專利名稱：具有支鏈淀粉、淀粉、糖原和直鏈淀粉水解活性的蛋白,編碼該蛋白的基因,表達該蛋白的 ...的制作方法
背景技術(shù)：
1、發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及了能夠水解支鏈淀粉、淀粉、糖原和直鏈淀粉的酶，該酶的基因，表達該酶的細胞及其生產(chǎn)方法。更具體來說，本發(fā)明涉及了一種酶，它不僅由于其抑制牙菌斑的形成和降解以前形成的牙菌斑的能力而可以用在抗牙菌斑組合物或漱口液中，而且由于其水解葡聚糖的良好能力而可以用于除去糖生產(chǎn)過程中的葡聚糖，此外還涉及了編碼該酶的基因，表達該酶的細胞以及生產(chǎn)該酶的方法。
2、相關(guān)技術(shù)描述牙菌斑是在牙齒上沉積的生物膜，來自于牙齒表面的微生物定居。牙菌斑的主體由被稱為葡聚糖(不溶性葡聚糖)的細菌產(chǎn)生的細胞外多糖構(gòu)成，它也被稱為齒斑葡聚糖，能夠增強定居。該多糖總數(shù)達到牙菌斑干重的大約20％，是導致齲齒的重要因素。對變體鏈球菌(Streptococcus mutans)產(chǎn)生的葡聚糖進行的結(jié)構(gòu)研究表明，不溶性葡聚糖中的葡萄糖部分彼此之間主要通過α-1，3-、α-1，4-和α-1，6-D-糖苷鍵連接。因此，有效地消除牙菌斑需要齒斑葡聚糖、淀粉和葡聚糖水解活性。
按照常規(guī)，防止牙菌斑和齲齒的形成主要依靠降低口腔中的變體鏈球菌的生長。由于這一點，具有抗變體鏈球菌生長活性的化合物例如抗菌劑或氟，被包含在口腔產(chǎn)品例如牙膏或漱口液中。氟是一種流行的抗齲洞化合物，因為它能夠抑制變體鏈球菌的生長，但是它也能夠引起牙齒氟中毒(在牙釉質(zhì)中形成色斑)以及副作用例如強烈的毒性和空氣污染。已經(jīng)進行了另一種預防齲齒的嘗試，就是使用酶例如葡聚糖酶；但是，它的效果還沒有得到證實。
美國專利No.5741773提供了含有具有抗牙菌斑和抗齲齒活性的配糖巨肽的牙粉組合物。這種常規(guī)技術(shù)目的在于抑制引起齲齒的細菌的生長。但是，還沒有提出防止牙菌斑的形成或水解以前形成的牙菌斑。
授權(quán)于發(fā)明人的美國專利No.6,485,953(對應于韓國專利No.10-0358376)提出使用能夠水解多種結(jié)構(gòu)多糖的DXAMase來抑制牙菌斑的形成并降解以前形成的牙菌斑。除了能夠水解多種多糖的酶之外，生產(chǎn)該酶的微生物(斯氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)KFCC-11077)和含有該酶的組合物也被公開了。
然而，對于在抑制牙菌斑的形成并水解以前形成的牙菌斑方面具有更高活性的酶的需求仍然存在。
在韓國專利申請No.10-2001-48442中，本發(fā)明人還提出了由韓國專利No.10-0358376的微生物(斯氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)KFCC-11077)產(chǎn)生的酶DXAMase，由于其高度的葡聚糖降解活性，可以用于除去葡聚糖。
因此，在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)存在著明顯的需求，開發(fā)具有葡聚糖降解活性的新酶，其活性足夠用于除去葡聚糖。
發(fā)明概述因此，在本發(fā)明的形成過程中一直考慮著現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，并且本發(fā)明的目的是提供新的酶，它能夠水解多種多糖，包括支鏈淀粉、淀粉、糖原和直鏈淀粉，以及提供編碼該酶的基因。
本發(fā)明的另一個目的是提供帶有該基因的菌株。
本發(fā)明的另一個目的是提供生產(chǎn)該酶和該基因的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供含有該酶的可以在工業(yè)中使用的組合物。
本發(fā)明的一個方面是提供了含有SEQ.ID.No.1的氨基酸序列，具有支鏈淀粉、淀粉、糖原和直鏈淀粉水解活性的蛋白，具有該活性的該蛋白的衍生物或其片段，以及為該蛋白編碼的基因。
本發(fā)明的另一方面是提供了表達該基因的轉(zhuǎn)化細胞。
本發(fā)明的另一方面是提供了生產(chǎn)具有支鏈淀粉、淀粉、糖原和直鏈淀粉水解活性的酶的方法，包括培養(yǎng)細胞；在培養(yǎng)的細胞中表達該酶；以及純化表達的酶。
