專利名稱：一種高溫麥芽糖基淀粉酶重組工程菌bl21－ma及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于酶基因工程和酶工程領(lǐng)域。具體地說，涉及一種含嗜熱菌(Bacillus species)WPD616麥芽糖基淀粉酶基因的重組質(zhì)粒和表達相應(yīng)酶的重組工程菌株BL21-MA，及利用該工程菌制備熱穩(wěn)定麥芽糖基淀粉酶的方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
麥芽糖基淀粉酶是一類可以催化分解淀粉、支鏈淀粉、環(huán)狀糊精的水解酶類。它們不同于一般的淀粉酶類，它是一種胞內(nèi)酶，對多種底物都具有轉(zhuǎn)糖基和降解作用，它們水解可溶性淀粉、β-環(huán)化糊精生成麥芽糖，水解支鏈淀粉生成潘糖。它們水解β-環(huán)化糊精的能力比可溶性淀粉、支鏈淀粉強。該類酶廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工、科學(xué)研究等方面[1，2，3，4]。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種構(gòu)建麥芽糖基淀粉酶重組工程菌BL21-MA及生產(chǎn)熱穩(wěn)定麥芽糖基淀粉酶的方法及用該方法所生產(chǎn)的熱穩(wěn)定麥芽糖基淀粉酶的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種熱穩(wěn)定麥芽糖基淀粉酶及其編碼基因(SEQ NO.1)。一種熱穩(wěn)定麥芽糖基淀粉酶，是指具有SEQ NO.2氨基酸序列(588個氨基酸)的蛋白質(zhì)，或者是將序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸取代、缺失或添加，并且具有序列2的相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
用大腸桿菌為宿主細胞，得到大腸埃希氏重組工程菌[Escherichiacoli BL21-MA]，該菌株已于2005年8月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC NoM205090.
本發(fā)明提供的麥芽糖基淀粉酶重組工程菌BL21-MA生產(chǎn)的麥芽糖基淀粉酶新穎之處在于1、對熱有較高的耐受范圍(30-80度)；2、極端pH值有較寬的適應(yīng)性(5.0-9.0)。3、對去污劑(Tween 20，Chaps或Triton X-100)及酶抑制劑(EDTA，2-ME or DTT)有較強的耐受性。


附圖1麥芽糖基淀粉酶基因的克隆。A淀粉酶基因PCR擴增；B重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物(BiglII+Xhol)。
附圖2麥芽糖基淀粉酶在大腸桿菌表達系統(tǒng)中的表達。泳道1，只含空載的菌，未誘導(dǎo)；2，只含空載的菌，誘導(dǎo)；3，含重組質(zhì)粒的菌，未誘導(dǎo)；4，含重組質(zhì)粒的菌，誘導(dǎo)；5，GST純化蛋白GST-MAase。
附圖3溫度對酶活的影響。
A，重組酶的最適反應(yīng)溫度測定。酶與底物在不同溫度下反應(yīng)30分，然后進行酶活測定。
B，重組酶的溫度耐受測定。酶先在不同溫度下溫育30分，然后加底物反應(yīng)30分，再進行酶活測定。
附圖4pH對酶活的影響。
A，重組酶的最適反應(yīng)pH測定。酶與底物在不同pH下反應(yīng)30分，然后進行酶活測定。
B，重組酶的pH耐受測定。酶先在不同pH下溫育30分，然后加底物反應(yīng)30分，再進行酶活測定。
附圖5去污劑和抑制劑對酶活的影響。
重組酶在抑制劑(1mM)及去污劑(0.1％)作用下酶活測定。
