谷薎gG分析，接下來(lái)的兩行用抗人IgM分析。血清樣品(行)顯示小鼠產(chǎn)生IgG和IgM抗-TNFα抗體。單行顯示陽(yáng)性IgM雜交瘤。各孔用可商業(yè)購(gòu)得的人TNFα包被。所有均為標(biāo)準(zhǔn)方法。
實(shí)施例2通過(guò)將兩種僅有重鏈單特異性抗體相結(jié)合產(chǎn)生雙特異性雙價(jià)抗體。第一種抗體形成骨架而產(chǎn)生第一種特異性和效應(yīng)子功能(分別為可變區(qū)和恒定區(qū))。經(jīng)新型改造的鉸鏈結(jié)合具有第二種特異性的第二種抗體。這種鉸鏈類(lèi)似于現(xiàn)存IgG2鉸鏈序列但是用脯氨酸代替半胱氨酸從而阻止抗體二聚體中半胱氨酸交聯(lián)，且提供由脯氨酸帶來(lái)的額外柔性而預(yù)防第二種抗體受到可能抑制其功能的空間位阻。
起始的骨架抗體為抗E.coli HSP70蛋白質(zhì)而產(chǎn)生的抗體。此HSP70抗原注射進(jìn)含有(參見(jiàn)前文圖14)中所述的僅有重鏈的抗體基因座轉(zhuǎn)基因小鼠。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)雜交瘤融合技術(shù)(參見(jiàn)上文)從這些小鼠產(chǎn)生單克隆抗體。然后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)RT-PCR重組DNA方法克隆編碼αHSP-抗體的cDNA產(chǎn)生含有全長(zhǎng)cDNA的質(zhì)粒，其從5’末端至3’末端(在蛋白質(zhì)中從N末端至COOH末端)包括起始密碼子ATG、信號(hào)肽序列、可變域VHH1(參見(jiàn)Janssens等)、重組D和J區(qū)及Cγ2的恒定區(qū)(缺少CH1區(qū))，但是包括終止密碼子和polyA位點(diǎn)(圖22左邊上部)。為克隆使用正向引物和反向引物通過(guò)PCR擴(kuò)增編碼αHSP70抗體的cDNA。
正向引物為CTGGAATTC GAGCTGGGGCTGAGC，提供用于克隆目的(加下劃線的)的EcoRI位點(diǎn)，有效翻譯起始序列(粗體)和正常起始密碼子(灰色底紋)。
反向引物為GACAAGCTTTACCCGGAGACAGGGAGAGGC，提供HindIII克隆位點(diǎn)(加下劃線的)并保留了正常終止密碼子。
這種擴(kuò)增因而導(dǎo)致形成EcoRI/HindIII片段，其包括EcoRI位點(diǎn)(加下劃線的)、有效翻譯起始序列(粗體)和正常αHSP70抗體基因的起始密碼子(灰色底紋，也見(jiàn)于圖22)。
反向3’末端引物為GACAAGCTTTACCCGGAGACAGGGAGAGGC，提供Hind III克隆位點(diǎn)(加下劃線的)并清除了正常終止密碼子。如此產(chǎn)生的片段帶有EcoRI位點(diǎn)和HindIII位點(diǎn)(圖22左邊從上數(shù)第2)，其中EcoRI位點(diǎn)克隆在啟動(dòng)子序列上，HindIII位點(diǎn)用于將5’末端克隆在表達(dá)質(zhì)粒上并將3’末端克隆在新型鉸鏈序列上(參見(jiàn)下述)。最后，用EcoRI和HindIII切割該片段從而提供用于克隆的適當(dāng)?shù)膯捂溎┒恕?br> 產(chǎn)生第二種特異性的第二種克隆的抗體包含抗豬逆轉(zhuǎn)錄病毒(PERV)gag抗原的馬駝抗體VHH域(Dekker等，(2003)J.Virol.，77(22)12132-9，圖22上右)。使用下列引物經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增法擴(kuò)增αgag正向GTC GCCCAGGTCCAACTGCAGGAGTCTG和反向引物GTCGAATTCTCATTCCGAGGAGACGGTGACCTGGGTC。其提供的擴(kuò)增片段(圖22右從上數(shù)第2)帶有XhoI位點(diǎn)(灰色底紋)和EcoRI位點(diǎn)(加下劃線的)，其中XhoI位點(diǎn)克隆框架內(nèi)5’末端與新型鉸鏈(參見(jiàn)下列)，EcoRI位點(diǎn)用于將3’末端克隆進(jìn)表達(dá)質(zhì)粒(圖22，右中)。最后用EcoRI和XhoI切割該片段從而產(chǎn)生用于克隆的單鏈末端。
這兩種抗體序列經(jīng)新型鉸鏈結(jié)合成一種雙抗體序列。新型鉸鏈由兩種寡核苷酸在一起形成帶有以克隆為目的的5’和3’突出端(分別與HindIII和XhoI相容)的雙鏈寡核苷酸而產(chǎn)生相容。結(jié)構(gòu)中改造進(jìn)αHSP70序列末端和αgag序列的起始端。形成的二硫鍵(sulphidebridges)通常存在于人IgG2鉸鏈中，通過(guò)用脯氨酸(加下劃線的)代替半胱氨酸(灰色底紋)防止其形成。脯氨酸向鉸鏈中加入額外柔性從而使經(jīng)鉸鏈連接于第一種抗體COOH末端的第二種抗體域起適當(dāng)功能。
正常IgG鉸鏈序列(半胱氨酸密碼子為灰色底紋，脯氨酸密碼子為加下劃線的)。
