專(zhuān)利名稱(chēng)：精細(xì)化學(xué)品的發(fā)酵產(chǎn)生的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過(guò)研磨、液化和糖化淀粉原料發(fā)酵產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品，以及產(chǎn)生的糖溶液作為發(fā)酵培養(yǎng)基的用途。
背景技術(shù)：
已公知通過(guò)微生物產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品(如氨基酸、維生素和類(lèi)胡蘿卜素)的發(fā)酵方法。根據(jù)多種方法的條件使用不同的碳原料。它們包括從甜菜和甘蔗糖蜜產(chǎn)生的純蔗糖到眾所周知的優(yōu)質(zhì)糖蜜(轉(zhuǎn)化的甘蔗糖蜜)到來(lái)自淀粉水解產(chǎn)物的葡萄糖。另外，乙酸和乙醇作為可用于以工業(yè)規(guī)模生物技術(shù)產(chǎn)生L-賴(lài)氨酸的共底物被提及(Pfefferle等，BiotechnologicalManufacture of Lysine，Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology，卷79(2003)，59-112)。
根據(jù)上述碳原料建立了多種以糖為基礎(chǔ)發(fā)酵產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品的方法和工藝。以L-賴(lài)氨酸為例，例如Pfefferle等(上文)描述了關(guān)于菌株發(fā)展、方法發(fā)展和工業(yè)生產(chǎn)的方法。
微生物介導(dǎo)發(fā)酵產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品的一個(gè)重要碳原料為淀粉。在發(fā)酵中用作碳原料之前，應(yīng)在之前的反應(yīng)步驟中首先將淀粉液化并糖化。為此，通常從天然淀粉原料例如馬鈴薯、木薯、谷物(如小麥、玉米、大麥、黑麥、小黑麥或稻)中獲得預(yù)純化形式的淀粉，隨后酶促液化并糖化，然后用于實(shí)際發(fā)酵以產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品。
除這類(lèi)預(yù)純化的淀粉原料外，還描述了未預(yù)處理的淀粉原料制備用于發(fā)酵產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品的碳原料的用途。通常先通過(guò)研磨粉碎淀粉原料。然后液化并糖化粉末。由于該粉末除淀粉外還包含一些負(fù)面影響發(fā)酵的非淀粉成分，在發(fā)酵前通常去除這些成分?？稍谘心ズ?WO02/277252；JP2001-072701；JP56-169594；CN1218111)，液化后(WO02/277252；CN1173541)或糖化后(CN1266102；Beukema等Production offermentation syrups by enzymatic hydrolysis of potatoes；potatosaccharification to give culture medium(Conference Abstract)，Symp.Biotechnol.Res.Neth.(1983)，6；NL8302229)直接去除。然而，所有的變化形式均涉及在發(fā)酵中使用基本純凈的淀粉水解產(chǎn)物。
更新的技術(shù)特別涉及改進(jìn)的方法，所述方法旨在可能在發(fā)酵前純化例如液化的和糖化的淀粉溶液(JP57159500)和從可更新資源中純化發(fā)酵培養(yǎng)基(EP1205557)。
相反的，已知在發(fā)酵產(chǎn)生生物酒精中大規(guī)模使用未處理的淀粉原料。大規(guī)模工業(yè)中確立了本文中淀粉原料的所謂的“干磨法”、液化和糖化。適當(dāng)?shù)姆椒枋隹梢?jiàn)于例如《The Alcohol Textbook-A reference for thebeverage，fuel and industrial alcohol industries》，Jaques等編，NottinghamUniv.Press 1995，ISBN 1-8977676-735和McAloon等，《Determining thecost of producing ethanol from corn starch and lignocellulosic feedstocks》，NREL/TP-580-28893，National Renewable Energy Laboratory，2000年10月。
干磨法的第一步將完整的谷粒，優(yōu)選玉米、小麥、大麥、小米和黑麥細(xì)磨。與所謂的濕磨法相反，不添加額外的液體。將材料研磨成細(xì)小成分的目的是使顆粒中存在的淀粉在隨后的液化和糖化中能夠受到水和酶的作用。
由于在發(fā)酵生產(chǎn)生物乙醇時(shí)有價(jià)值的產(chǎn)物通過(guò)蒸餾獲得，使用干磨法得到的未預(yù)純化形式的淀粉原料并不造成特殊的問(wèn)題。然而，使用干磨法產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品時(shí)，通過(guò)糖溶液引入發(fā)酵的固體流是有問(wèn)題的，因?yàn)樗坏蓪?duì)發(fā)酵起到負(fù)面作用，還顯著地使后續(xù)步驟更加困難。
因此，在許多發(fā)酵中，為所使用的微生物供應(yīng)的氧氣是一個(gè)限制因素，特別是當(dāng)微生物有大量氧氣需求時(shí)。通常不清楚高固體濃度對(duì)氧氣從氣相到液相的轉(zhuǎn)移和氧氣轉(zhuǎn)移速率的影響。另一方面，已知隨提高的固體濃度而提高的粘度引起氧氣轉(zhuǎn)移率降低。另外，如果與固體一起向發(fā)酵培養(yǎng)基中引入表面活性物質(zhì)，它們影響氣泡凝結(jié)的傾向。從而產(chǎn)生的氣泡大小對(duì)氧氣轉(zhuǎn)移具有顯著的影響(Mersmann，A。等Selection and Design ofAerobic Bioreactors，Chem.Eng.Technol.13(1990)，357-370)。
作為引入固體的結(jié)果，使用的培養(yǎng)基可在制備含淀粉懸液時(shí)達(dá)到臨界粘度值，因?yàn)槔绾幸灾亓坑?jì)磨碎玉米多于30％的水懸液不能夠再被均勻混和(《Industrial Enzymology》第二版，T.Godfrey，S.West，1996)。這限制了傳統(tǒng)方法中的葡萄糖濃度。結(jié)果，出于經(jīng)濟(jì)原因，使用更低濃度的溶液是不利的，因?yàn)檫@引起發(fā)酵液的不成比例的稀釋。這使得目的產(chǎn)物可達(dá)到的終濃度降低(引起分離時(shí)的額外成本)和時(shí)空產(chǎn)量降低(當(dāng)產(chǎn)生等量產(chǎn)物時(shí)引起更高的體積需要，即更高的投資成本)。
檢查時(shí)，提高的固體濃度可引起使用具體方法的具體困難。因此，例如通過(guò)離子交換層析純化發(fā)酵液時(shí)，需要考慮使用的層析柱往往會(huì)堵塞(即封閉)。
由于這些困難，干磨法的現(xiàn)有技術(shù)變化形式不適合產(chǎn)生用于發(fā)酵產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品的淀粉原料，并因此不具有特別的經(jīng)濟(jì)重要性。迄今為止，將干磨法概念和原則上與該方法相關(guān)的優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用于工業(yè)規(guī)模產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品的努力只被描述為使用木著作為淀粉原料。
因此，在JP2001/275693描述的發(fā)酵產(chǎn)生氨基酸的方法(其中使用在干燥條件下被研碎的剝皮的木薯塊莖作為淀粉原料)中，必須進(jìn)行將研磨料(millbase)顆粒大小調(diào)節(jié)為≤150μm的步驟。在為此進(jìn)行的過(guò)濾步驟中，按重量計(jì)大于10％的使用的研磨料(包括非淀粉成分)被去除，然后液化/糖化并隨后發(fā)酵獲得的淀粉。此外，該方法免除了在旨在用作飼料添加劑的發(fā)酵產(chǎn)物(例如賴(lài)氨酸)中去除非淀粉成分()的問(wèn)題，從而非淀粉木薯成分可留在有價(jià)值的產(chǎn)物中。
JP2001/309751描述了產(chǎn)生含有氨基酸飼料添加劑的類(lèi)似方法。類(lèi)似的，不需要純化或去除固體。
然而，在干磨法中與其他淀粉原料相比木薯應(yīng)該相對(duì)的沒(méi)有問(wèn)題。干木薯根中淀粉按重量計(jì)通常達(dá)到至少80％(Menezes等，F(xiàn)ungal cellulosesas an aid for the saccharification of Cassava，Biotechnology andBioengineering，第20卷(4)，1978，John Wiley and Sons，Inc.，表1，558頁(yè))，而谷物中的淀粉含量(干物質(zhì))相對(duì)更低，按重量計(jì)通常低于70％，例如在玉米中為約68％和小麥中約65％(Jaques等，The Alcohol Textbook，ibid.)。因此，使用干磨木薯與使用另一干磨的淀粉原料相比，液化和糖化后獲得的葡萄糖溶液含有更少的成分，特別是更少的固體。
提高的污染物量增加反應(yīng)混合物的粘度。然而木薯淀粉應(yīng)相對(duì)容易操作。雖然在吸漲溫度時(shí)它與玉米淀粉相比具有更高的粘度，相反的，在提高溫度時(shí)與玉米淀粉相比粘度降低得更快(Menezes，T.J.B.de，Saccharification of Cassava for ethyl alcohol production，ProcessBiochemistry，1978，24頁(yè)，right column)。此外，木薯淀粉的吸漲和膠凝溫度比來(lái)自谷物(如玉米)的淀粉低，這是其更容易被細(xì)菌α-淀粉酶作用的原因(Menezes，T.J.B.de，上述引文)。
木薯淀粉與其他淀粉原料相比的其他優(yōu)點(diǎn)為它的低纖維素含量和它的低肌醇六磷酸含量。纖維素和半纖維素可轉(zhuǎn)化為糖醛，特別是在酸性糖化條件下(Jaques等，The Alcohol Textbook，ibid.；Menezes，T.J.B.de，ibid.)，其反過(guò)來(lái)可對(duì)發(fā)酵中使用的微生物具有抑制作用。肌醇六磷酸同樣抑制發(fā)酵中使用的微生物。
因此雖然從技術(shù)方面可能在對(duì)應(yīng)干磨法的方法中使用木薯作為淀粉原料，這類(lèi)基于木薯的方法仍然是復(fù)雜的、未優(yōu)化的并從而未被廣泛使用。

