專利名稱：通過發(fā)酵的酸產(chǎn)生的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過將含CO的底物進行微生物發(fā)酵產(chǎn)生乳酸。
背景技術(shù)：
乳酸是一種具有多種應用的平臺化合物。在過去的十年中，乳酸已在洗滌行業(yè)中獲得了重要性。乳酸具有除垢以及抗細菌性質(zhì)，因此已被用作有益環(huán)境的清潔產(chǎn)品。此外，乳酸是用于一些生物可降解的聚合物(如聚乙酸)的前體。由于低二氧化碳排放，這些類型的塑料可提供替代由石油生產(chǎn)的常規(guī)塑料的良好選擇。其他應用包括乳酸酯的前體，其可替代石油化學衍生的溶劑。乳酸通常通過發(fā)酵碳水化合物(如葡萄糖、果糖和蔗糖)來產(chǎn)生。雖然也使用其他細菌甚至酵母，但是最重要的市售乳酸發(fā)酵菌屬是乳桿菌屬(Lactobacillus)。在這類發(fā)酵 中，通過糖酵解作用產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸再經(jīng)還原形成乳酸。這些碳水化合物原料的成本受其作為人類食物或動物飼料的價值影響。例如，用于乳酸生產(chǎn)的產(chǎn)淀粉或蔗糖的作物的栽培不是在所有地理條件下均為在經(jīng)濟上可持續(xù)的。因此，人們對于開發(fā)將低成本的和/或更豐富的碳源轉(zhuǎn)化成乳酸的技術(shù)有興趣。一氧化碳(CO)是有機材料(如煤或石油和石油衍生產(chǎn)物)不完全燃燒的主要副產(chǎn)物。雖然含碳前體的完全燃燒得到CO2和水作為僅有的最終產(chǎn)物，但是一些工業(yè)過程需要高溫，相對于CO2更有利于一氧化碳的積累。一個實例是鋼鐵行業(yè)，其需要高溫以生成所需的鋼鐵質(zhì)量。例如，據(jù)報道，澳大利亞鋼鐵行業(yè)每年生成并向大氣釋放超過500，000噸CO。而且，CO還是合成氣的主要成分，其中通過含碳燃料的氣化作用生成不同含量的一氧化碳和氫氣。例如，合成氣可通過裂解廢棄樹木和木材的有機生物質(zhì)產(chǎn)生，以生成用于生成燃料和更復雜化學物的前體。一氧化碳被釋放到大氣中可具有明顯的環(huán)境影響。此外，可能需要支付排放稅，增加工廠的成本。因為一氧化碳是富含反應能的分子，它可以被用作用于產(chǎn)生多種化學物的前體化合物。但是，這一有價值的原料目前還沒有被用于生產(chǎn)乳酸。本發(fā)明的目的是提供一種至少部分克服以上缺點的方法，或至少為公眾提供有用的選擇。

發(fā)明內(nèi)容
在一個方面，本發(fā)明提供了一種通過將含一氧化碳的底物進行微生物發(fā)酵而產(chǎn)生乳酸的方法。在具體實施方案中，本發(fā)明提供了一種通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生乳酸的方法，該方法包括a.提供含CO的底物；b.在含有一種或多種微生物的培養(yǎng)物的生物反應器中，厭氧發(fā)酵所述底物以產(chǎn)生乳酸。在具體實施方案中，產(chǎn)生了每升發(fā)酵液至少O. 05克乳酸/天。在具體實施方案中，產(chǎn)生了至少O. I克乳酸/升/天；或至少O. 2克乳酸/升/天；或至少O. 3克乳酸/升/天；或至少O. 5克乳酸/升/天；或至少I. O克乳酸/升/天。在另一方面，本發(fā)明提供了一種通過發(fā)酵提高乳酸產(chǎn)生效率的方法，該方法包括 a.提供含CO的底物；b.在含有一種或多種微生物的培養(yǎng)物的生物反應器中，厭氧發(fā)酵所述底物以產(chǎn)生乳酸。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生乳酸的方法，該方法包括a.提供底物b.在含有一種或多種微生物的培養(yǎng)物的生物反應器中，厭氧發(fā)酵所述底物，其中一種或多種微生物包含一個或多個乳酸脫氫酶基因；c.