專利名稱：檢測(cè)癌癥易感性的方法
檢測(cè)癌癥易感性的方法
背景技術(shù)：
所涉及的申請(qǐng)
本申請(qǐng)是非臨時(shí)申請(qǐng)，其根據(jù)第119(e)條要求臨時(shí)專利申請(qǐng)No. 60/574,248 (2004年5月25日提交)的優(yōu)先權(quán)。 發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及檢測(cè)個(gè)體對(duì)癌癥易感性的方法。本發(fā)明還涉及篩選對(duì)個(gè)體有 預(yù)防癌癥效果的化合物。 相關(guān)技術(shù)的描述
作為由于個(gè)體暴露給DNA損傷試劑所引起的體細(xì)胞DNA突變的結(jié)果， 癌癥會(huì)發(fā)展。這些試劑包括射線、化學(xué)試劑、食物以及自由基。盡管大部分 DNA損傷可以被適當(dāng)?shù)募?xì)胞響應(yīng)所修復(fù)，但是在關(guān)鍵的基因組位點(diǎn)累積的許 多處DNA損傷會(huì)導(dǎo)致癌癥。所以，癌癥的易感性依賴于每個(gè)個(gè)體中DNA損 傷和相應(yīng)的細(xì)胞響應(yīng)之間的平衡。己知，在少數(shù)疾病(例如共濟(jì)失調(diào)性毛細(xì) 血管擴(kuò)張)中，減弱的DNA損傷響應(yīng)會(huì)高頻率地誘導(dǎo)癌癥。

發(fā)明內(nèi)容
在確定個(gè)體對(duì)癌癥易感性的方法的一個(gè)實(shí)施方式中，在體外將個(gè)體的細(xì) 胞暴露給誘變刺激物，檢測(cè)在已暴露和未暴露的個(gè)體細(xì)胞中生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物 的水平，基于己暴露和未暴露的細(xì)胞中標(biāo)記物水平的差別確定個(gè)體對(duì)癌癥的 易感性。
在該實(shí)施方式的一個(gè)方面中，所述細(xì)胞來(lái)自個(gè)體的全血。在該實(shí)施方式 的另外一個(gè)方面中，所檢測(cè)的水平是mRNA水平。在該實(shí)施方式的另外一個(gè) 方面中，所述個(gè)體是人。在該實(shí)施方式的另外一個(gè)方面中，所述生長(zhǎng)抑制標(biāo) 記物是抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的標(biāo)記物。在該實(shí)施方式的另外一個(gè)方面中，所述抑制 細(xì)胞生長(zhǎng)的標(biāo)記物是p21。在該實(shí)施方式的另外一個(gè)方面中，所述生長(zhǎng)抑制 標(biāo)記物是殺細(xì)胞標(biāo)記物。在該實(shí)施方式的另外一個(gè)方面中，所述殺細(xì)胞標(biāo)記
7物是BAX。在該實(shí)施方式的另外一個(gè)方面中，所述殺細(xì)胞標(biāo)記物是PUMA。 在該實(shí)施方式的另外一個(gè)方面中，所述誘變刺激物是離子射線。在該實(shí) 施方式的另外一個(gè)方面中，當(dāng)被暴露后，生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物的水平大大提高， 則對(duì)癌癥的易感性被確定為降低。在該實(shí)施方式的另外一個(gè)方面中，當(dāng)被暴 露后，生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物的水平不提高或者微弱提高，則對(duì)癌癥的易感性被確 定為提高。
在該實(shí)施方式的另外一個(gè)方面中，檢測(cè)了多種生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物的水平。 在該實(shí)施方式的另外一個(gè)方面中，所述多種生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物包括至少一種抑 制細(xì)胞生長(zhǎng)的標(biāo)記物和一種殺細(xì)胞標(biāo)記物。在該實(shí)施方式的另外一個(gè)方面中， 所述抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的標(biāo)記物是p21 ，所述殺細(xì)胞標(biāo)記物是PUMA。
在確定個(gè)體對(duì)癌癥易感性的方法的另一個(gè)實(shí)施方式中，來(lái)自多個(gè)個(gè)體物 種成員的細(xì)胞，將所述細(xì)胞在體外暴露給誘變刺激物之后，以獲得細(xì)胞中生 長(zhǎng)抑制標(biāo)記物的基線平均檢測(cè)水平，在體外將細(xì)胞暴露給誘變刺激物，在暴 露之后，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物的水平；確定個(gè)體對(duì)癌癥的易感性，其 中比基線平均檢測(cè)高的水平預(yù)示較低的癌癥風(fēng)險(xiǎn)，比基線平均檢測(cè)低的水平 預(yù)示較高的癌癥風(fēng)險(xiǎn)。
在該實(shí)施方式的一個(gè)方面中，所述細(xì)胞來(lái)自個(gè)體的全血。在該實(shí)施方式 的另外一個(gè)方面中，所檢測(cè)的水平是mRNA水平。在該實(shí)施方式的另外一個(gè) 方面中，所述個(gè)體是人。在該實(shí)施方式的另外一個(gè)方面中，所述生長(zhǎng)抑制標(biāo) 記物是抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的標(biāo)記物。在該實(shí)施方式的另外一個(gè)方面中，所述抑制 細(xì)胞生長(zhǎng)的標(biāo)記物是p21。在該實(shí)施方式的另外一個(gè)方面中，所述生長(zhǎng)抑制 標(biāo)記物是殺細(xì)胞標(biāo)記物。在該實(shí)施方式的另外一個(gè)方面中，所述殺細(xì)胞標(biāo)記 物是BAX。在該實(shí)施方式的另外一個(gè)方面中，所述殺細(xì)胞標(biāo)記物是PUMA。
在該實(shí)施方式的另外一個(gè)方面中，所述誘變刺激物是離子射線。在該實(shí) 施方式的另外一個(gè)方面中，檢測(cè)了多種生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物的水平。在該實(shí)施方 式的另外一個(gè)方面中，所述多種生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物包括至少一種抑制細(xì)胞生長(zhǎng) 的標(biāo)記物和一種殺細(xì)胞標(biāo)記物。在該實(shí)施方式的另外一個(gè)方面中，所述抑制 細(xì)胞生長(zhǎng)的標(biāo)記物是p21，所述殺細(xì)胞標(biāo)記物是PUMA。
在篩選用于個(gè)體中預(yù)防癌癥作用的化合物的方法的一個(gè)實(shí)施方式中，將個(gè)體的細(xì)胞與所述化合物進(jìn)行孵育，將個(gè)體的經(jīng)過(guò)孵育的細(xì)胞和未孵育細(xì)胞 在體外暴露給誘變刺激物，檢測(cè)個(gè)體的在被暴露的細(xì)胞，以及在未孵育、未 暴露的細(xì)胞中生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物的水平，基于在暴露后，經(jīng)過(guò)孵育的細(xì)胞和未 孵育細(xì)胞中生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物水平的差別鑒定具有預(yù)防癌癥作用的化合物。在 該實(shí)施方式的一個(gè)方面中，檢測(cè)未受到誘變刺激的經(jīng)過(guò)孵育的細(xì)胞中生長(zhǎng)抑 制標(biāo)記物的水平。
在該實(shí)施方式的另外一個(gè)方面中，所述細(xì)胞來(lái)自個(gè)體的全血。在該實(shí)施
方式的另外一個(gè)方面中，所檢測(cè)的水平是mRNA水平。在該實(shí)施方式的另外 一個(gè)方面中，所述個(gè)體是人。在該實(shí)施方式的另外一個(gè)方面中，所述生長(zhǎng)抑 制標(biāo)記物是抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的標(biāo)記物。在該實(shí)施方式的另外一個(gè)方面中，所述 抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的標(biāo)記物是p21。在該實(shí)施方式的另外一個(gè)方面中，所述生長(zhǎng) 抑制標(biāo)記物是殺細(xì)胞標(biāo)記物。在該實(shí)施方式的另外一個(gè)方面中，所述殺細(xì)胞 標(biāo)記物是BAX。在該實(shí)施方式的另外一個(gè)方面中，所述殺細(xì)胞標(biāo)記物是 PUMA。在該實(shí)施方式的另外一個(gè)方面中，所述誘變刺激物是離子射線。在 該實(shí)施方式的另外一個(gè)方面中，檢測(cè)多種生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物的水平。在該實(shí)施 方式的另外一個(gè)方面中，所述多種生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物包括至少一種抑制細(xì)胞生 長(zhǎng)的標(biāo)記物和一種殺細(xì)胞標(biāo)記物。在該實(shí)施方式的另外一個(gè)方面中，所述抑 制細(xì)胞生長(zhǎng)的標(biāo)記物是p21，所述殺細(xì)胞標(biāo)記物是PUMA。
在該實(shí)施方式的另外一個(gè)方面中，在經(jīng)過(guò)孵育的細(xì)胞中比在未孵育細(xì)胞 中表現(xiàn)出較大提高的暴露后生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物的水平的化合物被鑒定為具有預(yù) 防癌癥的作用。在該實(shí)施方式的另外一個(gè)方面中，在孵育未暴露的細(xì)胞中相 對(duì)于未孵育未暴露的細(xì)胞中，表現(xiàn)出沒(méi)有或者較少提高的生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物水 平的化合物，以及在經(jīng)過(guò)孵育的細(xì)胞中比在未孵育的細(xì)胞中表現(xiàn)出較大提高 的暴露后生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物的水平的化合物被鑒定為具有預(yù)防癌癥的作用并且 具有較少的副作用風(fēng)險(xiǎn)。