GAGCGCAAATG CGAG CCACCG CCA及其互補(bǔ)序列被下述序列 TCTGAGCGCAAACCACCAGTCGAGCCACCACCGCCACCAC，及其互補(bǔ)序列 TGGTGGCGGTGGTGGCTCGACTGGTGGTTTGCGCTCAGA)替代。這也提供了帶有兩種單鏈末端與用于克隆目的的HindIII(粗體)和XhoI(斜體)位點(diǎn)相容的片段(白框鉸鏈，圖22，中部)。
這3種片段(αHSP70 IgG2、鉸鏈和αgag)然后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)連接進(jìn)含有小雞肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和CMV增強(qiáng)序列(圖22，表達(dá)質(zhì)粒)的bluescript(Pbluescript11 sk+)表達(dá)質(zhì)粒中。當(dāng)這種質(zhì)粒表達(dá)時(shí)(參見(jiàn)下列)則產(chǎn)生圖22底部所示的雙抗體。
通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法(superfect)培養(yǎng)雙抗體表達(dá)質(zhì)粒并將其與質(zhì)粒pGKhygro共轉(zhuǎn)染(從而使得能夠選擇轉(zhuǎn)染的細(xì)胞)進(jìn)CHO細(xì)胞(圖23)。通過(guò)使用α人IgG-HRP檢測(cè)含有由CHO細(xì)胞分泌的雙鏈抗體的生長(zhǎng)培養(yǎng)基的標(biāo)準(zhǔn)αgag ELISA法(Dekker等，J.Virol.2003)在含有均霉素的培養(yǎng)基中選擇陽(yáng)性克隆并將其鑒定為表達(dá)雙鏈抗體的陽(yáng)性克隆。α-gag活性陽(yáng)性試驗(yàn)使其最可能使某一給定的克隆表達(dá)完整雙抗體，因?yàn)間ag特異性在于雙抗體后端(COOH末端)。然后HSP70的ELISA試驗(yàn)也為陽(yáng)性。為與55KD的單體(非還原及還原條件及蛋白質(zhì)印跡，圖23右部)比較而顯示質(zhì)粒中表達(dá)的蛋白質(zhì)為110KD的二聚體(如圖23底部顯示)，進(jìn)行非還原條件和還原條件下這些ELISA選定的克隆的蛋白質(zhì)印跡。因此ELISA和蛋白質(zhì)印跡共同顯示轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞產(chǎn)生的雙抗體以二聚體表達(dá)并分泌進(jìn)入培養(yǎng)基中(以＞70ng/ml)，并且抗體可結(jié)合HSP70和gag抗原。但是其未顯示相同二聚體抗體分子可同時(shí)結(jié)合兩種抗原。
因此進(jìn)行了后續(xù)實(shí)驗(yàn)。首先將gag抗原(圖24中部第一個(gè)孔)固定到塑料孔底部。然后在應(yīng)用克隆1的CHO細(xì)胞上清液(圖24中部第2個(gè)孔)后通過(guò)第一種抗原(gag)捕獲雙抗體(圖24上部)。接著充分洗滌且然后應(yīng)用第二種抗原(HSP 70，圖24中部第3孔)，然后再充分洗滌。如果雙抗體分子可同時(shí)結(jié)合兩種抗原，其應(yīng)通過(guò)結(jié)合第一種抗原(gag)而被捕獲在孔底部并接著捕獲第二種抗原(HSP70)。當(dāng)隨后從該孔(圖24中部，右孔)洗脫整個(gè)復(fù)合體時(shí)，在蛋白質(zhì)印跡上雙抗體和抗原都可見(jiàn)到(圖24底部)。
為收集分泌的雙抗體，CHO克隆在相同標(biāo)準(zhǔn)條件和用于收集雜交瘤產(chǎn)生抗體的培養(yǎng)基(SIGMA雜交瘤培養(yǎng)基，沒(méi)有血漿)中生長(zhǎng)。
方法用純化的重組gag蛋白質(zhì)(12.5μg/ul的PBS溶液)O/N 4C包被Nunc-免疫板(Maxisorp)的孔。用1％牛奶/1％BSA的PBS溶液封閉2小時(shí)。CHO-DB克隆-1培養(yǎng)基在PBS-牛奶-BSA(或?qū)φ?中稀釋一倍，室溫(RT)下孵育3小時(shí)。細(xì)菌B121細(xì)胞裂解物(含有HSP70蛋白質(zhì))在PBS-牛奶-BSA中稀釋一倍，在室溫下孵育3小時(shí)并洗滌。用含有2-巰基乙醇的Laemmli樣品緩沖液稀釋結(jié)合蛋白。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析樣品且因此進(jìn)行10％SDS-PAGE且印跡在硝酸纖維素膜上。印跡用PBS-牛奶-BSA封閉2小時(shí)且用初級(jí)抗體孵育。產(chǎn)物使用偶聯(lián)到可目測(cè)染色的酶的二抗通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法顯影。使用的試劑為αGag兔多克隆(1∶2000)2小時(shí) 室溫α雙抗體山羊α人IgG-HRP(1∶2500)2小時(shí) 室溫αHSP70單克隆G20-380培養(yǎng)基(1∶2)2小 時(shí)室溫二抗為山羊α兔-AP(1∶2000)2小時(shí) 室溫 及山羊抗HSP70單克隆的α人IgG-HRP(1∶2500)2小時(shí) 室溫為顯影蛋白質(zhì)條帶，首先使用與堿性磷酸酶(AP)反應(yīng)的NBT/BCIP底物(紫色)，然后用與辣根過(guò)氧化物酶反應(yīng)的DAB底物(棕色)。
