專利名稱：一種快速檢測水果中桔小實蠅卵的分子診斷方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)，特別涉及一種快速檢測水果中桔小實蠅(Bactrocera dorsal is)卵的分子診斷方法。
背景技術(shù)：
桔小實蠅(Bactrocera dorsalis (Hendel))是一種直接危害果蔬生產(chǎn)并對出口貿(mào) 易形成重要影響的檢疫性害蟲，原產(chǎn)亞洲熱帶或亞熱帶地區(qū)，現(xiàn)已成為東南亞、印度次大陸 和夏威夷群島一帶的危險性果蔬害蟲，是我國植物檢疫的主要對象之一。目前桔小實蠅的 口岸檢疫鑒定工作中，主要以成蟲外部形態(tài)特征為依據(jù)，而口岸截獲的往往是幼蟲或卵，通 常做法是對其進行室內(nèi)飼養(yǎng)獲得成蟲后再進行鑒定。 隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù)、核酸序列分析技術(shù)等 分子技術(shù)在分類學(xué)、系統(tǒng)學(xué)、遺傳學(xué)、生態(tài)學(xué)等領(lǐng)域和學(xué)科得到廣泛應(yīng)用。以分子生物學(xué) 為實驗手段，研究昆蟲分類鑒定、類群遺傳結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育和分子進化為主要內(nèi)容的昆蟲 分子系統(tǒng)學(xué)是近年來新興學(xué)科之一。雖然上述技術(shù)已經(jīng)在植物檢驗檢疫病毒、真菌和線 蟲等檢疫性病害檢測中得到應(yīng)用，但用于檢疫性昆蟲的鑒定和區(qū)分則相對較少。在NCBI 上搜索發(fā)現(xiàn)，近年來美國、新西蘭、澳大利亞等相繼注冊了有關(guān)桔小實蠅的基因序列，美國 Davis等(2000)注冊了夏威夷桔小實蠅的無果基因(fruitless gene)BTB序列；新西蘭 Armstrong (1997)測定了該蟲兩個品系的ITS1部分序列、rRNA5. 8S的全序列以及ITS2部 分序列；澳大利亞昆士蘭大學(xué)Hoeben等(1997)測定了 Tabiti品系的mtDNA環(huán)區(qū)的全序列 以及核糖體基因18S的部分序列。我國運用分子生物學(xué)技術(shù)探討桔小實蠅種類鑒定、種群 分化的研究報道較少。為了快速、準確地確認疫情并保護果蔬生產(chǎn).開展對桔小實蠅的分 子鑒定研究是非常必要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種快速檢測水果中桔小實蠅卵的分子診斷 方法。可快速、準確地確認疫情并保護果蔬生產(chǎn). 本發(fā)明專利申請，使用的PCR方法用于快速鑒定果實中桔小實蠅卵。
本發(fā)明的技術(shù)方案是 —種利用嵌套式PCR擴增桔小實蠅rDNA中ITS間斷序列快速檢測水果中桔小實 蠅卵的分子診斷方法使用的PCR方法用于快速鑒定果實中桔小實蠅卵(l)PCR檢測樣品中 桔小實蠅卵 首先用通用的PCR程序去擴增三個樣品中目的片段，既PCR擴增條件為94t:預(yù)變 性2min，共運行30個循環(huán)；每一循環(huán)包括95。C變性30s， 55。C退火30s， 72。C延伸30s，最后 一次循環(huán)后72t:延伸5min ;PCR產(chǎn)物點入1%瓊脂糖凝膠，電泳檢測結(jié)果；第一輪PCR產(chǎn)物 大小為637bp，從該PCR反應(yīng)液中取出2微升稀釋100倍，再從稀釋樣品中取1微升作為下 一輪PCR的模板，第二輪PCR產(chǎn)物大小為432bp ;普通的PCR程序能夠檢測出柑橘果實中桔小實蠅的rDNA基因片段，本試驗設(shè)計的嵌套式PCR引物均正常工作；含不同數(shù)量桔小實蠅 卵的柑橘果實樣品，通過PCR擴增實蠅rDNA片段，都得到很強的目的條帶；