發(fā)明內(nèi)容
因此本發(fā)明的目的為提供發(fā)酵產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品的有效方法，所述方法允許使用多種含有淀粉的、全世界地域可獲得的植物(如谷物或馬鈴薯)作為淀粉原料。該方法的特征在于使用的培養(yǎng)基的簡(jiǎn)單加工并特別避免發(fā)酵前復(fù)雜的預(yù)純化或主純化步驟，例如去除非淀粉固體成分。此外，其允許容易地加工發(fā)酵混合物。根據(jù)申請(qǐng)公司進(jìn)行的工作，驚奇地發(fā)現(xiàn)盡管其本身提高了固體的引入，這類(lèi)方法可以以有效的方式完成。
因此本發(fā)明涉及通過(guò)基于糖的微生物發(fā)酵方法產(chǎn)生至少一種微生物代謝物的方法，所述代謝物具有至少3個(gè)碳原子或至少2個(gè)碳原子和至少一個(gè)氮原子，所述方法包括a)從淀粉原料中制備單糖含量按重量計(jì)大于20％的含糖液體培養(yǎng)基，含糖液體培養(yǎng)基還含有淀粉原料的非淀粉固體成分；b)發(fā)酵含糖液體培養(yǎng)基以制備代謝物；和c)從發(fā)酵液中排出或分離至少一種代謝物，其包括用含糖液體培養(yǎng)基培養(yǎng)產(chǎn)生目的代謝物的微生物菌株，所述液體培養(yǎng)基獲得自a1)研磨淀粉原料；和a2)將研磨料液化在含有至少一種淀粉液化酶的水性液體中，然后使用至少一種糖化酶糖化，其中至少一些研磨料通過(guò)連續(xù)或分批添加至水性液體中而被液化。
適于用作淀粉原料的主要為干谷物或種子，其中干燥狀態(tài)下淀粉達(dá)到按重量計(jì)至少40％并優(yōu)選按重量計(jì)至少50％。這樣的原料見(jiàn)于目前大規(guī)模種植的谷物植物，如玉米、小麥、燕麥、大麥、黑麥、黑小麥、稻和多種高粱和小米種類(lèi)，如蘆黍和買(mǎi)羅高梁。淀粉原料優(yōu)選選自谷粒，特別優(yōu)選玉米、黑麥、黑小麥和小麥麥粒。一般的，本發(fā)明的方法還可使用其他淀粉原料進(jìn)行，例如馬鈴薯、木薯/木薯淀粉或多種含淀粉水果或種子的混和物。
含糖液體培養(yǎng)基中存在的糖優(yōu)選單糖，例如己糖和戊糖，如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、山梨糖、木糖、阿拉伯糖和核糖，特別是葡萄糖。葡萄糖外的單糖數(shù)量可根據(jù)使用的淀粉原料和其中含有的非淀粉成分變化；其可被反應(yīng)過(guò)程影響，例如被通過(guò)添加纖維素酶分解纖維素成分影響。含糖液體培養(yǎng)基的單糖有利地含有按重量計(jì)占含糖液體培養(yǎng)基中存在的糖總量的至少60％，優(yōu)選按重量計(jì)至少70％，特別優(yōu)選按重量計(jì)至少80％的葡萄糖。通常，葡萄糖總量按重量計(jì)占含糖液體培養(yǎng)基中存在的糖總量的從75％到99％的范圍內(nèi)，特別是按重量計(jì)80％到97％并特別是按重量計(jì)85到95％。
根據(jù)本發(fā)明，(產(chǎn)生目的代謝物的微生物在其中培養(yǎng)的)含糖液體培養(yǎng)基含有至少一些，優(yōu)選按重量計(jì)至少20％，特別優(yōu)選按重量計(jì)至少50％，特別是按重量計(jì)至少90％并非常特別按重量計(jì)至少99％的存在于研碎的谷粒中的非淀粉固體成分，這取決于提取率。含糖液體培養(yǎng)基中的非淀粉固體成分優(yōu)選按重量計(jì)達(dá)到研磨料中的淀粉成分(從而占含糖液體培養(yǎng)基中單糖數(shù)量)的至少10％，特別是按重量計(jì)至少25％，例如按重量計(jì)25和75％之間，特別是按重量計(jì)30％和60％之間。
為了制備含糖液體培養(yǎng)基，在步驟a1)中研碎所述淀粉原料，其間添加或不添加液體(如水)，優(yōu)選不添加液體。還可能將干磨與隨后的濕磨步驟結(jié)合。通常用于干磨的設(shè)備為錘式粉碎機(jī)、旋轉(zhuǎn)粉碎機(jī)或輥式破碎機(jī)；適用于濕磨法的為槳葉混合機(jī)、攪拌球式粉碎機(jī)、循環(huán)粉碎機(jī)、盤(pán)式粉碎機(jī)、環(huán)室粉碎機(jī)、振蕩粉碎機(jī)或行星式球磨機(jī)。原則上其他粉碎機(jī)也是合適的。例行實(shí)驗(yàn)中濕磨法需要的液體數(shù)量可由本領(lǐng)域技術(shù)工人決定。通常調(diào)整為干物質(zhì)含量按重量計(jì)在10％到20％之間。
研磨產(chǎn)生適用于后續(xù)方法步驟的顆粒大小。在本文上下文中，在a1)步驟的研磨步驟特別是干磨步驟中獲得的研磨料具有按重量計(jì)30％到100％，優(yōu)選按重量計(jì)40％到95％，特別優(yōu)選按重量計(jì)50％到90％數(shù)量的顆粒大小為100到630μm范圍的粉末顆粒(即微粒成分)是有利的。優(yōu)選獲得的研磨料含有按重量計(jì)50％的粉末顆粒顆粒大小為大于100μm。通常，按重量計(jì)至少95％的獲得的粉末顆粒具有小于2mm的顆粒大小。在本文上下文中，使用振動(dòng)分析儀通過(guò)篩選分析測(cè)量顆粒大小。原則上小的顆粒大小有利于獲得高產(chǎn)物產(chǎn)量。然而，在液化或加工中研磨料成漿時(shí)，如發(fā)酵步驟后干燥固體時(shí)，過(guò)小的顆粒大小可能引起問(wèn)題，特別是歸于成塊/結(jié)塊的問(wèn)題，通常，粉末由提取率或粉末等級(jí)表征，它們的相互關(guān)系為粉末等級(jí)的性質(zhì)隨著提取率的上升而上升。提取率對(duì)應(yīng)于基于按重量計(jì)使用的100份研磨料所獲得的按重量計(jì)粉末的數(shù)量。在研磨方法中，最先獲得例如來(lái)自谷粒內(nèi)部的純凈的細(xì)小的粉末，而隨著粉末中粗纖維和外殼成分?jǐn)?shù)量的提高，淀粉的比例下降。從而提取率還反映了所謂的粉末等級(jí)，其用作分類(lèi)粉末(特別是谷物粉末)的數(shù)值并基于粉末的灰分含量(稱(chēng)為灰分比例)。粉末等級(jí)或類(lèi)型號(hào)指出將100g粉末固體燒成灰后留下的灰分(礦物質(zhì))的mg量。對(duì)谷物粉末而言，更高的類(lèi)型號(hào)意味著更高的提取率，因?yàn)楣攘：诵暮邪粗亓坑?jì)約0.4％的灰分，而外殼含有按重量計(jì)約5％的灰分。因此，對(duì)于更低的提取率，谷物粉末主要由粉碎的胚乳(即谷粒的淀粉內(nèi)容)組成；對(duì)于更高的提取率，谷物粉末也含有粉碎的、含有蛋白質(zhì)的谷粒糊粉層；對(duì)于粗磨而言，它們還含有含蛋白質(zhì)和含脂肪的胚胎成分和外殼成分(包括粗纖維和灰分)。就本發(fā)明而言，原則上優(yōu)選具有高提取率或高類(lèi)型號(hào)的粉末。如果使用谷物作為淀粉原料，優(yōu)選研磨并加工的完整谷物及其外殼。
如果合適，在研磨之前將淀粉原料分割成適合研磨的大小，例如當(dāng)使用相對(duì)較大的材料如馬鈴薯或木薯時(shí)。對(duì)谷物而言，可省卻該分割步驟并使用和研磨完整的谷粒。
a2)步驟中為了液化研磨料中存在的淀粉，在液化步驟過(guò)程中糖化步驟之前將至少一些，優(yōu)選按重量計(jì)至少40％，特別是按重量計(jì)至少50％并特別優(yōu)選按重量計(jì)至少50％的研磨料引入反應(yīng)器。通常加入的量按重量計(jì)不超過(guò)90％，特別是按重量計(jì)85％并特別優(yōu)選按重量計(jì)80％。優(yōu)選的，在處理過(guò)程中加入的這部分研磨料是在液化步驟使用的條件下加入反應(yīng)器的。添加可以分為若干批(即分步)或連續(xù)進(jìn)行，優(yōu)選每部分占待液化研磨料總量的按重量計(jì)總計(jì)不多于20％，特別優(yōu)選按重量計(jì)不多于10％，例如按重量計(jì)1％到20％，特別是按重量計(jì)2％到10％。本發(fā)明中基本上只有一些研磨料，優(yōu)選按重量計(jì)不多于60％，特別優(yōu)選按重量計(jì)不多于50％并非常優(yōu)選按重量計(jì)不多于45％的研磨料在液化處理開(kāi)始時(shí)存在于反應(yīng)器中，剩余的研磨料在液化步驟中加入。液化也可連續(xù)進(jìn)行，例如在多步驟反應(yīng)級(jí)聯(lián)中。
根據(jù)本發(fā)明，a2)步驟中的液化在至少一種淀粉液化酶存在下進(jìn)行，所述酶優(yōu)選選自α-淀粉酶。同樣，可以使用其他在反應(yīng)條件下有活性而且穩(wěn)定并液化穩(wěn)定淀粉的酶。
α-淀粉酶(或使用的淀粉液化酶)可首先引入反應(yīng)容器中或在a2)步驟的過(guò)程中加入。優(yōu)選的，a2)步驟需要的一些α-淀粉酶在a2)步驟開(kāi)始時(shí)加入或首先放入反應(yīng)器中?；谑褂玫牡矸墼系目偭?，α-淀粉酶的總量通常按重量計(jì)位于0.002％到3.0％范圍內(nèi)，優(yōu)選按重量計(jì)從0.01％到1.5％并特別優(yōu)選按重量計(jì)從0.02％到0.5％。
可在膠凝溫度之上或之下進(jìn)行液化。優(yōu)選的，在至少部分高于使用的淀粉的膠凝溫度下進(jìn)行a2)步驟中的液化(稱(chēng)為烹飪過(guò)程)。通常選擇從70℃到165℃之間，優(yōu)選80℃到125℃之間，特別優(yōu)選85℃和115℃之間的溫度，溫度優(yōu)選比膠凝溫度高至少5℃并特別優(yōu)選至少高10℃。
為了達(dá)到最佳的α-淀粉酶活性，步驟a2)至少部分在弱酸性范圍的pH值下進(jìn)行，優(yōu)選4.0和7.0之間，特別優(yōu)選5.0和6.5之間，pH值通常在步驟a2)之前或開(kāi)始時(shí)調(diào)節(jié)；優(yōu)選在液化中檢查及適當(dāng)時(shí)重新調(diào)節(jié)該pH。優(yōu)選使用稀釋的礦物酸(如H2SO4或H3PO4)或稀釋的氫氧化物堿(如NaOH或KOH)調(diào)節(jié)pH。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明方法的步驟a2)如下進(jìn)行按重量計(jì)占研磨料總量總計(jì)不多于60％，優(yōu)選按重量計(jì)不多于50％，特別優(yōu)選按重量計(jì)不多于45％，例如按重量計(jì)10％到60％，特別是按重量計(jì)15％到50％，特別優(yōu)選按重量計(jì)20％到45％的部分起初懸浮于水性液體(如新鮮水，例如來(lái)自發(fā)酵或加工步驟的循環(huán)加工水或這些液體的混合物)中，然后進(jìn)行液化。
為了實(shí)施本發(fā)明的方法，可以預(yù)加熱使用的液體以使得懸液具有適度提高的溫度，例如從40℃到60℃。然而，優(yōu)選使用室溫的液體。
然后，向懸液中加入所述至少一種淀粉液化酶，優(yōu)選α-淀粉酶。如果使用α-淀粉酶，只加入一些α-淀粉酶是有利的，例如步驟a2)中使用的α-淀粉酶總量按重量計(jì)的10％到70％，特別是按重量計(jì)20％到65％。在該時(shí)間加入的α-淀粉酶數(shù)量取決于所述α-淀粉酶在反應(yīng)條件下對(duì)所使用的淀粉原料的活性，并通常占使用的淀粉原料總量的按重量計(jì)從0.0004％到2.0％，優(yōu)選按重量計(jì)從0.001％到1.0％，特別優(yōu)選按重量計(jì)從0.02％到0.3％的范圍。另一種選擇是，α-淀粉酶部分可在制備懸液之前與使用的液體混和。
在本文上下文中，優(yōu)選在開(kāi)始加熱至用于液化的溫度之前加入α-淀粉酶部分，特別是在室溫下或僅適度提高溫度，例如從20℃到30℃。
有利地，α-淀粉酶和研磨料的數(shù)量按照下述方式選擇膠凝過(guò)程中的粘度足夠降低從而可能有效地混和懸液(如通過(guò)攪拌方法)。優(yōu)選凝膠時(shí)反應(yīng)混合物的粘度不大于20Pas，特別優(yōu)選不大于10Pas并非常特別優(yōu)選不大于5Pas。通常用Roto Visko RV20型Haake粘度計(jì)使用M5系統(tǒng)和MVDIN設(shè)備在50℃的溫度下和200s-1的切割率下測(cè)量粘度。
然后加熱如此產(chǎn)生的懸液，優(yōu)選在高于使用的淀粉的膠凝溫度的溫度下。通常選擇在70℃到165℃之間，優(yōu)選80℃到125℃之間，特別優(yōu)選85℃和115℃之間的溫度，溫度優(yōu)選比膠凝溫度高至少5℃并特別優(yōu)選高至少10℃。監(jiān)控粘度時(shí)，向含有淀粉的懸液中逐漸加入其他淀粉原料部分，例如每次按重量計(jì)占所有使用淀粉的2％到20％，特別是按重量計(jì)5％到10％。優(yōu)選將待加入的研磨料部分在液化步驟過(guò)程中以至少2個(gè)級(jí)分，優(yōu)選至少4個(gè)級(jí)分并特別優(yōu)選至少6個(gè)級(jí)分加入反應(yīng)混合物中。另外，未用作制造懸液的研磨料部分可在液化步驟中連續(xù)加入。加入時(shí)，應(yīng)有利地保持溫度高于淀粉的膠凝溫度。
加入所有粉末后，通常將反應(yīng)混合物在設(shè)定為高于淀粉膠凝溫度的溫度下保持某段時(shí)間(即烹飪)，如30到60分鐘或需要時(shí)更長(zhǎng)。然后在加入另外的α-淀粉酶部分(優(yōu)選主要部分)之前將反應(yīng)混合物冷卻至略微高于膠凝溫度的溫度，例如75℃到90℃。根據(jù)使用的α-淀粉酶在反應(yīng)條件下的活性，在該時(shí)間點(diǎn)加入的α-淀粉酶數(shù)量占使用的淀粉原料總量的優(yōu)選按重量計(jì)0.002％到2.0％，特別優(yōu)選按重量計(jì)0.01％到1.0％，尤其特別優(yōu)選按重量計(jì)0.02％到0.4％。
在這些溫度下，淀粉的顆粒結(jié)構(gòu)被破壞(膠凝)，使得酶淀粉降解成為可能。為了將淀粉完全降解為糊精，將反應(yīng)混合物保持在固定溫度下，或適當(dāng)時(shí)加熱更久直到通過(guò)碘測(cè)試淀粉或合適的其他檢測(cè)淀粉的測(cè)試為陰性或至少基本上為陰性。適當(dāng)時(shí)可在此時(shí)向反應(yīng)混合物中加入一種或多種其他α-淀粉酶部分，例如按重量計(jì)占使用的淀粉原料總量的0.001％到0.5％并優(yōu)選按重量計(jì)0.002％到0.2％。
淀粉液化結(jié)束后，液體培養(yǎng)基中存在的糊精被連續(xù)或分批糖化(即降解為葡萄糖)，優(yōu)選連續(xù)糖化。液化的培養(yǎng)基可在特定的糖化罐中持續(xù)糖化然后加入發(fā)酵步驟(b)。另一方面，證明發(fā)酵之前只進(jìn)行部分糖化是有利的。例如，可隨后進(jìn)行將液體培養(yǎng)基中存在的糊精部分糖化并在發(fā)酵中使用得到的含糖液體培養(yǎng)基，所述部分占糊精(或起始淀粉)總重量的例如按重量計(jì)10％到90％，特別是按重量計(jì)20％到80％。然后可直接在發(fā)酵培養(yǎng)基中原位進(jìn)行進(jìn)一步糖化。糖化還可直接在發(fā)酵罐中(原位)進(jìn)行，省略了分開(kāi)的糖化罐。
原位糖化(即部分或全部在發(fā)酵罐中進(jìn)行的糖化)的優(yōu)點(diǎn)首先是降低了花費(fèi)，其次，葡萄糖的延遲釋放在每批的開(kāi)始提供較高的葡萄糖濃度而不抑制使用的微生物或改變其代謝。例如對(duì)大腸桿菌(E.coli)而言，過(guò)高的葡萄糖濃度引起有機(jī)酸(醋酸)的形成，而例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)在這種情況下進(jìn)入發(fā)酵，盡管通氣發(fā)酵罐中存在足夠的氧氣(Crabtree效應(yīng))。葡萄糖的延遲釋放可通過(guò)控制葡糖淀粉酶濃度調(diào)節(jié)。這樣做可能抑制上述效應(yīng)，并且在開(kāi)始時(shí)能產(chǎn)生更多的物質(zhì)從而降低提供的補(bǔ)料流引起的稀釋。
對(duì)糖化罐中的糖化而言，通常將液化的淀粉溶液冷卻或加熱至糖化酶的最佳溫度或略低，例如50℃到70℃，優(yōu)選60℃到65℃，并隨后用葡糖淀粉酶處理。
如果在發(fā)酵罐中進(jìn)行糖化，通常會(huì)在加入發(fā)酵罐之前將液化的淀粉溶液冷卻至發(fā)酵溫度(即32℃到37℃)。這種情況下，用于糖化的葡糖淀粉酶(或至少一種糖化酶)直接加入發(fā)酵液中。步驟a2)中液化淀粉的糖化此時(shí)與步驟b)中描述的微生物的糖代謝同時(shí)發(fā)生。
在加入葡糖淀粉酶之前，有利地將液體培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至使用的葡糖淀粉酶最佳活性范圍內(nèi)的數(shù)值，優(yōu)選3.5和6.0之間，特別優(yōu)選4.0和5.5之間并非常特別優(yōu)選4.0和5.0之間。然而，特別是直接在發(fā)酵罐中進(jìn)行糖化時(shí)，也可能調(diào)節(jié)pH至位于上述范圍之外的數(shù)值，例如6.0到8.0之間。這通常是有利的，或是由于待建立的發(fā)酵條件而必需的，例如在制備賴(lài)氨酸、泛酸和維生素B2時(shí)，盡管標(biāo)準(zhǔn)葡糖淀粉酶的活性在該pH范圍內(nèi)受到限制。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，糖化在特殊的糖化罐中進(jìn)行。為此，將液化的淀粉溶液加熱至酶最佳的溫度或略低，并將pH按照上述方法調(diào)節(jié)至酶最佳的值。
通常向含糊精液體培養(yǎng)基中加入按重量計(jì)占使用的淀粉原料總量0.001％到5.0％，優(yōu)選按重量計(jì)0.005％到3.0％，特別優(yōu)選按重量計(jì)0.01％到1.0％數(shù)量的葡糖淀粉酶。加入葡糖淀粉酶后，優(yōu)選將含糊精懸液在糊精糖化產(chǎn)生單糖的固定溫度下保持一段時(shí)間(例如2到72小時(shí)或需要時(shí)更長(zhǎng))，特別是5到48小時(shí)的時(shí)間?？墒褂檬炀毤夹g(shù)人員公知的方法(例如HPLC、酶測(cè)定或葡萄糖檢測(cè)帶)監(jiān)測(cè)糖化過(guò)程的進(jìn)展。糖化在單糖濃度不再顯著上升或甚至下降時(shí)完成。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，存在步驟a2)中所述至少一種α-淀粉酶和所述至少一種葡糖淀粉酶時(shí)，按照如下方式不連續(xù)或連續(xù)(優(yōu)選不連續(xù)，特別是分步)加入研磨料液體培養(yǎng)基的粘度不大于20Pas，特別是不大于10Pas并特別優(yōu)選不大于5Pas。為了有助于控制粘度，證明在高于研磨料中存在淀粉的膠凝溫度下加入按重量計(jì)為所加入研磨料總量的至少25％，優(yōu)選按重量計(jì)至少35％，特別優(yōu)選按重量計(jì)至少50％是有利的。另外，還可通過(guò)分步加入所述至少一種淀粉液化酶(優(yōu)選α-淀粉酶)和/或所述至少一種糖化酶(優(yōu)選葡糖淀粉酶)來(lái)影響粘度控制。
進(jìn)行a1)和a2)步驟時(shí)，可能產(chǎn)生單糖含量?jī)?yōu)選按重量計(jì)大于30％，特別優(yōu)選按重量計(jì)大于35％，尤其特別優(yōu)選按重量計(jì)大于40％的含糖液體。
可用于液化研磨料中淀粉部分的酶一般為所有的α-淀粉酶(EC3.2.1.1類(lèi)酶)，特別是得自薊樣芽孢桿菌(Bacillus lichenformis)或嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus staerothermophilus)的α-淀粉酶，特別是用于液化得自涉及產(chǎn)生生物乙醇的干磨法的材料的那些酶。適用于液化的α-淀粉酶也可商業(yè)購(gòu)得，例如來(lái)自Novozymes的Termamyl120 L，L型或來(lái)自Genencor的Spezyme。不同α-淀粉酶的組合也可用于液化。
可用于糖化液化的淀粉溶液中的糊精(即寡糖)的酶一般是所有的葡糖淀粉酶(EC3.2.1.3類(lèi)酶)，特別是得自曲霉(Aspergilus)的葡糖淀粉酶，特別是用于糖化得自涉及產(chǎn)生生物乙醇的干磨法的材料的那些酶。適用于糖化的葡糖淀粉酶也可商業(yè)購(gòu)得，例如來(lái)自Novozymes的Dextrozyme GA或來(lái)自Genencor的Optidex。也可使用不同葡糖淀粉酶的組合。
為了穩(wěn)定使用的酶，適當(dāng)時(shí)應(yīng)例如使用CaCl2將Ca2+離子濃度調(diào)節(jié)至酶特異的最佳值。合適的濃度值可由常規(guī)實(shí)驗(yàn)的技術(shù)人員決定。例如如果使用Termamyl作為α-淀粉酶，有利地將液體培養(yǎng)基中Ca2+濃度調(diào)節(jié)至例如50到100ppm，優(yōu)選60到80ppm，特別優(yōu)選約70ppm。
由于全部淀粉原料都用于產(chǎn)生a)的含糖液體培養(yǎng)基(如谷物的整個(gè)谷粒)，也存在淀粉原料的非淀粉固體成分。這經(jīng)常引起引入來(lái)自谷物的大量肌醇六磷酸，其數(shù)量不可忽略。為了避免由此引起的抑制效應(yīng)，在步驟a2)中在將含糖液體培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵步驟b)之前向液體培養(yǎng)基中加入至少一種肌醇六磷酸酶是有利的。
如果肌醇六磷酸酶在各個(gè)高溫下足夠穩(wěn)定，可在糖化之前、之中或之后加入。
只要在每種情況中反應(yīng)條件下其活性不超過(guò)臨界影響，可使用任何肌醇六磷酸酶。使用的肌醇六磷酸酶優(yōu)選具有＞50℃的熱穩(wěn)定性(T50)并特別優(yōu)選＞60℃。
肌醇六磷酸酶的數(shù)量通常為1到10000單位/kg淀粉原料，特別是10到2000單位/kg淀粉原料。
為了提高總體糖產(chǎn)量或獲得游離的氨基酸，在產(chǎn)生含糖液體培養(yǎng)基時(shí)可向反應(yīng)混合物中額外添加其他酶，例如支鏈淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、葡萄糖苷酶或蛋白酶。加入這些酶可對(duì)粘度具有正面影響，即降低粘度(例如通過(guò)切割長(zhǎng)鏈葡聚糖和/或(阿拉伯)木聚糖)，并引起可代謝的葡糖苷釋放和(殘余的)淀粉的釋放。蛋白酶的使用具有類(lèi)似的正面影響，其還可能釋放作為發(fā)酵生長(zhǎng)因子作用的氨基酸。
含糖液體培養(yǎng)基可有利地用于發(fā)酵產(chǎn)生微生物代謝物，所述產(chǎn)物具有至少3個(gè)碳原子或至少兩個(gè)碳原子和至少一個(gè)氮原子。為此，將步驟a)中產(chǎn)生的含糖液體培養(yǎng)基如b)所述進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵時(shí)由微生物產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品，即具有至少3個(gè)碳原子和/或至少一個(gè)氮原子和至少兩個(gè)碳原子的化合物。通常，可按照技術(shù)人員公知的一般方式進(jìn)行發(fā)酵操作。進(jìn)料的含糖液體培養(yǎng)基和最初引入并含有微生物的液體培養(yǎng)基的體積比例通常在約1∶10到10∶1的范圍內(nèi)，例如約1∶2或約2∶1，特別是約1∶1。發(fā)酵液中的糖含量可具體通過(guò)含糖液體培養(yǎng)基的進(jìn)料率調(diào)節(jié)。通常，進(jìn)料率會(huì)以發(fā)酵液中單糖含量在按重量計(jì)≥0％到按重量計(jì)約5％范圍內(nèi)的方式調(diào)節(jié)，然而，發(fā)酵也可在發(fā)酵液中明顯更高的單糖含量下進(jìn)行，如按重量計(jì)約10％到20％。
如果糖化和發(fā)酵分開(kāi)進(jìn)行，如果合適時(shí)可在進(jìn)行發(fā)酵前將在步驟a)中產(chǎn)生的含糖液體培養(yǎng)基滅菌，在該操作中微生物被通過(guò)熱方法、化學(xué)方法或機(jī)械方法破壞。為此，液體通常被加熱到80℃以上的溫度。細(xì)胞的破壞或裂解可在發(fā)酵前即刻進(jìn)行。為此，所有的含糖液體培養(yǎng)基被裂解或破壞。這可通過(guò)熱方法、機(jī)械方法或化學(xué)方法完成。然而，就本發(fā)明方法而言，如本文所述在發(fā)酵前進(jìn)行滅菌步驟證明不是必須的；而證明不進(jìn)行這類(lèi)滅菌步驟是有利的。因此，本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案涉及下述方法其中步驟a)中產(chǎn)生的液體培養(yǎng)基被直接發(fā)酵(即不預(yù)先滅菌)或進(jìn)行至少部分原位完成的糖化。
發(fā)酵產(chǎn)生液體培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基除所需的不揮發(fā)微生物代謝物外含有基本上在發(fā)酵中產(chǎn)生的生物量、糖化淀粉溶液的不可代謝組分，尤其是淀粉來(lái)源的非淀粉固體組分(例如纖維和不可利用的糖以及不可利用的緩沖鹽和營(yíng)養(yǎng)鹽)。該液體培養(yǎng)基也作為發(fā)酵液在本申請(qǐng)中提及，術(shù)語(yǔ)發(fā)酵液還包括(含糖)液體培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基中存在的糖最初發(fā)生了部分或不完全的發(fā)酵轉(zhuǎn)化，即單糖的部分或不完全的微生物代謝。
下文中，術(shù)語(yǔ)精細(xì)化學(xué)品包括特別是有機(jī)單、雙和三羧酸，其優(yōu)選具有3到10個(gè)碳原子并適當(dāng)時(shí)具有一個(gè)或多個(gè)(如1、2、3或4個(gè))羥基基團(tuán)連結(jié)其上，如酒石酸、亞甲基丁二酸、丁二酸、反丁烯二酸、順丁烯二酸、2，5-呋喃二羧酸、3-羥基丙酸、戊二酸、乙酰丙酸、乳酸、丙酸、葡糖酸、丙烯三羧酸和二氨基庚二酸、檸檬酸；成蛋白質(zhì)和非成蛋白質(zhì)氨基酸，如賴(lài)氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、門(mén)冬氨酸和蘇氨酸；嘌呤和嘧啶堿基；核苷和核苷酸，如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和腺苷-5，-一磷酸(AMP)；脂質(zhì)；具有優(yōu)選10到22個(gè)碳原子的飽和和不飽和脂肪酸，如γ-亞麻酸、二高(dihomo)-γ-亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸；具有優(yōu)選3到8個(gè)碳原子的二醇，如丙二醇和丁二醇；具有3個(gè)或更多(如3、4、5或6個(gè))OH基團(tuán)的較高功能性醇，如丙三醇、山梨醇、甘露醇、木糖醇和阿拉伯糖醇；具有至少4個(gè)碳原子(如4到22個(gè)碳原子)的長(zhǎng)鏈醇，如丁醇；碳水化合物如玻璃酸酶和海藻糖；芳香族化合物，如芳香胺、香草醛和靛藍(lán)；維生素和維生素原，例如抗壞血酸、維生素B6、維生素B12和核黃素、輔因子和公知的營(yíng)養(yǎng)品；蛋白質(zhì)如酶，例如肌醇六磷酸酶、木聚糖酶和gluconases；類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)，如番茄紅素、β-胡蘿卜素、蝦青素、玉米黃素和斑蝥黃；具有優(yōu)選3到10個(gè)碳原子和適當(dāng)時(shí)1個(gè)或多個(gè)羥基基團(tuán)的酮，例如丙酮和3-羥基丁酮；內(nèi)酯，如γ-丁內(nèi)酯、環(huán)糊精、生物多聚體(如多羥醛、多元酯、多糖、聚類(lèi)異戊二烯、聚酰胺)、多羥基鏈烷酸酯(如聚-3-羥基丁酸)以及與其他如3-羥基纈氨酸、4-羥基丁酸和其他由Steinbiichel編《Biopolymers》第一版，2003，Wiley-VCH，Weinheim和其中引文描述的有機(jī)羥基羧酸的共多元酯；以及上述化合物的前體和衍生物。其他適合作為精細(xì)化學(xué)品的化合物由Gutcho在《Chemicals by Fermentation》，Noyes Data Corporation(1973)，ISBN0818805086描述。
術(shù)語(yǔ)“輔因子”包括正常酶活性發(fā)生必需的非蛋白質(zhì)化合物。這些化合物可以是有機(jī)或無(wú)機(jī)的；優(yōu)選本發(fā)明的輔因子分子為有機(jī)的。這類(lèi)分子的實(shí)例為NAD和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)；這些輔因子的前體為煙酸。
術(shù)語(yǔ)“營(yíng)養(yǎng)制品”包括促進(jìn)植物和動(dòng)物特別是人的健康的食品添加劑。這類(lèi)分子的實(shí)例為維生素、抗氧化劑和某些脂質(zhì)，如多不飽和脂肪酸。
具體而言，產(chǎn)生的代謝物選自酶、氨基酸、維生素、二糖、具有3到10個(gè)碳原子的脂肪族單羧酸或雙羧酸、具有3到10個(gè)碳原子的脂肪族羥基羧酸、具有3到10個(gè)碳原子的酮、具有4到10個(gè)碳原子的鏈烷醇、具有3到8個(gè)碳原子的鏈烷二醇和多羥基鏈烷酸酯。
本領(lǐng)域技術(shù)人員明白通過(guò)本發(fā)明發(fā)酵途徑產(chǎn)生的化合物在每種情況下均以由使用的微生物產(chǎn)生的對(duì)映體形式獲得(如果存在不同的對(duì)映體)。例如對(duì)氨基酸而言，通常獲得各自的L對(duì)映體。
本發(fā)明的方法優(yōu)選用于產(chǎn)生不揮發(fā)的微生物代謝物。就本發(fā)明而言，不揮發(fā)代謝物應(yīng)理解為通常不經(jīng)分解不能通過(guò)蒸餾從發(fā)酵液中去除的化合物。通常這些化合物在大氣壓下具有高于水沸點(diǎn)的沸點(diǎn)，通常高于150℃，特別是高于200℃。通常它們是在標(biāo)準(zhǔn)條件下(298K，101·3kPa)為固相的化合物。
然而，也可能使用本發(fā)明方法產(chǎn)生非揮發(fā)性的微生物代謝產(chǎn)物，所述產(chǎn)物在標(biāo)準(zhǔn)條件下具有低于水沸點(diǎn)的熔點(diǎn)和/或油的稠度。在這種情款下，通常在制備(特別是干燥)時(shí)控制最高溫度。這些化合物還可以下述方式產(chǎn)生以基本上固體形式(假固體形式)形成在吸附劑上。在這類(lèi)情況下，根據(jù)步驟c)，通常應(yīng)在消耗或分離目的產(chǎn)物之前去除發(fā)酵液的固體成分。
適用于上述目的的吸附劑為例如活性木炭、氧化鋁、硅膠、硅酸、粘土、煤煙、沸石、無(wú)機(jī)堿金屬和堿土金屬鹽(如鈉、鉀、鎂和鈣的氫氧化物、碳酸鹽、硅酸鹽硫酸鹽和磷酸鹽，特別是鎂鹽和鈣鹽，例如Mg(OH)2，MgCO3、MgSiO4、CaSO4、CaCO3)、堿土金屬氧化物(如MgO和CaO)、其他無(wú)機(jī)磷酸鹽和硫酸鹽(如ZnSO4)、無(wú)機(jī)酸鹽(特別是其堿金屬和堿土金屬鹽，特別是其鈉鹽和鉀鹽，例如醋酸鈉、甲酸鈉、甲酸氫鈉、檸檬酸鈉、醋酸鉀、甲酸鉀、甲酸氫鉀和檸檬酸鉀)和高分子量有機(jī)載體如碳水化合物(如糖，任選的變性淀粉、纖維素、木質(zhì)素)和一般的下文所述與產(chǎn)物形成有關(guān)的載體材料。通常上述載體材料應(yīng)含有非常少量的鹵素(如氯離子和硝酸鹽)，特別是只有痕量或完全不含。
在標(biāo)準(zhǔn)條件下具有低于水沸點(diǎn)的熔點(diǎn)和/或油的稠度并有利地通過(guò)本發(fā)明方法產(chǎn)生的化合物的實(shí)例為γ-亞麻酸、二高-γ-亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸，以及丙酸、乳酸、丙二醇、丁醇和丙酮。就本發(fā)明而言，這些假固體形式的化合物同樣被認(rèn)為是固體形式的不揮發(fā)微生物代謝物。
如下文所詳細(xì)說(shuō)明，發(fā)酵中使用的微生物以本身已知的方式取決于所需精細(xì)化學(xué)品基礎(chǔ)上。它們可以是天然來(lái)源或遺傳修飾的。合適的微生物和發(fā)酵方法實(shí)例為下文表A中給出的那些。
表A