附圖簡述根據(jù)下面的詳細描述以及附圖，將會更清楚地理解本發(fā)明的上述和其它的目的、特征和優(yōu)點，其中

圖1顯示了從本發(fā)明的斯氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)(LSA)中獲得的糖水解酶的氨基酸序列以及編碼該氨基酸序列的1946bp的核苷酸序列，其中通過成熟蛋白的N-端氨基酸測序分析獲得的用于在載體中克隆成熟蛋白的PCR引物對應于下劃線的標準字符，信號肽剪切位點用箭頭標明，α-淀粉酶的保守區(qū)用下劃線的粗體字符表示；圖2是一張照片，顯示了SDS-PAGE結(jié)果，其中在膠上上樣了煮沸的酶(1道)和未煮沸的酶(2道)，同時還顯示了Western雜交結(jié)果，其中抗糖水解酶抗體與煮沸的酶結(jié)合(3道)；圖3是一張照片，顯示了SDS-PAGE和Western雜交的結(jié)果，具中用箭頭指示的本發(fā)明的LSA與分子量標準(M)一起在膠上電泳，通過考馬斯亮藍染色(1道)和活性染色(2道)顯現(xiàn)，并與母細胞的抗LSA的抗體反應(3道)；圖4是將本發(fā)明的LSA的活性和穩(wěn)定性對溫度制作的圖；圖5是將本發(fā)明的LSA的活性和穩(wěn)定性對pH值制作的圖；圖6顯示了丙酮對本發(fā)明的LSA的活性的影響；圖7顯示了乙醇對本發(fā)明的LSA的活性的影響；圖8是TLC結(jié)果的照片，顯示本發(fā)明的LSA的酶活性，其中分析的樣品是酶水解之前和之后的淀粉樣品(1％w/v)和麥芽糖糊精(Mn)(分別為A圖的1道和2道)，以及純化的LSA與一系列麥芽寡糖包括G1(葡萄糖)到G7(麥芽七糖)反應后的麥芽寡糖樣品(1％w/v)(分別為B圖中的1到7道)。
優(yōu)選實施方案描述編碼本發(fā)明的糖水解酶(LSA)的基因的獲取是從在含有淀粉的培養(yǎng)基中培養(yǎng)斯氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)開始的。然后，在從斯氏油脂酵母中純化的碳水化合物水解酶的N-端氨基酸序列的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了含有預計的保守區(qū)的引物，然后用這些引物進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物大約2kb長，被用于5’RACE和3’RACE以獲得完整的糖水解酶基因(LSA)。在通過PCR擴增后，將該基因克隆到載體pRSETB中(Invitrogen，USA)，然后將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中。
己知斯氏油脂酵母能夠產(chǎn)生降解葡聚糖的內(nèi)切葡聚糖酶(EC3.2.1.11)和降解淀粉的α-淀粉酶。該微生物已經(jīng)被應用于食品中，尚未報道能產(chǎn)生抗生素或其它有毒代謝物。
已知大多數(shù)由微生物產(chǎn)生的葡聚糖酶，除了幾種來自細菌的之外，都是誘導酶。在美國專利No.5,229,277中首先報道的斯氏油脂酵母ATCC 74054產(chǎn)生葡聚糖酶和淀粉酶，其性質(zhì)已經(jīng)被公開。此外也已經(jīng)報道了該菌從蔗糖和淀粉產(chǎn)生低分子量的葡聚糖。在這些發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明人在2002年10月11日獲得了韓國專利No.10-0358376(對應于2002年11月26日的美國專利No.6,485,953)，該專利涉及能夠水解葡聚糖和淀粉兩者的DXAMase酶，生產(chǎn)該酶的微生物(鑒定為斯氏油脂酵母KFCC-11077)，以及含有該酶的組合物。
自本發(fā)明的基因(lsa)表達的酶是能夠水解支鏈淀粉、淀粉、糖原和直鏈淀粉的糖水解酶。此外，本發(fā)明的酶被發(fā)現(xiàn)能夠降解葡聚糖、α-環(huán)狀糊精和普魯蘭。該酶是高度穩(wěn)定的。其活性不僅在相對寬的pH范圍內(nèi)(pH5-8)能保持最大活性的90％，而且甚至不被變性溶液例如含有EGTA的溶液所抑制。Ca2+和Mg2+作為該酶的輔助因子。