在確定有效預(yù)防個(gè)體中癌癥的化合物的方法的另一個(gè)實(shí)施方式中，將細(xì) 胞從個(gè)體中取出，為個(gè)體施加至少一種化合物，在施加該化合物之后從個(gè)體 取出細(xì)胞，在體外使在施加化合物前后取出的細(xì)胞暴露給誘變刺激物，檢測(cè) 在被暴露的細(xì)胞以及施加化合物之前取出的未暴露的細(xì)胞中生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物的水平，并基于在施加化合物前后的細(xì)胞中，生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物水平的在暴露 后的差別確定該化合物的預(yù)防癌癥的作用。在該實(shí)施方式的一個(gè)方面中，檢 測(cè)在施加化合物之后沒(méi)有暴露給誘變刺激物的細(xì)胞中生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物的水 平。
在該實(shí)施方式的另外一個(gè)方面中，所述細(xì)胞來(lái)自個(gè)體的全血。在該實(shí)施
方式的另外一個(gè)方面中，所檢測(cè)的水平是mRNA水平。在該實(shí)施方式的另外 一個(gè)方面中，所述個(gè)體是人。在該實(shí)施方式的另外一個(gè)方面中，所述生長(zhǎng)抑 制標(biāo)記物是抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的標(biāo)記物。在該實(shí)施方式的另外一個(gè)方面中，所述 抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的標(biāo)記物是p21。在該實(shí)施方式的另外一個(gè)方面中，所述生長(zhǎng) 抑制標(biāo)記物是殺細(xì)胞標(biāo)記物。在該實(shí)施方式的另外一個(gè)方面中，所述殺細(xì)胞 標(biāo)記物是BAX。在該實(shí)施方式的另外一個(gè)方面中，所述殺細(xì)胞標(biāo)記物是 PUMA。
在該實(shí)施方式的另外一個(gè)方面中，所述誘變刺激物是離子射線。在該實(shí) 施方式的另外一個(gè)方面中，檢測(cè)了多個(gè)生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物的水平。在該實(shí)施方 式的另外一個(gè)方面中，所述多個(gè)生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物包括至少一種抑制細(xì)胞生長(zhǎng) 的標(biāo)記物和一種殺細(xì)胞標(biāo)記物。在該實(shí)施方式的另外一個(gè)方面中，所述抑制 細(xì)胞生長(zhǎng)的標(biāo)記物是p21，所述殺細(xì)胞標(biāo)記物是PUMA。
在該實(shí)施方式的另外一個(gè)方面中，在施加化合物之后取出的細(xì)胞中比在 施加化合物之前取出的細(xì)胞中表現(xiàn)出較大提高的生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物的暴露后水 平的化合物，被鑒定為具有預(yù)防癌癥的作用。在該實(shí)施方式的另外一個(gè)方面 中，在施加化合物之后未暴露的細(xì)胞中相對(duì)于在施加化合物之前未暴露的細(xì) 胞中表現(xiàn)出沒(méi)有或較少提高的生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物水平的化合物，以及在施加化 合物之后的細(xì)胞中比施加化合物之前取出的細(xì)胞中表現(xiàn)出較大提高的生長(zhǎng)抑 制標(biāo)記物的暴露后水平的化合物被鑒定為具有預(yù)防癌癥的作用，并具有較少 的副作用風(fēng)險(xiǎn)。


圖1表示在肝素化全血中射線誘導(dǎo)的p21誘導(dǎo)。
圖2表示在健康成年人(參)和癌癥患者(〇)中射線誘導(dǎo)的p21誘導(dǎo)。 圖3表示在健康成年人(參)和癌癥患者(〇)中射線誘導(dǎo)的BAX誘導(dǎo)。圖4表示在健康成年人(參， ， ▲)和癌癥患者(〇)中射線誘導(dǎo)的 p21和BAX誘導(dǎo)。
圖5表示通過(guò)各種飲食補(bǔ)充物的射線誘導(dǎo)的p21的沉默。 優(yōu)選的實(shí)施方式的詳細(xì)描述
不希望受到任何特定理論的限制，發(fā)明人認(rèn)為發(fā)展為癌癥的風(fēng)險(xiǎn)可能來(lái) 自對(duì)DNA損傷響應(yīng)的改變。而且，對(duì)DNA損傷響應(yīng)的提高可以顯示對(duì)防御 癌癥的能力的提高。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及檢測(cè)癌癥易感性以及分析 化合物在特定個(gè)體中預(yù)防癌癥的作用的方法，其基于DNA損傷對(duì)個(gè)體細(xì)胞的 影響。該方法的一個(gè)實(shí)施方式依賴于檢測(cè)細(xì)胞(如全血細(xì)胞)中標(biāo)記物mRNA 的水平。在美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)No. 2004/0265864中公開(kāi)了適合該目的的完成 檢測(cè)mRNA水平的方法，這里將其作為參考加以引用。在本發(fā)明的方法中， 該mRNA檢測(cè)方法可以總結(jié)如下
全血中mRNA的檢測(cè)
在所公開(kāi)的方法中采用的mRNA檢測(cè)方案能夠分析大量的未做任何準(zhǔn)備 的全血，其提供了一種分析mRNA的有效方法，其中所述mRNA僅僅來(lái)自 于白細(xì)胞；去除了 rRNA和tRNA，提供了可靠的mRNA回收，并容易適合 自動(dòng)化操作。提供了靈敏的定量系統(tǒng)，其包括使用實(shí)時(shí)PCR，以及變化系 數(shù)在20 25%之間的卓越再現(xiàn)性。
該檢測(cè)程序包括3個(gè)主要步驟1)分離白細(xì)胞以及在過(guò)濾板上裂解白細(xì) 胞；2)分離mRNA，進(jìn)行反向引物雜交以及在固定寡聚(dT)的微孔板上進(jìn)行 cDNA合成；以及3)實(shí)時(shí)PCR。簡(jiǎn)單的說(shuō)，將過(guò)濾板置于收集板上，并使 用150(iL5mmol/LTris (pH7.4)潤(rùn)濕過(guò)濾膜。4。C下120Xg離心1分鐘以從 過(guò)濾板去除溶液，接著在每個(gè)孔中使用50pL充分混合的血樣，并立即在4 'C下120Xg離心2分鐘，接著使用300pL磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)對(duì)每個(gè)孔 進(jìn)行清洗一次，并在4'C下2000Xg離心5分鐘。接著，將60pL裂解緩沖液 貯液應(yīng)用到過(guò)濾板，接著在37'C下孵育10分鐘，其中所述裂解緩沖液貯液 補(bǔ)充有1。/。2-巰基乙醇(BioRad)、 0.5mg/mL蛋白酶K(Pierce)、 0.1mg/mL鮭魚(yú) 精子DNA(5 Prime Eppendorf/Brinkmann) 、 0.1mg/mL大腸桿菌(五.co//) tRNA(Sigma)、 10mmol/L每種特異性反向引物以及1(^分子/mL的合成RNA34
ii作為內(nèi)標(biāo)。接著將過(guò)濾板置于固定寡聚(dT)的微孔板(GenePlate, RNAture)上， 并在4"C下2000Xg離心5分鐘。在4-C下存儲(chǔ)過(guò)夜后，使用100pL清澈的 裂解緩沖液對(duì)微孔板進(jìn)行清洗3次，接著在4'C下使用150mL清洗緩沖液
(0.5mol/LNaCl， 10mmol/L Tris(pH 7.4)， lmmol/L EDTA)清洗3次。通過(guò) 加入30^L含有1 XRT-緩沖液(50mmol/L KC1， 10mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)， 5.5mmol/LMgCl2，不含二硫蘇糖醇)、1.25mmol/L每種dNTP、 4單位rRNasin 以及80單位MMLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega)(不含引物)，并在37'C下孵育2小時(shí)， 在每個(gè)孔中直接合成cDNA。將所得到的4pLcDNA直接轉(zhuǎn)到384孔PCR板 中，向其中加入5pLTaqMan (由Biosystems提供)以及l(fā)pL寡聚核苷酸混合物
(正向和反向引物分別為15pmol/L以及3-6jimol/LTaqMan探針)，在PRISM 7900HT(由Biosystems提供)中進(jìn)行PCR，其通過(guò)一個(gè)循環(huán)95°C 10分鐘，接 著45個(gè)循環(huán)的95"C30秒，55'C30秒以及60'C1分鐘。在單獨(dú)的孔中擴(kuò)增每 一個(gè)基因。使用分析軟件(SDS，由Biosystems提供)確定循環(huán)極限(Ct)，其為 產(chǎn)生一定量PCR產(chǎn)物(熒光)的PCR循環(huán)?？梢允褂胕Cycler (BioRad)在 GenePlate中直接進(jìn)行PCR。
采用從全血簡(jiǎn)單的、可重復(fù)的高通量mRNA定量方法。該快速的方案將 取血后的mRNA 二次誘導(dǎo)或者降解最小化，并且96孔過(guò)濾板以及微孔板的 使用可以同時(shí)操作96個(gè)樣品。在程序中最少的操作提供了非常小的樣品間變 化，其中變化系數(shù)(CV)值小于30%，即使在使用PCR作為定量的方法時(shí)。 在該實(shí)施方式中，過(guò)濾板可以按如下進(jìn)行制備。使用玻璃纖維膜或者白 細(xì)胞過(guò)濾膜來(lái)捕獲白細(xì)胞。為了簡(jiǎn)化該檢測(cè)，使用玻璃纖維膜或者白細(xì)胞過(guò) 濾膜來(lái)構(gòu)建多孔過(guò)濾板，以能夠同時(shí)處理多個(gè)血樣。在美國(guó)專利No. 4,925,572 和4,880,548中公開(kāi)了用來(lái)捕獲白細(xì)胞過(guò)濾器的實(shí)施例，在這里引入其所公開(kāi) 的內(nèi)容作為參考。這些參考文獻(xiàn)整體上公開(kāi)了用于清除血產(chǎn)品或者血小板濃 縮物中白細(xì)胞的設(shè)備。美國(guó)專利No. 4,925,572所公開(kāi)的用于血產(chǎn)品的設(shè)備包 括上游多孔元件，其包括用于去除凝膠的設(shè)備例如針狀纖維無(wú)紡網(wǎng)；至少 一種中間多孔元件，其包括用于去除微聚集體的設(shè)備例如兩層或者三層熔噴 法制備的網(wǎng)；以及下游元件，其包括通過(guò)吸附和過(guò)濾去除白細(xì)胞的設(shè)備，例 如多層相對(duì)小直徑的纖維網(wǎng)，優(yōu)選為至少一種元件已經(jīng)被修飾為臨界濕潤(rùn)表面張力超過(guò)53達(dá)因/cm。美國(guó)專利No. 4,880,548所公開(kāi)的用于血小板濃縮物 的設(shè)備包括修飾的多孔紡織介質(zhì)，其具有至少大約卯達(dá)因/cm的臨界濕潤(rùn)表 面張力。該專利還公開(kāi)了一種清除白細(xì)胞含量以及提濃血小板的方法，其包 括將血小板濃縮物通過(guò)多孔介質(zhì)。