本發(fā)明方法優(yōu)選的實(shí)施方案涉及產(chǎn)生酶(如肌醇六磷酸酶、木聚糖酶、葡聚糖酶)，氨基酸(例如賴(lài)氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸)，維生素(例如泛酸和核黃素)，它們的前體和衍生物；以及產(chǎn)生上述單、雙或三羧酸，特別是具有3到10個(gè)碳原子的脂肪族單和雙羧酸(例如丙酸和琥珀酸)，具有3到10個(gè)碳原子的脂肪族羥基羧酸(例如乳酸)；產(chǎn)生上述長(zhǎng)鏈鏈烷醇，特別是具有4到10個(gè)碳原子的鏈烷醇(如丁醇)；產(chǎn)生上述二醇；特別是具有3到8個(gè)碳原子的鏈烷二醇如丙二醇；產(chǎn)生上述酮，特別是具有3到10個(gè)碳原子的酮(如丙酮)；產(chǎn)生上述碳水化合物，特別是二糖(如海藻糖)；以及產(chǎn)生多羥基鏈烷酸酯。
因此在優(yōu)選的實(shí)施方案中，發(fā)酵中使用的微生物選自能夠產(chǎn)生至少一種下述代謝物的天然或重組的微生物酶(如肌醇六磷酸酶、木聚糖酶、葡聚糖酶)，氨基酸(例如賴(lài)氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸)，維生素(例如泛酸和核黃素)，它們的前體和衍生物；二糖(如海藻糖)；特別是具有3到10個(gè)碳原子的脂肪族單和雙羧酸(例如丙酸和琥珀酸)，具有3到10個(gè)碳原子的脂肪族羥基羧酸(例如乳酸)；具有3到10個(gè)碳原子的酮(如丙酮)；具有4到10個(gè)碳原子的鏈烷醇(如丁醇)；具有3到8個(gè)碳原子的鏈烷二醇如丙二醇；以及多羥基鏈烷酸酯。
具體而言，微生物選自棒桿菌屬、芽孢桿菌屬、阿舒囊霉、埃希氏菌(Escherichia)、曲霉、產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)、放線桿菌、厭氧螺菌、乳酸桿菌屬、丙酸菌和梭狀芽孢桿菌，特別是選自谷氨酸棒桿菌、枯草芽孢桿菌、棉阿舒囊霉、大腸桿菌、黑曲霉或肥大產(chǎn)堿桿菌、產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌、丁二酸放線桿菌、德式乳酸桿菌、萊氏乳桿菌(Lactobacillusleichmanni)、阿拉伯糖丙酸桿菌(Propionibacterium arabinosum)、謝氏丙酸桿菌(Propionibacterium schermanii)、費(fèi)氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii)、丙酸梭菌和丙酮丁醇梭菌菌株。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，發(fā)酵中由微生物產(chǎn)生的代謝物為賴(lài)氨酸。為了進(jìn)行發(fā)酵，可使用如Pfefferle等上述引文和US3,708,395中用于其他碳原料的類(lèi)似條件和操作。原則上連續(xù)的和不連續(xù)的(分批或補(bǔ)料分批)操作模式是合適的，優(yōu)選補(bǔ)料分批的模式。
在另一特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，發(fā)酵中由微生物產(chǎn)生的代謝物為甲硫氨酸。為了進(jìn)行發(fā)酵，可使用如WO03/087386和WO03/100072中所述的用于其他碳原料的類(lèi)似條件和操作。
在另一特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，發(fā)酵中由微生物產(chǎn)生的代謝物為泛酸。為了進(jìn)行發(fā)酵，可使用如WO01/021772的用于其他碳原料的類(lèi)似條件和操作。
在另一特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，發(fā)酵中由微生物產(chǎn)生的代謝物顯示為多羥基鏈烷酸酯(例如聚-3-羥基丁酸)和與其他有機(jī)羥基羧酸(如3-羥基戊酸、4-羥基丁酸和其他在上文Steinbüchel中描述的，包括例如長(zhǎng)鏈羥基羧酸如3-羥基辛酸、3-羥基癸酸和3-羥基十四烷酸及其混合物)的共多元酯的形式。為了進(jìn)行發(fā)酵，可使用如S.Y.Lee，Plastic Bacteria Progress andprospects for polyhydroxyalkanoate production in bacteria，Tibtech，卷14，(1996)，431-438頁(yè)中所述的用于其他碳原料的類(lèi)似的條件和操作。
在另一特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，發(fā)酵中由微生物產(chǎn)生的代謝物為核黃素。為了進(jìn)行發(fā)酵，可使用如WO01/011052、DE 19840709、WO98/29539、EP 1186664和Fujioka，KNew biotechnology for riboflavin(vitamin B2)and character of this riboflavin.Fragrance Journal(2003)，31(3)，44-48所述的用于其他碳原料的類(lèi)似條件和操作。
在另一特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，發(fā)酵中由微生物產(chǎn)生的代謝物為肌醇六磷酸酶。為了進(jìn)行發(fā)酵，本文也可使用如WO98/55599所述用于其他碳原料的類(lèi)似條件和操作。
如果合適，在進(jìn)一步加工發(fā)酵液之前(即在步驟c之前)如上述方式進(jìn)行滅菌步驟。
通常按照如下方式完成根據(jù)步驟c)從發(fā)酵液中分離或排出代謝物至少一種代謝物從發(fā)酵液中排出或分離從而剩余發(fā)酵液中該代謝物的含量按重量計(jì)不多于20％，特別是按重量計(jì)不多于10％，優(yōu)選按重量計(jì)不多于5％，非常優(yōu)選按重量計(jì)不多于2.5％，各情況均基于剩余發(fā)酵液總重量。
根據(jù)步驟c)從發(fā)酵液中分離或排出精細(xì)化學(xué)品(即微生物代謝物)可一步或多步進(jìn)行。本文中一個(gè)必要的步驟是從發(fā)酵液中去除固體成分。這可在分離有價(jià)值產(chǎn)物之前或之后進(jìn)行。本領(lǐng)域常規(guī)使用的用于分離有價(jià)值產(chǎn)物和用于分離固體(即固液相分離)的方法(其還包括用于粗提和精制有價(jià)值產(chǎn)物和用于配制的步驟)是公知的(例如Belter，P.A，《BioseparationsDownstream Processing for Biotechnology》，JohnWiley&Sons(1988)和《Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry》第五版on CD-ROM，Wiley-VCH中所描述)。
為了分離有價(jià)值的產(chǎn)物，隨后可有利地進(jìn)行下述操作其中首先從發(fā)酵液中去除固體成分(例如通過(guò)離心或過(guò)濾方法)，然后從液相中分離有價(jià)值產(chǎn)物(如通過(guò)結(jié)晶、沉淀、吸附或蒸餾)。另外，還可直接從發(fā)酵液中分離有價(jià)值的產(chǎn)物，例如通過(guò)使用層析法或抽提法。必須特別提到的層析法為離子交換層析，有價(jià)值的產(chǎn)物可在層析柱上選擇性地分離。在這種情況下，有利地通過(guò)例如潷析、蒸發(fā)和/或干燥從發(fā)酵液中去除殘留的固體。
常規(guī)的過(guò)濾方法實(shí)例為濾餅過(guò)濾和深度過(guò)濾(如A.Rushton，A.S.Ward，R.G.Holdich《Solid-Liquid Filtration and SeparationTechnology》，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim 1996，pp.177 ff.，K.J.Ives，in A.Rushton編《Mathematical Models and Design Methodsin Solid-Liquid Separation》，NATO ASI series E No.88，Martinus Nijhoff，Dordrecht 1985，pp.90 ff.所述)和交叉流過(guò)濾，特別是用于去除＞0.1μm固體的微量過(guò)濾法(如J.Altmann，S.Ripperger，J.Membrane Sci.124(1997)119-128所述)。
常規(guī)的離心方法描述于例如D.B.Purchas，《Solid-LiquidSeparation》，Upland Press，Croydon 1977，493-559頁(yè)的G.Hultsch，H.Wilkesmann，″Filtering Centrifuges，″和H.Trawinski，Die quivalenteKlrflche von Zentrifugen[The equivalent clarifying area of centrifuges]，Chem.Ztg.83(1959)606-612?？墒褂枚喾N設(shè)計(jì)如管式離心機(jī)，籃式離心機(jī)，特別是推桿(pusher)離心機(jī)、濾紙條(slip-filter)離心機(jī)和盤(pán)式分離器。
常規(guī)的抽提方法包括分批或分步驟方法和直流或逆流的不同的連續(xù)方法。在本文上下文中，方法可涉及兩個(gè)或更多流動(dòng)相。有價(jià)值產(chǎn)物和待去除的次級(jí)組分在兩相內(nèi)的溶解性可特別受到溶劑選擇、平衡離子的變化和改變pH的影響(Treybal，R.E.，《Mass Transfer Operations》，第三版，New York，McGraw-Hill，1979；Kula，M.，Kroner，K.H.，Hustedt，H.和Schutee，H.，Technical aspects of extractive enzyme purification，Ann.N.Y.Acad.Sci.，341(1981)；Robinson，R.G.和Cha，D.Y.，Controlled pHextraction in the separation of weak acids and bases，Biotech.Progress，1(1)，18(1985))。
常規(guī)吸附方法描述于例如D.M.Ruthven《Principles of Adsorptionand Adsorption Processes》，J.Wiley&Sons，New York 1984；G.Wedler《Adsorption》，Verlag Chemie，Weinheim 1970.可以使用固體床、移動(dòng)床和流動(dòng)床吸附器?？煞峙蜻B續(xù)進(jìn)行吸附(K.Hauffe，S.R.MorrisonDe Gruyter Studienbuch″Adsorption，″De Gruyter，Berlin 1974.；W.KastAdsorptionstechnik[Adsorption techniques]，VCHVerlagsgesellschaft，Weinheim 1988)。除了許多其他的吸附劑外，可使用活性炭、離子交換樹(shù)脂、天然或合成沸石和活性氧化鋁。另外，也可使用親和吸附法(如Arnold，F(xiàn).H.，Blanch，H.W.和Wilke，C.R.，Analysis ofAffinity separations.Chem.Engr.J.，30，B9(1985)所述)。
可特別用于純化精細(xì)化學(xué)品的方法為例如層析、沉淀、超濾、微量過(guò)濾、納膜過(guò)濾、逆向滲透、電泳、電透析和等電聚焦。
可分批或連續(xù)進(jìn)行層析法。連續(xù)層析包括例如連續(xù)旋轉(zhuǎn)環(huán)層析(CRAC)(如A.J.P.Martin，Diseuss.Farraday Soc.7(1949)所述)、真移動(dòng)床層析(TMBC)(如K.Takeuchi，T.Miyauchi，Y.Uraguchi，J.Chem.Eng.Japan 11(1978)216-220所述)和模擬移動(dòng)床層析(SMB)(如D.B.Broughton，Universal Oil Products Co.，US2,985,589，1961所述)。使用的固相為例如活性氧化鋁、硅膠、浸透乙二醇的硅藻土、葡聚糖、多聚磺化苯乙烯、聚丙烯酰胺和多聚體凝結(jié)蛋白質(zhì)(Arnold，F(xiàn).H.，Blanch，H.W.和Wilke，C.R.，Analysis of Affinity separations.Chem.Engr.J.，30，B9(1985)；Gibbs，S.J.和Lightfoot，E.N.，Scaling up gradient elutionchromatography，IEC Fund.，25，490(1986)；King，C.J.，SeparationProcesses，第二版，New York，McGraw-Hill(1979)；Yau，W.W.，Kirlland，J.J.和Bly，D.D.，Modern Size-Exclusion LiquidChromatography，Wiley，New York(1979))。
沉淀可涉及有價(jià)值產(chǎn)物或次級(jí)組分的沉淀(J.W.MullinCrystallization，第三版，Butterworth-Heinemann，Oxford 1993)?？赏ㄟ^(guò)例如添加更多溶劑、添加鹽和改變溫度來(lái)引起沉淀。產(chǎn)生的沉淀可通過(guò)上述用于分離固體的常規(guī)方法從液體中分離。
可用于微量過(guò)濾、超濾、納米過(guò)濾和逆向滲透的材料實(shí)例為微孔膜(E.S.Perry編輯《Progress in Separation and Purification》，第一卷，Interscience Publ.，New York 1968中A.S.Michaels″Ultrafiltration，″)、均質(zhì)膜(J.Crank，G.S.Park編輯《Diffusion in Polymers》，AcademicPress，New York 1968；P.Meares編輯《Membrane SeparationProcesses》，Elsevier，Amsterdam 1976中S.A.Stern″The Separation ofGases by Selective Permeation，″)、非對(duì)稱(chēng)膜(R.E.Kesting《SyntheticPolymeric Membranes，A Structural Perspective》，Wiley-Interscience，New York 1985)和帶電膜(F.Helfferich《Ion-Exchange》，McGraw-Hill，London 1962)，所有這些均通過(guò)不同方法產(chǎn)生(R.Zsigmondy，US1 421 341，1922；D.B.Pall，US4 340 479，1982；S.Loeb，S.Sourirajan，US3 133 132，1964)。通常的材料為纖維素酯、尼龍、聚氯乙稀、丙烯腈、聚丙烯、聚碳酸和陶器。這些膜用作板構(gòu)件(R.F.Madsen，Hyperfiltrationand Ultrafiltration in Plate-and-Frame Systems，Elsevier，Amsterdam1977)、螺旋構(gòu)件(US3 417 870，1968(D.T.Bray))、管束或中空纖維構(gòu)件(H.Strathmann″Synthetic Membranes and their Preparation，″inM.C.Porter(ed.)Handbook of Industrial Membrane Technology，NoyesPublication，Park Ridge，NJ 1990，pp.1-60)。另外，可能使用液膜(N.N.Li″Permeation Through Liquid Surfactant Membranes，″AIChE J.17(1971)459；S.G.Kimura，S.L.Matson，W.J.Ward III″IndustrialApplications of Facilitated Transport，″in N.N.Li(ed.)RecentDevelopments in Separation Science，卷V，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)lorida，1979，pp.11-25)。目的有價(jià)值產(chǎn)物不僅可在加料側(cè)富集并通過(guò)滲余物流(retentate stream)取出，也可以在加料側(cè)耗盡并通過(guò)過(guò)濾/滲透流取出。
電泳法描述于例如《Separation Recovery and Purification inBiotechnology》，J.Asenjo and J.Hong編輯，ACS Symposium Series，314，122(1986)中Rudge，S.R.，Ladisch，M.R.，Process considerations forscale-up of liquid chromatography and electrophoresis。使用大量的變化形式，如粒狀凝膠層中的等電聚焦、使用再循環(huán)的連續(xù)等電聚焦、“Rotofor”小室、使用再循環(huán)的自由流動(dòng)聚焦和使用等電膜的多室電解。使用的基質(zhì)材料為(特別是)乙酸纖維素、瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠。
常規(guī)的結(jié)晶方法描述于例如Janeic，S.J.，Grootscholten，P.A.，《Industrial Crystallization》，New York，Academic，1984；A.W.Bamforth《Industrial Crystallization》，Leonard Hill，London 1965；G.Matz《Kristallisation》，第二版，Springer Verlag，Berlin 1969；J.N vlt《Industrial Crystallization-State of the Art.》VCH Verlagsges.，Weinheim 1982；S.J.Janci ，P.A.M.Grootscholten《IndustrialCrystallization》，Reidel，Dordecht 1984；O.Shnel，J.Garside《Precipitation》，Butterworth-Heinemann，Oxford，1992；A.S.Myerson編輯《Handbook of Industrial Crystallization》，Butterworth-Heineman，Boston 1993；J.W.Mullin《Crystallization》，第三版，Butterworth-Heinemann，Oxford 1993；A.Mersmann編輯《Crystallization Technology Handbook》，Marcel Dekker，NeW York1995?？赏ㄟ^(guò)例如冷卻、蒸發(fā)、真空結(jié)晶(絕熱冷卻)、反應(yīng)結(jié)晶和鹽析完成結(jié)晶。結(jié)晶可在例如攪動(dòng)或不攪動(dòng)槽中、直接接觸操作中、蒸發(fā)結(jié)晶器中(R.K.Multer，Chem Eng.(N.Y.)89(1982)March，87-89)、真空結(jié)晶器中分批或連續(xù)地，例如在強(qiáng)制循環(huán)結(jié)晶器(Swenson強(qiáng)制循環(huán)結(jié)晶器)或流化床結(jié)晶器(Oslo型)中進(jìn)行(A.D.Randolph，M.A.Larson《Theoryof Particulate Processes》，第二版，Academic Press，New York 1988；J.Robinson，J.E.Roberts，Can.J.Chem.Eng.35(1957)105-112；J.N vlt《(Design of Crystallizers》，CRC Press，Boca Raton，1992)。也可能分步結(jié)晶(L.Gordon，M.L.Salutsky，H.H.Willard《Precipitation fromHomogeneous Solution》，Wiley-Interscience，NeW York 1959)。類(lèi)似的，可分離對(duì)映異構(gòu)物和外消旋化合物(J.Jacques，A.Collet，S.H.Willen《Enantiomers，Racemates and Resolutions》，Wiley，NeW York 1981；R.A.Sheldon《Chirotechnology》，Marcel Dekker，New York 1993；A.N.Collins，G.N.Sheldrake，J.Crosby編輯《Chirality in Industry》，Wiley，New York 1985)。
常規(guī)的干燥方法描述于例如O.Krischer，W.Kast《Diewissenschaftlichen Grundlagen der Trocknungstechnik[The scientificbases of drying technology]》，第三版，Springer，Berlin-Heidelberg-NewYork 1978；R.B.Keey《DryingPrinciples and Practice》，Pergamon Press，Oxford 1972；K.Krll《Trockner und Trocknungsverfahren[Dryersand drying methods]》，第二版，Springer，Berlin-Heidelberg-New York1978；Williams-Gardener，A.《Industrial Drying》，Houston，Guif，1977；K.Krll，W.Kast《Trocknen und Trockner in der Produktion[Dryingand dryers in production]》，Springer，Berlin-Heidelberg-New York 1989。干燥方法的實(shí)例包括用于如在干燥箱、洞道干燥器、帶狀干燥器、盤(pán)式干燥器、噴射干燥器、流化床干燥器、充氣和旋轉(zhuǎn)鼓旋轉(zhuǎn)器、噴霧干燥器、氣體對(duì)流干燥器、旋流干燥器、混和干燥器、研磨干燥器(也用于糊劑)、環(huán)狀干燥器、管道干燥器、旋轉(zhuǎn)干燥器、圓盤(pán)干燥器中對(duì)流干燥的方法。其他方法通過(guò)接觸(如槳式干燥器、真空或冷凍干燥箱、圓錐體干燥器、抽吸干燥器、盤(pán)式干燥器、通過(guò)接觸作用的膠片干燥器、轉(zhuǎn)鼓式干燥器、粘稠相干燥器、平板干燥器、旋轉(zhuǎn)螺管干燥器、雙錐干燥器)或熱輻射(紅外的，如紅外旋轉(zhuǎn)干燥器)或電解體能量(微波)進(jìn)行干燥。大部分情況下，用于熱干燥法的干燥設(shè)備通過(guò)蒸汽、油、燃?xì)饣螂娂訜?，在一些情況下可在減壓情況下進(jìn)行，取決于它們的設(shè)計(jì)。
除干燥之外，還可能使用如下文所述用于制備蛋白質(zhì)組合物的配制方法。如下文所述，這些方法還包括添加配制輔料。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)離子交換層析進(jìn)行從c)的發(fā)酵液中分離精細(xì)化學(xué)品。其中，通常的條件和操作為技術(shù)工人公知并描述于例如《Rmpp Lexikon der Chemie[Dictionary of Chemistry]》第十版，1997，Georg Thieme Verlag，Stuttgart；Weis，《Handbuch derIonenchromatographie[Ion Chromatography Manual]》，1991，VCHVerlagsgesellschaft，Weinheim。一般而言，在洗脫微生物產(chǎn)生的化合物之前，應(yīng)進(jìn)行這樣的操作，即由微生物產(chǎn)生的化合物選擇性地結(jié)合在離子交換柱上并用例如水洗滌離子交換柱。
在含有固體的發(fā)酵液應(yīng)用于離子交換層析柱之前，適當(dāng)時(shí)應(yīng)通過(guò)技術(shù)人員熟悉的常規(guī)方法(如過(guò)濾和離心)去除固體。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，在含有固體的發(fā)酵液應(yīng)用于離子交換層析柱之前不去除固體。在這種情況下，含有固體的發(fā)酵液有利地逆重力流入離子交換柱從而存在的固體不引起離子交換柱的封閉(即堵塞)。
如果由微生物產(chǎn)生的代謝物為基本氨基酸，后者可使用酸性陽(yáng)離子交換柱通過(guò)離子交換層析從發(fā)酵液中有利地取出。在這種情況下，基本氨基酸(如賴(lài)氨酸)選擇性地結(jié)合在離子交換柱上。在洗脫之前通過(guò)洗滌(特別是用水)純化是可能的。然后用合適的洗脫液例如氨水(優(yōu)選用5％體積濃度的氨水)洗脫基本氨基酸。
離子交換層析用于取出或純化基本氨基酸(如賴(lài)氨酸)的用途描述于例如WO01/072689和Lee等，The use of ion exclusion chromatography asapproved to the normal ion exchange chromatography to achieve a moreefficient lysine recovery from fermentation broth，Enzyme and MicrobialTechnology 30(2002)，798-303。
殘余的發(fā)酵殘?jiān)深?lèi)似于下文所述整理(即處理和/或加工)，產(chǎn)生蛋白質(zhì)副產(chǎn)品。
如果由微生物產(chǎn)生的代謝物為甲硫氨酸，有價(jià)值產(chǎn)物有利地通過(guò)離心或過(guò)濾分離。其中可使用已描述的(如之前的申請(qǐng)DE10359668.2中)用于其他碳原料的類(lèi)似的條件和操作。發(fā)酵結(jié)束后，加熱產(chǎn)生的發(fā)酵液至溶解所有甲硫氨酸。然后通過(guò)離心或過(guò)濾分離固體。固體分離步驟的澄清流出物優(yōu)選通過(guò)部分或完全蒸發(fā)濃縮，在該操作中甲硫氨酸結(jié)晶析出。此后干燥甲硫氨酸，適當(dāng)時(shí)在此之前進(jìn)行前述的額外過(guò)濾步驟。
通過(guò)離心或過(guò)濾分離的固體基本上包含發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生的生物量和糖化淀粉溶液的不可代謝組分(如纖維)。該殘余的發(fā)酵殘?jiān)深?lèi)似于下文所述處理或加工，產(chǎn)生含蛋白質(zhì)次級(jí)產(chǎn)物。
如果由微生物產(chǎn)生的代謝物為泛酸，有價(jià)值產(chǎn)物類(lèi)似地有利地通過(guò)過(guò)濾或離心分離。在本文上下文中，可使用已描述的(如EP1050219和WO01/83799中)用于其他碳原料的類(lèi)似的條件和操作。另外，可類(lèi)似于上述甲硫氨酸情況下描述的進(jìn)行整理。在泛酸的情況下，優(yōu)選在固體分離之前對(duì)所有發(fā)酵液額外進(jìn)行巴氏消毒。固體分離步驟獲得的澄清流出物優(yōu)選部分蒸發(fā)，適當(dāng)時(shí)用氯化鈣處理并干燥(優(yōu)選噴霧干燥)。
為了獲得泛酸，還可在步驟c)之后進(jìn)行操作，其中通過(guò)潷析、離心、過(guò)濾技術(shù)或膜技術(shù)(微量過(guò)濾、超濾、納米過(guò)濾)和/或這些方法的組合將細(xì)胞和不溶物或固體、非淀粉組分分離。固體含量低或不含固體的流含有泛酸。該流可被例如進(jìn)一步濃縮和/或進(jìn)行干燥或配制步驟。含固體流可如下文所述進(jìn)行處理以產(chǎn)生蛋白質(zhì)副產(chǎn)品。
適當(dāng)時(shí)將細(xì)胞裂解或破壞。這可在發(fā)酵后直接進(jìn)行。為此，將所有的發(fā)酵液進(jìn)行裂解或破壞步驟，該步驟可以熱、機(jī)械或化學(xué)方法進(jìn)行。細(xì)胞還可在去除固體后裂解。這樣做時(shí)，只對(duì)富含固體的流進(jìn)行上述裂解步驟。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，泛酸的整理以如下方式進(jìn)行在發(fā)酵后熱破壞細(xì)胞并通過(guò)潷析、離心、過(guò)濾技術(shù)或膜技術(shù)和/或其組合去除細(xì)胞和非淀粉固體組分。固體含量低或不含固體的流含有泛酸。該流可進(jìn)一步(例如)濃縮。在濃縮步驟之前、期間或之后向固體含量低的液體中加入佐劑(如下文所述)是有利的。這使得可能降低泡沫的形成和/或覆蓋物(coating)的形成。然后干燥或直接配制濃縮的流。此外，在干燥或配制步驟之前、之中或之后可加入下文所述的佐劑以降低產(chǎn)物的吸濕性、改善產(chǎn)物的流動(dòng)性和/或提高貯藏穩(wěn)定性。在這種情況下，類(lèi)似于下文所要描述的，優(yōu)選加工含固體流以產(chǎn)生蛋白質(zhì)副產(chǎn)品。
用于處理泛酸的另一優(yōu)選的實(shí)施方案提供了在發(fā)酵步驟間盡早加入含特殊陽(yáng)離子的佐劑的可能性。這描述于例如WO02/072857。
而用于通過(guò)離心、潷析、超濾和/或透析過(guò)濾處理泛酸的另一優(yōu)選實(shí)施方案描述于WO05/028659。
還可能通過(guò)電泳或離子交換從發(fā)酵液中分離泛酸。然而，這些方法并不優(yōu)選，因?yàn)轭A(yù)計(jì)可能出現(xiàn)問(wèn)題。
分離或取出泛酸后殘留的發(fā)酵殘?jiān)?即特別是被分離出來(lái)的固體)可類(lèi)似于下文描述處理或加工，產(chǎn)生蛋白質(zhì)次級(jí)產(chǎn)物。
如果微生物產(chǎn)生的代謝物是多羥基鏈烷酸酯形式，有價(jià)值產(chǎn)物的分離有利地通過(guò)使用溶劑抽提來(lái)進(jìn)行，如US4310684或EP355307所描述。殘留的固體可以常規(guī)方法去除，例如通過(guò)過(guò)濾或離心。另外，可類(lèi)似于甲硫氨酸情況下所描述的進(jìn)行操作。在多羥基鏈烷酸酯情況下，優(yōu)選在分離出固體之前對(duì)所有發(fā)酵液額外進(jìn)行巴氏消毒。固體分離步驟獲得的澄清流出物優(yōu)選部分蒸發(fā)，適當(dāng)時(shí)用氯化鈣處理并干燥(優(yōu)選噴霧干燥)。多羥基鏈烷酸酯的進(jìn)一步純化以已知方法進(jìn)行，例如如US4310684或EP355307所述。
殘留的發(fā)酵殘?jiān)?即特別是被分離出來(lái)的固體)可類(lèi)似于下文描述處理或加工，產(chǎn)生蛋白質(zhì)次級(jí)產(chǎn)物。
取出目的產(chǎn)物(如基本氨基酸，如賴(lài)氨酸)后殘余的發(fā)酵液基本上包含發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生的生物量和糖化淀粉溶液的不可代謝組分(如纖維和不可利用的糖和不可利用的緩沖液和營(yíng)養(yǎng)鹽)。這些固體可獲得自發(fā)酵液，所述發(fā)酵液類(lèi)似于生物醇產(chǎn)生中產(chǎn)生的次級(jí)產(chǎn)物(在其上下文中被稱(chēng)為可溶性蒸餾器干燥顆粒(DDGS)，并以該名稱(chēng)進(jìn)入市場(chǎng))而留下。在本文上下文中，發(fā)酵液可基本上完全地或僅從某種程度上從固體中分離。由該方法獲得的蛋白質(zhì)次級(jí)產(chǎn)物(本文下文也稱(chēng)為蛋白質(zhì)組合物)可在進(jìn)一步處理或加工步驟之前或之后用作食品或飼料添加劑以喂養(yǎng)動(dòng)物，特別是農(nóng)業(yè)家畜，特別優(yōu)選牛、豬和家禽，尤其特別優(yōu)選牛。
產(chǎn)生蛋白質(zhì)組合物的發(fā)酵液整理或加工可通過(guò)技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行，特別是通過(guò)改變干物質(zhì)含量(例如通過(guò)干燥或蒸發(fā))、研磨和配制(例如添加添加劑、成型方法如造粒和擠壓)。次級(jí)產(chǎn)物的整理和加工還包括與其他食品或飼料添加劑混和，例如以穩(wěn)定營(yíng)養(yǎng)成分。
通常，以以下方式制備蛋白質(zhì)組合物在取出或分離至少一種步驟c)代謝物之后去除發(fā)酵液的至少一些揮發(fā)組分。這產(chǎn)生固體或半固體形式的蛋白質(zhì)組合物。通常，在殘留的發(fā)酵液中取出的或分離的代謝物含量按重量計(jì)不多于20％，特別是按重量計(jì)不多于15％，特別是按重量計(jì)不多于10％，非常特別是按重量計(jì)不多于5％，每種情況均以殘余發(fā)酵液的總重量為根據(jù)。
為了在取出目的產(chǎn)物后獲得蛋白質(zhì)組合物，通常在蒸發(fā)步驟中部分蒸發(fā)所有殘余液(通常為多級(jí)操作)然后分離出產(chǎn)生的固體(例如使用潷析器)，或從所有發(fā)酵液中直接分離固體。為了去除固體，可能使用離心、微量過(guò)濾、超濾、納米過(guò)濾、逆向滲透或這些方法的組合(如在多級(jí)設(shè)備中)。分離出的固體通常具有以重量計(jì)10％到80％，優(yōu)選以重量計(jì)15％到60％并特別優(yōu)選以重量計(jì)20％到50％范圍內(nèi)的干物質(zhì)含量。進(jìn)一步整理或加工得到的最終蛋白質(zhì)組合物有利地具有按重量計(jì)約90％的干物質(zhì)含量，從而降低了保存時(shí)變質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)。
還可使用熱方法(如蒸發(fā))、機(jī)械方法(如使用濾紙、潷析器、離心機(jī))和上述技術(shù)人員慣用的各個(gè)方法的組合通過(guò)濃縮步驟c)后殘留的發(fā)酵液中的固體組分獲得蛋白質(zhì)組合物。濃縮液體產(chǎn)生固體或半固體(如糊狀)殘?jiān)?，所述殘?jiān)€包含少量根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的代謝物(以基于殘?jiān)傊亓客ǔＴ诎粗亓坑?jì)0％到10％范圍內(nèi)，特別是按重量計(jì)0％到5％的范圍內(nèi))和淀粉來(lái)源的非揮發(fā)性的，通常是固體的非淀粉組分或至少大量的這些物質(zhì)(通常按重量計(jì)至少90％)，或淀粉來(lái)源的所有固體非淀粉組分，以及發(fā)酵產(chǎn)生的生物量。該半固體或固體殘?jiān)深?lèi)似于步驟c)后殘留的濃縮的發(fā)酵液進(jìn)行干燥或配制。
部分獲得次級(jí)產(chǎn)物時(shí)分離出的液相可作為加工水再循環(huán)。該液相的再循環(huán)部分可有利地全部或部分用在根據(jù)步驟a)制備的含糖液體中，或用于產(chǎn)生發(fā)酵中使用的緩沖液或營(yíng)養(yǎng)鹽溶液。在步驟a)中混和再循環(huán)的加工水時(shí)，必須考慮到過(guò)高的比例可對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生不良作用(作為某些礦物和離子如鈉離子和乳酸根離子供給過(guò)多的結(jié)果)。因此優(yōu)選制備用于淀粉液化目的的本發(fā)明混懸液時(shí)，再循環(huán)加工水的數(shù)量應(yīng)限制在按重量計(jì)不多于75％，優(yōu)選按重量計(jì)不多于60％并特別優(yōu)選按重量計(jì)不多于50％，每種情況均以用于制備混懸液的所有水為基礎(chǔ)。在步驟a2)優(yōu)選的實(shí)施方案中制備混懸液時(shí)，加工水的數(shù)量有利地位于按重量計(jì)5％到60％范圍內(nèi)并優(yōu)選位于按重量計(jì)10％到50％范圍內(nèi)，每種情況均基于以用于制備混懸液的所有水。
沒(méi)有再循環(huán)進(jìn)入加工的液相部分可在多級(jí)蒸發(fā)操作中被濃縮產(chǎn)生漿。漿通常具有按重量計(jì)20％到90％，優(yōu)選按重量計(jì)30％到80％，特別優(yōu)選按重量計(jì)40％到70％范圍內(nèi)的干物質(zhì)含量。該漿可與潷析步驟(或任何其他方法)中分離出的固體混和然后干燥。干燥可通過(guò)例如轉(zhuǎn)鼓式干燥器、噴霧干燥器或槳式干燥器進(jìn)行，優(yōu)選使用轉(zhuǎn)鼓式干燥器。優(yōu)選以如下方式進(jìn)行干燥產(chǎn)生的固體具有按重量計(jì)不大于30％，優(yōu)選按重量計(jì)不大于20％，特別優(yōu)選按重量計(jì)不大于10％的殘留水分含量。
與固體發(fā)酵組分共同存在的干燥的次級(jí)產(chǎn)物(即蛋白質(zhì)組合物)的性質(zhì)以本身已知的涉及大量參數(shù)的方式了解，如顆粒大小、顆粒形狀、撒粉的敏感性、吸濕性、穩(wěn)定性特別是保存穩(wěn)定性、顏色、氣味、流動(dòng)性、凝結(jié)敏感性、靜電荷的產(chǎn)生、對(duì)光和高溫的敏感性、機(jī)械穩(wěn)定性以及通過(guò)添加配制輔料(例如載體和包衣材料、粘合劑和其他添加劑)的再分散性。
方便使用的配制輔料包括例如粘合劑、載體、粉末包衣材料/流動(dòng)改進(jìn)劑，以及彩色顏料、殺蟲(chóng)劑、分散劑、消泡劑、粘度調(diào)節(jié)劑、酸、堿液、抗氧化劑、酶穩(wěn)定劑、酶抑制劑、吸附劑、脂肪、脂肪酸、油或這些的混合物。當(dāng)使用配制和干燥方法(如噴霧干燥、流化床干燥和凍干法)時(shí)，這類(lèi)配制輔料有利地用作干燥輔料。
粘合劑的實(shí)例為碳水化合物，特別是糖類(lèi)如單糖、雙糖、寡糖和多糖(如糊精、海藻糖、葡萄糖、葡萄糖漿、麥芽糖、蔗糖、果糖和乳糖)；膠狀物質(zhì)如動(dòng)物蛋白質(zhì)(例如明膠、酪素特別是酪蛋白酸鈉)、植物蛋白質(zhì)(如大豆蛋白質(zhì)、豌豆蛋白質(zhì)、黃豆蛋白質(zhì)、羽扇豆、玉米、小麥蛋白質(zhì)、玉米蛋白質(zhì)和稻蛋白質(zhì))、合成聚合物(如聚乙二醇、聚乙烯醇特別是來(lái)自BASF的Kollidon商標(biāo))、任選地修飾的生物多聚體(如木質(zhì)素、甲殼質(zhì)、殼聚糖、聚交酯)和變性淀粉如辛烯基琥珀酸酐(OSA)；樹(shù)膠如阿拉伯樹(shù)膠；纖維素衍生物，如甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基甲基纖維素(HEMC)、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、羧甲基纖維素(CMC)；粉末如玉米粉、小麥粉、黑麥粉、大麥粉和米粉。
載體材料的實(shí)例為碳水化合物(特別是上述作為粘合劑提高的糖)和淀粉(如玉米淀粉、米淀粉、馬鈴薯淀粉、小麥淀粉和木薯淀粉)；變性淀粉如辛烯基琥珀酸酐；纖維素和微晶纖維素；無(wú)機(jī)礦物質(zhì)或壤土，如粘土、煤、硅藻土、硅酸、云母和高嶺土；粗磨粉(如粗磨小麥粉)、麩(如麥麩)、上述作為粘合劑提到的粉末；鹽如金屬鹽，特別是堿金屬和堿土金屬的有機(jī)酸鹽(如Mg，Ca，Zn，Na和K的檸檬酸鹽、醋酸鹽、甲酸鹽和甲酸氫鹽)、無(wú)機(jī)鹽(如Mg，Ca，Zn，Na和K的硫酸鹽、碳酸鹽、硅酸鹽或磷酸鹽)；堿土金屬氧化物如CaO和MgO；無(wú)機(jī)緩沖液如堿土金屬的磷酸氫鹽，特別是鈉和鉀的磷酸氫鹽，例如K2HPO4，KH2PO4和Na2HPO4；以及通常在本發(fā)明代謝物產(chǎn)生中提到的具有低熔點(diǎn)或油濃度的吸附劑。
粉末包衣劑或流動(dòng)佐劑的實(shí)例為硅藻土、硅酸(如來(lái)自Degussa的Sipernat商標(biāo))；粘土、煤、動(dòng)物脂和高嶺土；淀粉、變性淀粉、無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)酸鹽和上述作為載體提到的緩沖液；纖維素和微晶纖維素。
就其他添加劑而言，可提到的實(shí)例為彩色顏料(如TiO2)、殺蟲(chóng)劑、分散劑、消泡劑、粘度調(diào)節(jié)劑、無(wú)機(jī)酸(如磷酸、硝酸、鹽酸、硫酸)、有機(jī)酸(如飽和或不飽和單或二羥酸，如甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、軟脂酸、硬脂酸、乙二酸、丙二酸、丁二酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、順丁烯二酸和反丁烯二酸)、堿液(如堿金屬氫氧化物如NaOH和KOH)、抗氧化劑、酶穩(wěn)定劑、酶抑制劑、吸附物、脂肪、脂肪酸和油。
上述添加劑以及適當(dāng)時(shí)的其他添加劑(如包衣材料)的數(shù)量可在廣闊范圍內(nèi)變化，取決于所述代謝物的特定要求并取決于所使用的添加劑的性質(zhì)，例如在按重量計(jì)0.1％到80％范圍內(nèi)，特別是在按重量計(jì)5％到70％范圍內(nèi)，最特別按重量計(jì)10％到60％范圍內(nèi)，每種情況均以完成的配制產(chǎn)物總重量為基礎(chǔ)，或每種情況均以完成的配制產(chǎn)物或組合物的總重量為基礎(chǔ)。
配制輔料的添加(也稱(chēng)為產(chǎn)物成型或固體涉及)可在加工發(fā)酵液之前、之中或之后(特別是在干燥中)進(jìn)行。在濃縮步驟c)后殘余的發(fā)酵液之前添加配制輔料對(duì)促進(jìn)待整理的物質(zhì)或產(chǎn)物的可操作性是特別有利的。配制輔料可添加進(jìn)(以固體形式獲得的)次級(jí)產(chǎn)物和含有所述次級(jí)產(chǎn)物的溶液或混懸液中，如它們可直接添加進(jìn)步驟c)后的發(fā)酵液中，或在整理中和最后干燥步驟之前加入獲得的溶液或混懸液中。
因此，輔料可與例如通過(guò)濃縮步驟c)之后剩余的發(fā)酵液得到的混懸液混和；這類(lèi)混懸液也可通過(guò)例如混和應(yīng)用于載體材料。配制輔料的添加具體在干燥后進(jìn)行，例如對(duì)干燥的顆粒涂布包衣或多層包衣時(shí)。其他佐劑可在干燥后和已經(jīng)進(jìn)行的任何包衣步驟后添加。通過(guò)配制方法獲得的顆?？赏ㄟ^(guò)使用上述干燥方法干燥至目的殘余水分含量。
所有以固體形式獲得的次級(jí)產(chǎn)物(如顆粒、顆粒體和滲出物)可用包衣包被(即至少再用一層物質(zhì))。包衣在例如混和器或流化床上進(jìn)行，在那里使等待包衣的顆粒流動(dòng)然后噴上包衣材料。包衣材料可以是干燥形式(如粉末形式)或溶劑(如水、有機(jī)溶劑及其混合物，特別是水)中的溶液、分散液、乳濁液或混懸液。如果存在溶劑，其可在噴在顆粒表面時(shí)或之后通過(guò)蒸發(fā)去除。此外，包衣材料如脂肪也可以熔化物的形式應(yīng)用。
可以以水分散系或混懸液形式噴霧的包衣材料描述于例如WO03/059087。這些材料包括(特別是)聚烯烴(如聚乙烯、聚丙烯、聚乙烯蠟、蠟、無(wú)機(jī)和有機(jī)鹽)、Acronals(如butyl acrolate/methyl acrolate共聚體)、來(lái)自BASF的Styrofan商標(biāo)(如以苯乙烯和丁二烯為基礎(chǔ)的那些)和如WO03/059086中所述的疏水物質(zhì)。當(dāng)應(yīng)用這類(lèi)材料時(shí)，包衣材料的固體含量通常在按重量計(jì)0.1％到20％范圍內(nèi)，特別是按重量計(jì)0.2％到10％范圍內(nèi)，最特別是按重量計(jì)0.4％到5％范圍內(nèi)，每種情況均以配制完畢的產(chǎn)物總重量為基礎(chǔ)。
可以以溶液形式噴霧的包衣材料為例如聚乙二醇、纖維素衍生物(如甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素和乙基纖維素)、聚乙烯醇、蛋白質(zhì)(如明膠)、無(wú)機(jī)和有機(jī)鹽、碳水化合物如糖(如葡萄糖、乳糖、果糖、蔗糖和海藻糖)、淀粉和變性淀粉。應(yīng)用這類(lèi)材料時(shí)，包衣材料的固體含量通常在按重量計(jì)0.1％到20％范圍內(nèi)，特別是按重量計(jì)0.2％到10％范圍內(nèi)，最特別是按重量計(jì)0.4％到5％范圍內(nèi)，每種情況均以配制完畢的產(chǎn)物總重量為基礎(chǔ)。
可以以熔化物的形式噴霧的包衣材料描述于例如DE199 29 257和WO92/12645。這些材料包括(特別是)聚乙二醇、合成脂肪和蠟(如來(lái)自BASF的Polygen WE)、天然脂肪如動(dòng)物脂肪(如蜂蠟)和植物脂肪(如小燭樹(shù)蠟)、脂肪酸(如動(dòng)物蠟、動(dòng)物脂肪酸、軟脂酸、硬脂酸、甘油三酸酯)、Edenor產(chǎn)品、Vegeole產(chǎn)品、Montan酯蠟(如來(lái)自BASF的LuwaxE)。應(yīng)用這類(lèi)材料時(shí)，包衣材料的固體含量通常在按重量計(jì)1％到25％范圍內(nèi)，特別是按重量計(jì)2％到25％范圍內(nèi)，最特別是按重量計(jì)3％到20％范圍內(nèi)，每種情況均以配制完畢的產(chǎn)物總重量為基礎(chǔ)。
干燥和/或配制步驟后，完整的或磨碎的谷物顆粒(優(yōu)選玉米、小麥、大麥、小米/高粱和/或黑麥)可添加進(jìn)次級(jí)產(chǎn)物或蛋白質(zhì)組合物。
因此本發(fā)明還涉及來(lái)自基于糖的微生物發(fā)酵的蛋白質(zhì)組合物，所述發(fā)酵根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行以產(chǎn)生具有至少3個(gè)碳原子或具有至少2個(gè)碳原子和至少一個(gè)N原子的代謝物，所述蛋白質(zhì)產(chǎn)物可如上所述獲得。該蛋白質(zhì)組合物通常包含蛋白質(zhì)材料(即來(lái)自發(fā)酵的生物量)、淀粉來(lái)源的非淀粉組分(特別是纖維)和發(fā)酵產(chǎn)物(代謝物)。具體而言，蛋白質(zhì)組合物基本上包含下列干物質(zhì)組分a)按重量計(jì)1％到90％，優(yōu)選按重量計(jì)5％到85％，特別優(yōu)選按重量計(jì)10％到75％的來(lái)自發(fā)酵的生物量；b)按重量計(jì)1％到90％，特別是按重量計(jì)5％到85％，更特別是按重量計(jì)10％到80％，非常特別是按重量計(jì)15％到75％的淀粉來(lái)源的非淀粉組分，特別是纖維；c)按重量計(jì)0.01％到10％，特別是按重量計(jì)0.1％到5％，特別是按重量計(jì)0.2％到5％，非常特別是按重量計(jì)0.3％到5％的具有至少3個(gè)碳原子或具有至少2個(gè)碳原子和至少一個(gè)N原子的微生物代謝物；d)按重量計(jì)0％到90％，特別是按重量計(jì)5％到80％，更特別是按重量計(jì)10％到70％的常規(guī)配制輔料；和e)按重量計(jì)0％到40％，特別是按重量計(jì)0.5％到30％，更特別是按重量計(jì)1％到20％的發(fā)酵液的不可代謝的其他組分，特別是糖、淀粉、營(yíng)養(yǎng)鹽和/或緩沖液鹽殘?jiān)?br> 其中組分a)到e)總計(jì)干物質(zhì)重量的100％。在本文上下文中，術(shù)語(yǔ)“基本上”是指不同于a)到e)的其他組分?jǐn)?shù)量較低。通常該數(shù)量按重量計(jì)將不超過(guò)10％，特別是按重量計(jì)5％，每種情況均以蛋白質(zhì)組合物干物質(zhì)總量為基礎(chǔ)；優(yōu)選該數(shù)量按重量計(jì)少于1％，特別是按重量計(jì)約0％。
生物量(組分a))包括(特別是)蛋白質(zhì)組合物中粗蛋白的數(shù)量。該數(shù)量通常占按重量計(jì)至少40％，一般按重量計(jì)在40％到90％范圍內(nèi)，特別是按重量計(jì)在40％到90％范圍內(nèi)，特別是按重量計(jì)在45％到85％范圍內(nèi)，最特別按重量計(jì)在50％到80％范圍內(nèi)，每種情況均以蛋白質(zhì)組合物的總干物質(zhì)為基礎(chǔ)。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)組合物通常包含一種或多種必需氨基酸，特別是至少一種選自賴(lài)氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸和色氨酸的氨基酸。必需氨基酸(特別是所提到的)通常在每種情況下均以下述數(shù)量存在所述數(shù)量與發(fā)酵產(chǎn)生生物醇時(shí)產(chǎn)生的傳統(tǒng)DDGS次級(jí)產(chǎn)物相比提高因子至少為1.5倍。如果所述氨基酸存在于蛋白質(zhì)組合物中，后者通常具有按重量計(jì)至少1％(特別是按重量計(jì)在1％到5％范圍內(nèi))的賴(lài)氨酸含量，按重量計(jì)至少0.8％(特別是按重量計(jì)在0.8％到5％范圍內(nèi))的甲硫氨酸含量，按重量計(jì)至少1.5％(特別是按重量計(jì)1.5％到5％范圍內(nèi))的蘇氨酸含量和/或按重量計(jì)至少0.4％(特別是按重量計(jì)0.4％到5％范圍內(nèi))的色氨酸含量，每種情況均以蛋白質(zhì)組合物的總干物質(zhì)為基礎(chǔ)。
通常本發(fā)明的蛋白質(zhì)組合物包含少量水，一般按重量計(jì)在0％到25％范圍內(nèi)，優(yōu)選按重量計(jì)在0.5％到15％范圍內(nèi)，更優(yōu)選按重量計(jì)在1％到10％范圍內(nèi)，非常優(yōu)選按重量計(jì)1％到5％范圍內(nèi)的水，每種情況均以蛋白質(zhì)組合物總重量為基礎(chǔ)。
本發(fā)明還涉及如上所述的方法，其中
(i)從步驟a)獲得的含糖液體培養(yǎng)基中去除按重量計(jì)不多于50％的部分(其包含淀粉原料的非淀粉固體組分)并用剩余物進(jìn)行如b)中所述的發(fā)酵以產(chǎn)生第一代謝物(A)；和(ii)將所有或一些淀粉原料的非淀粉固體組分從該部分中分離并用該部分進(jìn)行如b)所述的發(fā)酵以產(chǎn)生第二代謝物(B)，其與代謝物(A)一致或不同。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，按照如下方式進(jìn)行(ii)的非淀粉固體組分的去除含糖液體培養(yǎng)基剩余物的固體含量總計(jì)按重量計(jì)不大于50％，優(yōu)選按重量計(jì)不大于30％，特別優(yōu)選按重量計(jì)不大于10％，非常特別優(yōu)選按重量計(jì)不大于5％。
該操作使得在(iii)的獨(dú)立發(fā)酵中可能使用其最低要求(如氧氣轉(zhuǎn)移率)必需被滿足的微生物。用于(iii)獨(dú)立發(fā)酵的合適微生物為例如芽孢桿菌物種，優(yōu)選枯草芽孢桿菌。這類(lèi)微生物在獨(dú)立發(fā)酵中產(chǎn)生的化合物選自(特別是)維生素、輔因子和營(yíng)養(yǎng)制品、嘌呤和嘧啶堿基、核苷和核苷酸、脂質(zhì)、飽和和不飽和脂肪酸、芳香族化合物、蛋白質(zhì)、類(lèi)胡蘿卜素，優(yōu)選來(lái)自維生素、輔因子和營(yíng)養(yǎng)制品、蛋白質(zhì)和類(lèi)胡蘿卜素，特別優(yōu)選來(lái)自核黃素和泛酸鈣。
具體而言，該操作允許有利地使用本發(fā)明的方法，即使當(dāng)產(chǎn)生的精細(xì)化學(xué)品在發(fā)酵中以固體形式獲得。
該操作的優(yōu)選的實(shí)施方案涉及在兩個(gè)獨(dú)立的發(fā)酵中類(lèi)似產(chǎn)生相同的代謝物(A)和(B)。這在相同代謝物的不同應(yīng)用具有不同純度要求的情況下特別有利。因此，第一個(gè)代謝物(A)如將用作飼料添加劑的氨基酸(如賴(lài)氨酸)使用含固體發(fā)酵液產(chǎn)生，而相同的第二個(gè)代謝物(B)如將用作食品添加劑的相同氨基酸(在本案例中為例如賴(lài)氨酸)使用(ii)的不含固體發(fā)酵液。由于完全或部分去除非淀粉固體組分，可降低整理代謝物(其應(yīng)用領(lǐng)域具有更高的純度要求)時(shí)純化的復(fù)雜性。
在該操作的另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，微生物在發(fā)酵中產(chǎn)生的代謝物B為核黃素。為了進(jìn)行發(fā)酵，可使用已描述用于其他碳原料的如WO01/011052，DE19840709，WO98/29539，EP1186664和Fujioka，K.New biotechnology for riboflavin(vitamin B2)and character of thisriboflavin.Fragrance Journal(2003)，31(3)，44-48中的類(lèi)似條件和操作。
例如下面的操作可用于實(shí)施本方法的變化形式。根據(jù)本發(fā)明方法步驟a)到c)使用優(yōu)選的大體積發(fā)酵產(chǎn)生代謝物A如精細(xì)化學(xué)品(如賴(lài)氨酸)。根據(jù)(i)，根據(jù)(ii)通過(guò)常規(guī)方法(如離心或過(guò)濾)從一些步驟a)獲得的含糖液體培養(yǎng)基中完全或部分去除或分離固體。由此獲得的含糖液體培養(yǎng)基(其基本上完全或部分不含固體)根據(jù)(ii)加入發(fā)酵以產(chǎn)生代謝物B，如核黃素。根據(jù)(ii)分離的固體流有利地送回大體積發(fā)酵的含糖液體培養(yǎng)基流。
根據(jù)(ii)產(chǎn)生的含核黃素發(fā)酵液可使用已描述用于其他碳原料的如DE4037441，EP464582，EP438767和DE3819745中的類(lèi)似條件和操作進(jìn)行加工。細(xì)胞生物量的以下裂解液(以晶體形式存在的賴(lài)氨酸)優(yōu)選通過(guò)潷析分離。其他分離固體的方法如過(guò)濾也是可能的。此后干燥核黃素，優(yōu)選通過(guò)噴霧干燥器和流化床干燥器。另外，根據(jù)(ii)產(chǎn)生的含核黃素發(fā)酵混合物可在類(lèi)似條件下使用類(lèi)似方法(如描述干如EP1048668和EP730034的)加工。巴氏消毒后離心發(fā)酵液，然后用礦物酸處理殘余的含固體部分。通過(guò)過(guò)濾從酸性水培養(yǎng)基中取出形成的核黃素，洗滌，適當(dāng)時(shí)隨后干燥。
已經(jīng)分離出的固體可在如上所述大體積發(fā)酵方法范圍內(nèi)加工，如前述，其平行操作以產(chǎn)生次級(jí)產(chǎn)物。
在該操作的另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，微生物在發(fā)酵中產(chǎn)生的代謝物B為泛酸。為了進(jìn)行發(fā)酵，可使用已描述用于其他碳原料的如WO01/021772中的類(lèi)似條件和操作。
為了實(shí)施該方法的變化形式，可隨后進(jìn)行如上所述用于核黃素的操作。將已經(jīng)按照(ii)純化和優(yōu)選已經(jīng)基本上不含固體的含糖液體培養(yǎng)基加入根據(jù)(ii)的發(fā)酵以產(chǎn)生泛酸。此處與含固體液體培養(yǎng)基相比粘度降低的事實(shí)特別有利。分離的固體流優(yōu)選送回大體積發(fā)酵的含糖液體培養(yǎng)基流。
根據(jù)(ii)產(chǎn)生的含泛酸發(fā)酵液可在類(lèi)似條件下使用類(lèi)似操作(如在EP1050219和WO01/83799中已描述用于其他碳原料的)加工。巴氏消毒發(fā)酵液后通過(guò)例如離心或過(guò)濾分離殘余固體。部分蒸發(fā)固體分離步驟中獲得的澄清流出液，適當(dāng)時(shí)用氯化鈣處理并干燥(特別是噴霧干燥)。
已經(jīng)分離出的固體可在如上所述大體積發(fā)酵方法范圍內(nèi)加工如前述，其平行操作以產(chǎn)生次級(jí)產(chǎn)物。
在該操作的另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，微生物在發(fā)酵中產(chǎn)生的代謝物B為多羥基鏈烷酸酯。為了進(jìn)行發(fā)酵，可使用已描述用于其他碳原料的如S.Y.Lee，Plastic Bacteria？Progress and prospects forpolyhydroxyalkanoate production in bacteria，Tibtech，第14卷，(1996)，431-438頁(yè)中的類(lèi)似條件和操作。
為了實(shí)施該方法的變化形式，可隨后進(jìn)行如上所述用于核黃素的操作。將已經(jīng)按照(ii)純化和優(yōu)選已經(jīng)基本上不含固體的含糖液體培養(yǎng)基加入根據(jù)(ii)的發(fā)酵以產(chǎn)生多羥基鏈烷酸酯。部分蒸發(fā)固體分離步驟中獲得的澄清流出液，適當(dāng)時(shí)用氯化鈣處理并干燥(特別是噴霧干燥)。
根據(jù)(ii)產(chǎn)生的含多羥基鏈烷酸酯發(fā)酵液可在類(lèi)似條件下使用類(lèi)似操作(如在US4310684和EP355307中已描述用于其他碳原料的)加工。巴氏消毒發(fā)酵液后通過(guò)例如離心或過(guò)濾分離殘余固體。部分蒸發(fā)固體分離步驟中獲得的澄清流出液，適當(dāng)時(shí)用氯化鈣處理并干燥(特別是噴霧干燥)。多羥基鏈烷酸酯的進(jìn)一步純化以本身已知(例如如US4310684或EP355307所述)的方式進(jìn)行。
已經(jīng)分離出的固體可在如上所述大體積發(fā)酵方法范圍內(nèi)加工如前述，其平行操作以產(chǎn)生次級(jí)產(chǎn)物。
下列實(shí)施例旨在說(shuō)明本發(fā)明的單個(gè)方面，但絕不應(yīng)理解為限制。
實(shí)施例I、粉碎淀粉原料下文使用的研磨料如下產(chǎn)生。使用旋轉(zhuǎn)粉碎機(jī)完全粉碎完整的玉米顆粒。使用不同的杵、粉碎路徑或篩選元件，獲得三種不同程度的細(xì)度。通過(guò)實(shí)驗(yàn)室震動(dòng)篩選(振動(dòng)分析儀Retsch Vibrotronic VE1型；篩選時(shí)間5分鐘，振幅1.5mm)篩選分析研磨料，給出表1列出的結(jié)果。
表1