(2)PCR程序優(yōu)化 鑒于通用PCR程序?qū)?組果實樣品中的桔小實蠅卵都擴增出很強的條帶，我們 把PCR程序進一步優(yōu)化，以達到縮短PCR運行時間，快速鑒定目的條帶；PCR循環(huán)數(shù)設(shè)定為 5 (CI) 、 15 (C2) 、25 (C3)，對桔小實蠅卵含量最少的樣品SI進行PCR鑒定;PCR產(chǎn)物電泳結(jié) 果，循環(huán)數(shù)降低對PCR產(chǎn)物量影響很大，基于有利于鑒定，我們選取循環(huán)數(shù)15(C2)為可識別 的標準值； (3)PCR片段序列對比 從電泳后的瓊脂糖凝膠中分別回收兩輪PCR產(chǎn)物，純化后直接送樣測序；序列對 比分析發(fā)現(xiàn)，本試驗中第二輪PCR產(chǎn)物GS-F，片段大小為432bp，其全序列與第一輪PCR產(chǎn) 物GB-F，片段大小為637bp的部分序列完全相同，且被包含于其中；證明第二輪PCR產(chǎn)物是 第一輪PCR產(chǎn)物的特異擴增片段；二者DNA序列對比，可以確定，第二輪PCR產(chǎn)物GS-F是第 一輪PCR產(chǎn)物GB-F的一部分； 將PCR產(chǎn)物GB-F的DNA序列進行生物信息分析，PCR產(chǎn)物GB_F片段序列跨越桔 小實蠅rDNA間隔區(qū)ITS-1與ITS-2 ;通過將GB_F的DNA序列在NCBI上進行BLAST,所檢測 的實蠅卵與桔小實蠅親緣關(guān)系最近，序列對比二者間同源性百分之百，因此可確定本試驗 所用蟲源是桔小實蠅；生物信息分析結(jié)果進一步確證了本試驗中設(shè)計的嵌套式PCR引物能 夠精確、快速鑒定出果實樣品中的桔小實蠅卵。
本發(fā)明效果是 該方法結(jié)果可靠，可快速檢測出水果中桔小實蠅卵的存在，并經(jīng)序列分析確定樣 品的種屬進化關(guān)系。 在桔小實蠅的分子檢測方面，我們選擇應(yīng)用rDNA分子標記基因。rDNA特點是 成熟RNA的編碼區(qū)具高度保守性，間隔區(qū)序列ITS(internal transcribedspacer)區(qū)被 5. 8SrRNA分成ITS-1和ITS-2兩段，其進化速度比較快。間隔區(qū)序列由于不受選擇壓力的 影響，其變異較大，非編碼區(qū)有高度的多態(tài)性，常用來區(qū)分姐妹種、同種不同種群或同一生 物群內(nèi)部不同個體的差異。目前ITS-1和ITS-2主要被用于研究近緣種或低級分類階元的 系統(tǒng)發(fā)育，如ITS用于鑒別寡鬃實蠅近緣種。ITS是分子系統(tǒng)發(fā)育研究中應(yīng)用最多的標記基 因之一，因為ITS大小適中，全長約1.5kb，既能提供足夠的信息，又便于實驗室操作；其序 列在許多近緣種里是非保守的，有利于設(shè)計特異的引物用于序列擴增；基于rDNA的ITS也 具有一定的保守性，其全序列的分析結(jié)果可靠，基本上與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)推斷一致，目前生物各 類群在這一區(qū)域積累了龐大的基因數(shù)據(jù)庫。因此，我們通過設(shè)計嵌套式特異性引物來擴增 桔小實蠅rDNA特定的ITS基因片段，達到準確、快速鑒定果實中桔小實蠅卵，并通過序列對 比確定其與近緣種的區(qū)分。 本試驗設(shè)計的引物特點是，第一輪PCR正反向引物均設(shè)計在rDNA間隔區(qū)ITS內(nèi)， 可精確鑒定桔小實蠅近緣種，第二輪PCR對檢測結(jié)果給予了更精確、可靠的依據(jù)和保障。


圖1是桔小實蠅rDNA基因片段結(jié)構(gòu)圖
圖2是PCR檢測柑橘果實中桔小實蠅卵 圖3是不同循環(huán)數(shù)PCR檢測柑橘果實中桔小實蠅卵 圖4是PCR產(chǎn)物GS-F和GB_F序列對比
具體實施例方式