通常采用將白細(xì)胞吸附在過(guò)濾器表面作為去除白細(xì)胞的機(jī)制。由于給定 重量纖維的表面與纖維的直徑成反比，因此，預(yù)期更細(xì)的纖維將具有更高的 能力，并且如果所使用纖維直徑更小，達(dá)到期望效率所必需的纖維重量將更 小。大量通常使用的纖維包括聚酯、聚酰胺和丙烯酸樹(shù)脂，對(duì)其進(jìn)行輻射枝 接，由于其對(duì)在所需接枝水平的Y-射線所引起的降解有充分抗性，并且具有 與有用的單體進(jìn)行反應(yīng)的結(jié)構(gòu)。PBT已經(jīng)成為用于開(kāi)發(fā)本發(fā)明產(chǎn)品的主要樹(shù) 脂，并且是實(shí)施例中所使用的樹(shù)脂。然而，需要注意的是發(fā)現(xiàn)其它樹(shù)脂可以 纖維化并且收集作為1.5微米或更小的纖維墊或者纖維網(wǎng)，以及臨界濕潤(rùn)表 面張力被調(diào)節(jié)到最優(yōu)范圍內(nèi)的產(chǎn)品，可以很好的適合制造相同效率但更少白 細(xì)胞損失的設(shè)備。相似的，適當(dāng)處理的玻璃纖維可用于制造有效設(shè)備。當(dāng)使 用PBT基過(guò)濾器時(shí)，CD4 mRNA的吸附效果是玻璃纖維基過(guò)濾器的高達(dá)4 倍。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，多個(gè)過(guò)濾膜被層疊在一起來(lái)提高從全血中捕 獲白細(xì)胞的量。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，過(guò)濾板用塑料膠帶(Bio-Rad 223-9444)密封，并且該膠帶被切割使得允許進(jìn)入希望數(shù)目的孔。在另一優(yōu) 選的實(shí)施方式中，用低滲緩沖液(20pL5mMTris，pH7.4)對(duì)將要加入樣品 的每個(gè)孔進(jìn)行清洗。
該方法優(yōu)選包括收集血、將血加到多孔過(guò)濾板以及去除紅細(xì)胞和其它非 白細(xì)胞組分。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，全血被吸入含有抗凝血?jiǎng)┑难占?管中，其提高了白細(xì)胞的過(guò)濾效率?？鼓?jiǎng)└嗡?，在提高白?xì)胞過(guò)濾效率 方面是特別有效的。也可以采用其它抗凝血及例如ACD和EDTA，但在所得 到mRNA檢測(cè)中的信號(hào)強(qiáng)度會(huì)被降低。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，血樣品可 以被冷凍，這去除了某些破壞mRNA的RNA酶。可以用低滲緩沖液對(duì)孔進(jìn) 行清洗。 一旦血被加入到過(guò)濾板上的期望數(shù)目的孔中，將血過(guò)濾通過(guò)過(guò)濾膜。 可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員任何已知的技術(shù)來(lái)實(shí)施過(guò)濾例如離心、真空吸引 或者正壓。該方法包括細(xì)胞裂解以及將mRNA雜交到固定在mRNA捕獲區(qū)內(nèi)的寡 聚(dT)上。將裂解緩沖液應(yīng)用到過(guò)濾板孔(40^L/孔)，并進(jìn)行孵育(室溫下進(jìn) 行20分鐘)以從被捕獲的白細(xì)胞中釋放出mRNA。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中， 將多孔過(guò)濾板密封在塑料包中并進(jìn)行離心(IECMultiRF， 2000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C 下1分鐘)。接著再加入裂解緩沖液(20 nL/ L)，接下來(lái)進(jìn)行離心(IEC MultiRF， 3000轉(zhuǎn)/分鐘，4"C下5分鐘)。接著從離心機(jī)中取出多孔過(guò)濾板并 進(jìn)行孵育(室溫下2小時(shí))。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，裂解緩沖液含有去污劑、鹽、pH緩沖液、硫氰酸 胍和蛋白酶K。
裂解緩沖液的優(yōu)選的實(shí)施方式含有至少一種去污劑，但可以含有一種以 上的去污劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用具有不同強(qiáng)度的去污劑濃度的不同組 合來(lái)達(dá)到對(duì)各種類型細(xì)胞不同膜的不同水平的裂解。例如，IGEPAL CA-630 是比N-月桂酰肌氨酸弱的去污劑，在一個(gè)實(shí)施方式中，單獨(dú)IGEPAL CA-630 足以裂解細(xì)胞質(zhì)膜。在另一個(gè)實(shí)施方式中，強(qiáng)去污劑(例如N-月桂肌氨酸) 可以與一種或者多種弱去污劑結(jié)合使用以優(yōu)化對(duì)細(xì)胞核膜的裂解。所述去污 劑優(yōu)選足以裂解至少細(xì)胞質(zhì)膜。另一優(yōu)選的實(shí)施方式包括足以裂解細(xì)胞核膜 的去污劑，因?yàn)轱@著量的mRNA存在于在細(xì)胞核中。在某些情況下，希望只 檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)mRNA，而其它情況下希望檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的mRNA。
裂解緩沖液的強(qiáng)去污劑優(yōu)選包括但不限于N-月桂酰肌氨酸 (N曙lauroylsarcosine)、 S.D.S、脫氧膽酸鈉和十六烷基三甲基溴化銨。
弱去污劑包括IGEPALCA-630、 N-癸酰基-N-甲基葡糖胺、辛基-P-D-吡 喃型葡萄糖苷或者其它本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的去污劑。裂解緩沖液中可以使 用0.05~2%的去污劑。裂解緩沖液的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式含有0.5MN-月 桂酰肌氨酸。另一個(gè)優(yōu)選的裂解緩沖液實(shí)施方式含有0.1~2% IGEPAL CA-630。特別優(yōu)選的實(shí)施方式含有0.1% IGEPAL CA-630。
鹽和螯合劑的組合也可以作為裂解劑。例如75^M NaCl和24pM Na-EDTA可以作為裂解劑。裂解劑的實(shí)施方式可以包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知 的其它裂解劑。
所述裂解緩沖液的鹽作為mRNA-寡聚(dT)雜交劑。按照本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定的，鹽應(yīng)該優(yōu)選具有不超過(guò)4XSSC的嚴(yán)格程度(與其互補(bǔ)DNA序 列雜交在一起的嚴(yán)格程度)。裂解緩沖液的其它實(shí)施方式包括NaCl或者其它 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的鹽。
優(yōu)選裂解緩沖液貯液的pH緩沖液保持7.0 8.0的pH。 一個(gè)實(shí)施方式含 有l(wèi)mM 100mM Tris HC1 (pH7.4)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，pH緩沖液含 有10mM Tris HC1 (pH7.4)。裂解緩沖液的其它優(yōu)選的實(shí)施方式包括本領(lǐng)域技 術(shù)人員已知的pH緩沖液，其包括具有0.03。/。H2O2的0.1M檸檬酸鹽-磷酸鹽(pH 5.0)。
根據(jù)裂解緩沖液特別優(yōu)選的實(shí)施方式，硫氰酸胍作為RNA酶失活劑。我 們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在現(xiàn)有技術(shù)中通常以不足以有效的濃度使用硫氰酸胍。因此， 優(yōu)選，硫氰酸胍的濃度高于1.4M。硫氰酸胍濃度可以高到IOM，更優(yōu)選不高 于2M。然而，濃度超過(guò)1.7M時(shí)，裂解緩沖液的效率會(huì)降低。因此，優(yōu)選的 實(shí)施方式使用大約1.4~大約1.75M的硫氰酸胍。 一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式含有 1.7 1.8M硫氰酸胍。發(fā)揮作用的裂解緩沖液可以從貯液制備，以達(dá)到1.791M 硫氰酸胍的精確濃度。在將其它試劑加入到裂解緩沖液時(shí)，硫氰酸胍的濃度 被稀釋。所述裂解緩沖液優(yōu)選含有濃度為大約1.6 大約1.7M的硫氰酸胍。
特別優(yōu)選的實(shí)施方式還含有20mg/ml的蛋白酶K作為RNA酶失活劑。 裂解緩沖液的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式含有20(^g/ml 20mg/ml的蛋白酶K。另一 優(yōu)選的實(shí)施方式含有200^ig/ml 1.0mg/ml的蛋白酶K。另一優(yōu)選的實(shí)施方式 含有200昭/ml 500昭/ml的蛋白酶K。十二垸基硫酸鈉也可以作為RNA酶失 活劑。另一實(shí)施方式含有0.1 10。/。的2-巰基乙醇作為RNA酶失活劑。 一個(gè)特 別優(yōu)選的實(shí)施例包括1%的2-巰基乙醇。RNA酶失活劑的其它實(shí)施方式可以 優(yōu)選包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的還原RNA酶中二硫鍵的材料。
裂解緩沖液的優(yōu)選的實(shí)施方式還含有螯合Mg21n <^2+的螯合劑。 一個(gè)優(yōu) 選的實(shí)施方式含有0.1mM 5mM EDTA。特別優(yōu)選的實(shí)施方式含有1 mM EDTA。裂解緩沖液貯液的其它優(yōu)選的實(shí)施方式含有本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的螯 合劑，其包括但不限于EDTMP、 2,3-二巰基丙醇和EGTA。
裂解緩沖液的優(yōu)選的實(shí)施方式可以含有tRNA，其來(lái)自各種來(lái)源并含有其 以抑制來(lái)自血的DNA和RNA非特異性吸附到過(guò)濾板上。另外，tRNA的存
15在防止來(lái)自血的RNA的降解。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，發(fā)揮作用的裂解緩沖液 的tRNA包括0.1 10mg/ml大腸桿菌(E. coli) tRNA。其它實(shí)施方式可以含 有來(lái)自任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知來(lái)源的tRNA。