用PBS-0.05％Tween-20完成所有洗滌步驟。
通過(guò)去掉一種組分或添加不產(chǎn)生雙抗體(圖24)的CHO細(xì)胞的培養(yǎng)基進(jìn)行對(duì)照，即；缺乏沒(méi)有雙抗體應(yīng)用(培養(yǎng)基來(lái)自非轉(zhuǎn)染的CO細(xì)胞)因此僅有g(shù)ag(泳道2)；孔底部缺乏gag(用牛奶蛋白代替)因而沒(méi)有產(chǎn)物(泳道3)；缺乏gag和雙抗體因而沒(méi)有產(chǎn)物(泳道4)；缺乏HSP70抗原(被牛奶抗原代替)因而僅有雙抗體和gag(泳道5)；缺乏HSP70和雙抗體因而僅有g(shù)ag(泳道6)。
所有3種組分(雙抗體附加兩種抗原)僅存在于泳道1的孔，其接受所有3種組分(也見(jiàn)于圖24底部插圖的說(shuō)明)這一事實(shí)顯示單一雙抗體同時(shí)結(jié)合兩種抗原。
雙特異性IgA或多特異性IgM的產(chǎn)生雙特異性IgA的產(chǎn)生基本類(lèi)似于所述的IgG(上述)，但是除另外使用Vhsol、D和J外，還使用導(dǎo)致產(chǎn)生IgA的恒定區(qū)Cα(圖25)。
IgM的產(chǎn)生大同小異，但是因?yàn)镮gM分子可形成大的多聚體(有或沒(méi)有J鏈)而提供了其他可能性。因此除類(lèi)似于前面所述分子(圖26右底部，除去多聚化的序列后)外，也可簡(jiǎn)單通過(guò)共表達(dá)具有不同特異性的IgM’s產(chǎn)生多聚體。
實(shí)施例3如Sambrook等((1989)Molecular Cloning A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press)中所述分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建了一種編碼多肽復(fù)合體的表達(dá)載體，該復(fù)合體包含重鏈和輕鏈，其中重鏈包括結(jié)合于PSCA(前列腺干細(xì)胞抗原)的結(jié)合域、含Jun亮氨酸拉鏈基序和抗體鉸鏈的裝配域、CH2和CH3域，而輕鏈包括含F(xiàn)os亮氨酸拉鏈基序的互補(bǔ)裝配域。
然后通過(guò)常規(guī)技術(shù)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞從而產(chǎn)生最適合載體表達(dá)的轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。然后使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適當(dāng)技術(shù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞從而產(chǎn)生本發(fā)明的多肽復(fù)合體。
一旦產(chǎn)生就通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)步驟包括交叉流過(guò)濾、硫酸銨沉淀法和親和層析(例如蛋白A)純化多肽復(fù)合體。
然后使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知技術(shù)將包括3，3′-二吲哚基甲烷(DIM)的可溶效應(yīng)子域融合到互補(bǔ)裝配域。
實(shí)施例4如Sambrook等所述分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建了編碼本發(fā)明多肽復(fù)合體重鏈的表達(dá)載體，該復(fù)合體包含結(jié)合于AFP(α胎兒蛋白)的可溶性VHH結(jié)合域和包括Jun亮氨酸拉鏈基序和抗體鉸鏈的裝配域、CH2和CH3。
也構(gòu)建了編碼本發(fā)明多肽復(fù)合體輕鏈的第二種表達(dá)載體。其包含包括Fos亮氨酸拉鏈基序的互補(bǔ)裝配域。
然后通過(guò)常規(guī)技術(shù)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)移到適當(dāng)宿主細(xì)胞從而產(chǎn)生最適合載體表達(dá)的共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。然后使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適當(dāng)技術(shù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞從而產(chǎn)生本發(fā)明的多肽復(fù)合體。
一旦產(chǎn)生就通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)步驟包括交叉流過(guò)濾、硫酸銨沉淀法和親和層析(例如蛋白A)純化多肽復(fù)合體。
然后使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知技術(shù)將包括3，3′-二吲哚基甲烷(DIM)的可溶效應(yīng)子域融合到互補(bǔ)裝配域。