上調(diào)所述一個或多個乳酸脫氫酶基因，使得所述微生物產(chǎn)生乳酸。在具體實施方案中，所述底物包括一氧化碳。在多個方面的具體實施方案中，所述含一氧化碳的底物是含一氧化碳的氣態(tài)底物。所述含一氧化碳的氣態(tài)底物可作為工業(yè)過程的副產(chǎn)物獲得。在一些實施方案中，所述工業(yè)過程選自鐵金屬產(chǎn)品制造、非鐵金屬產(chǎn)品制造、石油精煉過程、生物質(zhì)氣化、煤氣化、電力生產(chǎn)、炭黑生產(chǎn)、氨生產(chǎn)、甲醇生產(chǎn)和焦炭制造。在一個實施方案中，所述氣態(tài)底物包括從鋼廠獲得的氣體。在另一個實施方案中，所述氣態(tài)底物包括汽車尾氣。 在具體實施方案中，所述含CO的底物通常包含大比例的CO，例如至少約20體積％至約100體積％的CO，40體積％至95體積％的CO，40體積％至60體積％的CO，以及45體積％至55體積％的CO。在具體實施方案中，所述底物包含約25體積％、或約30體積％、或約35體積％、或約40體積％、或約45體積％、或約50體積％、或約55體積％或約60體積％的CO。含更低濃度的CO，例如6%，的底物也可能是合適的，特別當還存在H2和CO2時。在多個方面的具體實施方案中，提供了足夠水平的所述含一氧化碳的底物，使得可產(chǎn)生乳酸。在具體實施方案中，提供CO使得維持至少O. 4mmol/g/min、或至少O. 5mmol/g/min、或至少 O. Bmmol /g/min、或至少 O. 7mmo1 /g/min、或至少 O. 8mmo1 /g/min、或至少0. 9mmol/g/min、或至少 I. Ommol/g/min、或至少 I. 2mmol/g/min、或至少 I. 5mmol/g/min 的比攝入速率。在多個方面的一些實施方案中，所述方法包括使用一種或多種一氧化碳營養(yǎng)微生物經(jīng)Wood-Ljungdahl途徑進行微生物發(fā)酵。在具體實施方案中，所述微生物是梭菌,例如自產(chǎn)乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)。在另一方面，本發(fā)明提供了一種通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生乳酸的方法，該方法包括a.提供底物b.在包括自產(chǎn)乙醇梭菌培養(yǎng)物的生物反應器中，厭氧發(fā)酵所述底物以產(chǎn)生乳酸。在具體實施方案中，所述底物是一種或多種碳水化合物，例如果糖。或者，所述底物是含一氧化碳的底物，更優(yōu)選為如上文所述的含一氧化碳的氣態(tài)底物。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種前述方面任一項的方法，其中所述方法還包括捕獲或回收所述乳酸的步驟。
在另一方面，提供了通過前述方面任一項的方法產(chǎn)生的乳酸。本發(fā)明從廣義上說還可以單獨或綜合地包括在本申請說明書中提及或指出的部分、要素或特征，其以兩個或多個所述部分、要素或特征的任意或所有組合，并且當本文提及在本發(fā)明涉及領(lǐng)域中具有已知等同物的具體整體時，所述已知等同物被認為如同被單獨提出一樣被納入本文。


圖I的曲線圖顯示了根據(jù)實施例I所描述的本發(fā)明方法的乳酸產(chǎn)生。圖2的曲線圖顯示了根據(jù)實施例2所描述的本發(fā)明方法的乳酸產(chǎn)生。圖3的曲線圖顯示了根據(jù)實施例3所描述的本發(fā)明方法的乳酸產(chǎn)生。圖4的曲線圖顯示了根據(jù)實施例4所描述的本發(fā)明方法的乳酸產(chǎn)生。 圖5a、圖5b和圖5c的曲線圖示出了實施例5中所描述的不同乳酸鹽濃度對細胞生長和代謝物產(chǎn)生的影響。圖5c中的圖例也適用于圖5a和圖5b。