—種快速檢測水果中桔小實蠅(Bactrocera dorsalis)卵的分子診斷方法。應(yīng)用 分子生物學(xué)技術(shù)對于桔小實蠅的分子快速鑒定研究，尤其是針對果實中目測不到的桔小實 蠅卵的分子快速鑒定，其意義重大。 本試驗基于快速檢測出水果中桔小實蠅卵為目的，研究了一套嵌套式PCR擴增桔
小實蠅rDNA中ITS間斷序列，試驗結(jié)果表明，該方法結(jié)果可靠，可快速檢測出水果中桔小實
蠅卵的存在，并經(jīng)序列分析確定樣品的種屬進化關(guān)系。 —套嵌套式PCR擴增桔小實蠅rDNA中ITS間斷序列，的制作 1.試驗材料與方法 1. 1供試樣品和蟲源 將柑橘削去直徑3-4厘米，厚度2毫米的外皮，放入培養(yǎng)箱，取經(jīng)實驗室飼養(yǎng)至成 蟲的桔小實蠅雌、雄各一只放入培養(yǎng)箱中，待雌蟲產(chǎn)卵，取柑橘提取總的基因組DNA。
1 2基因組DNA提取(CTAB法) 將柑橘削去外皮部分切割出長和寬為0. 5厘米、厚0. 2厘米的方塊，用于基因 組DNA提取。DNA的提取和質(zhì)量檢測方法參照分子克隆手冊。DNA樣品放于-2(TC冰箱 保存。具體如下植物材料液氮冷凍(每個印pendorf管約0. 05g)磨棒搗碎(快速)， 然后加入500ul 2% CTAB，混勻，65t:保溫30min以上，中間注意搖動，加入氯仿異戊醇 (24 : l)500ul震蕩混勻，12000rpm，10min離心，取上清，加等體積的異丙醇，_20"放置 30min以上。再次10000rpm， 5min離心，棄上清，用70%乙醇洗一次，10000rpm， 5min離心， 棄上清，徹底晾干，加30ul TE溶解基因組DNA。1.3引物設(shè)計引物設(shè)計參照NCBI上公開的桔小實蠅rDNA基因序列，第一輪PCR引物，正向PF-1 :5，TGACCTAAGACATGCGCAGCTT 3，；反向引物PR-1 :5， GGGACTTAAGGTCTAGGTCACA :
第一輪PCR產(chǎn)物DNA序列tgacct aagacatgcg cagcttgcaa atgtttgggt^gatgtgttggaattttatttattctttcaaactcttgactttgaatcaaaaatttttactctaagcggtggatcactcggctcatgca3CgC3gC^3ctgtgcgtcatcgtgtgaactgC3gg3C3Catg^catcgacattttgaacgcatattgcggtccatgctgttatgtactttaaagtgctgcttggactacatatggttggactatggctcttattctttatattattggattgtattttccaatccataatatattcttgaatacctcatatttgaacgatcttagtatatttaaataaatacattacgtgtgacctagaccttaagtc
cc 第二輪PCR引物，正向引物PF-2 :5 ， tctaagcggtggatcact 3 ，;反向引物PR-2 : 5' tgctagactgtcctcgta 3'。引物合成由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。
第二輪PCR產(chǎn)物DNA序列 tct朋gcgg tggatcactc ggctcatgca tcgatg朋g3 3Cgcagc朋3
ctgtgcgtca tcgtgtgaac tgcaggacac atgaacatcg acattttgaa cgcatattgc
ggtccatgct gttatgtact ttaattaatt ttaaagtgct gcttggacta catatggttg
agggttgtaa gactatggct aaattagttg cttattcttt tagttaatta aaagaattta
agcatatggt atattattgg attgtatttt ccaatccata atattaatag cataaaaaga
朋tetetec3 atetettctt g朋tecctca tetttg朋cg 3朋ttttete ateaatgaga