實(shí)施例5VCAM和VLA-4使用如Sambrook等所述分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建了編碼多肽復(fù)合體的表達(dá)載體，該復(fù)合體包含重鏈和輕鏈，其中重鏈包括結(jié)合于PSCA(前列腺干細(xì)胞抗原)的結(jié)合域、包括VCAM和抗體鉸鏈的裝配域、CH2和CH3域，而輕鏈包括含融合到蓖麻毒蛋白A毒素的VLA-4的互補(bǔ)裝配域。
然后通過(guò)常規(guī)技術(shù)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞從而產(chǎn)生最適合載體表達(dá)的轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。然后使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適當(dāng)技術(shù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞從而產(chǎn)生本發(fā)明的多肽復(fù)合體。
一旦產(chǎn)生就通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)步驟包括交叉流過(guò)濾、硫酸銨沉淀法和親和層析(例如蛋白A)純化多肽復(fù)合體。
實(shí)施例6使用如Sambrook等所述分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建了編碼多肽復(fù)合體的表達(dá)載體，該復(fù)合體包含重鏈和輕鏈，其中重鏈包括結(jié)合于PSCA(前列腺干細(xì)胞抗原)的結(jié)合域、包括Jun亮氨酸拉鏈基序和抗體鉸鏈的裝配域、CH2和CH3域，輕鏈包括含F(xiàn)os亮氨酸拉鏈基序的互補(bǔ)裝配域和編碼嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)的可溶性效應(yīng)子域。
然后通過(guò)常規(guī)技術(shù)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞從而產(chǎn)生最適合載體表達(dá)的轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。然后使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適當(dāng)技術(shù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞從而產(chǎn)生本發(fā)明的多肽復(fù)合體。
一旦產(chǎn)生就通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)步驟包括交叉流過(guò)濾、硫酸銨沉淀法和親和層析(例如蛋白A)純化多肽復(fù)合體。
PNP將氟達(dá)拉濱轉(zhuǎn)化為毒性代謝產(chǎn)物2-氟腺嘌呤，其殺滅包含PNP酶細(xì)胞并進(jìn)一步擴(kuò)散而殺滅周?chē)锤腥炯?xì)胞而形成局部旁觀者效應(yīng)。
實(shí)施例7使用如Sambrook等所述分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建了編碼本發(fā)明多肽復(fù)合體第一條重鏈的表達(dá)載體，該復(fù)合體包含結(jié)合于糖蛋白抗原gp120的V3-PND區(qū)的可溶性VHH結(jié)合域和包括Jun亮氨酸拉鏈基序和抗體鉸鏈的裝配域、CH2和CH3域。
也構(gòu)建了編碼本發(fā)明多肽復(fù)合體第二條重鏈的第二種表達(dá)載體，該復(fù)合體包含結(jié)合于GP-41的可溶性VHH結(jié)合域、包括Jun亮氨酸拉鏈基序和抗體鉸鏈的裝配域、CH2和CH3域。
還構(gòu)建了編碼本發(fā)明多肽復(fù)合體輕鏈的第三種表達(dá)載體。其包括含F(xiàn)os亮氨酸拉鏈基序的互補(bǔ)裝配域。
然后通過(guò)常規(guī)技術(shù)將這些表達(dá)載體轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞從而產(chǎn)生最適合載體表達(dá)的共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。然后使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適當(dāng)技術(shù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞從而產(chǎn)生本發(fā)明的多肽復(fù)合體。
一旦產(chǎn)生就通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)步驟包括交叉流過(guò)濾、硫酸銨沉淀法和親和層析(例如蛋白A)純化多肽復(fù)合體。