裂解緩沖液的優(yōu)選的實(shí)施方式可以含有來(lái)自廣泛多種來(lái)源的DNA，其被 加入以抑制來(lái)自血的DNA和RNA非特異性吸附到過(guò)濾板上。發(fā)揮作用的裂 解緩沖液的DNA包括0.1~10mg/ml的超聲降解的鮭魚(yú)精子DNA。在其它實(shí) 施方式中，可以使用來(lái)自其它生物的DNA。
裂解緩沖液的優(yōu)選的實(shí)施方式可以含有摻標(biāo)對(duì)照的RNA，以計(jì)算在原始 樣品中的目標(biāo)mRNA的精確量。在本發(fā)明的實(shí)施方式之前，由于原理間的變 化且缺乏標(biāo)準(zhǔn)，所以一個(gè)實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果很難與其他實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相比較。然 而，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方法中，通過(guò)將用TaqMan或其他PCR檢測(cè)所獲得 的值除以用每個(gè)樣品中摻標(biāo)對(duì)照的RNA劑量的回收百分比，即可確定目標(biāo) mRNA的精確量。
裂解緩沖液的特別優(yōu)選的實(shí)施方式每孔含有10~lXe1Q，更優(yōu)選1Xe5 1 Xe"個(gè)拷貝的慘標(biāo)RNA。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所使用對(duì)照RNA的量至少 足以被檢測(cè)，但不能多到顯著地干涉需要定量的目標(biāo)mRNA的量。在優(yōu)選的 實(shí)施方式中，加入到裂解緩沖液中的對(duì)照RNA是多聚(A)+RNA。在特別優(yōu)選 的實(shí)施方式中，其中檢測(cè)樣品是人血，對(duì)照RNA與人血中存在的RNA不同 源。在某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，對(duì)照RNA的序列與目標(biāo)mRNA的同源性小 于90%，或者與目標(biāo)mRNA在長(zhǎng)度上有大于10%的差異。在其它優(yōu)選的實(shí)施 方式中，對(duì)照RNA的序列與目標(biāo)mRNA的同源性小于85%，或者與目標(biāo) mRNA在長(zhǎng)度上有大于5。/。的差異。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，對(duì)照RNA的序 列與目標(biāo)mRNA的同源性小于75%，或者與目標(biāo)mRNA在長(zhǎng)度上有大于2% 的差異。在可以替代的實(shí)施方式中，對(duì)照RNA的序列與目標(biāo)mRNA的同源 性小于65%，或者與目標(biāo)mRNA在長(zhǎng)度上有大于1%的差異。在一個(gè)實(shí)施方 式中，對(duì)照RNA可以優(yōu)選地通過(guò)PCR方法擴(kuò)增模板寡聚核苷酸來(lái)制備。因 此，可以使用正向引物(SEQIDNo: 3、 4、 7和1)、反向引物(SEQIDNO: 2和8)以及TaqMan探針(FAM-SEQ ID NO 6-TAMRA、 FAM-SEQ ID NO 9-TAMRA和FAM-SEQ ID NO 5-TAMRA)來(lái)擴(kuò)增各種對(duì)照RNA寡聚核苷酸?？商娲膶?shí)施方式包括使用多個(gè)不同的需要定量的目標(biāo)mRNA。進(jìn)一步的實(shí) 施方式包括使用多個(gè)對(duì)照RNA。
該方法包括對(duì)mRNA進(jìn)行定量，在優(yōu)選的實(shí)施方式中需要由mRNA合 成cDNA和使用PCR擴(kuò)增cDNA。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用裂解緩沖 液(150pl/孔X3次，手工)和清洗緩沖液(150nl/孔X3次，手工或者BioTek #G4)對(duì)多孔過(guò)濾板進(jìn)行清洗。接著，將cDNA合成緩沖液加入到多孔過(guò)濾 板(40pl/ L，手工或者I&J糾)。可以將Axymat (Amgen AM-96-PCR-RD) 放置在多孔過(guò)濾板上，接著將其放在熱塊(37°C， VWR)上并孵育(>卯分 鐘)。然后，將多孔過(guò)濾板進(jìn)行離心(2000轉(zhuǎn)/分鐘，4"C下1分鐘)。將PCR 引物加入384孔PCR板，將cDNA從多孔過(guò)濾板轉(zhuǎn)移到384孔PCR板。對(duì) PCR板進(jìn)行離心(2000轉(zhuǎn)/分鐘，4'C下1分鐘)，開(kāi)始實(shí)時(shí)PCR (TaqMan/SYBER )。
另 一優(yōu)選實(shí)施方式包括在mRNA雜交或者cDNA合成的過(guò)程中應(yīng)用特異 性反義引物。優(yōu)選在mRNA雜交的過(guò)程中加入所述引物，這樣可以在cDNA 合成之前去除多余的反義引物，以避免遺留效應(yīng)。寡聚(dT)和特異性引物 (NNNN)同時(shí)在多聚-A RNA的不同位置引導(dǎo)cDNA的合成。特異性引物 (NNNN)和寡聚(dT)在擴(kuò)增過(guò)程中引起cDNA的形成。即使當(dāng)通過(guò)在95°C 下對(duì)每個(gè)孔加熱2分鐘將特異性引物衍生的cDNA從GenePlate去除時(shí)，由 加熱變性處理(使用TaqMan定量PCR)所得到特異性CD4 cDNA的量也與 由未加熱陰性對(duì)照中所得到的量相似。不希望被任何解釋或者理論所限制， 這種結(jié)果一個(gè)可能的解釋就是在擴(kuò)增過(guò)程中寡聚(dT)衍生的cDNA可以替換 引物衍生的cDNA。這是特別方便的，因?yàn)榧訜嶙冃猿绦虮煌耆÷粤?。?且，為不同目的加入多種反義引物，可以從試樣的cDNA擴(kuò)增出每種基因， 將GenePlate內(nèi)的寡聚(dT)衍生的cDNA貯存以將來(lái)使用。
本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方式包括對(duì)來(lái)自全血mRNA進(jìn)行高通量定量的設(shè) 備。該設(shè)備包括多孔過(guò)濾板，其含有多個(gè)樣品傳輸孔、在樣品傳輸孔下方 捕獲白細(xì)胞的過(guò)濾器、以及在濾器下方的mRNA捕獲區(qū)，其含有固定在mRNA 捕獲區(qū)的孔中的寡聚(dT)。為了提高白細(xì)胞的收集效率，可以將多個(gè)過(guò)濾膜 層疊在一起。盡管許多傳統(tǒng)的擴(kuò)增技術(shù)可以與本發(fā)明的檢測(cè)方法結(jié)合使用，但本發(fā)明
特別優(yōu)選的實(shí)施方式包括使用來(lái)自全血的RNA和對(duì)照RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量 PCR (TaqMan)。 Holland等人的PNAS 88: 7276 7280 (1991)描述了一種 稱作TaqMan檢測(cè)的檢測(cè)。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物檢測(cè)系統(tǒng)中采用Taq聚合 酶的5'—3'核酸外切酶活性，以隨著擴(kuò)增產(chǎn)生特異性可檢測(cè)的信號(hào)。3'末端不 能延伸，5'末端被標(biāo)記的一種寡聚核苷酸探針被設(shè)計(jì)成在目標(biāo)序列內(nèi)部雜交， 將該探針引入到聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)中。在擴(kuò)增過(guò)程中，探針與聚合酶鏈?zhǔn)?反應(yīng)產(chǎn)物鏈中之一的退火產(chǎn)生了適合核酸外切酶活性的底物。在擴(kuò)增過(guò)程中， Taq聚合酶的5'—3'核酸外切酶活性把探針降解成更小的片段，其可以與未降 解的探針區(qū)別開(kāi)。這種檢測(cè)是靈敏和特異性的，并且相對(duì)于更多麻煩的檢測(cè) 方法有顯著的改進(jìn)。Gdfand等人的美國(guó)專利No. 5,210,015描述了該檢測(cè)一個(gè) 版本。該專利公開(kāi)了一種方法，其包括(a)提供PCR檢測(cè)，其含有樣品， 至少一種含有與目標(biāo)核酸區(qū)域互補(bǔ)的序列的被標(biāo)記的寡聚核苷酸，其中被標(biāo) 記的寡聚核苷酸退火至被步驟(b)中寡聚核苷酸引物限定的目標(biāo)核酸序列內(nèi)； (b)提供一組寡聚核苷酸弓I物，其中第一引物含有與目標(biāo)核酸序列一條鏈中的 區(qū)域互補(bǔ)的序列并引導(dǎo)互補(bǔ)DNA鏈的合成，第二引物含有與目標(biāo)核酸序列的 第二條鏈中的區(qū)域互補(bǔ)的序列并引導(dǎo)互補(bǔ)DNA鏈的合成;其中每種寡聚核苷
酸引物被選擇為退火至任何被標(biāo)記寡聚核苷酸的互補(bǔ)模版上游，其中所述被 標(biāo)記的寡聚核苷酸退火至相同的核酸鏈；(c)采用具有5'—3'核酸酶活性的核 酸聚合酶作為模板依賴聚合劑對(duì)目標(biāo)核酸序列進(jìn)行擴(kuò)增，其在允許PCR下列 循環(huán)步驟的條件下進(jìn)行(i)將引物和被標(biāo)記的寡聚核苷酸退火至包含在目標(biāo)區(qū) 域內(nèi)的模板核酸序列，以及(ii)延伸引物，其中所述核酸聚合酶合成引物延伸 產(chǎn)物，而核酸聚合酶的5'—3'核酸酶活性同時(shí)將標(biāo)記的片斷從退火的含有被標(biāo) 記的寡聚核苷酸及其互補(bǔ)模板核酸序列的雙鏈中釋放出來(lái)，這樣形成了可檢 測(cè)的被標(biāo)記的片斷；以及(d)檢驗(yàn)和域檢測(cè)被標(biāo)記的片斷的釋放，以確定樣品 中是否出現(xiàn)目標(biāo)序列。這里將Gelfand等人的美國(guó)專利No. 5,210,015和 Holland等人的PNAS 88:7276-7280 (1991)作為參考加以引入。
進(jìn)一步，F(xiàn)isher等人的美國(guó)專利No. 5,491,063提供了 TaqMan型檢測(cè)。 Fisher等人的方法提供了一種反應(yīng)，其導(dǎo)致被發(fā)射光標(biāo)記所標(biāo)記的單鏈寡聚核苷酸探針的剪切，其中該反應(yīng)是在存在結(jié)合DNA的、對(duì)標(biāo)記有影響以改變 標(biāo)記的發(fā)射光的化合物下進(jìn)行的。該方法利用被標(biāo)記探針的發(fā)射光變化，其 來(lái)自于探針的降解。該方法通?？梢詰?yīng)用于利用導(dǎo)致寡聚核苷酸探針剪切的 反應(yīng)的檢測(cè)，特別的，可以應(yīng)用于同源擴(kuò)增/檢驗(yàn)的檢測(cè)，其中雜交的探針隨 著引物的延伸而被剪切。提供了同源擴(kuò)增/檢驗(yàn)的檢測(cè)，其可以同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增 目標(biāo)累積的檢驗(yàn)和目標(biāo)序列的序列特異性檢測(cè)。在此引入Fisher等人的美國(guó) 專利No. 5，491，063作為參考。