atcttegtet tccc朋朋te朋33333朋t ttc朋tette ttt朋朋tet 3ttte朋t朋
atacattacg aggacagtct agca
1. 4PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件的優(yōu)化 PCR反應(yīng)的擴增體積為20 ii L，包含1 X PCR緩沖液，2mmol/L Mg2+， 0. 2mmol/L dNTP，正反向引物各O. 2iimol/L，lU Taq酶(Takara)，模板DNA 20 40ng。 PCR擴增通用 條件為94。C預(yù)變性2min，共運行30個循環(huán)。每一循環(huán)包括95。C變性30s，55。C退火30s， 72t:延伸30s，最后一次循環(huán)后72t:延伸5min。樣品在Biosystem Gene Amp PCR System 9700儀器上進行目的片段擴增。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂凝膠上電泳檢測擴增效果。
1.5PCR產(chǎn)物純化回收PCR產(chǎn)物用QIAquick PCR Purification試劑盒(德國，QIAGEN)純化PCR產(chǎn)物。
具體操作按產(chǎn)品指南手冊進行。
1. 6序列測定
PCR產(chǎn)物經(jīng)純化以后，送樣直接測序，測序反應(yīng)均在上海美季生物技術(shù)有限公司進
行。

1. 7DNA序列數(shù)據(jù)處理與對比
用DNAstar軟件編輯獲得的DNA測序的序列文件，在NCBI上進行BLAST,對比相近 種并進行分析。
2.結(jié)果與分析
2. 1樣品基因組DNA提取 將不同產(chǎn)卵時期的柑橘樣品切割成長和寬O. 5厘米、厚度0. 2厘米方塊，本試驗中
所用柑橘試驗材料，肉眼無法分辨出是否帶有實蠅卵，需要在體視顯微鏡下計卵數(shù)，按卵數(shù) 將樣品分成3個等級，SI : (1-10)個卵/塊，S2 : (10-100)個卵/塊，S3 : (100-500)個卵/ 塊。分別將樣品加入液氮研磨，提取基因組DNA。將待測樣品分級，目的是探測PCR技術(shù)在 鑒定含不同量桔小實蠅卵的柑橘果實的效率。供試樣品基因組DNA提取是按照傳統(tǒng)植物材 料基因組DNA提取方法進行，提取的DNA樣品OD值測定只是對柑橘果實組織基因組DNA含 量及質(zhì)量的測定，對實蠅卵基因組DNA含量及所占比例無法估計。
2. 2PCR引物設(shè)計 在NCBI上搜索到桔小實蠅的18S rRNA基因片段，登錄號為AF276516,是一個未完 全的rDNA基因的部分片段，大小為1522bp，依據(jù)該序列，設(shè)計了兩套PCR引物，第一輪PCR
6引物擴增目的片段大小為637bp，其中正向引物位于rDNA間隔區(qū)ITS-1內(nèi)，該區(qū)是一個多 變區(qū)，可用以區(qū)分形態(tài)學(xué)方法難以鑒別的近緣種的關(guān)系。反向引物位于rDNA間隔區(qū)ITS-2 內(nèi)，同樣該區(qū)也是一個變異較大的區(qū)，可用于鑒定近緣關(guān)系。第二輪PCR引物擴增目的條帶 大小為432bp，該片段被包含在第一輪PCR片段中。其正向引物位于5.8S rRNA基因內(nèi)部， 這是一個非常保守的區(qū)域，可用來鑒別不同的物種。PCR引物在rDNA中的位置見圖l所示。 第二輪PCR反向引物位于rDNA間隔區(qū)ITS-2內(nèi)。本試驗設(shè)計的引物特點是，第一輪PCR正 反向引物均設(shè)計在rDNA間隔區(qū)ITS內(nèi)，可精確鑒定桔小實蠅近緣種，第二輪PCR對檢測結(jié) 果給予了更精確、可靠的依據(jù)和保障。
參考圖1.桔小實蠅rDNA基因片段結(jié)構(gòu)圖 Figurel. The construction of rDNA of Bactrocera dorsalis(Hendel)