然后使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知技術(shù)將包括HIV-1MN V3(PND)肽免疫原的可溶性效應(yīng)子域融合到互補(bǔ)裝配域。
實(shí)施例8使用Sambrook等((1989)Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press)所述分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建了編碼本發(fā)明多肽復(fù)合體第一條重鏈的表達(dá)載體，該復(fù)合體包含可溶性VHH結(jié)合域，其結(jié)合于糖蛋白抗原的V3-PND區(qū)。
也構(gòu)建了編碼本發(fā)明多肽復(fù)合體第二條重鏈的第二種表達(dá)載體，包含結(jié)合于GP-41的可溶性VHH結(jié)合域。
這兩種重鏈的特征在于兩重鏈恒定區(qū)包含相同的μ、CH2、CH3和CH4域。
然后通過(guò)常規(guī)方法將這些表達(dá)載體轉(zhuǎn)移到組成型表達(dá)J鏈的宿主細(xì)胞從而產(chǎn)生最適合載體表達(dá)的共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。然后使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適當(dāng)技術(shù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞從而產(chǎn)生本發(fā)明的多肽復(fù)合體。
一旦產(chǎn)生就通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)步驟包括交叉流過(guò)濾、硫酸銨沉淀法和親和層析(例如蛋白A)純化多肽復(fù)合體。
然后使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知技術(shù)將包括HIV-1MN V3(PND)肽免疫原的可溶性效應(yīng)子域融合到互補(bǔ)裝配域。
在前面說(shuō)明書(shū)中提及的所有公開(kāi)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
未偏離本發(fā)明范圍和精神的本發(fā)明所述的方法及體系的各種修改和變化對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。雖然已結(jié)合特定實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但是應(yīng)理解本發(fā)明不應(yīng)局限于這些特定的實(shí)施方案。事實(shí)上，對(duì)于生物化學(xué)、分子生物學(xué)和生物技術(shù)或相關(guān)領(lǐng)域中技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)的實(shí)踐本發(fā)明所述方法的各種修改均在下列權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種在轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生僅有VH重鏈的抗體的方法，所述方法包括在該哺乳動(dòng)物中表達(dá)異源VH重鏈基因座的步驟，其中VH重鏈基因座包含不編碼CH1域的重鏈恒定區(qū)，且當(dāng)這種基因座表達(dá)時(shí)能形成一種或多種確定類(lèi)別的僅有重鏈的抗體。
2.一種在轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生僅有駱駝VH(VHH)重鏈的抗體的方法，所述方法包括在該哺乳動(dòng)物中表達(dá)駱駝VH(VHH)重鏈基因座的步驟，其中VHH重鏈基因座包含不編碼CH1域的重鏈恒定區(qū)，且當(dāng)這種基因座表達(dá)時(shí)能形成一種或多種確定類(lèi)別的僅有重鏈的抗體。
3.權(quán)利要求1和2的方法，其中VH重鏈基因座或駱駝VH(VHH)重鏈基因座包含一種或多種V基因片段。
4.前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，其中選擇或改造所述V基因片段或每個(gè)V基因片段以提高溶解性。
5.前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，其中所述V基因片段或每個(gè)V基因片段得自人。
6.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中重鏈恒定區(qū)包含一種或多種同種型的Cα重鏈恒定區(qū)基因。
7.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中重鏈恒定區(qū)包含一種或多種同種型的Cε重鏈恒定區(qū)基因。
8.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中重鏈恒定區(qū)包含一種或多種同種型的Cδ重鏈恒定區(qū)基因。