具體實施例方式下面是以總括的形式給出的對本發(fā)明的描述，包括本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。在下文中的標題“實施例”下所給出的公開內(nèi)容中對本發(fā)明進一步舉例說明，所述實施例提供了支持本發(fā)明的實驗數(shù)據(jù)、本發(fā)明各方面的具體實例和實施本發(fā)明的方式。術(shù)語“乳酸(lactic acid)”和“乳酸鹽(lactate)”在本文中可互換使用，二者包括2-羥基丙酸的所有立體異構(gòu)體，包括(R)式、(S)式和消旋式。術(shù)語“生物反應器(bioreactor)”包括由一個或多個容器和/或塔或管道布置組成的發(fā)酵裝置，所述發(fā)酵裝置包括連續(xù)攪拌釜反應器(CSTR)、固定化細胞反應器(ICR)、滴流床反應器(TBR)、鼓泡塔、氣升發(fā)酵罐、靜態(tài)混合器、或其他適于氣-液接觸的其他容器或裝置。如下文所述，在一些實施方案中，所述生物反應器可包括第一生長反應器和第二發(fā)酵反應器。因此，當提到加入底物，例如含一氧化碳的底物，到所述生物反應器或發(fā)酵反應中時，如果合適，應該理解為包括加入到這些反應器之一或兩個中。術(shù)語“含一氧化碳的底物”及類似術(shù)語應理解為包括其中一氧化碳可被一株或多株細菌利用進行例如生長和/或發(fā)酵的任何底物?！昂谎趸嫉臍鈶B(tài)底物”包括包含某一水平一氧化碳的任何氣體。所述氣態(tài)底物通常包含大比例的CO，優(yōu)選地至少約15體積％至約95體積％的一氧化碳。除非上下文另外要求，本文所使用的短語“發(fā)酵”、“發(fā)酵過程”或“發(fā)酵反應”等意在包括所述過程的生長階段和產(chǎn)物生物合成階段。本發(fā)明人驚奇地表明，乳酸可以通過對含一氧化碳的底物進行微生物發(fā)酵來產(chǎn)生。令人吃驚地表明，乳酸可以由一氧化碳營養(yǎng)細菌通過發(fā)酵含CO的底物來產(chǎn)生。發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵可產(chǎn)生數(shù)種產(chǎn)物，因此乙醇和乳酸是重要取代物。以前乳酸并沒有被鑒定為是含CO的底物發(fā)酵的產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明的方法，還令人驚奇地證明，乳酸可以由自產(chǎn)乙醇梭菌從含CO的底物尤其是含CO的氣態(tài)底物產(chǎn)生。以前在發(fā)酵過程中使用氣態(tài)碳源尤其是含CO的氣態(tài)碳源沒有導致乳酸產(chǎn)生。在本發(fā)明的具體實施方案中，乳酸產(chǎn)生的效率可以通過以使得乳酸可產(chǎn)生的足夠水平提供底物來提高。已經(jīng)認識到，增加提供至微生物培養(yǎng)物的底物量可增加所述培養(yǎng)物產(chǎn)生的乳酸的量。在本發(fā)明的具體實施方案中，以足夠水平提供含CO的底物，使得乳酸可產(chǎn)生。已經(jīng)表明，含自產(chǎn)乙醇梭菌的微生物培養(yǎng)物可以最高達約I. O至2mmol/g微生物細胞干重/min的速率攝入一氧化碳(比CO攝入)。在本發(fā)明的具體實施方案中，向含自產(chǎn)乙醇梭菌的微生物培養(yǎng)物提供含CO的底物，使得比攝入基本維持在或至少O. 4mmol/g/min、或至少O. 5mmol/g/min、或至少 O. 6mmol/g/min、或至少 O. 7mmol/g/min、或至少 O. 8mmol/g/min、或至少 O. Qmmol!g/min、或至少 I. Ommol!g/min、或至少 I. 2mmol/g/min、或至少 I. Smmol!g/min。在這些實施方案中，乳酸是至少O. 05g/L、或至少O. lg/L、或至少O. 2g/L、或至少O. 3g/L、或至少O. 4g/L、或至少O. 5g/L的重要發(fā)酵產(chǎn)物。在具體實施方案中，乳酸以至少O. 5g/L/天或至少lg/L/天的速率產(chǎn)生。