2. 3PCR檢測樣品中桔小實蠅卵 首先用通用的PCR程序去擴增三個樣品中目的片段，既PCR擴增條件為94t:預(yù)變 性2min，共運行30個循環(huán)。每一循環(huán)包括95。C變性30s， 55。C退火30s， 72。C延伸30s，最 后一次循環(huán)后72t:延伸5min。 PCR產(chǎn)物點入1 %瓊脂糖凝膠，電泳檢測結(jié)果見圖2。第一輪 PCR產(chǎn)物大小為637bp，從該PCR反應(yīng)液中取出2微升稀釋100倍，再從稀釋樣品中取1微 升作為下一輪PCR的模板，第二輪PCR產(chǎn)物大小為432bp。從圖2中可以看出，普通的PCR 程序能夠檢測出柑橘果實中桔小實蠅的rDNA基因片段，本試驗設(shè)計的嵌套式PCR引物均正 常工作。從圖2中可以看到，含不同桔小實蠅卵的柑橘果實樣品，通過PCR擴增實蠅rDNA 片段，都得到很強的目的條帶。 參考圖2. PCR檢測柑橘果實中桔小實蠅卵 Figure2. Identification of eggs of Bactrocera dorsalis(Hendel)withPCR
2. 4PCR程序優(yōu)化 鑒于通用PCR程序?qū)?組果實樣品中的桔小實蠅卵都擴增出很強的條帶，我們 把PCR程序進一步優(yōu)化，以達到縮短PCR運行時間，快速鑒定目的條帶。PCR循環(huán)數(shù)設(shè)定為 5(C1) 、15(C2) 、25(C3)，對桔小實蠅卵含量最少的樣品SI進行PCR鑒定。PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果 見圖3。由圖3可見，循環(huán)數(shù)降低對PCR產(chǎn)物量影響很大，基于有利于鑒定，我們選取循環(huán)數(shù) 15(C2)為可識別的標準值。參考圖3.不同循環(huán)數(shù)PCR檢測柑橘果實中桔小實蠅卵
Figure3. The amplification of ITS fragments with different PCR program
2. 5PCR片段序列對比 從電泳后的瓊脂糖凝膠中分別回收兩輪PCR產(chǎn)物，純化后直接送樣測序。序列對
比分析發(fā)現(xiàn)，本試驗中第二輪PCR產(chǎn)物GS-F，片段大小為432bp，其全序列與第一輪PCR產(chǎn)
物GB-F，片段大小為637bp的部分序列完全相同，且被包含于其中。證明第二輪PCR產(chǎn)物是
第一輪PCR產(chǎn)物的特異擴增片段。二者DNA序列對比結(jié)果見圖4，由圖中可以確定，第二輪
PCR產(chǎn)物GS-F是第一輪PCR產(chǎn)物GB-F的一部分。 參考圖4. PCR產(chǎn)物GS-F和GB_F序列對比 Figure4. The alignment of PCR products GS_F and GS_F將PCR產(chǎn)物GB-F的DNA序列進行生物信息分析，PCR產(chǎn)物GB_F片段序列跨越桔
小實蠅rDNA間隔區(qū)ITS-1與ITS_2。通過將GB_F的DNA序列在NCBI上進行BLAST,所檢
測的實蠅卵與桔小實蠅親緣關(guān)系最近，序列對比二者間同源性百分之百，因此可確定本試
7驗所用蟲源是桔小實蠅。生物信息分析結(jié)果進一步確證了本試驗中設(shè)計的嵌套式PCR引物
能夠精確、快速鑒定出果實樣品中的桔小實蠅卵。