9.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中重鏈恒定區(qū)包含一種或多種同種型的Cγ重鏈恒定區(qū)基因。
10.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中重鏈恒定區(qū)包含一種或多種同種型的Cμ重鏈恒定區(qū)基因。
11.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的方法，其中重鏈恒定區(qū)包含一種以上的下列重鏈恒定區(qū)Cα、Cε、Cδ、Cγ、Cμ。
12.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中VH重鏈基因座包含含有至少一個(gè)駱駝或非-駱駝V基因片段、至少一個(gè)D基因片段和至少一個(gè)J基因片段的可變區(qū)，其中V基因片段、D基因片段和J基因片段能夠重組而形成VDJ編碼序列。
13.權(quán)利要求12的方法，其中重鏈基因座包含20個(gè)或更多的D基因片段。
14.權(quán)利要求12或權(quán)利要求13的方法，其中重鏈基因座包含5個(gè)或更多的J基因片段。
15.權(quán)利要求12-14中任一項(xiàng)的方法，其中至少一個(gè)D和至少一個(gè)J基因片段得自駱駝。
16.權(quán)利要求12-14中任一項(xiàng)的方法，其中至少一個(gè)D和至少一個(gè)J基因片段得自非-駱駝脊椎動(dòng)物。
17.權(quán)利要求16的方法，其中至少一個(gè)D和至少一個(gè)J基因片段得自哺乳動(dòng)物。
18.權(quán)利要求12-14中任一項(xiàng)的方法，其中D和J基因片段得自人。
19.權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的方法，其中CDR3環(huán)來(lái)源于脊椎動(dòng)物的單個(gè)物種。
20.權(quán)利要求19的方法，其中CDR3環(huán)得自駱駝或人。
21.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中VH或駱駝VH(VHH)重鏈基因座進(jìn)一步包含能夠使J基因片段直接與重鏈恒定區(qū)基因重組的重組序列(rss)。
22.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中異源重鏈基因座的重鏈恒定區(qū)基因來(lái)源于駱駝。
23.權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)的方法，其中異源重鏈基因座的重鏈恒定區(qū)基因來(lái)源于非-駱駝的脊椎動(dòng)物。
24.權(quán)利要求23的方法，其中異源重鏈基因座的重鏈恒定區(qū)基因來(lái)源于人。
25.權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)的方法，其中恒定區(qū)并非來(lái)源于重鏈。
26.前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，其中B細(xì)胞成熟基本正常。
27.一種根據(jù)權(quán)利要求1-26中任一項(xiàng)的方法得到或能夠得到的僅有重鏈的抗體或其片段或多類(lèi)僅有重鏈的抗體的混合物。
28.權(quán)利要求27的僅有重鏈的抗體，其為單克隆抗體或其片段。
29.權(quán)利要求28的片段，其為VH或駱駝VH(VHH)結(jié)合域。
30.權(quán)利要求29的VH結(jié)合域，其缺乏延伸的駱駝樣CDR3環(huán)。
31.權(quán)利要求29的VH結(jié)合域，其包含延伸的駱駝樣CDR3環(huán)。
32.一種包含如權(quán)利要求1-26中任一項(xiàng)定義的異源重鏈基因座的載體。
33.一種用權(quán)利要求32的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
34.一種表達(dá)如權(quán)利要求1-26中任一項(xiàng)定義的異源重鏈基因座的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物。
35.權(quán)利要求34的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，其表達(dá)內(nèi)源性抗體基因的能力降低。
36.權(quán)利要求27-31中任一項(xiàng)的僅有重鏈的抗體或其片段在制備免疫治療藥物中的用途。
37.權(quán)利要求27-31中任一項(xiàng)的僅有重鏈的抗體或其片段作為診斷劑、試劑、抗體酶或抑制劑的用途。
38.一種藥用組合物，包含權(quán)利要求27-31中任一項(xiàng)的僅有重鏈的抗體或其片段及藥理學(xué)上適當(dāng)?shù)妮d體。