此外，本發(fā)明還涉及帶有編碼糖水解酶基因的新的微生物。本發(fā)明的菌株大腸桿菌BL21(DE3)pLysS保藏在位于韓國Daejeon市Yusung Gu的韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)，登記號KCTC10573BP，保藏日期是2003年12月24日。
此外，本發(fā)明涉及生產(chǎn)糖水解酶的方法。首先，對大腸桿菌BL21(DE3)pLysS進行培養(yǎng)。在從培養(yǎng)物中收獲后，將細胞用玻璃珠破碎，然后從其中分離糖水解酶。
含有本發(fā)明的酶的組合物可以用于各種口腔護理領(lǐng)域。由于其降解多糖例如葡聚糖和淀粉的能力，本發(fā)明的酶也可以有效地用于在糖生產(chǎn)過程中除去葡聚糖。此外，含有本發(fā)明的酶的組合物可以用于食品中，例如口香糖、飲料、牛奶等，本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員可以容易地確定其成分。
通過下面的實施例可以獲得對本發(fā)明更好的理解，這些實施例是為了說明的目的，而不對本發(fā)明構(gòu)成限制。
實施例1將lsa基因克隆到斯氏油脂酵母中1)菌株和質(zhì)粒能夠產(chǎn)生具有葡聚糖酶和淀粉酶活性的DXAMase的斯氏油脂酵母KFCC-11077被用作cDNA分離和淀粉酶基因篩選的DNA供體。普通的DNA操作和DNA測序是用大腸桿菌DH5α和pGEM-T easy載體(Promega，USA)進行的。為了構(gòu)建cDNA文庫，大腸桿菌XL1-Blue和SOLR(Stratagene，USA)被用作宿主細胞，λ噬菌體Uni-ZAP XR(Stratagene，USA)被用作載體。
2)培養(yǎng)條件斯氏油脂酵母被培養(yǎng)在添加了1％(w/v)淀粉的LW培養(yǎng)基中。LW培養(yǎng)基含有0.3％(w/v)酵母提取物和0.3％(w/v)KH2PO4，用HCl將pH調(diào)整到4.5。對于細菌的培養(yǎng)來說，使用LB培養(yǎng)基(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH7.3)和LBA培養(yǎng)基(每毫升含有50g氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基)。
3)糖水解酶的純化為了獲得預培養(yǎng)物，斯氏油脂酵母在添加了1％(w/v)淀粉的LW培養(yǎng)基中振蕩生長。然后，將預培養(yǎng)物接種到含有8.3升LW培養(yǎng)基的10L發(fā)酵罐(Hanil R&D，Korea)中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加了1％(w/g)淀粉作為碳源以生產(chǎn)所需的糖水解酶。培養(yǎng)上清液通過截留分子量100K的中空纖維(Saehan，Korea)過濾，然后通過截留分子量30K的中空纖維(Millipore，USA)濃縮到830ml。通過在濃縮液中加入多達70％量的硫酸銨(Sigma Chemical Co.，USA)將蛋白沉淀。離心后，將沉淀懸浮在60ml 20mM的磷酸鉀緩沖溶液中(pH6.4)。在純化的每個階段測量蛋白的濃度和滴度。將蛋白濃縮液(30mg/1.5m1)上樣到用20mM的磷酸鉀緩沖溶液(pH6.4)平衡的DEAE-Sepharose柱上，然后用從0到1.0M的NaCl濃度梯度進行洗脫。將有活性的洗脫級分合并、濃縮，然后上樣到GPC柱上(Bio-Rad Co.，A-0.5m，70cm×2.6cm)以分離所需的蛋白。柱子用50mM檸檬酸磷酸緩沖溶液(pH5.5)平衡，濃縮液含有液濃度為4mg/ml的蛋白。
4)poly A+RNA的分離將斯氏油脂酵母接種到添加了1％(w/v)淀粉的LW培養(yǎng)基中。在28C培養(yǎng)36小時后(達到指數(shù)生長期中期)，將培養(yǎng)液于6500xg離心，得到細胞沉淀。使用玻璃珠和熱的酸性苯酚分離總RNA。將細胞與含有硫氰酸胍、0.5％月桂基肌氨酸鈉、0.1Mβ-巰基乙醇和25mM檸檬酸鈉(pH 7.0)的溶液混合，然后與等體積的酸洗過的玻璃珠和苯酚/氯仿/異戊醇(25/24/1，v/v/v)混合物混合，再以最高速度渦旋振蕩5分鐘。離心后，將混合溶液與3倍體積的異丙醇和0.3倍體積的3M乙酸鈉混合以產(chǎn)生RNA沉淀，然后將沉淀溶解在無RNA酶的蒸餾水中儲存，直到下次使用。
5)N-端氨基酸測序和寡聚核苷酸合成使用基于Edman降解方法的自動蛋白測序儀(型號471A，AppliedBiosystems，USA)來分析純化的淀粉酶蛋白的氨基末端氨基酸序列。