II.酶促淀粉液化和淀粉糖化II.1.糖化步驟中不使用植酸酶II.1a)酶促淀粉液化用480g水混懸320g干磨玉米粉(T71/03)并與310mg氯化鈣通過(guò)連續(xù)攪拌混和。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中持續(xù)攪拌。用H2SO4將pH調(diào)至6.5并將混合物加熱至35℃后，添加2.4g L型Termamyl120(Novozymes A/S)。在40分鐘過(guò)程內(nèi)，將反應(yīng)混合物加熱至86.5℃的溫度，必需時(shí)用NaOH將pH調(diào)至上述值。在30分鐘內(nèi)，再加入400g干磨玉米粉(T71/03)，在該方法中將溫度升至91℃。反應(yīng)混合物在該溫度下持續(xù)約100分鐘。隨后再加入2.4gTermamyl120L并將溫度保持約100分鐘。實(shí)驗(yàn)中使用碘-淀粉反應(yīng)監(jiān)控液化進(jìn)展。溫度最終升至100℃并將反應(yīng)混合物再煮沸20分鐘。此時(shí)不能再檢測(cè)到淀粉。將反應(yīng)器冷卻至35℃。
II.1b)糖化將II.1a)獲得的反應(yīng)混合物加熱至61℃并持續(xù)攪拌。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中持續(xù)攪拌。用H2SO4將pH調(diào)至4.3后，添加10.8g(9.15ml)Dextrozyme GA(Novozymes A/S)。將溫度保持約3小時(shí)，該時(shí)間段中用葡萄糖測(cè)試條(Boehringer的S-Glucotest)監(jiān)控反應(yīng)進(jìn)展。結(jié)果在下文表2中列出。隨后將反應(yīng)混合物加熱至80℃然后冷卻。這產(chǎn)生約1180g液體產(chǎn)物，所述產(chǎn)物具有約1.2kg/l的密度和按重量計(jì)總計(jì)約53.7％(由紅外干燥器決定)的干物質(zhì)含量。用水洗滌后，干物質(zhì)含量(不含水溶性組分)按重量計(jì)約14％。反應(yīng)混合物的葡萄糖含量總計(jì)380g/l(由HPLC決定)(見(jiàn)表2，樣品編號(hào)7)。
表2