39.一種產(chǎn)生并選擇權(quán)利要求27-31中任一項(xiàng)的僅有重鏈的抗體的方法，包括步驟(a)將抗原注射進(jìn)權(quán)利要求34或權(quán)利要求35的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物中；(b)分離表達(dá)所需抗原特異性、僅有重鏈的抗體的細(xì)胞或組織；(c)從步驟(b)的細(xì)胞或組織產(chǎn)生雜交瘤；(d)任選從所述雜交瘤克隆僅有重鏈的抗體mRNA，以便隨后在異源表達(dá)體系例如哺乳動(dòng)物、植物、昆蟲(chóng)、微生物、真菌或其它可行的體系中生產(chǎn)抗體；(e)自步驟(c)克隆VH域；(f)在細(xì)菌、酵母或其它可行的表達(dá)體系中單獨(dú)表達(dá)VH域或作為融合蛋白表達(dá)VH域。
40.一種產(chǎn)生并選擇權(quán)利要求27-31中任一項(xiàng)的VH結(jié)合域的方法，包括步驟(a)將抗原注射進(jìn)權(quán)利要求34或權(quán)利要求35的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物中；(b)分離表達(dá)所需抗原特異性、僅有重鏈的抗體的細(xì)胞或組織；(c)從來(lái)源于分離細(xì)胞或組織的mRNA克隆VH基因座；(d)使用噬菌體或類(lèi)似文庫(kù)展示編碼的蛋白質(zhì)；(e)鑒定抗原特異性VH域；且(f)在細(xì)菌、酵母或其它可行的表達(dá)體系中單獨(dú)表達(dá)VH域或作為融合蛋白表達(dá)VH域。
41.一種包含第一條重鏈和第二條重鏈的二聚體的結(jié)合多肽復(fù)合體，其中每個(gè)重鏈包含結(jié)合域、效應(yīng)子部分和二聚化域；第一條重鏈中結(jié)合域與第二條重鏈中結(jié)合域的特異性可以相同或不同；第一條重鏈中效應(yīng)子部分與第二條重鏈中效應(yīng)子部分可具有相同或不同的功能。
42.權(quán)利要求41的結(jié)合多肽復(fù)合體，其中二聚化域相同。
43.權(quán)利要求41或權(quán)利要求42的結(jié)合多肽復(fù)合體，其中所述二聚化域或每個(gè)二聚化域包含得自任何類(lèi)別的免疫球蛋白重鏈基因的至少CH2、CH3和任選的CH4抗體恒定域。
44.一種包含一對(duì)重鏈和一對(duì)效應(yīng)子(輕)鏈的多肽復(fù)合體，其中一對(duì)重鏈相互連接；一條效應(yīng)子(輕)鏈與一條重鏈相連，而另一條效應(yīng)子(輕)鏈與另一條重鏈相連；每個(gè)重鏈包含結(jié)合域、二聚化域和效應(yīng)子部分；效應(yīng)子(輕)鏈包含連接于效應(yīng)子部分的互補(bǔ)裝配域；及重鏈效應(yīng)子域與效應(yīng)子(輕)鏈的互補(bǔ)裝配域通過(guò)非共價(jià)相互作用互相連接。
45.權(quán)利要求44的結(jié)合多肽復(fù)合體，其中二聚化域包含得自任何類(lèi)別的免疫球蛋白重鏈基因的至少CH2、CH3和任選的CH4抗體恒定域。
46.權(quán)利要求41-45中任一項(xiàng)的多肽復(fù)合體，其中效應(yīng)子(輕)鏈的效應(yīng)子部分為酶、毒素、結(jié)合域、血清穩(wěn)定劑、細(xì)胞或顯像劑。
47.權(quán)利要求41-46中任一項(xiàng)的多肽復(fù)合體，其中重鏈的效應(yīng)子部分為酶、毒素、結(jié)合域、血清穩(wěn)定劑或顯像劑。
48.權(quán)利要求41-47中任一項(xiàng)的多肽復(fù)合體，其中效應(yīng)子部分以肽鍵鍵合到互補(bǔ)裝配域。
49.權(quán)利要求41-48中任一項(xiàng)的多肽復(fù)合體，其中重鏈恒定域?yàn)棣糜?、ε域、α域或μ域?br> 50.權(quán)利要求41-49中任一項(xiàng)的多肽復(fù)合體，其中重鏈各自包括CH4域，恒定域?yàn)棣劣蚯宜龆嚯膹?fù)合體包括J鏈。
51.權(quán)利要求41-49中任一項(xiàng)的多肽復(fù)合體，其中重鏈各自包括CH4域，恒定域?yàn)棣逃蚯宜龆嚯膹?fù)合體包括J鏈。
52.一種包含多個(gè)重鏈二聚體和J鏈的結(jié)合多肽復(fù)合體，其中多個(gè)重鏈二聚體通過(guò)J鏈裝配；每個(gè)重鏈包含可溶結(jié)合域和相同的μCH2、CH3和CH4域；且在所述結(jié)合多肽復(fù)合體中至少有兩個(gè)具有不同特異性的可溶結(jié)合域。
53.權(quán)利要求52的結(jié)合多肽復(fù)合體，其中僅有兩個(gè)具有不同特異性的結(jié)合域。
54.權(quán)利要求41-53中任一項(xiàng)的結(jié)合多肽復(fù)合體，其中每個(gè)重鏈進(jìn)一步包括在結(jié)合域與二聚化域之間的鉸鏈域，及在效應(yīng)子部分和二聚化域之間的鉸鏈樣域。
55.權(quán)利要求41-54中任一項(xiàng)的多肽復(fù)合體，其中所述結(jié)合域或每個(gè)結(jié)合域?yàn)閂HH域。
56.權(quán)利要求41-54中任一項(xiàng)的多肽復(fù)合體，其中結(jié)合域?yàn)槿魏紊矬w的修飾后VH域。
57.權(quán)利要求41-54中任一項(xiàng)的多肽復(fù)合體，其中結(jié)合域?yàn)椴溉閯?dòng)物細(xì)胞粘附多肽復(fù)合體、原核細(xì)胞粘附多肽復(fù)合體或病毒細(xì)胞粘附多肽復(fù)合體。