結(jié)論 桔小實蠅Bactrocera dorsalis (Hendel)是危害熱帶、亞熱帶水果的重要檢疫性 害蟲之一。實蠅種類鑒定主要以成蟲形態(tài)特征為鑒定依據(jù)，形態(tài)學(xué)鑒定方法雖然簡單、直 觀，但要求鑒定者具有豐富的經(jīng)驗。在口岸檢疫過程中，通常截獲害蟲幼蟲或卵而非成蟲， 常規(guī)方法是將幼蟲或卵培養(yǎng)到成蟲再進行鑒定，整個檢疫鑒定過程有時長達數(shù)周。目前，利 用分子生物學(xué)技術(shù)對昆蟲的近緣種進行分類鑒定的方法已越來越廣泛地被采用。相對于形 態(tài)鑒定方法而言，其最大的優(yōu)勢就是不受昆蟲蟲態(tài)的制約，甚至不完整的蟲體也能進行鑒 定。 由于生物基因組數(shù)量相當龐大，無法進行全面的序列分析，需要針對基因組中個 別特征基因片段進行重點研究。因此選擇合適的分子標記片段是分子檢測方法建立的關(guān)鍵 所在。分子檢測選擇的標記基因種類很多，目前線粒體DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)、核 糖體DNA(Ribosomal DNA，rDNA)、衛(wèi)星DNA(Satel. lites Df)、微衛(wèi)星DNA(MicrosateUites DNA)和核蛋白編碼基因(Nuclear proteincoding genes)等特征基因作為分子標記被廣泛 應(yīng)用于昆蟲的分類鑒定和系統(tǒng)發(fā)育研究中，其中rDNA和mtDNA中多個標記基因在昆蟲的分 子系統(tǒng)研究中應(yīng)用最廣[9—15]。 rDNA是核基因組中的序列，同時具有多變區(qū)及保守區(qū)，能夠反 映早期及近期進化關(guān)系，利用其保守區(qū)研究高級分類階元關(guān)系。mtDNA屬于細胞器基因組， 缺乏細胞核基因組中的保護機制，因而變異較為明顯，能夠反映較短時間內(nèi)的進化事件，被 廣泛應(yīng)用于物種及種下關(guān)系的鑒別。 在桔小實蠅的分子檢測方面，我們選擇應(yīng)用rDNA分子標記基因。rDNA特點是 成熟RNA的編碼區(qū)具高度保守性，間隔區(qū)序列ITS(internal transcribedspacer)區(qū)被 5. 8SrRNA分成ITS-1和ITS-2兩段，其進化速度比較快。間隔區(qū)序列由于不受選擇壓力的 影響，其變異較大，非編碼區(qū)有高度的多態(tài)性，常用來區(qū)分姐妹種、同種不同種群或同一生 物群內(nèi)部不同個體的差異。目前ITS-1和ITS-2主要被用于研究近緣種或低級分類階元的 系統(tǒng)發(fā)育，如ITS用于鑒別寡鬃實蠅近緣種。ITS是分子系統(tǒng)發(fā)育研究中應(yīng)用最多的標記基 因之一，因為ITS大小適中，全長約1.5kb，既能提供足夠的信息，又便于實驗室操作；其序 列在許多近緣種里是非保守的，有利于設(shè)計特異的引物用于序列擴增；基于rDNA的ITS也 具有一定的保守性，其全序列的分析結(jié)果可靠，基本上與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)推斷一致，目前生物各 類群在這一區(qū)域積累了龐大的基因數(shù)據(jù)庫。因此，我們通過設(shè)計嵌套式特異性引物來擴增 桔小實蠅rDNA特定的ITS片段，達到準確、快速鑒定果實中桔小實蠅卵，并通過序列對比確 定其與近緣種的區(qū)分。
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〈120〉Title :—種快速檢測水果中桔小實蠅卵的分子診斷方法 〈130〉A(chǔ)ppFileReference :XQ12026978311 〈140〉CurrentAppNumber :200910228973X 〈141〉CurrentFilingDate :2009-12-07 Sequence
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Feature
Sequence :5 :
〈221〉FeatureKey :PF_2
〈222〉LocationFrom :1
〈222〉LocationTo :18
Other Information :第二輪PCR正向引物
CDSJoin :No
Sequence
〈213〉0rganismName人工序歹廿 〈400〉PreSequenceString :