在本發(fā)明的具體實施方案中，用于執(zhí)行本發(fā)明方法的裝置能夠測量和/或控制參數(shù)，如CO供應、CO攝入、生物質(zhì)水平、pH、乳酸產(chǎn)生。例如，可從生物反應器中取樣以測定一 個或多個上述參數(shù)并任選地調(diào)節(jié)所述生物反應器狀態(tài)以促進乳酸產(chǎn)生。例如，在生物反應器中，其中所述微生物培養(yǎng)物沒有產(chǎn)生乳酸或產(chǎn)生少量乳酸，可以提高CO供應，使得乳酸產(chǎn)生。如Phillipsetal, 1994, Apped Biochemistry and Biotechnology, 45/46:145中所述，已經(jīng)公認的是，產(chǎn)物例如乙酸和乙醇可經(jīng)Wood-Ljungdahl途徑由一氧化碳經(jīng)乙酰輔酶A循環(huán)和THF循環(huán)的組合產(chǎn)生。但是，根據(jù)本發(fā)明的方法，令人吃驚地表明可產(chǎn)生乳酸，尤其在提供CO使得維持至少O. 4mmol/g/min、或至少O. 5mmol/g/min、或至少O. 6mmol/g/min、或至少 O. 7mmo1 /g/min、或至少 O. 8mmo1 /g/min、或至少 O. Qmmol /g/min、或至少 I. Ommol /g/min、或至少I. 2mmol/g/min、或至少I. 5mmol/g/min的比CO攝入速率的情況下。不希望囿于理論，發(fā)明人認為，通過提供足夠的或增加的一氧化碳水平，在發(fā)酵過程中可以生成更高能量產(chǎn)物，例如乳酸。發(fā)明人認為，產(chǎn)物前體例如乳酸可作為電子受體，從而以NAD(P)H的形式減輕微生物細胞的過量還原能力，因此恢復有利的NAD (P) :NAD (P)H平衡。發(fā)明人還認為，所述培養(yǎng)物發(fā)酵的碳水化合物也可以以相似方式轉(zhuǎn)化成乳酸。推定的具有981個堿基長度的NAD依賴型D-(-)-乳酸脫氫酶基因可在自產(chǎn)乙醇梭菌LZ1560 (在DSMZ以登錄號為19630保藏的菌株)基因組序列中被鑒定到。所述單順反子基因與梭菌屬菌株IBUN 13A (登錄號Nr.GQ_180219. I)和IBUN 158B (登錄號Nr.GQ_180219. I)的部分D-(-)_乳酸脫氫酶基因IdhA顯示了高同源性(74%同一性(486/656)，E-值為 2e_55)。核苷酸序列ATGAAAGTTTTGGCATATAGTCATAGACAAGATGAAACTGAATATTTCAAAAAATTCAGTAAAAAATACGACGTGGAGGTTGTATTGTGTGATGATCCACCAACTATGGAAAATGCAGACTTGGCCAAGGGATTTGACTGCATCAGCATTATCACAACTAAAATTTCAGATAAATTAGTAGAAAAATTTCATGAAATTGGAGTAAAATTTATATCTACAAGAACAATAGGATATGACCATATAGACATAAAAAAGGCAAAAGAGCTAGGTGTCCATATAGGCAATGTAAACTATTCACCAAATAGTGTAGCCGATTATACAATTATGATGATTCTTATG GCTATAAGAAAAACGAAAGCTATTATAGAACGAAGTAATGTACAGGATTATTCTTTAAAAGGTGTTCAAGGTAAAGAGCTTCACAATTTAACTGTAGGTGTTAT
TGGTACAGGAAGAATTGGCCGTGCAGTTATAAGTCGCTTAAGTGGATTTGGCTGCAAAATATTAGCTTATGATTTATATGAGAATGAAGAAATAAAGAAGTATGTTACATATGTTACACTAGAAGATCTCTTTAAAAACAGTGACATTATTACAATGCATGCACCTGCAACAGATGACAATTATCACATGATAAATAAGGATTCCATAGCACTTATGAAAGATGGTACATTTATTATCAATATAGCCCGAGGCTCACTTATCAATACTGAAGATCTTATAGATGCCATTGAAAATAAAAAAATTGGTGGTGCAGCTA