在純化后，對從斯氏油脂酵母獲得的糖水解酶(LSA，具有葡聚糖酶和淀粉酶活性)進行分析，N-端氨基酸序列是DXSTVTVLSSPETVT(其中X尚未確定)。在氨基酸序列TVTVLSSPE的基礎(chǔ)上，設(shè)計了一個寡聚核苷酸，即正義引物1(5’-TACAGTTACGGTCTTGTCCTCCCCTGA-3’)(SEQ.ID.No.3)。設(shè)計了反義引物2(5’-CTCTACATGGAGCAGATTCCA-3’)(SEQ.ID.No.4)。使用正義和反義引物獲得的PCR產(chǎn)物通過電泳測量，發(fā)現(xiàn)大小大約為2kb。
6)斯氏油脂酵母cDNA文庫的構(gòu)建從在添加淀粉的培養(yǎng)基中培養(yǎng)了36小時的斯氏油脂酵母獲得5gpoly A+RNA，使用ZAP-cDNA合成試劑盒從中制備了cDNAs。通過旋轉(zhuǎn)柱分級方法從制備的cDNAs中分離了大小在500bp及其以上的cDNAs，并與用EcoRI-XhoI消化的Uni-ZAP XR載體連接。使用Gigapack Gold試劑盒(Stratagene，USA)對連接的噬菌體cDNAs進行體外包裝。
7)lsa的克隆通過PCR獲得了具有l(wèi)sa基因的開放閱讀框的DNA片段，所用引物為正義引物5’-TACAGTTACGGTCTTGTCCTCCCCTGA-3’，反義引物5’-CTCTACATGGAGCAGATTCCA-3’，它們分別對應于顯示了葡聚糖酶和淀粉酶特性的蛋白的N-端和C-端氨基酸序列。在瓊脂糖凝膠上分離后，用AccPrepTM凝膠提取試劑盒(Bioneer，Korea)純化PCR產(chǎn)物，與pGEM-T easy載體(Promega，USA)進行連接。使用ABI PRISMCycle測序試劑盒(Perkin Elmer Corp.USA)，在GeneAmp 9600熱循環(huán)儀DNA測序系統(tǒng)(型號373-18，Applied Biosystems，USA)中進行了堿基測序。
8)LSA蛋白在大腸桿菌中的異源表達和純化將lsa基因插入到pRSETB載體(Invitrogen USA)的Sacl-EcoRI位點中制備重組載體pRSET-LSA。用pRSET-LSA轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)pLysS在含有50mg/l氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)到穩(wěn)定期中期。在培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度為1mM后，在28℃繼續(xù)培養(yǎng)6小時。通過離心(5000gx 10分鐘)收集細胞，用0.1M磷酸鉀(pH7.4)洗滌細胞，然后通過超聲裂解細胞。使用Ni2+-次氮基三乙酸-瓊脂糖(NTA)(Quiagene，Germany)進行表達蛋白的純化。將細胞裂解液與Ni2+-NTA結(jié)合，在4℃放置1小時，將混合物上樣至柱子上，然后用清洗緩沖液洗滌4次。每0.5ml蛋白級分用緩沖液乳化。
9)電泳和活性染色對于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)來說，蛋白樣品被上樣到10％聚丙烯酰胺凝膠上，使用Tris-甘氨酸緩沖液(pH8.8)。在聚丙烯酰胺凝膠中含有1％淀粉，以檢測蛋白樣品是否能夠降解淀粉多糖。電泳完成后，用50mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)和20％2-丙醇溶液清洗凝膠1小時以除去SDS。將凝膠浸泡在反應緩沖液中(50mM乙酸鈉，5mM CaCl2，pH5)37℃放置2天，然后在碘溶液中(0.3％碘，3％碘化鉀)浸泡10分鐘，用蒸餾水清洗。通過在棕色背景上出現(xiàn)透明的區(qū)域可以鑒定淀粉水解活性。
為了確定所需蛋白的分子量，在凝膠上還上樣了分子量標準品，包括肌球蛋白(200kDa)、β-半乳糖苷酶(116kDa)、磷酸化酶b(97.4kDa)、血清白蛋白(66.2kDa)、碳酸酐酶(31kDa)和抑蛋白酶肽(6.5kDa)。