58.權(quán)利要求41-54中任一項(xiàng)的多肽復(fù)合體，其中結(jié)合域?yàn)榧?xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、受體拮抗劑或激動(dòng)劑或配體。
59.一種分離的多核苷酸，編碼權(quán)利要求41-58中任一項(xiàng)的多肽復(fù)合體中的一條鏈。
60.一種克隆或表達(dá)載體，含有權(quán)利要求59的分離多核苷酸。
61.一種克隆或表達(dá)載體，含有編碼第一條重鏈的權(quán)利要求59的分離多核苷酸及編碼第二條重鏈的權(quán)利要求59的分離多核苷酸，其中第一條重鏈中可溶結(jié)合域與第二條重鏈中可溶結(jié)合域具有不同的特異性。
62.一種克隆或表達(dá)載體，含有編碼權(quán)利要求44的多肽復(fù)合體重鏈的權(quán)利要求59的分離多核苷酸及編碼權(quán)利要求44的多肽復(fù)合體輕鏈的權(quán)利要求59的分離多核苷酸。
63.一種用權(quán)利要求60-62中任一項(xiàng)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
64.一種用于產(chǎn)生權(quán)利要求41-58中任一項(xiàng)的多肽復(fù)合體的方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求63的宿主細(xì)胞并分離此多肽復(fù)合體。
65.一種產(chǎn)生權(quán)利要求41-58中任一項(xiàng)的多肽復(fù)合體的方法，包括用編碼第一條重鏈的第一種多核苷酸和編碼第二條重鏈的第二種多核苷酸轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；在能使這兩種多核苷酸編碼序列表達(dá)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞；及自宿主細(xì)胞收獲多肽復(fù)合體。
66.權(quán)利要求64或權(quán)利要求65的方法，進(jìn)一步包括用編碼輕鏈的多核苷酸轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
67.權(quán)利要求66的方法，進(jìn)一步包括用編碼第一條輕鏈的第一種多核苷酸和編碼第二條輕鏈的第二種多核苷酸轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，其中第一條輕鏈中可溶效應(yīng)子域與第二條輕鏈中可溶效應(yīng)子域不同。
68.一種用于產(chǎn)生權(quán)利要求41-58中任一項(xiàng)的多肽復(fù)合體的方法，其中通過(guò)合成途徑例如肽化學(xué)法或偶聯(lián)法產(chǎn)生效應(yīng)子鏈。
69.一種包含權(quán)利要求41-58中任一項(xiàng)的多肽結(jié)合復(fù)合體的藥用組合物。
70.權(quán)利要求41-58中任一項(xiàng)的多肽結(jié)合復(fù)合體在制造用于疾病預(yù)防或治療的藥物中的用途。
71.權(quán)利要求41-58中任一項(xiàng)的多肽結(jié)合復(fù)合體的重鏈和效應(yīng)子鏈，供免疫治療中聯(lián)合、單獨(dú)或依次給予時(shí)使用。
72.一種治療患者的方法，包括給予需要治療的患者權(quán)利要求41-58中任一項(xiàng)的多肽結(jié)合復(fù)合體或權(quán)利要求69的藥用組合物。
73.權(quán)利要求41-58中任一項(xiàng)的多肽結(jié)合復(fù)合體作為診斷劑、試劑、抗體酶、抑制劑、細(xì)胞化學(xué)試劑或診斷劑的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及經(jīng)歷了親和力成熟的功能性僅有重鏈的抗體多樣性庫(kù)的制造及其用途。本發(fā)明也涉及類(lèi)別特異性僅有重鏈的抗體多樣性庫(kù)的制造和用途，也涉及具有抗體重鏈功能性優(yōu)選抗體重鏈結(jié)合功能性、恒定區(qū)效應(yīng)子活性及任選其他效應(yīng)子功能的多價(jià)多肽復(fù)合物的制造和用途。本發(fā)明還涉及在轉(zhuǎn)基因小鼠中響應(yīng)抗原激發(fā)產(chǎn)生全功能性僅有重鏈的抗體的方法。本發(fā)明特別涉及產(chǎn)生任何種類(lèi)的人抗原特異性、高度親和力、僅有重鏈的抗體或多種混合物的方法，以及分離及表達(dá)全功能性VH抗原結(jié)合域的方法。
文檔編號(hào)C12N5/10GK101052652SQ200580031529
公開(kāi)日2007年10月10日 申請(qǐng)日期2005年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月22日
發(fā)明者羅杰·金登·克雷格, F·G·格洛斯費(fèi)爾德, R·W·楊森斯, D·德拉貝克 申請(qǐng)人:伊拉茲馬斯大學(xué)鹿特丹醫(yī)學(xué)中心, 羅杰·金登·克雷格