TAGACGTTATTGAAAATGAATTCGGACTTTGCTATAACGATTTAAAATGTGAGATACTAGATAAAAGGGAAATGGCAATTTTAAAATCTTTTCCAAATGTAATTGTAACACCTCACACAGCTTTTTATACAGATCAAGCTGTAAGTGATATGGTAGAACATTCTATTTTAAGTTGTGTTTTATTCATGGAAGGCAAAGAAAATCCATGGCAAATTGAATAA所述基因編碼具321氨基酸的蛋白質(zhì)，其與其他梭菌菌種(見表I)的α -酮酸脫氫酶(例如具有完全相同長度的丙酮丁醇梭菌(C. acetobutylicum)的乳酸脫氫酶)具有高度的同源性。COG (蛋白質(zhì)的直系同源組聚類(Clusters of Orthologous Groups ofproteins))分析將該蛋白分配至“乳酸脫氫酶及相關(guān)脫氫酶”功能組(C0G1052)。蛋白質(zhì)序列MKVLAYSHRQDETEYFKKFSKKYDVEVVLCDDPPTMENADLAKGFDCISIITTKISDKLVEKFHEIGVKFISTRTIGYDHIDIKKAKELGVHIGNVNYSPNSVADYTIMMILMAIRKTKAIIERSNVQDYSLKGVQGKELHNLTVGVIGTGRIGRAVISRLSGFGCKILAYDLYENEEIKKYVTYVTLEDLFKNSDIITMHAPATDDNYHMINKDSIALMKDGTFIINIARGS LINTED LIDAIENKKIGGAAIDVIENEFGLCYNDLKCEILDKREMAIL KSFPNVIVTPHTAFYTDQAVSDMVEHSILSCVLFMEGKENPWQIE*進一步的證據(jù)來自于對PR0SITE 數(shù)據(jù)庫(Hulo N, et al, (2008) ‘The20years ofPR0SITE，Nucleic Acids Res 36:D245_249)和 Pfam 數(shù)據(jù)庫(Finn et al (2010) ‘ThePfam protein families database’Nucleic Acids Res38:D211_222)進行的結(jié)構(gòu)域搜索。PR0SITE搜索得到對“D-異構(gòu)體特異性2-羥酸脫氫酶MD-結(jié)合標志”的兩項強搜索結(jié)果(PS00065和PS00671 )，而從Pfam搜索鑒定了 “D-異構(gòu)體特異性2-羥酸脫氫酶，催化結(jié)構(gòu)域”和“D-異構(gòu)體特異性2-羥酸脫氫酶，NAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域”，分別具有8. le-72和2. le-30的高E-值。根據(jù)其他NAD依賴型D-(-)_乳酸脫氫酶(EC1. I. I. 28)，所述蛋白質(zhì)被提出可催化丙酮酸+NADH得到D-㈠-乳酸+NAD*的反應。
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權(quán)利要求
1.一種通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生乳酸的方法，所述方法包括 a.提供含CO的底物； b.在含有一種或多種微生物的培養(yǎng)物的生物反應器中，厭氧發(fā)酵所述底物以產(chǎn)生乳酸。
2.一種通過發(fā)酵提高乳酸產(chǎn)生效率的方法，所述方法包括 a.提供含CO的底物； b.在含有一種或多種微生物的培養(yǎng)物的生物反應器中，厭氧發(fā)酵所述底物以產(chǎn)生乳酸。
3.權(quán)利要求I或2的方法，其中以足以使得乳酸產(chǎn)生的水平提供所述含CO的底物。