10)Western雜交在電泳后，將凝膠上的蛋白在存在電場的情況下轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。使用特異性針對糖水解酶(同時具有葡聚糖酶和淀粉酶活性)的兔多克隆抗體檢測LSA。含有抗糖水解酶抗體的血清以1∶200的比例稀釋使用。將抗體處理過的膜用含有0.1％Tween 20(T)的Tris緩沖的鹽溶液(TBS)(20mM Tris-HCl，137mM NaCl)洗滌3次。使用ECLWestern雜交分析系統(tǒng)(Amersham Pharmacia，USA)與第二抗體相結(jié)合探測抗原-抗體結(jié)合物。用作第二抗體的過氧化物酶偶聯(lián)的抗兔IgG(Amersham Pharmacia，USA)以1∶1500的比例稀釋。Biomax膠卷(Kodak，USA)被用來屏幕曝光1分鐘。
實施例2糖水解酶活性的分析通過DNS(3，5-二硝基水楊酸)方法與二辛可寧酸銅方法相結(jié)合來測定糖水解酶的還原值。具體來說，將100μl二辛可寧酸銅加入到100μl酶溶液中，在80℃反應35分鐘，然后冷卻大約15分鐘。在560nm測量吸收值。
實施例3酶的最適pH、溫度和穩(wěn)定性分析通過測量在pH3-9的范圍內(nèi)相隔1個pH單位的反應速度來分析LSA酶的最適pH。為此，使用了20mM檸檬酸磷酸緩沖液(pH4.0)、檸檬酸/磷酸緩沖液(pH5-6)和磷酸鈉緩沖液(pH7-9)。在37℃反應48小時后，通過DNS方法測定酶的糖水解酶活性。此外，酶的pH穩(wěn)定性是在酶加入到每種緩沖液中并于22℃保溫3小時后測定的。
酶的最適溫度是通過測量已經(jīng)在不同溫度(20-80℃，間隔10℃)下保溫30分鐘的酶的反應速度來確定的。為了確定酶的溫度穩(wěn)定性，測量酶在不同溫度(20-90℃，間隔10℃)下保溫30分鐘后的殘余活性。使用1％(w/v)淀粉作為底物測定酶的活性和穩(wěn)定性。
實施例4金屬離子、螯合溶液和變性溶液對酶活性的影響測量了EDTA、EGTA和金屬離子對酶活性的影響。EDTA和EGTA每種使用的終濃度是1mM。金屬離子，包括ZnCl2、CuSO4、CaCl2和MgCl2，使用的終濃度是5mM。也測量了在存在十二烷基硫酸鈉(SDS，0.1％、0.5％、1％、2％)、尿素(2M)、丙酮(0-80％)和乙醇(0-70％)的情況下的酶活性。在測量時，將酶與作為底物的2％淀粉于37℃反應30分鐘。
結(jié)果從斯氏油脂酵母克隆lsa基因在純化后，分析從斯氏油脂酵母獲得的糖水解酶(LSA，同時具有葡聚糖酶和淀粉酶活性)，N-端氨基酸序列是DXSTVTVLSSPETVT(X尚未確定的氨基酸殘基)。在氨基酸序列TVTVLSSPE的基礎(chǔ)上，設(shè)計并合成了正義引物1(5’-TACAGTTACGGTCTTGTCCTCCCCTGA-3’)。另外設(shè)計了反義引物2(5’-CTCTACATGGAGCAGATTCCA-3’)。PCR產(chǎn)物通過電泳顯示為大小大約為2kb的條帶。氨基酸和堿基測序結(jié)果在圖1和SEQ.ID.No.1和2中給出。
lsa基因的表征從產(chǎn)生葡聚糖酶和淀粉酶的斯氏油脂酵母KFCC11077中克隆了為LSA編碼的基因，這是一個1946bp的cDNA片段。在cDNA片段中，開放閱讀框由1944bp(647個氨基酸)組成，分子量為71889Da，對應于未修飾的LSA前體。它的成熟蛋白被發(fā)現(xiàn)具有619個氨基酸(1857bp)，分子量為68709Da。據(jù)推斷前體蛋白在Arg28和Asp29之間的位置被加工，從而產(chǎn)生成熟的蛋白(圖1)。
LSA的ORF開始于核苷酸1位的起始密碼子ATG，結(jié)束于核苷酸1944位的終止密碼子TAG。推測的LSA氨基酸序列與來自多種酵母和植物的α-淀粉酶，來自細菌的環(huán)狀糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶、普魯蘭酶和α-糖苷酶，以及來自多粘芽孢桿菌(B.polymyxa)的β-淀粉酶具有同源性。LSA被發(fā)現(xiàn)與結(jié)林卡油脂酵母(L.kononenkoae)、西方許旺氏酵母(Sw.occidentalis)(AMY1)和肋狀復膜孢糖酵母(Sh.Fibuligera)(ALP1)的α-淀粉酶顯示出52-78％的同源性(Park，J.C.，Bai，S.，Tai，C.Y.和Chun，S.B.(1992)酵母西方許旺氏酵母(Schwanniomycesoccidentailis)ATCC 26077中的細胞外淀粉酶基因的核苷酸序列，F(xiàn)EMSMicrobiol Lett.93，17-24；Steyn，A.J.C.