II.2.糖化步驟中使用植酸酶II.2a)淀粉液化如II.1a)中所述液化干磨的玉米粉樣品。
II.2b)糖化將II.1a)中獲得的反應(yīng)混合物加熱至61℃并持續(xù)攪拌。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中持續(xù)攪拌。用H2SO4將pH調(diào)至4.3后，添加10.8g(9.15ml)Dextrozyme GA(Novozymes A/S)和70μl植酸酶(700單位植酸酶，來(lái)自BASF AG的Natuphyt Liquid 10000L)。將溫度保持約3小時(shí)，該時(shí)間段中用葡萄糖測(cè)試條(Boehringer的S-Glucotest)監(jiān)控反應(yīng)進(jìn)展。隨后將反應(yīng)混合物加熱至80℃然后冷卻。獲得的產(chǎn)物通過(guò)紅外干燥器干燥并用水洗滌。用HPLC確定反應(yīng)混合物中的葡萄糖含量。
II.3用于酶促淀粉液化和淀粉糖化的其他方案II.3a)玉米粉將360g去離子水倒入反應(yīng)管中。加入1.54ml CaCl2儲(chǔ)存溶液(100gCaCl2×2H2O/l)至醪液終濃度約70ppm Ca2+。將240g玉米粉緩慢加入水中并持續(xù)攪拌。使用按重量計(jì)50％的NaOH水溶液將pH調(diào)至6.5后，加入4.0ml(＝酶/干物質(zhì)按重量計(jì)2％)的Termamyl120L型L(NovozymesA/S)。然后將醪液快速加熱至85℃。在該方法中，必需持續(xù)監(jiān)控并在適當(dāng)時(shí)調(diào)節(jié)pH。
到達(dá)最終溫度后，開(kāi)始加入更多粉末(開(kāi)始50g粉末)。此外，向醪液中加入0.13ml CaCl2儲(chǔ)存液以保持Ca2+濃度在70ppm。添加中，溫度持續(xù)保持在85℃。聽(tīng)任維持至少10分鐘的時(shí)間以保證在添加另一部分(50g粉末和0.13ml CaCl2儲(chǔ)存液)之前反應(yīng)完全。添加兩部分后加入1.67mlTermamyl；然后再添加兩部分(每種情況50g粉末和0.13ml CaCl2儲(chǔ)存液)。達(dá)到按重量計(jì)55％的干物質(zhì)含量。添加后將溫度升至100℃并將醪液煮沸10分鐘。
取出一份樣品并冷卻至室溫。用去離子水稀釋樣品(約1∶10)后，加入一滴濃縮的Lugol’s溶液(每升5g I和10g KI)。深藍(lán)色指出殘留的淀粉含量；當(dāng)所有淀粉已水解后顏色變?yōu)楹稚?。?dāng)測(cè)試指出仍殘余淀粉時(shí)，再次將溫度降至85℃并保持不變。加入另外1.67ml Termamyl直至碘/淀粉反應(yīng)為陰性。
然后將測(cè)試對(duì)淀粉陰性的混合物降至61℃以進(jìn)行隨后的糖化反應(yīng)。通過(guò)加入50％濃度的硫酸將pH調(diào)至4.3。反應(yīng)過(guò)程中將pH維持在該數(shù)值。溫度保持在61℃。加入5.74ml(＝按重量計(jì)酶/干物質(zhì)1.5％)的Dextrozym GA(Novozymes A/S)將液化的淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖。允許反應(yīng)進(jìn)行一小時(shí)。將混合物加熱至85℃以滅活酶。將熱混合物裝入無(wú)菌容器并在冷卻后貯存在4℃。
II.3b)黑麥粉(包括用纖維素/半纖維素預(yù)處理)將360g去離子水引入反應(yīng)容器中。將155g黑麥粉緩慢加入水中并持續(xù)攪拌。溫度保持在50℃不變。使用按重量計(jì)50％的NaOH水溶液將pH調(diào)至5.5后，加入3.21ml(＝酶/干物質(zhì)按重量計(jì)2.5％)的Viscozyme L(Novozymes A/S)。30分鐘后，開(kāi)始加入更多粉末；開(kāi)始加入55g粉末。再過(guò)30分鐘后，加入另外50g粉末；30分鐘后，再加入另外40g粉末。液化可在最后一次添加后30分鐘開(kāi)始。
加入1.7ml CaCl2儲(chǔ)存溶液(100g CaCl2×2H2O/l)。使用按重量計(jì)50％的NaOH水溶液將pH調(diào)至6.5后，加入5.0ml(＝酶/干物質(zhì)按重量計(jì)2％)的Termamyl120L型L(Novozymes A/S)。然后將醪液快速加熱至85℃。在該方法中，必需持續(xù)監(jiān)控并在適當(dāng)時(shí)調(diào)節(jié)pH。
到達(dá)最終溫度后，開(kāi)始加入更多粉末(開(kāi)始60g粉末)。此外，向醪液中加入0.13ml CaCl2儲(chǔ)存液以保持Ca2+濃度在70ppm。添加中，溫度持續(xù)保持在85℃。聽(tīng)任維持至少10分鐘的時(shí)間以保證在添加另一部分(40g粉末和0.1ml CaCl2儲(chǔ)存液)之前反應(yīng)完全。添加兩部分后添加1.1mlTermamyl；然后添加更多部分(40g粉末和0.1ml CaCl2儲(chǔ)存液)。達(dá)到按重量計(jì)55％的干物質(zhì)含量。添加后將溫度升至100℃并將醪液煮沸10分鐘。
取出一份樣品并冷卻至室溫。用去離子水稀釋樣品(約1∶10)后，加入一滴濃縮的Lugol’s溶液(每升5g I和10g KI)。深藍(lán)色指出殘留的淀粉含量；當(dāng)所有淀粉已水解后顏色變?yōu)楹稚．?dāng)測(cè)試指出仍殘余淀粉時(shí)，再次將溫度降至85℃并保持不變。加入另外1.1ml Termamyl直至碘/淀粉反應(yīng)為陰性。
然后將測(cè)試對(duì)淀粉陰性的混合物降至61℃以進(jìn)行隨后的糖化反應(yīng)。通過(guò)加入50％濃度的硫酸將pH調(diào)至4.3。反應(yīng)過(guò)程中將pH維持在該數(shù)值。溫度保持在61℃。加入5.74ml(＝按重量計(jì)酶/干物質(zhì)1.5％)的Dextrozym GA(Novozymes A/S)將液化的淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖。允許反應(yīng)進(jìn)行一小時(shí)。將混合物加熱至85℃以滅活酶。將熱混合物裝入無(wú)菌容器并在冷卻后在4℃保藏。
II.3c)小麥粉(包括用木聚糖酶預(yù)處理)將360g去離子水引入反應(yīng)容器中。將水加熱至55℃并使用按重量計(jì)50％的NaOH水溶液將pH調(diào)至6.0。調(diào)節(jié)溫度和pH后，加入3.21ml(＝酶/干物質(zhì)按重量計(jì)2.5％)Shearzyme 500L(Novozymes A/S)。將115g小麥粉緩慢加入水中并持續(xù)攪拌。溫度和pH保持不變。30分鐘后，開(kāi)始加入更多粉末；最初加入55g粉末。再過(guò)30分鐘后，加入兩外50g粉末；30分鐘后，再加入另外40g粉末。液化可在最后一次添加后30分鐘開(kāi)始。
如II.3b所述進(jìn)行液化和糖化。
III.構(gòu)建超量生產(chǎn)賴(lài)氨酸的谷氨酸棒桿菌菌株ATCC13032 lysCfbrIII.1構(gòu)建質(zhì)粒pCIS lysC在構(gòu)建菌株的第一步，在谷氨酸棒桿菌ATCC13032中進(jìn)行編碼天冬氨酸激酶(lysC)的野生型基因的等位基因替代。其中在lysC基因中進(jìn)行核苷酸替代，從而在產(chǎn)生的蛋白質(zhì)中，位置311的氨基酸蘇氨酸被異亮氨酸取代。以來(lái)自ATCC13032的染色體DNA為模板，按照制造商說(shuō)明借助于Pfu-Turbo PCR系統(tǒng)(Stratagene，USA)進(jìn)行PCR反應(yīng)，用下述寡聚核苷酸引物擴(kuò)增lysC5’-GAGAGAGAGACGCGTCCCAGTGGCTGAGACGCATC-3’(SEQ ID NO1)和5’-CTCTCTCTGTCGACGAATTCAATCTTACGGCCTG-3’(SEQ ID NO2)通過(guò)Tauch等(1995)Plasmid 33168-179或Eikmanns等(1994)Microbiology 1401817-1828的方法制備來(lái)自谷氨酸棒桿菌ATCC13032的染色體DNA。擴(kuò)增的片段5’側(cè)翼添加SaII限制性切割位點(diǎn)，3’側(cè)翼添加MluI限制性切割位點(diǎn)?？寺≈坝眠@兩種限制性?xún)?nèi)切酶消化擴(kuò)增的片段并用GFXTMPCR，DNA and Gel Band Purification Kit(AmershamPharmacia，F(xiàn)reiburg)將其純化。
將通過(guò)SalI和MluI限制性切割將產(chǎn)生的多核苷酸克隆進(jìn)pCLIK5MCS integrativ SacB，下文稱(chēng)為pCIS(SEQ ID NO3)并轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌XL-1 blue。通過(guò)在含有卡那霉素(20μg/ml)的LB瓊脂上涂板選擇含有質(zhì)粒的細(xì)胞(Lennox，1955，Virology，1190)。分離質(zhì)粒并通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證目的核苷酸序列。使用Quiagen的方法和材料制備質(zhì)粒DNA。測(cè)序反應(yīng)通過(guò)Sanger等(1977)Proceedings of the National Academy of Sciences USA745463-5467的方法進(jìn)行。通過(guò)ABI Prism 377(PE Applied Biosystems，Weiterstadt)分離測(cè)序反應(yīng)并進(jìn)行評(píng)估。產(chǎn)生的質(zhì)粒稱(chēng)為pCIS lysC(SEQID NO4)。其包含下列重要部分