4.權(quán)利要求1-3任一項的方法，其中提供所述含CO的底物，使得維持所述培養(yǎng)物的至少O. 4mmol CO/克細菌干細胞重/min的CO攝入比速率。
5.權(quán)利要求4的方法,其中提供所述底物,使得維持至少O.6mmolC0/g/min的比攝入速率。
6.權(quán)利要求4或5的方法,其中提供所述底物,使得維持至少O.8mmol CO/g/min的比攝入速率。
7.權(quán)利要求4-6任一項的方法,其中提供所述底物,使得維持至少I.9mmol CO/g/min的比攝入速率。
8.權(quán)利要求4-7任一項的方法,其中提供所述底物,使得維持至少I.Ommol CO/g/min的比攝入速率。
9.一種通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生乳酸的方法，所述方法包括 a.提供含CO的底物； b.在含有一種或多種微生物的培養(yǎng)物的生物反應器中，厭氧發(fā)酵所述底物，其中所述一種或多種微生物包括一個或乳酸脫氫酶基因； c.上調(diào)所述乳酸脫氫酶基因，使得所述微生物產(chǎn)生乳酸。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述底物包含CO。
11.權(quán)利要求9的方法，其中以足以使得乳酸產(chǎn)生的水平提供所述含CO的底物。
12.權(quán)利要求9-11任一項的方法，其中提供所述含CO的底物，使得維持所述培養(yǎng)物的至少O. 4mmol CO/克細菌干細胞重/min的CO攝入比速率。
13.上述權(quán)利要求任一項的方法，其中所述一種或多種微生物是自產(chǎn)乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)。
14.權(quán)利要求1-12任一項的方法，其中所述含CO的底物是氣態(tài)的。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述含CO的底物包含至少約15體積％至約100體積％的CO。
16.權(quán)利要求14或15的方法，其中所述含CO的底物包含從工業(yè)過程作為副產(chǎn)物獲得的氣體。
17.—種通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生乳酸的方法，所述方法包括 a.提供底物 b.在包含自產(chǎn)乙醇梭菌培養(yǎng)物的生物反應器中，厭氧發(fā)酵所述底物以產(chǎn)生乳酸。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述底物包含一種或多種碳水化合物。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述方法包括在提供包含一種或多種碳水化合物的底物的步驟之前、同時或之后提供含CO的底物的另一步驟。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述方法包括將所述提供含CO的底物的步驟和所述提供含一種或多種碳水化合物的底物的步驟互換。
21.通過權(quán)利要求1-20任一項的方法產(chǎn)生的乳酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了通過厭氧發(fā)酵產(chǎn)生乳酸的方法。根據(jù)本發(fā)明的具體方法，通過厭氧發(fā)酵包括氫和一氧化碳的底物而產(chǎn)生乳酸。
文檔編號C12P7/56GK102791869SQ201180013225
公開日2012年11月21日 申請日期2011年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月10日
發(fā)明者S·D·辛普森 申請人:新西蘭郎澤科技公司