tgctagactg tcctcgta 18 〈212〉Type :DNA〈211〉Length :18 SequenceName :6 SequenceDescription : Feature
Sequence :6 :
〈221〉FeatureKey :PR_2
〈222〉LocationFrom :1
〈222〉LocationTo :18
Other Information :第二輪PCR反向引物
CDSJoin :No
Sequence
〈213〉0rganismName :枯小實蟲竜(Bactrocero dorsalis (Hendel)) 〈400〉PreSequenceString :
tgaccteagacatgcgcagcttgcaaatgtttgggtttaa60
tgtgttgg^ttttattttattattattattctttcaata120
tcttgacttttttttactct■gcggtgga180
tcactcggctcatgcatcgatg^g^cgcgcgtcatcgt240
acatcgacattttgaacgcatattgcggtccatgctgttatgtactttaa300
agtgctgctttggttg鄉(xiāng)gttgtaagact360
tagttgcttattcttttagttatggtatattattggattg420
tattttccaatccataatatattcttgaat■
acctcatatttagtattccc 540
attecgaggacagtctagca600
tcatattgtgacctagaccttaagtccc638
〈212>Type :DNA 〈211〉Length :638 SequenceName :7 SequenceDescription : Feature
Sequence :7 :
〈221〉FeatureKey :第一輪PCR產(chǎn)物網(wǎng)上對比序列 〈222>LocationFrom :1 〈222〉LocationTo :638
Other Information :該序列來自網(wǎng)上公開序列，為設(shè)計PCR引物做參照
CDS Jo in :No
DatebaseSequence :7 :
〈308〉DBAccessionN咖ber :AF276516 〈309〉DBEntryDate :2001-07-02 〈313>From :1 〈313>To :638 Sequence
〈213>OrganismName :桔小實鵬(Bactrocero dorsalis (Hendel)) 〈400>PreSequenceString :
tctaagcggtggatcactcggctcatgcatcgatg^g^CgC3gC肌3Ctgtgcgtcat60
cgtgtgaactgC3gg3C3C3tg^catcgacattttgaacgcatattgcggtccatgctg120
ttatgtacttte^gtgctgcttggactacgggttgt卿180
actatggctaaattagttgcttattcttttgcatetggte240
tattattggattgtattttctattaatagc300
tatattcttgaatacctcattcttagtatt360
tacattacga420
ggacagtctegca433
〈212>Type :DNA 〈211〉Length :433 SequenceName :8 SequenceDescription : Feature
Sequence :8 :
〈221〉FeatureKey :第二輪PCR產(chǎn)物網(wǎng)上對比序列 〈222>LocationFrom :1 〈222〉LocationTo :433
Other Information :該序列來自網(wǎng)上公開序列，為設(shè)計PCR引物做參照
CDS Jo in :No
Datebase
Sequence :8 :