TaqMan檢驗(yàn)的檢測(cè)為經(jīng)典的PCR檢測(cè)提供了多種優(yōu)點(diǎn)。首先，TaqMan 檢測(cè)將PCR的靈敏性以及存在于目標(biāo)序列中的內(nèi)部寡聚核苷酸序列的雜交結(jié) 合在一起。PCR后，不需要必須在瓊脂糖凝膠上分離樣品，并且取消了用來(lái) 確定PCR產(chǎn)物同一性所必須的后續(xù)Southern印跡和雜交步驟。為了進(jìn)行精確 的確定，這些附加的PCR后確認(rèn)步驟可能容易地增加多天時(shí)間。使用TaqMan 系統(tǒng)，在2.5小時(shí)內(nèi)完成該檢測(cè)。進(jìn)一步，檢測(cè)過(guò)程中所采用的方法使有效 地處理大量樣品而沒(méi)有交叉污染成為可能，因此其適合遙控取樣。其結(jié)果是， 使用TaqMan檢驗(yàn)可以在非常短的時(shí)間內(nèi)處理大量的檢測(cè)樣品。TaqMan系統(tǒng)
的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是用于多元化的潛力。由于可以使用不同的熒光報(bào)告子染色劑 來(lái)構(gòu)建探針，因此在相同的PCR反應(yīng)中可以結(jié)合幾種不同的HIV系統(tǒng)，這樣
降低了在單獨(dú)進(jìn)行每個(gè)檢驗(yàn)的情況下會(huì)發(fā)生的勞力成本?？焖俸妥罱K數(shù)據(jù)的 優(yōu)點(diǎn)結(jié)合勞力和成本效率使得使用本發(fā)明特異性引物的TaqMan檢測(cè)系統(tǒng)成 為用于監(jiān)測(cè)存在HIV的非常有利的系統(tǒng)。
也可以采用其它的實(shí)時(shí)PCR模式。一種模式采用插入染料例如SYBR綠。 該染料在結(jié)合雙鏈DNA上提供強(qiáng)熒光信號(hào)；該信號(hào)可以對(duì)所擴(kuò)增的DNA進(jìn) 行定量。盡管該模式不能夠?qū)U(kuò)增進(jìn)行序列特異性檢測(cè)，但是它能夠?qū)λ鶖U(kuò) 增DNA進(jìn)行直接定量，而不需要任何被標(biāo)記的探針(參見(jiàn)例如Ponchel等人 (2003) Real-time PCR based on SYBR-Green I fluorescence: An alternative to the TaqMan assay for a relative quantification of gene rearrangements, gene amplifications and micro gene deletions. BMC Biotechnology 3:18)?？梢圆捎玫?其它這類熒光染料是SYBR Gold、 YO-PRO染料和Yo Yo染料。
另一種可以采用的實(shí)時(shí)PCR模式使用報(bào)告探針，其雜交到擴(kuò)增子上以產(chǎn)生熒光信號(hào)。該雜交事件將探針上的報(bào)告部分和淬滅部分分離，或者將它們 拉得更近。這些探針本身并不被降解，并且報(bào)告子熒光信號(hào)自身在反應(yīng)中并
不累積。通過(guò)當(dāng)探針雜交到擴(kuò)增子時(shí)報(bào)告子熒光信號(hào)的提高，監(jiān)測(cè)在PCR過(guò) 程中產(chǎn)物的累積。該類的模式包括分子信標(biāo)(Sanjay,T and Russell, K (1996) Molecular Beacons: Probes that Fluoresce upon Hybridization. Nature Biotech. Vol. 14， March, pp303-308)、雙-Hyde探針(Cardullo等人(1988) Detection of nucleic acid hybridization by nonradiative fluorescence resonance energy transfer. PNAS USA 85:8790-8794)、 Sunrise或Amplifluor (Nazarenko等人(1997) A closed tube format for amplification and detection of DNA based on energy transfer. Nucleic Acid Res. 25:2516- 2521 )以及Scorpion( Whitcombe等人(1999) Detection of PCR products using self quenching probing amplicons and fluorescence. Nature Biotech. 17:804-807)實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)。
另一種可以采用的實(shí)時(shí)PCR模式是所謂的"警察"系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中， 引物包括熒光部分(例如FAM)，以及能夠淬滅熒光部分的熒光的淬滅子部 分(例如TAMRA，其共價(jià)結(jié)合到引物3'末端的至少一個(gè)核苷酸堿基上)。在 3，末端，該引物具有至少一個(gè)錯(cuò)配堿基，因此在所述錯(cuò)配堿基處不能夠與核 酸樣品互補(bǔ)。通過(guò)使用具有3'—5'核酸外切酶活性的聚合酶(例如Pfii酶) 的PCR對(duì)模板核酸序列進(jìn)行擴(kuò)增以產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。通過(guò)3'—5'核酸外切酶 活性將結(jié)合到淬滅子部分上的錯(cuò)配堿基從PCR產(chǎn)物的3'末端剪切掉。在PCR 過(guò)程中的至少一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，對(duì)當(dāng)錯(cuò)配的堿基與共價(jià)結(jié)合的淬滅子部分被聚合 酶剪切掉，進(jìn)而去除了其對(duì)熒光部分的淬滅作用下，對(duì)所得到的熒光進(jìn)行檢 驗(yàn)和/或定量。在背景上的熒光表明合成的核酸樣品的存在。在美國(guó)專利申請(qǐng) Na 10/309,691中對(duì)這種PCR模式進(jìn)行了詳細(xì)描述，這里將引入以作為參考。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過(guò)簡(jiǎn)單地改變每個(gè)目標(biāo)的引物和探針，可以對(duì) 各種mRNA進(jìn)行定量。因?yàn)楦嗡睾邪?&++，而這這對(duì)于最大的生物活性
是重要的因子，因此在全血中可以分析藥物作用，而不需要分離白細(xì)胞。 在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過(guò)使用已知量摻標(biāo)RNA確定給定樣品的
總效率的能力來(lái)自于不依賴劑量和不依賴序列的實(shí)施方式。使用已知量的對(duì) 照RNA可以使PCR檢測(cè)能夠轉(zhuǎn)化成原始樣品中目標(biāo)mRNA的量。另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式包括一種高通量定量全血中mRNA的試劑盒。該 試劑盒包括用于高通量定量全血中mRNA的設(shè)備；含肝素的血收集管；低 滲緩沖液；和裂解緩沖液。
另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式包括一種用于進(jìn)行高通量定量全血中mRNA的全 自動(dòng)系統(tǒng)，其包括向設(shè)備加入血樣、低滲緩沖液和裂解緩沖液的遙控設(shè)備； 自動(dòng)真空吸引儀和離心機(jī)，以及自動(dòng)PCR儀。
這里所公開(kāi)的檢測(cè)癌癥易感性的方法還可以采用其它不同于這里所描述 的檢測(cè)mRNA的方法。其它可以采用的方法包括例如Northern印跡分析、 RNA酶保護(hù)、溶液雜交方法、半定量RT-PCR以及原位雜交。
而且，也可以采用除了來(lái)自全血的細(xì)胞外的細(xì)胞。例如，也可以采用來(lái) 自其它組織的細(xì)胞懸浮液(例如成纖維細(xì)胞)。
檢測(cè)癌癥易感性
本發(fā)明檢測(cè)個(gè)體全血中生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物的水平。在優(yōu)選的實(shí)施方式中， 所檢測(cè)的標(biāo)記物水平是mRNA水平。然而，也可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員所己知 的其它方法對(duì)標(biāo)記物的水平進(jìn)行檢測(cè)，例如通過(guò)確定個(gè)體細(xì)胞中所存在的標(biāo) 記物蛋白質(zhì)的水平。在本申請(qǐng)中所使用的"個(gè)體"可以是任何物種的動(dòng)物， 其包括人類。而且，在本申請(qǐng)中所使用的"生長(zhǎng)抑制"mRNA包括使細(xì)胞增 殖停止的抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的mRNA，以及殺死細(xì)胞的殺細(xì)胞mRNA。在下面的 實(shí)施例中，在誘變刺激后生長(zhǎng)抑制mRNA水平較大的提高預(yù)示較低的癌癥風(fēng) 險(xiǎn)，而降低則預(yù)示較高的癌癥風(fēng)險(xiǎn)。然而，其它標(biāo)記物也可以表現(xiàn)出相反的 特征誘變刺激后mRNA水平較大的降低預(yù)示較低的癌癥風(fēng)險(xiǎn)，而提高則預(yù) 示較高的癌癥風(fēng)險(xiǎn)。
使用本發(fā)明的方法，個(gè)體對(duì)癌癥易感性的檢測(cè)與抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的標(biāo)記物 mRNA的提高相關(guān)，其中所述提高來(lái)自于暴露給誘變刺激物(例如離子射線)。 響應(yīng)刺激，標(biāo)記物mRNA的提高越大，對(duì)能夠?qū)е掳┌Y的DNA損傷積累的 個(gè)體的易感性就越低。然而，如果個(gè)體針對(duì)誘變刺激表現(xiàn)出很少或者沒(méi)有標(biāo) 記物mRNA誘導(dǎo)，則可能DNA損傷會(huì)在增殖的細(xì)胞中累積，這最終將導(dǎo)致
癌癥的發(fā)展。