III.2誘變谷氨酸棒桿菌lysC基因使用QuickChange Kit(Stratagene，USA)按照制造商說(shuō)明定向突變谷氨酸棒桿菌lysC基因。誘變?cè)谫|(zhì)粒pCIS lysC(SEQ ID NO4)中進(jìn)行。合成下列寡聚核苷酸引物用于借助Quickchange方法(Stratagene)用311異亮氨酸取代311蘇氨酸5’-CGGCACCACCGACATCATCTTCACCTGCCCTCGTTCCG-3’(SEQ ID NO5)5’-CGGAACGAGGGCAGGTGAAGATGATGTCGGTGGTGCCG-3’(SEQ ID NO6)在Quickchange反應(yīng)中使用這些寡核苷酸引物在lysC基因(SEQ IDNO7)中引起932位的核苷酸替代(用T替代C)。轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌XL-1 blue并制備質(zhì)粒后通過(guò)測(cè)序反應(yīng)驗(yàn)證產(chǎn)生的lysC基因中thr311ile的氨基酸替代。質(zhì)粒命名為pCIS lysC thr311ile(SEQ ID NO8)。其包含下列重要部分


III.3轉(zhuǎn)化pCIS lysC thr311ile進(jìn)入谷氨酸棒桿菌(菌株ATCC13032)通過(guò)如Liebl等FEMS Microbiology Letters 53299-303(1989)所述的電穿孔法將質(zhì)粒pCIS lysC thr311ile轉(zhuǎn)化進(jìn)入谷氨酸棒桿菌ATCC13032。該方案的改良形式描述于DE10046870。通過(guò)Sambrook等，《MolecularCloningA Laboratory Manual》，Cold Spring Harbor(1989)描述的Southern印跡和雜交，使用標(biāo)準(zhǔn)方法驗(yàn)證單個(gè)轉(zhuǎn)化體中l(wèi)ysC基因座的染色體排列。從而確認(rèn)轉(zhuǎn)化體為其中轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒通過(guò)同源重組整合在lysC基因座上的轉(zhuǎn)化體。這類(lèi)菌落在不含抗生素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜后，將細(xì)胞涂布在蔗糖CM瓊脂培養(yǎng)基(10％蔗糖)上并在30℃孵育24小時(shí)。
由于載體pCIS lysC thr311ile中存在的sacB基因?qū)⒄崽寝D(zhuǎn)化為有毒產(chǎn)物，只有下述菌落能夠生長(zhǎng)其中sacB基因通過(guò)野生型基因lysC和突變基因lysC thr311ile之間的又一個(gè)次同源重組步驟被刪除。同源重組時(shí)，野生型基因或突變基因均可與sacB基因一起被刪除。當(dāng)sacB基因與野生型基因一起被刪除時(shí)，產(chǎn)生突變的轉(zhuǎn)化體。
挑出生長(zhǎng)的菌落并研究其卡那霉素敏感表型。刪除了sacB的克隆必需同時(shí)顯示卡那霉素敏感的生長(zhǎng)行為。在搖瓶中研究這類(lèi)卡那霉素敏感克隆的賴(lài)氨酸生產(chǎn)力。為了比較，培養(yǎng)未處理的谷氨酸棒桿菌ATCC13032。選擇具有比對(duì)照提高的賴(lài)氨酸生產(chǎn)的克隆，獲得染色體DNA，按照制造商說(shuō)明通過(guò)PCR反應(yīng)(Pfu-Turbo PCR Systems；Stratagene，USA)擴(kuò)增lysC基因的相應(yīng)區(qū)域并測(cè)序(通過(guò)Sanger等的方法，上述引文)。具有增強(qiáng)的賴(lài)氨酸合成特性并證實(shí)位置932的lysC突變的克隆稱(chēng)為ATCC13032lysCfbr。
實(shí)施例1a)酶促淀粉液化和淀粉糖化
500g干磨的玉米粉混懸于750ml水并在攪拌器中再次細(xì)磨。將混懸液分為4個(gè)樣品編號(hào)1到4，各自用約3g熱穩(wěn)定α-淀粉酶處理(樣品編號(hào)1和2Termamyl L；樣品編號(hào)3和4Spezyme)。樣品編號(hào)2和4隨后用約7g/l葡糖淀粉酶處理(樣品編號(hào)2Dextrozyme GA；樣品編號(hào)4Optidex)。這產(chǎn)生淡黃色粘稠樣品，各通過(guò)離心分離其固體內(nèi)容物，在該方法中一層疏水固體漂浮在澄清液相上方。
產(chǎn)生樣品的(濃縮形式和10倍稀釋的)澄清上清液通過(guò)HPLC分析，忽略或考慮離心沉下的沉淀物?？紤]沉淀物時(shí)，假定50％的沉淀物干物質(zhì)含量?；谄鹗紭悠返慕Y(jié)果在下文表3中列出。
表3

b)發(fā)酵使用谷氨酸棒桿菌的搖瓶實(shí)驗(yàn)中使用根據(jù)實(shí)施例II.1獲得的兩種玉米粉水解產(chǎn)物(瓶4-9)。此外，同時(shí)使用類(lèi)似實(shí)施例II.1制備的小麥粉水解產(chǎn)物(瓶1-3)。
1b.1)制備接種物將細(xì)胞在無(wú)菌CM瓊脂(成分見(jiàn)表4；121℃20分鐘)上劃線然后在30℃孵育48小時(shí)。隨后從板上刮下細(xì)胞并重懸在鹽水中。用這樣數(shù)量的細(xì)胞懸液各自接種250ml三角瓶中的25ml培養(yǎng)基(見(jiàn)表5)從而使600nm處達(dá)到光密度OD600值為1。
表4CM瓊脂的組成

1b.2)制備發(fā)酵液表5列出瓶培養(yǎng)基1到9的組成。
表5瓶培養(yǎng)基


*用稀釋的NaOH水溶液調(diào)節(jié)**水解產(chǎn)物中的葡萄糖濃度***每升培養(yǎng)基中水解產(chǎn)物的重量接種后將瓶在30℃潮濕搖床中搖動(dòng)(200rpm)培養(yǎng)48小時(shí)。發(fā)酵結(jié)束后，通過(guò)HPLC確定糖和賴(lài)氨酸含量。使用Agilent 1100系列LC系統(tǒng)進(jìn)行HPLC。柱前用正酞己炔酯衍生化允許定量形成的氨基酸；使用AgilentHypersil AA柱分離產(chǎn)物混合物。結(jié)果在表6中列出。
表6