，Marmur，J.和Pretorius，I.S.(1995)含有結(jié)林卡油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)α-淀粉酶編碼基因的cDNA的克隆、序列分析及其在酵母中的表達，GENE，166，65-7；Ito，T.，Yamashita，I.和Fukui，S.(1987)酵母肋狀復膜孢糖酵母(Saccharomycopsis fibuligera)中α-淀粉酶基因(ALP1)的核苷酸序列，F(xiàn)EBS Lett.219，339-342)。為了進行比較，在下面的表1中給出了各種淀粉酶包括按照本發(fā)明獲得的LSA基因的四個保守區(qū)域。在保守區(qū)域中6個框中的氨基酸殘基是完全一樣的。
表1 酶的縮寫LSA，斯氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)的α-淀粉酶；AMYA，構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)的α-淀粉酶；ALP1，肋狀復膜孢糖酵母(Saccharomycopsis fibuligera)的α-淀粉酶；SWA2，西方德巴利氏酵母(Debaromyces occidentails)的α-淀粉酶；AMY2，粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccahromyces pobme)的α-淀粉酶；LKA1，結(jié)林卡油脂酵母(L.Kononenkoae)的α-淀粉酶；NPL，嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)的新普魯蘭酶；IAM，Pseudomonasamyloderamosa的異淀粉酶；PUL1，產(chǎn)氣克雷伯氏桿菌(Klebsiellaaerogenes)的普魯蘭酶；PUL2，嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)的普魯蘭酶；CGT1，肺炎克雷伯氏桿菌(K.pneumoniae)的環(huán)狀糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶；CGT2，浸麻芽孢桿菌(Paenibacillus macerans)的環(huán)狀糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶；CGT3，嗜堿芽孢桿菌(Alkaliphilic Bacillus sp.)的環(huán)狀糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶；CGT4，嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)的環(huán)狀糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶；BE1，大腸桿菌(Escherichia coli)的分枝酶；BE2，Synechococcus sp.的分枝酶；BE3，玉米的分枝酶；MAL，卡爾斯伯糖酵母(Saccharomycescarisbergensis)的麥芽糖酶；1,6G，臘狀芽孢桿菌(B.cereus)的寡聚-1，6-糖苷酶。
在LSA的基因組DNA中存在一個內(nèi)含子，它被發(fā)現(xiàn)位于cDNA的966和967堿基之間，由60個堿基(5’-GTGGTATGTATCTAAGCATATTTGTAGCATTCTATCTTGGAACTGACCGGCCCTCAGTGC-3’)組成。按照本發(fā)明制備的重組LSA的分子量在通過SDS-PAGE測量時發(fā)現(xiàn)與母細胞(斯氏油脂酵母)中的LSA的分子量(大約100kDa)不同。這種差別相信是由于母細胞的酶被酵母中的糖蛋白糖基化而產(chǎn)生的。母細胞中的糖水解酶，在用抗糖水解酶抗體檢測時大約是100kDa(圖2)。因為在未煮沸的情況下傾向于彼此聚集，當用凝膠滲透層析測量時有活性的LSA酶被發(fā)現(xiàn)是200kDa。