盡管下面的實(shí)施例采用優(yōu)選的方案檢測(cè)個(gè)體中直接在受到誘變刺激前后說(shuō)明書(shū)第16/20頁(yè)
的標(biāo)記物mRNA水平的變化，但是也可以從許多相同物種的個(gè)體中得到標(biāo)記 物mRNA水平在未暴露的細(xì)胞中的平均基線，并將暴露后個(gè)體細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記物 mRNA水平與平均基線進(jìn)行比較以確定標(biāo)記物mRNA水平的改變。這樣的優(yōu) 點(diǎn)是只需要檢測(cè)一次mRNA水平來(lái)確定個(gè)體的癌癥易感性。優(yōu)選基于來(lái)自至 少10個(gè)個(gè)體的標(biāo)記物mRNA檢測(cè)來(lái)獲得平均基線檢測(cè)。更優(yōu)選基于來(lái)自至 少20個(gè)個(gè)體的標(biāo)記物mRNA檢測(cè)來(lái)獲得平均基線檢測(cè)。最優(yōu)選基于來(lái)自至 少50個(gè)個(gè)體的標(biāo)記物mRNA檢測(cè)來(lái)獲得平均基線檢測(cè)。
在本發(fā)明的方法中可以采用很多種誘變剌激物。這樣的誘變刺激物可以 包括例如物理因子(如熱、紫外線或者離子射線(如X-射線或者Y-射線))。 所述誘變剌激物也可以是化學(xué)試劑，其包括堿基類似物例如溴尿嘧啶和氨 基嘌呤；改變堿基結(jié)構(gòu)和配對(duì)特性的試劑例如亞硝酸、亞硝基胍、甲基磺酸 乙酯和甲基磺酸甲酯,.以及插入試劑例如吖啶橙、二氨基吖啶和溴化乙啶； 改變結(jié)構(gòu)的試劑例如NAAAF、補(bǔ)骨脂素和過(guò)氧化物；以及抗腫瘤藥物例如爭(zhēng) 光霉素和依托泊苷(VP-16)。還可以預(yù)計(jì)使用可轉(zhuǎn)位的因子，如反轉(zhuǎn)錄病毒。
己經(jīng)知道了許多抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的標(biāo)記物例如p21、 p27^和pl6/pl5皿4。 因?yàn)槭熘猵21能夠響應(yīng)DNA損傷來(lái)停止細(xì)胞增殖，所以在實(shí)施例中使用p21 作為射線誘導(dǎo)的細(xì)胞停止(cell arrest)的抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的標(biāo)記物。然而，還 可以檢測(cè)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的標(biāo)記物mRNA，例如 p27,和pl6/pl5麵。
類似的，在實(shí)施例中，檢測(cè)了殺細(xì)胞標(biāo)記物BAX和PUMA，已知其具 有強(qiáng)前凋亡作用。本發(fā)明的發(fā)明人確定PUMA是人血中主要的前凋亡mRNA， 如美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)No. 60/653,557所公開(kāi)的，這里將該專利申請(qǐng)引入作為 參考。然而，還可以檢測(cè)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它殺細(xì)胞標(biāo)記例如Bak、 Bok、 Bcl國(guó)XS、 Bid、 Bad、 Bik、 Bim和NOXA。
實(shí)施例1
在本實(shí)施例中所采用的檢測(cè)mRNA水平的方案如下。該檢測(cè)程序包括3 個(gè)主要步驟1)分離白細(xì)胞以及在過(guò)濾板上裂解白細(xì)胞；2)分離mRNA， 反向引物雜交以及在固定寡聚(dT)的微孔板上進(jìn)行cDNA合成；以及3)實(shí)時(shí) PCR。簡(jiǎn)單的說(shuō)，將過(guò)濾板置于收集板上，并使用150|iL5mmol/LTris(pH7.4)
22以潤(rùn)濕過(guò)濾膜。在4'C下120Xg離心l分鐘以過(guò)濾板去除溶液之后，在每個(gè) 孔中使用50^iL充分混合的血樣，并立即在4。C下120Xg離心2分鐘，接著 使用300mL磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)對(duì)每個(gè)孔迸行清洗一次，并在4'C下2000 Xg離心5分鐘。接著，將60^L裂解緩沖液貯液(見(jiàn)后)應(yīng)用到過(guò)濾板，接 著在37。C下孵育IO分鐘，其中所述裂解緩沖液貯液補(bǔ)充有1% 2-巰基乙醇(Bio Rad)、 0.5mg/mL蛋白酶K(Pierce)、 O.lmg/mL鮭魚(yú)精子DNA(5 Prime Eppendorf/Brinkmann)、 O.lmg/mL大腸桿菌(五.co〃) tRNA(Sigma)、 10mmol/L 每種特異性反向引物以及1(^分子/mL的合成RNA34作為內(nèi)標(biāo)。接著將過(guò)濾 板置于固定寡聚(dT)的微孔板(GenePlate, RNAture)上，并在4。C下2000Xg離 心5分鐘。在4'C下存儲(chǔ)過(guò)夜后，使用100pL清澈的裂解緩沖液對(duì)微孔板進(jìn) 行清洗3次，接著在4。C下使用150pL清洗緩沖液(0.5mol/LNaCl， 10mmol/L Tris(pH7.4)， lmmol/LEDTA)清洗3次。通過(guò)加入30pL含有1 XRT-緩沖液 (50mmol/L KC1， 10mmol/L Tris畫(huà)HCl(pH 8.3)， 5.5mmol/L MgCl2，不含二硫 蘇糖醇)、1.25mmol/L每種dNTP、 4單位rRNasin以及80單位MMLV反轉(zhuǎn) 錄酶(Promega)(不含引物)的緩沖液并在37"C下孵育2小時(shí)，在每個(gè)孔中直接 合成cDNA。將所得到的4iiLcDNA直接轉(zhuǎn)到384孔PCR板中，向其中加入 5pL TaqMan通用主體混合物(Applied Biosystems)以及l(fā)|iL寡聚核苷酸混合物 (正向和反向引物分別為15|_imol/L以及3-6^mol/LTaqMan探針)，在PRISM 7900HT(Applied Biosystems)中迸行PCR,其通過(guò)一個(gè)循環(huán)的95°C10分鐘， 接著45個(gè)循環(huán)的95'C30秒，55。C30秒以及6(TC1分鐘。在單獨(dú)的孔中擴(kuò)增 每一個(gè)基因。使用分析軟件(SDS， Applied Biosystems)確定循環(huán)極限(Ct)，其 為產(chǎn)生一定量PCR產(chǎn)物(熒光)的PCR循環(huán)?？梢允褂胕Cyder (BioRad)在 GenePlate中直接進(jìn)行PCR。
裂解緩沖液貯液
0.5%月桂酰肌氨酸
4XSSC
10mMTrisHCl， PH7.4
lmMEDTA
0.1%IGEPALCA-6301.791 M硫氰酸胍。
在暴露到不同劑量離子射線前后都進(jìn)行對(duì)p21 mRNA的檢測(cè)。其結(jié)果如 圖1所示。該結(jié)果說(shuō)明當(dāng)在體外將肝素化的全血暴露到離子射線時(shí)，p21 mRNA被以依賴于劑量的方式誘導(dǎo)。在暴露到射線之后2個(gè)小時(shí)，其表達(dá)達(dá) 到最大值。而且，如圖2所示，當(dāng)使用相同的方案檢測(cè)患有2種獨(dú)立的惡性 癌癥和l種獨(dú)立的良性腫瘤的患者時(shí)，p21 mRNA的誘導(dǎo)非常低(空心圓)。
實(shí)施例2
使用上述相同的方案對(duì)殺細(xì)胞標(biāo)記物BAX的mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)。BAX 被認(rèn)為是殺細(xì)胞標(biāo)記物，因?yàn)樵诩?xì)胞凋亡的早期BAXmRNA被誘導(dǎo)。如圖3 所示，通過(guò)10Gy的射線刺激實(shí)施例1中的癌癥患者表現(xiàn)出降低的BAX mRNA，而所檢測(cè)的大部分健康成年人在經(jīng)過(guò)射線刺激后表現(xiàn)出提高的BAX mRNA。
當(dāng)結(jié)合圖2和圖3，并加入更多的健康成年人的數(shù)據(jù)(圖4)時(shí)，癌癥患 者表現(xiàn)出對(duì)p21和BAX的差響應(yīng)。在圖4中，在不同的日期從相同的個(gè)體得 到了4個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)( )和2個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)(▲)。健康的成年人表現(xiàn)出差的BAX 響應(yīng)，但這被提高的p21響應(yīng)所彌補(bǔ)(圖4，一)。類似的，表現(xiàn)出差21響 應(yīng)的健康成年人表現(xiàn)出補(bǔ)償?shù)奶岣叩腂AX響應(yīng)(圖4， #"因此，通過(guò) 抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的標(biāo)記物基因(p21)和殺細(xì)胞標(biāo)記物基因(BAX)的響應(yīng)可以 鑒定癌癥易感性或者癌癥風(fēng)險(xiǎn)。
實(shí)施例3
使用上述相同的方案對(duì)殺細(xì)胞標(biāo)記物PUMA的mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)。 在人血中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PUMAmRNA具有BAX基因家族中最強(qiáng)的前凋亡作用。 使用10Gy射線刺激的癌癥患者的血表現(xiàn)出差的PUMA響應(yīng)，而大部分健康 成年人在射線刺激后表現(xiàn)出提高的PUMAmRNA。
檢測(cè)化合物在個(gè)體中預(yù)防癌癥的作用的方法
感興趣的是，圖4的數(shù)值在同一個(gè)體中并不固定( ， ▲)，隨著時(shí)間而 變化。這預(yù)示可以改變癌癥風(fēng)險(xiǎn)(DNA損傷響應(yīng))。因此，這項(xiàng)測(cè)試可以用 于鑒定對(duì)于在體內(nèi)每個(gè)個(gè)體的防止癌癥的方案，或者通過(guò)在體外將全血與候 選化合物進(jìn)行孵育。圖5表示了篩選防止癌癥的個(gè)體化藥物的結(jié)果。首先，將肝素化全血與