〈308〉DBAccessionN咖ber :AF276516 〈309〉DBEntryDate :2001-07-02 〈313>From :1 〈313>To :43權(quán)利要求
一種快速檢測水果中桔小實蠅卵的分子診斷方法使用的PCR方法用于快速鑒定果實中桔小實蠅卵，即利用嵌套式PCR擴增桔小實蠅rDNA中ITS間斷序列進行快速鑒定果實中桔小實蠅卵(1)PCR檢測樣品中桔小實蠅卵首先用通用的PCR程序去擴增三個樣品中目的片段，既PCR擴增條件為94℃預(yù)變性2min，共運行30個循環(huán)；每一循環(huán)包括95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，最后一次循環(huán)后72℃延伸5min；PCR產(chǎn)物點入1％瓊脂糖凝膠，電泳檢測結(jié)果；第一輪PCR產(chǎn)物大小為637bp，從該PCR反應(yīng)液中取出2微升稀釋100倍，再從稀釋樣品中取1微升作為下一輪PCR的模板，第二輪PCR產(chǎn)物大小為432bp；普通的PCR程序能夠檢測出柑橘果實中桔小實蠅的rDNA基因片段，本試驗設(shè)計的嵌套式PCR引物均正常工作；含不同數(shù)量桔小實蠅卵的柑橘果實樣品，通過PCR擴增實蠅rDNA片段，都得到很強的目的條帶；(2)PCR程序優(yōu)化鑒于通用PCR程序?qū)?組果實樣品中的桔小實蠅卵都擴增出很強的條帶，我們把PCR程序進一步優(yōu)化，以達到縮短PCR運行時間，快速鑒定目的條帶；PCR循環(huán)數(shù)設(shè)定為5(C1)、15(C2)、25(C3)，對桔小實蠅卵含量最少的樣品S1進行PCR鑒定；PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果，循環(huán)數(shù)降低對PCR產(chǎn)物量影響很大，基于有利于鑒定，我們選取循環(huán)數(shù)15(C2)為可識別的標準值；(3)PCR片段序列對比從電泳后的瓊脂糖凝膠中分別回收兩輪PCR產(chǎn)物，純化后直接送樣測序；序列對比分析發(fā)現(xiàn)，本試驗中第二輪PCR產(chǎn)物GS-F，片段大小為432bp，其全序列與第一輪PCR產(chǎn)物GB-F，片段大小為637bp的部分序列完全相同，且被包含于其中；證明第二輪PCR產(chǎn)物是第一輪PCR產(chǎn)物的特異擴增片段；二者DNA序列對比，可以確定，第二輪PCR產(chǎn)物GS-F是第一輪PCR產(chǎn)物GB-F的一部分；將PCR產(chǎn)物GB-F的DNA序列進行生物信息分析，PCR產(chǎn)物GB-F片段序列跨越桔小實蠅rDNA間隔區(qū)ITS-1與ITS-2；通過將GB-F的DNA序列在NCBI上進行BLAST，所檢測的實蠅卵與桔小實蠅親緣關(guān)系最近，序列對比二者間同源性百分之百，因此可確定本試驗所用蟲源是桔小實蠅；生物信息分析結(jié)果進一步確證了本試驗中設(shè)計的嵌套式PCR引物能夠精確、快速鑒定出果實樣品中的桔小實蠅卵。
全文摘要
一種快速檢測水果中桔小實蠅卵的分子診斷方法采用嵌套式PCR擴增桔小實蠅rDNA中ITS間斷序列通過設(shè)計嵌套式特異性引物來擴增桔小實蠅rDNA特定的ITS片段，達到準確、快速鑒定果實中桔小實蠅卵，并通過序列對比確定其與近緣種的區(qū)分。該方法結(jié)果可靠，可快速檢測出水果中桔小實蠅卵的存在，并經(jīng)序列分析確定樣品的種屬進化關(guān)系。
文檔編號C12Q1/68GK101792796SQ20091022897
公開日2010年8月4日 申請日期2009年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月4日
發(fā)明者葉軍, 孔秋蓮, 岳玲, 戚文元, 陳志軍 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院