在所有瓶中，賴(lài)氨酸以相當(dāng)于約30到40g/l(相應(yīng)于使用葡萄糖培養(yǎng)液的標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵獲得的產(chǎn)量)的量產(chǎn)生。
實(shí)施例2發(fā)酵使用如實(shí)施例II.1中描述獲得的玉米粉水解產(chǎn)物，使用III描述的菌株ATCC13032 lysCfbr，類(lèi)似實(shí)施例1b)進(jìn)行發(fā)酵。將細(xì)胞在無(wú)菌CM瓊脂(構(gòu)成見(jiàn)表4；121℃20分鐘)上在30℃孵育48小時(shí)。隨后從板上刮下細(xì)胞并重懸在鹽水中。用這樣數(shù)量的細(xì)胞懸液各自接種250ml三角瓶中的25ml培養(yǎng)基1或2(見(jiàn)表5)從而使光密度達(dá)到610nm處OD600值為1。然后將樣品在30℃潮濕搖床(相對(duì)大氣濕度85％)中200rpm培養(yǎng)48小時(shí)。通過(guò)HPLC確定培養(yǎng)基中的賴(lài)氨酸含量。在所有情況下均產(chǎn)生約相同的賴(lài)氨酸數(shù)量。
實(shí)施例3使用谷氨酸棒桿菌(ATCC13032 lysCfbr)的搖瓶實(shí)驗(yàn)中使用根據(jù)實(shí)施例II.3a獲得的兩種玉米粉水解產(chǎn)物(瓶1+2)。此外，同時(shí)使用類(lèi)似實(shí)施例II.3制備的黑麥粉水解產(chǎn)物(瓶5+6)和小麥粉水解產(chǎn)物(瓶3+4)。
3.1)制備接種物將細(xì)胞在無(wú)菌CM+CaAc瓊脂(成分見(jiàn)表7；121℃20分鐘)上劃線然后在30℃孵育48小時(shí)，然后接種至新板并在30℃孵育過(guò)夜。隨后從板上刮下細(xì)胞并重懸在鹽水中。用這樣數(shù)量的細(xì)胞懸液各自接種裝有兩個(gè)擋板的250ml三角瓶中的23ml培養(yǎng)基(見(jiàn)表8)從而使光密度達(dá)到610nm處OD610值為0.5。
表7CM+CaAc瓊脂平板的構(gòu)成


3.2)制備發(fā)酵液表8顯示瓶培養(yǎng)基1到6的構(gòu)成。對(duì)照培養(yǎng)基中使用合適數(shù)量的葡萄糖溶液代替粉末水解產(chǎn)物。
表8瓶培養(yǎng)基


*用稀釋的NaOH水溶液調(diào)節(jié)**水解產(chǎn)物中的葡萄糖濃度***每升培養(yǎng)基中水解產(chǎn)物的量接種后將瓶在30℃潮濕搖床中搖動(dòng)(200rpm)培養(yǎng)48小時(shí)。發(fā)酵結(jié)束后，通過(guò)HPLC確定葡萄糖和賴(lài)氨酸含量。使用Agilent 1100系列LC系統(tǒng)進(jìn)行HPLC。氨基酸定量需要用正酞己炔酯衍生化，使用Agilent ZorbaxExtend C18柱進(jìn)行分離。結(jié)果在表9中列出。
表9


在所有瓶中，賴(lài)氨酸以相當(dāng)于約10到12g/l(相應(yīng)于使用葡萄糖培養(yǎng)液的標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵獲得的產(chǎn)量)的量產(chǎn)生。
3.3)分離賴(lài)氨酸為了分離賴(lài)氨酸，通常第一步從發(fā)酵液中離心分離固體。也可使用過(guò)濾方法(如膜過(guò)濾)作為離心的替代選擇。然后將現(xiàn)已不含固體的發(fā)酵液酸化(如使用硫酸)，由此賴(lài)氨酸以單或雙質(zhì)子化的形式存在。隨后將該酸化的溶液經(jīng)過(guò)陽(yáng)離子交換器從而賴(lài)氨酸結(jié)合在離子交換器上。用水洗滌后，用氨水經(jīng)過(guò)離子交換器以洗脫賴(lài)氨酸。蒸發(fā)洗脫液；隨后通過(guò)添加鹽酸將目前以游離堿形式存在于洗脫液中的賴(lài)氨酸轉(zhuǎn)化為賴(lài)氨酸鹽酸鹽并結(jié)晶析出。通過(guò)離心將晶體從晶體混懸液中分離并在最終步驟中干燥。該操作給出高純度(按重量計(jì)≥98.5％的賴(lài)氨酸*HCl)的結(jié)晶賴(lài)氨酸。該操作的詳細(xì)描述以及賴(lài)氨酸整理的其他方法可見(jiàn)于Ikeda，M.Amino AcidProduction Processes.Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology，第79卷，(2003)，1-35和Hermann，T.Industrial production of amino acids by coryneform bacteria.Journal ofBiotechnology 104(2003)，155-172。
實(shí)施例4搖瓶實(shí)驗(yàn)中使用如實(shí)施例II.3a所述獲得的兩種玉米粉水解產(chǎn)物(瓶1-3)。使用芽孢桿菌PA824(詳細(xì)描述于WO02/061108)作為產(chǎn)泛酸菌株。此外，同時(shí)使用類(lèi)似實(shí)施例II.3制備的黑麥粉水解產(chǎn)物(瓶7-9)和小麥粉水解產(chǎn)物(瓶4-6)。
4.1)制備接種物用0.4ml冰凍培養(yǎng)物各自接種裝有兩個(gè)擋板的250ml三角瓶中的42ml預(yù)培養(yǎng)物培養(yǎng)基(見(jiàn)表10)并在潮濕搖床中43℃下?lián)u動(dòng)(250rpm)培養(yǎng)24小時(shí)。
表10預(yù)培養(yǎng)物培養(yǎng)基的組成

*用稀釋的KOH水溶液調(diào)節(jié)用1ml預(yù)培養(yǎng)物各自接種裝有兩個(gè)擋板的250ml三角瓶中的42ml主要培養(yǎng)基(見(jiàn)表11)。
4.2)制備發(fā)酵液表11顯示瓶培養(yǎng)基1到9的組成。對(duì)照培養(yǎng)基中使用合適數(shù)量的葡萄糖溶液代替粉末水解產(chǎn)物。
表11瓶培養(yǎng)基

*用稀釋的NaOH水溶液調(diào)節(jié)**水解產(chǎn)物中的葡萄糖濃度***每升培養(yǎng)基中水解產(chǎn)物的量接種后將瓶在潮濕搖床中43℃下?lián)u動(dòng)(250rpm)培養(yǎng)24小時(shí)。發(fā)酵結(jié)束后，通過(guò)HPLC確定葡萄糖和泛酸含量。借助于來(lái)自Bio-Rad的AminexHPX-87H柱測(cè)定葡萄糖。泛酸濃度通過(guò)在來(lái)自Phenomenex的Aqua C18-柱上分離測(cè)定。結(jié)果在表12中列出。
表12

在所有瓶中，賴(lài)氨酸以相對(duì)于約1.5到2g/l(相應(yīng)于使用葡萄糖培養(yǎng)液的標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵獲得的產(chǎn)量)的量產(chǎn)生。
可例如如WO02/24001，WO02/072857和WO05/028659所述整理產(chǎn)物。
實(shí)施例5使用黑曲霉的搖瓶實(shí)驗(yàn)中使用如實(shí)施例II.3a所述獲得的玉米粉水解產(chǎn)物(瓶1-3)。此外，同時(shí)使用類(lèi)似實(shí)施例II.3制備的黑麥粉水解產(chǎn)物(瓶7-9)和小麥粉水解產(chǎn)物(瓶4-6)。
5.1)菌株類(lèi)似于制備N(xiāo)P505-7(詳細(xì)描述于WO98/46772)制備帶有g(shù)laA啟動(dòng)子控制下的無(wú)花果曲霉(Aspergillus ficuum)phyA基因的6個(gè)拷貝的黑曲霉產(chǎn)植酸酶菌株。使用帶有3個(gè)修飾的glaA擴(kuò)增子(類(lèi)似于ISO505)而不帶有整合的phyA表達(dá)盒的菌株作為對(duì)照。
5.2)制備接種物用100μl冰凍培養(yǎng)物各自接種裝有一個(gè)擋板的100ml三角瓶中的20ml預(yù)培養(yǎng)物培養(yǎng)基(見(jiàn)表13)并在潮濕搖床中34℃下?lián)u動(dòng)(170rpm)培養(yǎng)24小時(shí)。
表13預(yù)培養(yǎng)物培養(yǎng)基的組成

*用稀釋的硫酸調(diào)節(jié)用5ml預(yù)培養(yǎng)物各自接種裝有一個(gè)擋板的250ml三角瓶中的50ml主要培養(yǎng)基(見(jiàn)表14)。
5.3)制備發(fā)酵液表14顯示瓶培養(yǎng)基1到9的構(gòu)成。對(duì)照培養(yǎng)基中使用合適數(shù)量的葡萄糖溶液代替粉末水解產(chǎn)物。
表14瓶培養(yǎng)基


*用稀釋的硫酸調(diào)節(jié)**水解產(chǎn)物中的葡萄糖濃度***每升培養(yǎng)基中水解產(chǎn)物的量接種后將瓶在潮濕搖床中34℃下?lián)u動(dòng)(170rpm)培養(yǎng)6天。發(fā)酵結(jié)束后，借助于測(cè)定法確定植酸酶活性。發(fā)酵結(jié)束后，使用植酸作為底物在合適的植酸酶活性水平(標(biāo)準(zhǔn)0.6 U/ml)下、250 mM醋酸/醋酸鈉/吐溫20，pH5.5緩沖液中確定植酸酶活性。標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)定以便在微孔滴定板(MTP)上使用。將10μl酶溶液與140μl 6.49mM植酸鹽溶液在250mM醋酸鈉緩沖液，pH5.5中混和(植酸鹽植酸十二鈉鹽)。在37℃孵育一小時(shí)后，通過(guò)加入等體積(150μl)三氯乙酸終止反應(yīng)。將該混合物的等分式樣轉(zhuǎn)移至280μl含有0.32N H2SO4，按重量計(jì)0.27％鉬酸銨和按重量計(jì)1.08％抗壞血酸的溶液中。隨后在50℃孵育25分鐘。在820nm處測(cè)量藍(lán)色溶液的吸光度。結(jié)果在表15中列出。
表15

*)FTU＝福爾馬肼(formazine)濁度單位可如WO98/55599所述整理產(chǎn)物。
實(shí)施例6使用棉阿舒囊霉的搖瓶實(shí)驗(yàn)中使用如實(shí)施例II.3a所述獲得的玉米粉水解產(chǎn)物(瓶1-4)。此外，同時(shí)使用類(lèi)似實(shí)施例II.3制備的黑麥粉水解產(chǎn)物(瓶9-12)和小麥粉水解產(chǎn)物(瓶5-8)。
6.1)菌株使用的產(chǎn)核黃素菌株為棉阿舒囊霉ATCC 10895(參閱Schmidt G.等，Inhibition of purified isocitrate lyase identified itaconate and oxalateas potential antimetabolites for the riboflavin overproducer Ashbyagossypii.Microbiology 142411-417，1996)。
6.2)制備接種物將細(xì)胞在無(wú)菌的HMG瓊脂(構(gòu)成見(jiàn)表16；121℃20分鐘)上劃線然后在28℃孵育72小時(shí)。
表16HMG瓊脂平板的構(gòu)成

隨后用一滿環(huán)細(xì)胞各自接種裝有兩個(gè)擋板的250ml三角瓶中的50ml預(yù)培養(yǎng)物培養(yǎng)基(見(jiàn)表17)并在潮濕搖床中28℃下?lián)u動(dòng)(180rpm)培養(yǎng)24小時(shí)。
表17預(yù)培養(yǎng)物培養(yǎng)基的構(gòu)成

*用稀釋的NaOH水溶液調(diào)節(jié)用5ml預(yù)培養(yǎng)物各自接種裝有兩個(gè)擋板的250ml三角瓶中的50ml主要培養(yǎng)基(見(jiàn)表18)。
6.3)制備發(fā)酵液表18顯示瓶培養(yǎng)基1到12的構(gòu)成。對(duì)照培養(yǎng)基中使用合適數(shù)量的葡萄糖溶液代替粉末水解產(chǎn)物。
表18瓶培養(yǎng)基


*用稀釋的NaOH水溶液調(diào)節(jié)**水解產(chǎn)物中的葡萄糖濃度***每升培養(yǎng)基中水解產(chǎn)物的量接種后將瓶在潮濕搖床中28℃下?lián)u動(dòng)(180rpm)培養(yǎng)6天。發(fā)酵結(jié)束后，通過(guò)HPLC確定維生素B2含量。結(jié)果在表19中列出。
表19

可如EP00345717所述整理產(chǎn)物。
實(shí)施例7使用谷氨酸棒桿菌的搖瓶實(shí)驗(yàn)中使用如實(shí)施例II.3a所述獲得的玉米粉水解產(chǎn)物(瓶1-3)。此外，同時(shí)使用類(lèi)似實(shí)施例II.3制備的黑麥粉水解產(chǎn)物(瓶7-9)和小麥粉水解產(chǎn)物(瓶4-6)。
7.1)菌株技術(shù)人員知道產(chǎn)生甲硫氨酸的棒狀桿菌菌株。這類(lèi)菌株的制備描述于例如Kumar D.Gomes J.Biotechnology Advances，23(1)41-61，2005；Kumar D.等Process Biochemistry，381165-1171，2003；WO04/024933和WO02/18613。
7.2)制備接種物將細(xì)胞在無(wú)菌CM+Kan瓊脂(成分見(jiàn)表20；121℃20分鐘)上劃線然后在30℃孵育24小時(shí)。隨后從板上刮下細(xì)胞并重懸在鹽水中。用這樣數(shù)量的細(xì)胞懸液各自接種裝有兩個(gè)擋板的250ml三角瓶中的35ml培養(yǎng)基(見(jiàn)表5)從而使光密度達(dá)到610nm處OD610值為0.5。
表20CM+Kan瓊脂平板的構(gòu)成

7.3)制備發(fā)酵液表21顯示瓶培養(yǎng)基1到9的構(gòu)成。對(duì)照培養(yǎng)基中使用合適數(shù)量的葡萄糖溶液代替粉末水解產(chǎn)物。
表21瓶培養(yǎng)基



*用稀釋的NaOH水溶液調(diào)節(jié)**水解產(chǎn)物中的葡萄糖濃度***每升培養(yǎng)基中水解產(chǎn)物的量接種后將瓶在潮濕搖床中30℃下?lián)u動(dòng)(200rpm)培養(yǎng)直至葡萄糖耗盡。發(fā)酵結(jié)束后，通過(guò)HPLC確定甲硫氨酸含量(柱Agilent ZORBAXEclipse AAA；Method It.Eclipse AAA protocol，Technical Note5980-1193)。結(jié)果在表22中列出。
表22


可如例如WO05/007862和之前的申請(qǐng)DE10359668.2所述整理產(chǎn)物。
實(shí)施例8使用細(xì)菌130Z的搖瓶實(shí)驗(yàn)中使用如實(shí)施例II.3a所述獲得的玉米粉水解產(chǎn)物。
8.1)菌株使用細(xì)菌130Z(ATCC No.55618)作為產(chǎn)琥珀酸菌株。
8.2)制備發(fā)酵液用1ml冰凍培養(yǎng)物各自接種裝有兩個(gè)擋板的120ml血清瓶中的50ml主要培養(yǎng)基(見(jiàn)表23)。密封血清瓶前注入CO2(0.7bar)。
表23列出培養(yǎng)基的組成(參照US5,504,004)。對(duì)照培養(yǎng)基中使用相應(yīng)數(shù)量的葡萄糖溶液代替粉末水解產(chǎn)物(葡萄糖終濃度100g/l)。
表23培養(yǎng)基*

*CO2/N2大氣下，也包括灌注瓶時(shí)**水解產(chǎn)物中的葡萄糖濃度***每升培養(yǎng)基中水解產(chǎn)物的量接種后將瓶在潮濕搖床中37℃下?lián)u動(dòng)(200rpm)培養(yǎng)46小時(shí)。發(fā)酵結(jié)束后，通過(guò)HPLC確定葡萄糖和琥珀酸含量。測(cè)定借助于來(lái)自Bio-Rad的Aminex HPX-87H柱進(jìn)行。結(jié)果在表24中列出。
表24

實(shí)施例9使用大腸桿菌的搖瓶實(shí)驗(yàn)中使用如實(shí)施例II.3a所述獲得的玉米粉水解產(chǎn)物(瓶1-3)。此外，同時(shí)使用類(lèi)似實(shí)施例II.3制備的黑麥粉水解產(chǎn)物(瓶7-9)和小麥粉水解產(chǎn)物(瓶4-6)。
9.1)菌株本領(lǐng)域技術(shù)人員公知產(chǎn)生L-蘇氨酸的大腸桿菌菌株。這類(lèi)菌株的制備描述于例如EP1013765，A1、EP1016710 A2、US5,538,873。
9.2)制備接種物將細(xì)胞在無(wú)菌LB瓊脂上劃線。如果存在合適的抗性基因作為所述菌株的標(biāo)記物，向LB瓊脂中加入抗生素。例如可為此目的加入卡那霉素(40μg/ml)或氨芐青霉素(100mg/l)。將菌株在30℃下孵育24小時(shí)。隨后從扳上刮下細(xì)胞并重懸在鹽水中。用這樣數(shù)量的細(xì)胞懸液各自接種裝有兩個(gè)擋板的250ml三角瓶中的25ml培養(yǎng)基(見(jiàn)表25)從而使光密度達(dá)到610nm處OD610值為0.5。
9.3)制備發(fā)酵液表25顯示瓶1到9培養(yǎng)基的組成。對(duì)照培養(yǎng)基中使用合適數(shù)量的葡萄糖溶液代替粉末水解產(chǎn)物。
表25瓶培養(yǎng)基

*用稀釋的NaOH水溶液調(diào)節(jié)**水解產(chǎn)物中的葡萄糖濃度***每升培養(yǎng)基中水解產(chǎn)物的量接種后將瓶在潮濕搖床中30℃下?lián)u動(dòng)(200rpm)培養(yǎng)直至葡萄糖耗盡。發(fā)酵結(jié)束后通過(guò)Lindroth等，Analytical Chemistry 511167-1174，1979所述反向HPLC確定L-蘇氨酸含量。
之后，收集發(fā)酵液并分離、純化或以其他方式整理發(fā)酵液中存在的L-蘇氨酸，如US5,538,873和Okamoto等，Bioscience，Biotechnology andBiochemistry 61(11)，1877-1882，1997所述。
實(shí)施例10其他L-氨基酸谷氨酸、賴(lài)氨酸、組氨酸、脯氨酸和精氨酸通過(guò)使用合適的菌株類(lèi)似于實(shí)施例9中描述的操作產(chǎn)生。所述菌株描述于例如EP1016710。
實(shí)施例11使用11.2)所述產(chǎn)賴(lài)氨酸的谷氨酸棒桿菌的搖瓶實(shí)驗(yàn)中使用類(lèi)似實(shí)施例II.3獲得的木薯粉水解產(chǎn)物(瓶1-4)。使用的粉末具有如下大小分布45％＜100μm、56％＜200μm、79％＜630μm。
甚至在液化步驟開(kāi)始，混懸液的粘度相對(duì)較高從而最初使用的木薯粉數(shù)量相應(yīng)于按重量計(jì)35％的干物質(zhì)含量。然后合適地添加更多粉末以達(dá)到最終按重量計(jì)55％的干物質(zhì)含量。在整個(gè)液化和糖化過(guò)程中混懸液的粘度保持相對(duì)較高。另外，木薯粉具有結(jié)團(tuán)的傾向；在該方法過(guò)程中，團(tuán)塊只溶解到某種程度。在碘-淀粉測(cè)試中，存在的團(tuán)塊在幾分鐘后被染成深藍(lán)；這提示盡管重復(fù)煮沸和延長(zhǎng)等待時(shí)間，結(jié)團(tuán)的淀粉仍未完全轉(zhuǎn)化。
11.1)菌株使用III.所述具有解除反饋調(diào)節(jié)的天冬氨酸激酶ATCC13032 lysCfbr的修飾的野生型。
11.2)制備接種物將細(xì)胞在無(wú)菌CM+CaAc瓊脂(成分見(jiàn)表26；121℃20分鐘)上劃線然后在30℃孵育24小時(shí)。隨后從板上刮下細(xì)胞并重懸在鹽水中。用這樣數(shù)量的細(xì)胞懸液各自接種裝有兩個(gè)擋板的250ml三角瓶中的23ml培養(yǎng)基(見(jiàn)表27)從而使光密度達(dá)到610nm處OD610值為0.5。
表26CM+CaAc瓊脂平板的組成


11.3)制備發(fā)酵液表27顯示瓶培養(yǎng)基的組成。對(duì)照培養(yǎng)基中使用合適數(shù)量的葡萄糖溶液代替粉末水解產(chǎn)物。
表27瓶培養(yǎng)基