各種飲食補(bǔ)充物在37'C下進(jìn)行孵育1個(gè)小時(shí)(每種化合物2管)。接著將1 管暴露到lGy離子射線，接著將兩管均在37。C下再進(jìn)行孵育2個(gè)小時(shí)。通過(guò) 上述的對(duì)p21 mRNA進(jìn)行定量。如圖5所示，不使用任何補(bǔ)充物得到了最左 邊的數(shù)據(jù)點(diǎn)組(標(biāo)記為(-))，并確認(rèn)了射線誘導(dǎo)的p21誘導(dǎo)，這與圖1~3的 結(jié)果類似。在圖5中，每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)為使用(參)或者不使用(〇)1Gy射線 的p21mRNA的平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差。飲食補(bǔ)充物分別是維生素A(1(VM)、 維生素C(10pg/mL)、維生素D(lOOnM)和維生素E(l:lOOO)、表沒(méi)食子兒茶素 (EGC，綠茶提取物)(10pM), y-亞油酸(rLA)(10昭/mL)、染料木黃酮(Gen，大 豆提取物)(10^M)、姜黃色素(Cur,香料)(lpM)、槲皮素(Que，植物類黃 酮)(100nM)、 Agaricus (Aga，蘑菇提取物)(I:IOO)、蜂膠(Pro，蜂巢提取 物)(I:IOOO)、 Shimemakobu(Shi，蘑燕提取物)(少量，30mg/mL)以及烷氧基甘 油(Alkoxy，鯊魚(yú)提取物)(I:IOO)。被圓包圍的數(shù)據(jù)預(yù)示p<0.05。
感興趣的是，某些飲食補(bǔ)充物例如表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(綠茶提 取物)顯著地增強(qiáng)了射線誘導(dǎo)的p21表達(dá)，而對(duì)照血(沒(méi)有射線處理)的p21
水平未表現(xiàn)出任何改變，Y-亞油酸和姜黃色素(香料)也增強(qiáng)了射線誘導(dǎo)的 p21表達(dá)，盡管這些化合物業(yè)提高了 p21的背景水平。背景mRNA表達(dá)的提
高可以預(yù)示某些副作用或者毒性。表現(xiàn)出稍稍提高的背景標(biāo)記物mRNA表達(dá) 的化合物可能具有這樣的副作用。這里所述的mRNA表達(dá)的"少"或者"微 弱"的提高優(yōu)選為小于400%的表達(dá)水平的提高，更優(yōu)選為小于200%的表達(dá) 水平的提高，更加優(yōu)選的是小于100%的表達(dá)水平的提高，最優(yōu)選的是小于 50%的表達(dá)水平的提高。較大的提高被認(rèn)為是"大幅度(strong)"提高。這 些數(shù)據(jù)預(yù)示這些飲食補(bǔ)充物提高了對(duì)DNA損傷的響應(yīng)，這可能預(yù)示著防止癌 癥。
如上所述，也可以在檢測(cè)生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物之前通過(guò)將化合物施加給個(gè)體 來(lái)體內(nèi)篩選這些化合物。所述施加可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式進(jìn)行， 例如口服或者經(jīng)靜脈。適當(dāng)?shù)膭┝扛鶕?jù)所施加的化合物而變化，也可以根據(jù) 本領(lǐng)域抑制的標(biāo)準(zhǔn)劑量方案來(lái)確定。
也可以對(duì)上面的作為提取物的這些化合物進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)以鑒定其活性組分。希望這能夠增強(qiáng)預(yù)防癌癥的作用，并可以降低任何副作用或者毒性。 如來(lái)自單個(gè)個(gè)體的圖5的結(jié)果所示，可以鑒定對(duì)于個(gè)體增強(qiáng)個(gè)體預(yù)防癌
癥發(fā)展的適當(dāng)?shù)幕衔?。換句話說(shuō)，可以開(kāi)發(fā)適合個(gè)體特制的癌癥預(yù)防方案。 而且，如果某些化合物在許多其他個(gè)體中表現(xiàn)出相似的結(jié)果，則這些化
合物可以被認(rèn)為具有通用的預(yù)防癌癥的作用，并被公眾采用以降低癌癥風(fēng)險(xiǎn)。
權(quán)利要求
1. 一種確定個(gè)體對(duì)癌癥易感性的方法，其包括在體外將個(gè)體的細(xì)胞暴露給誘變刺激物；檢測(cè)在被暴露和未暴露的個(gè)體細(xì)胞中生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物的水平；以及基于被暴露和未暴露的細(xì)胞中標(biāo)記物水平的差別確定個(gè)體對(duì)癌癥的易感性。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞來(lái)自個(gè)體的全血。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所檢測(cè)的水平是mRNA水平。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述個(gè)體是人。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物是抑制細(xì)胞生 長(zhǎng)的標(biāo)記物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的標(biāo)記物是p21。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物是殺細(xì)胞標(biāo)記物。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述殺細(xì)胞標(biāo)記物是BAX。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述殺細(xì)胞標(biāo)記物是PUMA。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述誘變刺激物是離子射線。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中如果在暴露后，生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物 的水平大幅度提高，則對(duì)癌癥的易感性被確定為降低。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中如果在被暴露后，生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物的水平不提高或者微弱提高，則對(duì)癌癥的易感性被確定為提高。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中檢測(cè)多種生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物的水平。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述多種生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物包括至少一種抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的標(biāo)記物和一種殺細(xì)胞標(biāo)記物。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的標(biāo)記物是 p21，所述殺細(xì)胞標(biāo)記物是PUMA。
16. —種確定個(gè)體對(duì)癌癥易感性的方法，其包括在體外將細(xì)胞暴露給誘變剌激物之后，從多個(gè)個(gè)體物種成員獲得細(xì)胞中生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物的基線平均檢測(cè)水平；在體外將個(gè)體的細(xì)胞暴露給誘變剌激物；在暴露之后，撿測(cè)細(xì)胞中生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物的水平；以及 確定個(gè)體對(duì)癌癥的易感性，其中比基線平均檢測(cè)高的水平預(yù)示較低的癌 癥風(fēng)險(xiǎn)，比基線平均檢測(cè)低的水平預(yù)示較高的癌癥風(fēng)險(xiǎn)。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述細(xì)胞來(lái)自個(gè)體的全血。
18. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所檢測(cè)的水平是mRNA水平。
19. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述個(gè)體是人。
20. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物是抑制細(xì)胞 生長(zhǎng)的標(biāo)記物。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的標(biāo)記物是p21。
22. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物是殺細(xì)胞標(biāo) 記物。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述殺細(xì)胞標(biāo)記物是BAX。
24. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述殺細(xì)胞標(biāo)記物是PUMA。
25. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述誘變刺激物是離子射線。
26. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中檢測(cè)多種生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物的水平。
27. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述多種生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物包括至少一種抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的標(biāo)記物和一種殺細(xì)胞標(biāo)記物。
28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的標(biāo)記物是 p21，所述殺細(xì)胞標(biāo)記物是PUMA。
29. —種對(duì)個(gè)體有癌癥預(yù)防作用的化合物的篩選方法，其包括 將個(gè)體的細(xì)胞與所述化合物進(jìn)行孵育；在體外，將個(gè)體的經(jīng)過(guò)孵育的細(xì)胞和未孵育細(xì)胞暴露給誘變刺激物； 檢測(cè)在個(gè)體的被暴露的細(xì)胞，以及在未孵育、未暴露的細(xì)胞中生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物的水平；以及基于在暴露后，經(jīng)過(guò)孵育的細(xì)胞和未孵育細(xì)胞中生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物水平的差別，鑒定具有預(yù)防癌癥作用的化合物。
30. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中檢測(cè)未暴露給誘變剌激物的經(jīng)過(guò) 孵育的細(xì)胞中生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物的水平。
31. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述細(xì)胞來(lái)自個(gè)體的全血。
32. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所檢測(cè)的水平是mRNA水平。
33. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述個(gè)體是人。
34. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物是抑制細(xì)胞 生長(zhǎng)的標(biāo)記物。
35. 根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的標(biāo)記物是p21。
36. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物是殺細(xì)胞標(biāo) 記物。
37. 根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述殺細(xì)胞標(biāo)記物是BAX。
38. 根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述殺細(xì)胞標(biāo)記物是PUMA。
39. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述誘變剌激物是離子射線。
40. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中檢測(cè)多種生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物的水平。
41. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述多種生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物包括至少一種抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的標(biāo)記物和一種殺細(xì)胞標(biāo)記物。
42. 根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的標(biāo)記物是 p21，所述殺細(xì)胞標(biāo)記物是PUMA。
43. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中在經(jīng)過(guò)孵育的細(xì)胞中比在未孵育 細(xì)胞中表現(xiàn)出較大提高的暴露后生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物水平的化合物，被鑒定為具 有預(yù)防癌癥的作用。
44. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中在經(jīng)過(guò)孵育未暴露的細(xì)胞中相對(duì)于未孵育未暴露的細(xì)胞中表現(xiàn)出沒(méi)有或者較少提高的生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物水平的 化合物，以及在經(jīng)過(guò)孵育的細(xì)胞中比在未孵育的細(xì)胞中表現(xiàn)出較大提高的暴 露后生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物的水平的化合物，被鑒定為具有預(yù)防癌癥的作用并且具 有較少的副作用風(fēng)險(xiǎn)。
45. —種對(duì)個(gè)體癌癥預(yù)防有效的化合物的確定方法，其包括 將細(xì)胞從個(gè)體中取出；為個(gè)體施加至少一種化合物；在施加該化合物之后從個(gè)體中取出細(xì)胞；在體外，將施加化合物前后所取出的細(xì)胞暴露給誘變刺激物； 檢測(cè)在被暴露的細(xì)胞以及施加化合物之前取出的未暴露的細(xì)胞中生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物的水平；以及基于在施加化合物前后的細(xì)胞中，暴露后生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物水平的差別確定所述化合物的預(yù)防癌癥的作用。
46. 根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中檢測(cè)在施加化合物之后取出的、 未暴露給誘變刺激物的細(xì)胞中生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物的水平。
47. 根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述細(xì)胞來(lái)自個(gè)體的全血。
48. 根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所檢測(cè)的水平是mRNA水平。
49. 根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述個(gè)體是人。
50. 根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物是抑制細(xì)胞 生長(zhǎng)的標(biāo)記物。
51. 根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中所述抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的標(biāo)記物是p21。
52. 根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物是殺細(xì)胞標(biāo) 記物。
53. 根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中所述殺細(xì)胞標(biāo)記物是BAX。
54. 根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中所述殺細(xì)胞標(biāo)記物是PUMA。
55. 根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述誘變刺激物是離子射線。
56. 根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中檢測(cè)多種生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物的水平。
57. 根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述多種生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物包括至少一種抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的標(biāo)記物和一種殺細(xì)胞標(biāo)記物。
58. 根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中所述抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的標(biāo)記物是 p21，所述殺細(xì)胞標(biāo)記物是PUMA。
59. 根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中在施加化合物之后取出的細(xì)胞中 比在施加化合物之前取出的細(xì)胞中表現(xiàn)出較大提高的暴露后的生長(zhǎng)抑制標(biāo)記 物水平的化合物，被鑒定為具有預(yù)防癌癥的作用。
60.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中在施加化合物之后未暴露的細(xì)胞 中相對(duì)于在施加化合物之前未暴露的細(xì)胞中表現(xiàn)出沒(méi)有或較少提高的生長(zhǎng)抑 制標(biāo)記物水平的化合物，以及在施加化合物之后取出的細(xì)胞中比施加化合物 之前取出的細(xì)胞中表現(xiàn)出較大提高的暴露后的生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物的水平的化合 物，被鑒定為具有預(yù)防癌癥的作用，并具有較少的副作用風(fēng)險(xiǎn)。
全文摘要
基于個(gè)體細(xì)胞對(duì)誘變劑(例如射線)的細(xì)胞響應(yīng)，檢測(cè)個(gè)體對(duì)癌癥的易感性。在將個(gè)體細(xì)胞暴露給誘變劑前后，檢測(cè)生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物的水平。個(gè)體對(duì)由于誘變劑所引起的癌癥的易感性與通過(guò)暴露給誘變劑所誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物的程度相關(guān)。還公開(kāi)了一種檢測(cè)化合物在個(gè)體中預(yù)防癌癥作用的方法，例如微生素或者食品提取物。將來(lái)自個(gè)體的細(xì)胞與至少一種化合物在體外進(jìn)行孵育，或者將所述化合物直接施加給個(gè)體，之后將一些經(jīng)過(guò)孵育的細(xì)胞以及未經(jīng)過(guò)孵育的細(xì)胞暴露給誘變劑(例如射線)。接著將與所述化合物孵育的并暴露給誘變劑的細(xì)胞中的生長(zhǎng)抑制標(biāo)記物水平與在暴露給誘變劑的未孵育細(xì)胞中的水平進(jìn)行比較。該化合物的預(yù)防癌癥的作用與孵育的細(xì)胞中較高水平的標(biāo)記物相關(guān)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101426930SQ200580016467
公開(kāi)日2009年5月6日 申請(qǐng)日期2005年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月25日
發(fā)明者三橋?qū)⑷?申請(qǐng)人:日立化成工業(yè)株式會(huì)社;日立化成研究中心公司