lsa基因的表達在大腸桿菌中在IPTG誘導后，收集細胞，通過超聲進行破碎。使用組氨酸標記的親和柱純化蛋白，通過SDS-PAGE(10％)進行分析(圖3，1道)。主要的表達蛋白帶對應于73kDa(LSA+His-tag)。為了檢查純化的蛋白降解多糖例如淀粉的能力，使用含有淀粉的PAGE凝膠進行了電泳。在電泳完成后，將凝膠在37C放置30分鐘，然后用碘液染色。在棕色背景上顯出了LSA活性條帶的透明區(qū)域(圖3，2道)。正如在Western雜交分析中看到的那樣，抗糖水解酶抗體檢測到了大約73kDa的蛋白(LSA+His-tag)(圖3，3道)。
LSA的生物化學性質(zhì)LSA酶被發(fā)現(xiàn)在40℃顯示出最適活性，在20-50℃的溫度范圍內(nèi)保持穩(wěn)定。在60℃保溫3小時后，LSA酶的活性為穩(wěn)定溫度下活性的70％(圖4)。LSA酶的淀粉酶活性在pH5-8的范圍內(nèi)保持穩(wěn)定，最適pH為6(圖5)。
盡管被5mM Cu2+所抑制，酶的淀粉降解活性在存在5mM Ca2+和5mM Mg2+的情況下分別增加大約315％和220％(表2)。酶的活性被1mM EDTA所抑制，但是不受1mM EGTA的影響。SDS完全抑制了酶的淀粉降解活性，而尿素或丙酮能夠增加酶活性。當在10-40％的丙酮溶液和10-20％的乙醇溶液中使用時，LSA酶的活性分別增加1.03-1.22倍和1.25-1.33倍。在存在60％丙酮或乙醇的情況下，LSA酶顯示出低于50％的最適活性(圖6和圖7)。本發(fā)明的LSA酶的高穩(wěn)定性與目前已知的淀粉水解酶相當不同。
表2金屬離子、螯合試劑和變性劑對LSA酶活性的影響
在LSA與2％淀粉反應的早期階段，產(chǎn)生大于麥芽五糖的寡糖。然后，麥芽寡糖被降解成為麥芽五糖和更低的寡糖。最后，寡糖中主要是麥芽三糖和麥芽四糖(圖8)。當與麥芽寡糖系列的混合物(從麥芽糖到麥芽七糖)反應時，LSA不水解G2和G3，但是將G4降解成G2，G5降解成G2+G3，G6降解成G2+G4或G3+G3，G7降解成G3+G4(圖8B)。此外，還發(fā)現(xiàn)LSA強烈地降解支鏈淀粉、淀粉(可溶性)和糖原，微弱地降解直鏈淀粉、淀粉糊精、葡聚糖、α-環(huán)狀糊精和普魯蘭(表3)。
表3LSA酶的相對底物特異性
如上所述，本發(fā)明提供的酶能夠有效地水解多種多糖，例如支鏈淀粉、淀粉、糖原和直鏈淀粉。由于具有這樣的降解活性，本發(fā)明的酶不僅能夠在牙齒護理工業(yè)中發(fā)現(xiàn)廣泛的應用，包括抗牙菌斑組合物和漱口液，而且也可以用于除去糖生產(chǎn)過程中的葡聚糖或多糖污染物。
盡管出于說明的目的公開了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員將會認識到對本發(fā)明進行各種修改、補充和替代，而不背離權(quán)利要求中公開的本發(fā)明的范圍和精神仍是可能的。
序列表序列表<110>利分扎株式會社(Lifenza Co.，Ltd.)<120>具有支鏈淀粉、淀粉、糖原和直鏈淀粉水解活性的蛋白，編碼該蛋白的基因，表達該蛋白的細胞及其生產(chǎn)方法(PROTEIN WITH ACTIVITY OF HYDROLYZINGAMYLOPECTIN，STARCH，GLYCOGEN AND AMYLOSE，GENE ENCODING THE SAME，CELLEXPRESSING THE SAME，AND PRODUCTION METHOD THEREOF)<130>SCT063526-47<150>KR2004-0006186<151>2004-01-30<160>4<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>647<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
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85 90 95Leu Ser Asn Asn Trp Glu Leu Trp Ser Leu Ser Ala Pro Ala Ala Asp100 105 110Ala Val Glu Ile Thr Gly Ala Ser Tyr Val Asp Ser Asp Ala Ser Ala115 120 125Thr Tyr Ala Thr Ser Phe Asp Ile Pro Leu Thr Thr Thr Thr Thr Ser130 135 140Ser Ser Ser Ala Ser Ala Thr Ser Thr