*用稀釋的NaOH水溶液調(diào)節(jié)**水解產(chǎn)物中的葡萄糖濃度***每升培養(yǎng)基中水解產(chǎn)物的量接種后將瓶在潮濕搖床中30℃下?lián)u動(dòng)(200rpm)培養(yǎng)48小時(shí)。發(fā)酵結(jié)束后，通過(guò)HPLC確定葡萄糖和賴(lài)氨酸含量。使用Agilent 1100系列LC系統(tǒng)進(jìn)行HPLC分析。借助于來(lái)自Bio-Rad的Aminex HPX-87H柱測(cè)定葡萄糖。通過(guò)在Agilent 1100系列LC系統(tǒng)中進(jìn)行高壓液相層析確定氨基酸濃度。使用正酞己炔酯的柱前衍生化允許定量形成的氨基酸；從Hypersil AA柱(Agilent)上分離氨基酸混合物。結(jié)果列在表28中。
表28

在所有瓶中，賴(lài)氨酸以相當(dāng)于約10到14g/l(對(duì)應(yīng)使用葡萄糖培養(yǎng)液的標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵獲得的產(chǎn)量)的量產(chǎn)生。
實(shí)施例12在使用米曲霉的搖瓶實(shí)驗(yàn)中使用部分糖化的玉米粉水解產(chǎn)物。
12.1)液化和(部分)糖化類(lèi)似實(shí)施例II.3a進(jìn)行液化。將混懸液冷卻到61℃并將pH調(diào)節(jié)到4.3之后，加入5.38ml(＝按重量計(jì)1.5％的酶/干物質(zhì))Dextrozyme GA(Novozymes A/S)。添加酶后每10、15、20、30、45和60分鐘后取出50g樣品并混懸于25ml無(wú)菌、冰冷的完全軟化水中。將樣品置于冰浴中并立刻用于瓶測(cè)試中。沒(méi)有發(fā)生酶的失活。
12.2)發(fā)酵使用實(shí)施例5.1)中使用的菌株。如實(shí)施例5.2所述制備接種物。
使用表29所列的瓶培養(yǎng)基組成制備發(fā)酵液。每個(gè)樣品用于兩瓶。
表29瓶培養(yǎng)基


*用稀釋的硫酸調(diào)節(jié)***每升培養(yǎng)基中部分糖化的水解產(chǎn)物量接種后將瓶在潮濕搖床中34℃下?lián)u動(dòng)(170rpm)培養(yǎng)6天。發(fā)酵結(jié)束后，借助于測(cè)定法(如實(shí)施例5.3中描述)確定植酸酶活性。結(jié)果在表30中列出。
表30

實(shí)施例13
在使用谷氨酸棒桿菌的搖瓶實(shí)驗(yàn)中使用部分糖化的玉米粉水解產(chǎn)物。
13.1)液化和(部分)糖化類(lèi)似實(shí)施例II.3a進(jìn)行液化。將混懸液冷卻到61℃并將pH調(diào)節(jié)到4.3之后，加入5.38ml(＝按重量計(jì)1.5％的酶/干物質(zhì))Dextrozyme GA(Novozymes A/S)。添加酶后每10、15、20、30、45和60分鐘后取出50g樣品并混懸于25ml無(wú)菌、冰冷的完全軟化水中。將樣品置于冰浴中并立刻用于瓶測(cè)試中。沒(méi)有發(fā)生酶的失活。
13.2)發(fā)酵使用實(shí)施例3)中使用的菌株。如實(shí)施例3.1)所述制備接種物。
使用表31所列的瓶培養(yǎng)基組成制備發(fā)酵液。每個(gè)樣品用于三瓶。
表31瓶培養(yǎng)基


*用稀釋的NaOH水溶液調(diào)節(jié)***每升培養(yǎng)基中水解產(chǎn)物的量接種后將瓶在潮濕搖床中30℃下?lián)u動(dòng)(200rpm)培養(yǎng)48小時(shí)。發(fā)酵結(jié)束后，通過(guò)HPLC確定葡萄糖和賴(lài)氨酸含量。HPLC分析使用Agilent 1100系列LC體系進(jìn)行。借助于來(lái)自Bio-Rad的Aminex HPX-87H柱測(cè)定葡萄糖。通過(guò)在Agilent 1100系列LC體系上進(jìn)行高壓液相層析測(cè)定氨基酸濃度。柱前用正酞己炔酯衍生化允許定量形成的氨基酸；使用AgilentHypersil AA柱(Agilent)分離產(chǎn)物混合物。結(jié)果在表32中列出。
表32

實(shí)施例14在類(lèi)似實(shí)施例3進(jìn)行的產(chǎn)生賴(lài)氨酸的發(fā)酵中，從步驟c)的發(fā)酵液中取出賴(lài)氨酸后作為干燥的發(fā)酵殘?jiān)@得蛋白質(zhì)組合物。表33列出組合物的主要成分及其重量，并將它們與傳統(tǒng)DDGS組合物比較。
表33基于干物質(zhì)重量百分比的分析結(jié)果**


*根據(jù)National Research Council(NRC)，Nutrient Requirements forDairy Cattle，第七修訂版，National Academy Press，2001(或SpiehsM.J.，Whitney M.H.和Shurson G.CNutrient database for distiller’sdried grains with solubles produced from new ethanol plants inMinnesota and South Dakota，Journal of Animal Science 80，2002，2639-2645)的DDGS(可溶性蒸餾器干燥谷物，生物醇產(chǎn)生的次級(jí)產(chǎn)物)**提到的參數(shù)和所需的分析方法為技術(shù)人員公知。
序列表<110>巴斯福股份公司<120>精細(xì)化學(xué)品的發(fā)酵產(chǎn)生<130>M/44156<160>8<170>PatentIn版本3.1<210>1<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>1gagagagaga cgcgtcccag tggctgagac gcatc35<210>2<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>2ctctctctgt cgacgaattc aatcttacgg cctg 34<210>3<211>4327<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>質(zhì)粒pCIS<400>3tcgagaggcc tgacgtcggg cccggtacca cgcgtcatat gactagttcg gacctaggga 60tatcgtcgac atcgatgctc ttctgcgtta attaacaatt gggatcctct agacccggga120tttaaatgat ccgctagcgg gctgctaaag gaagcggaac acgtagaaag ccagtccgca180gaaacggtgc tgaccccgga tgaatgtcag ctactgggct atctggacaa gggaaaacgc240aagcgcaaag agaaagcagg tagcttgcag tgggcttaca tggcgatagc tagactgggc300ggttttatgg acagcaagcg aaccggaatt gccagctggg gcgccctctg gtaaggttgg360gaagccctgc aaagtaaact ggatggcttt cttgccgcca aggatctgat ggcgcagggg420atcaagatct gatcaagaga caggatgagg atcgtttcgc atgattgaac aagatggatt480gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc ggctatgact gggcacaaca540gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct600ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg caggacgagg cagcgcggct660
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<220>
<223>質(zhì)粒pCIS lysC<400>4cccggtacca cgcgtcccag tggctgagac gcatccgcta aagccccagg aaccctgtgc 60agaaagaaaa cactcctctg gctaggtaga cacagtttat aaaggtagag ttgagcgggt120aactgtcagc acgtagatcg aaaggtgcac aaaggtggcc ctggtcgtac agaaatatgg180cggttcctcg cttgagagtg cggaacgcat tagaaacgtc gctgaacgga tcgttgccac240caagaaggct ggaaatgatg tcgtggttgt ctgctccgca atgggagaca ccacggatga300acttctagaa cttgcagcgg cagtgaatcc cgttccgcca gctcgtgaaa tggatatgct360cctgactgct ggtgagcgta tttctaacgc tctcgtcgcc atggctattg agtcccttgg420cgcagaagcc caatctttca cgggctctca ggctggtgtg ctcaccaccg agcgccacgg480aaacgcacgc attgttgatg tcactccagg tcgtgtgcgt gaagcactcg atgagggcaa540gatctgcatt gttgctggtt tccagggtgt taataaagaa acccgcgatg tcaccacgtt600gggtcgtggt ggttctgaca ccactgcagt tgcgttggca gctgctttga acgctgatgt660gtgtgagatt tactcggacg ttgacggtgt gtataccgct gacccgcgca tcgttcctaa720tgcacagaag ctggaaaagc tcagcttcga agaaatgctg gaacttgctg ctgttggctc780caagattttg gtgctgcgca gtgttgaata cgctcgtgca ttcaatgtgc cacttcgcgt840acgctcgtct tatagtaatg atcccggcac tttgattgcc ggctctatgg aggatattcc900tgtggaagaa gcagtcctta ccggtgtcgc aaccgacaag tccgaagcca aagtaaccgt960tctgggtatt tccgataagc caggcgaggc tgcgaaggtt ttccgtgcgt tggctgatgc 1020agaaatcaac attgacatgg ttctgcagaa cgtctcttct gtagaagacg gcaccaccga 1080
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<223>PCR引物<400>5
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<223>PCR引物<400>6cggaacgagg gcaggtgaag atgatgtcgg tggtgccg 38<210>7<211>1266<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)<400>7gtggccctgg tcgtacagaa atatggcggt tcctcgcttg agagtgcgga acgcattaga 60aacgtcgctg aacggatcgt tgccaccaag aaggctggaa atgatgtcgt ggttgtctgc120tccgcaatgg gagacaccac ggatgaactt ctagaacttg cagcggcagt gaatcccgtt180ccgccagctc gtgaaatgga tatgctcctg actgctggtg agcgtatttc taacgctctc240gtcgccatgg ctattgagtc ccttggcgca gaagcccaat ctttcacggg ctctcaggct300ggtgtgctca ccaccgagcg ccacggaaac gcacgcattg ttgatgtcac tccaggtcgt360
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<223>質(zhì)粒pCIS lysC thr311ile<400>8cccggtacca cgcgtcccag tggctgagac gcatccgcta aagccccagg aaccctgtgc 60agaaagaaaa cactcctctg gctaggtaga cacagtttat aaaggtagag ttgagcgggt120aactgtcagc acgtagatcg aaaggtgcac aaaggtggcc ctggtcgtac agaaatatgg180cggttcctcg cttgagagtg cggaacgcat tagaaacgtc gctgaacgga tcgttgccac240caagaaggct ggaaatgatg tcgtggttgt ctgctccgca atgggagaca ccacggatga300acttctagaa cttgcagcgg cagtgaatcc cgttccgcca gctcgtgaaa tggatatgct360cctgactgct ggtgagcgta tttctaacgc tctcgtcgcc atggctattg agtcccttgg420cgcagaagcc caatctttca cgggctctca ggctggtgtg ctcaccaccg agcgccacgg480aaacgcacgc attgttgatg tcactccagg tcgtgtgcgt gaagcactcg atgagggcaa540gatctgcatt gttgctggtt tccagggtgt taataaagaa acccgcgatg tcaccacgtt600gggtcgtggt ggttctgaca ccactgcagt tgcgttggca gctgctttga acgctgatgt660gtgtgagatt tactcggacg ttgacggtgt gtataccgct gacccgcgca tcgttcctaa720tgcacagaag ctggaaaagc tcagcttcga agaaatgctg gaacttgctg ctgttggctc780caagattttg gtgctgcgca gtgttgaata cgctcgtgca ttcaatgtgc cacttcgcgt840acgctcgtct tatagtaatg atcccggcac tttgattgcc ggctctatgg aggatattcc900tgtggaagaa gcagtcctta ccggtgtcgc aaccgacaag tccgaagcca aagtaaccgt960tctgggtatt tccgataagc caggcgaggc tgcgaaggtt ttccgtgcgt tggctgatgc 1020agaaatcaac attgacatgg ttctgcagaa cgtctcttct gtagaagacg gcaccaccga 1080catcatcttc acctgccctc gttccgacgg ccgccgcgcg atggagatct tgaagaagct 1140tcaggttcag ggcaactgga ccaatgtgct ttacgacgac caggtcggca aagtctccct 1200
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權(quán)利要求
1.通過(guò)基于糖的微生物發(fā)酵的方法產(chǎn)生至少一種微生物代謝物的方法，所述代謝物具有至少3個(gè)碳原子或至少2個(gè)碳原子和至少一個(gè)氮原子，所述方法包括a)從淀粉原料中制備單糖含量按重量計(jì)大于20％的含糖液體培養(yǎng)基，含糖液體培養(yǎng)基還含有淀粉原料的非淀粉固體成分；b)發(fā)酵含糖液體培養(yǎng)基以制備代謝物；并c)從發(fā)酵液中排出或分離至少一種代謝物，其包括用含糖液體培養(yǎng)基培養(yǎng)產(chǎn)生目的代謝物的微生物菌株，所述液體培養(yǎng)基獲得自a1)研磨淀粉原料；和a2)將研磨料液化在含有至少一種淀粉液化酶的水性液體中，然后使用至少一種糖化酶糖化，其中至少一些研磨料通過(guò)連續(xù)或分批添加至水性液體中而被液化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中含糖液體培養(yǎng)基包含總的淀粉來(lái)源非淀粉固體成分按重量計(jì)的至少20％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中至少一種淀粉液化酶選自α-淀粉酶且至少一種糖化酶選自淀粉糖化酶。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中使用谷物顆粒作為淀粉原料。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中谷物選自玉米、黑麥、小黑麥和玉米顆粒。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中步驟a1)中粉碎獲得的研磨料包含按重量計(jì)至少50％的具有大于100μm顆粒大小的粉末顆粒。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中步驟a2)中的研磨料液化和糖化以下述方式進(jìn)行液體培養(yǎng)基的粘度總計(jì)不超過(guò)20Pas。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中液化時(shí)添加的研磨料總量中按重量計(jì)至少25％在高于研磨料中存在的淀粉的膠凝溫度下添加。
9.根據(jù)權(quán)利要求3到8中任一項(xiàng)的方法，其中在步驟a2)中所述至少一種α-淀粉酶的部分在液化時(shí)添加進(jìn)水性液體。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中獲得具有按重量計(jì)大于40％單糖含量的含糖液體培養(yǎng)基。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中至少一種植酸酶在發(fā)酵步驟b)之前添加進(jìn)含糖液體培養(yǎng)基。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中產(chǎn)生的代謝物選自非揮發(fā)性物質(zhì)。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中產(chǎn)生的代謝物選自任選地連有羥基基團(tuán)和具有3到10個(gè)碳原子的有機(jī)單、雙和三羧酸，如成蛋白質(zhì)和非成蛋白質(zhì)氨基酸、嘌呤堿基、嘧啶堿基、核苷、核苷酸、脂質(zhì)、飽和和不飽和脂肪酸、具有優(yōu)選3到10個(gè)碳原子的二醇、具有3個(gè)或更多羥基基團(tuán)的較高功能性醇、具有至少4個(gè)碳原子的長(zhǎng)鏈醇、碳水化合物、芳香族化合物、維生素、維生素原、輔因子、營(yíng)養(yǎng)品、蛋白質(zhì)、類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)、具有3到10個(gè)碳原子的酮、內(nèi)酯、生物多聚體和環(huán)糊精。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中產(chǎn)生的代謝物選自酶、氨基酸、維生素、二糖、具有3到10個(gè)碳原子的脂肪族單羧酸和雙羧酸、具有3到10個(gè)碳原子的脂肪族羥基羧酸、具有3到10個(gè)碳原子的酮、具有4到10個(gè)碳原子的鏈烷醇、具有3到8個(gè)碳原子的鏈烷二醇和多羥基鏈烷酸酯。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中使用的微生物選自能夠產(chǎn)生至少一種下述代謝物的天然或重組的微生物，所述代謝物為酶、氨基酸、維生素、二糖、具有3到10個(gè)碳原子的脂肪族單羧酸和雙羧酸、具有3到10個(gè)碳原子的脂肪族羥基羧酸、具有3到10個(gè)碳原子的酮、具有4到10個(gè)碳原子的鏈烷醇、具有3到8個(gè)碳原子的鏈烷二醇和多羥基鏈烷酸酯。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中微生物選自棒桿菌屬、芽孢桿菌屬、阿舒囊霉、埃希氏菌、曲霉、產(chǎn)堿菌屬、放線桿菌、厭氧螺菌、乳酸桿菌屬、丙酸菌和梭狀芽孢桿菌，特別是選自谷氨酸棒桿菌、枯草芽孢桿菌、棉阿舒囊霉、大腸桿菌、黑曲霉或肥大產(chǎn)堿桿菌、產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌、丁二酸放線桿菌、德式乳酸桿菌、萊氏乳桿菌、阿拉伯糖丙酸桿菌、謝氏丙酸桿菌、費(fèi)氏丙酸桿菌、丙酸梭菌和丙酮丁醇梭菌菌株。
17.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中通過(guò)離子交換層析從步驟c)中描述的發(fā)酵液中取出或分離代謝物。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中代謝物選擇性結(jié)合在離子交換器上，適當(dāng)時(shí)在洗脫產(chǎn)物之前洗滌離子交換器。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或18的方法，其中帶有固體的發(fā)酵液逆重力流入離子交換器。
20.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中(i)從步驟a)獲得的含糖液體培養(yǎng)基中去除按重量計(jì)不多于50％的部分(其包含淀粉原料的非淀粉固體組分)并用剩余物進(jìn)行如b)中所述的發(fā)酵以產(chǎn)生第一代謝物(A)；和(ii)將所有或一些淀粉原料的非淀粉固體組分從該部分中分離并用該部分進(jìn)行如b)所述的發(fā)酵以產(chǎn)生第二代謝物(B)，其與代謝物(A)一致或不同。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中(ii)的非淀粉固體成分分離以如下方式進(jìn)行含糖液體殘留物的固體含量總計(jì)按重量計(jì)不超過(guò)50％。
22.根據(jù)權(quán)利要求20到21的方法，其中代謝物(B)選自植酸酶、核黃素、泛酸和多羥基鏈烷酸酯。
23.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中取出或分離根據(jù)步驟c)的代謝物后，在某種程度上去除發(fā)酵液的揮發(fā)性成分，產(chǎn)生固體或半固體蛋白質(zhì)組合物。
24.蛋白質(zhì)組合物，其可通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求23的方法獲得。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的蛋白質(zhì)組合物，主要包含下列干物質(zhì)成分a)按重量計(jì)1％到90％的來(lái)自發(fā)酵的生物量；b)按重量計(jì)1％到90％的淀粉來(lái)源的非淀粉組分；c)按重量計(jì)0.01％到10％的具有至少3個(gè)碳原子或至少2個(gè)碳原子和至少一個(gè)N原子的微生物代謝物；d)按重量計(jì)0到90％的常規(guī)配制輔料；和e)按重量計(jì)0到40％的發(fā)酵液的不可代謝的其他組分其中組分a)到e)總計(jì)達(dá)干物質(zhì)重量的100％。
26.根據(jù)權(quán)利要求24或25的蛋白質(zhì)組合物，其具有基于蛋白質(zhì)組合物干物質(zhì)按重量計(jì)40％到90％范圍內(nèi)的粗蛋白含量。
27.根據(jù)權(quán)利要求24到26中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)組合物，其特征是具有來(lái)自賴(lài)氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸和色氨酸的至少一種主要氨基酸。
28.權(quán)利要求1到22中任一項(xiàng)定義的含糖液體培養(yǎng)基在發(fā)酵產(chǎn)生具有至少3個(gè)碳原子或具有至少2個(gè)碳原子和至少1個(gè)氮原子的微生物代謝物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過(guò)基于糖的微生物發(fā)酵的方法產(chǎn)生至少一種微生物代謝物的方法，所述代謝物具有至少3個(gè)碳原子或至少2個(gè)碳原子和至少一個(gè)氮原子，所述方法包括a)從淀粉原料中制備單糖含量按重量計(jì)大于20％的含糖液體培養(yǎng)基，含糖液體培養(yǎng)基還含有淀粉原料的非淀粉固體成分；b)發(fā)酵含糖液體培養(yǎng)基以制備代謝物；和c)從發(fā)酵液中排出或分離至少一種代謝物，其中產(chǎn)生目的代謝物的微生物菌株使用含糖液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，所述液體培養(yǎng)基獲得自a1)研磨淀粉原料；和a2)將研磨料液化在含有至少一種淀粉液化酶的水性液體中，然后使用至少一種糖化酶糖化，其中至少一些研磨料通過(guò)連續(xù)或分批添加至水性液體中而被液化。
文檔編號(hào)C12P13/08GK1981045SQ200580022451
公開(kāi)日2007年6月13日 申請(qǐng)日期2005年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月28日
發(fā)明者M·蓬佩尤斯, S·弗里爾, M·洛沙德伊特, O·策爾德?tīng)? M·博伊 申請(qǐng)人:巴斯福股份公司