Ser Ser Leu Thr Thr Thr Ser145 150 155 160Ser Val Ser Ile Ser Val Ser Val Pro Thr Gly Thr Ala Ala Asn Trp165 170 175Arg Gly Arg Ala Ile Tyr Glu Ile Val Thr Asp Arg Phe Ala Arg Thr180 185 190Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Leu Cys Asp Val Thr Asp Arg Val Tyr Cys195 200 205Gly Gly Ser Tyr Glu Gly Ile Ile Asn Met Leu Asp Tyr Ile Glu Gly210 215 220Met Gly Phe Thr Ala Ile Trp Ile Ser Pro Ile Val Glu Asn Ile Pro225 230 235 240Asp Asp Thr Gly Tyr Gly Tyr Ala Tyr His Gly Tyr Trp Met Lys Asp245 250 255Ile Phe Ala Leu Asn Thr Asn Phe Gly Thr Ala Asp Asp Leu Ile Ala260 265 270Leu Ala Thr Glu Leu His Asn Arg Gly Met Tyr Leu Met Val Asp Ile275 280 285Val Val Asn His Phe Ala Phe Ser Gly Ser His Ala Asp Val Asp Tyr290 295 300Ser Glu Tyr Phe Pro Tyr Ser Ser Glu Asp Tyr Phe His Ser Phe Cys305 310 315 320
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<223>L.starkeyi primer 1(sense)<400>3tacagttacg gtcttgtcct cccctga 27<210>4<211>21<212>DNA<213>Artiflicial Sequence<220>
<223>L.starkeyi primer 2(antisense)<400>4ctctacatgg agcagattcca 2權(quán)利要求
1.含有SEQ.ID.No.1的氨基酸序列，具有水解支鏈淀粉、淀粉、糖原和直鏈淀粉活性的蛋白，其衍生物或片段。
2.SEQ.ID.No.2的基因，編碼權(quán)利要求1的蛋白，其衍生物或片段，該基因的衍生物或片段。
3.表達權(quán)利要求2的基因，其衍生物或片段的轉(zhuǎn)化細胞。
4.權(quán)利要求2的轉(zhuǎn)化細胞，其中的細胞是原核細胞或真核細胞。
5.權(quán)利要求3或4的轉(zhuǎn)化細胞，其中的細胞是保藏號為KCTC10573HP的大腸桿菌BL21(DE3)pLysS。
6.生產(chǎn)具有支鏈淀粉、淀粉、糖原和直鏈淀粉水解活性的酶的方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求3的細胞；在培養(yǎng)的細胞中表達酶；以及純化被表達的酶。
7.通過權(quán)利要求6的方法生產(chǎn)的酶。
8.含有權(quán)利要求7的酶的組合物。
9.權(quán)利要求8的組合物，其中的組合物用于在糖生產(chǎn)過程中除去葡聚糖。
10.權(quán)利要求8的組合物，其中的組合物用于消除牙菌斑或用作漱口液。
全文摘要
本發(fā)明公開了氨基酸序列為SEQ.ID.No.1，具有支鏈淀粉、淀粉、糖原和直鏈淀粉水解活性的酶，以及編碼該酶的基因和表達該基因的轉(zhuǎn)化細胞。此外，本發(fā)明還公開了生產(chǎn)能夠降解支鏈淀粉、淀粉、糖原和直鏈淀粉的酶的方法，該方法包括培養(yǎng)細胞、在細胞中表達該酶以及酶的純化。含有該酶的組合物被提供用于除去糖生產(chǎn)過程中的葡聚糖或多糖污染物。
文檔編號C12N15/56GK1946840SQ200580003752
公開日2007年4月11日 申請日期2005年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月30日
發(fā)明者金都滿, 姜希暻, 李鎮(zhèn)河 申請人:利分扎株式會社