圖6金屬離子對酶活的影響。在不同濃度的金屬離子作用下，對酶活的測定下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等所著的《分子克隆實驗室手冊》(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的實驗條件，或按照制造廠商所建議的條件。
具體實施例方式
實施例1.嗜熱菌(Bacillus species)WPD616總DNA的提取及麥芽糖基淀粉酶基因的克隆采用從西太平洋深海熱液區(qū)分離的嗜熱菌(Bacillus speciesWPD616)，常規(guī)或采用基因組提取試劑盒提取其總DNA。采用下列簡并引物Amy15’-(AG)TGA(GT)GAAAGAAGCCAT(CT)CACCAC-3’，Amy 25’-T(TC)ACCA(GT)CTTTCGACCGCGT(AG)AA-3’，或者來源于簡并引物的一對特異引物。PCR反應(yīng)體系如下94℃，4分鐘，一個循環(huán)；94℃，45秒，55℃，45秒，68℃，75秒，30個循環(huán)；68℃，7分鐘一個循環(huán)。產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖電泳驗證得到一個約1.7K的DNA片段，見序列表SEQ NO.1。
實施例2.麥芽糖基淀粉酶重組工程菌構(gòu)建，麥芽糖基淀粉重組酶的表達及純化采用基因工程工具酶，將擴增的DNA片段連接到質(zhì)粒載體pETGST中。然后用連接產(chǎn)物Escherichia coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞，涂布在LB平板(含Amp 100μg/ml)上。挑取陽性重組工程菌菌落，提取質(zhì)粒。然后采用雙酶切和測序的方法鑒定麥芽糖基淀粉酶的DNA片段已正確重組進了表達載體。
挑取含有重組質(zhì)粒的單菌落于5ml LB液體培養(yǎng)基(含Amp100μg/ml)，37℃搖培過夜。吸取1ml菌液于新的1000ml LB液體培養(yǎng)基(含Amp 100μg/ml)，37℃搖培至OD600為0.6左右，加入IPTG至終濃度0.5mM，繼續(xù)震蕩培養(yǎng)4hr。
菌液離心，去上清。將細胞用適量PBS(pH 7.4)重懸，超聲裂解菌體，離心去沉淀，上清中的重組蛋白麥芽糖基淀粉酶用GST柱進行親和純化。
實施例3.麥芽糖基淀粉酶活性測定按照Lee et al[5]等建立的酶活測定方法(DNS)。適量酶液與底物混合后，50℃溫育30分鐘，通過測定575nm波長下的吸光值判定酶活。酶的定義為，每小時水解β-環(huán)化糊精釋放出的還原糖使575nm波長下的吸光值提高1.0的酶量定義為一個單位[6]。
實施例4.麥芽糖基淀粉酶的性質(zhì)鑒定(1)酶最適反應(yīng)溫度的測定酶與底物在不同溫度下反應(yīng)30分，通過575nm波長下的吸光值判定酶活。重組酶的溫度耐受測定。酶先在不同溫度下溫育30分，然后加底物反應(yīng)30分，再進行酶活測定。
(2)重組酶的最適反應(yīng)pH測定酶與底物在不同pH下反應(yīng)30分，然后進行酶活測定。重組酶的pH耐受測定酶先在不同pH下溫育30分，然后加底物反應(yīng)30分，再進行酶活測定。
(3)去污劑和抑制劑對酶活的影響重組酶在抑制劑(1mM)及去污劑(0.1％)作用30分鐘后進行酶活測定。
(4)金屬離子對酶活的影響在不同濃度的金屬離子作用30分鐘后，對酶活進行測定序列表SEQ NO.11 ATGAGGAAAG AAGCCATCCA CCACCGCTCA ACCGACAATT TCGCTTACGC TTATGACAGC61 GAGACGCTCC ATCTCCGGCT TCAAACAAAG AAAAATGATG TCGACCACGT CGAGCTGCTT121TTTGGCGACC CGTACGAATG GCACGATGGC GCCTGGCAGT TTCAAACGAT GCCGATGCGG181AAAACGGGGA GCGACGGGTT GTTTGACTAT TGGCTCGCCG AAGTCAAACC GCCATATCGA241CGGCTGCGCT ATGGGTTTGT GCTTCGAGCT GGGGGCGAGA AACTGGTCTA TACGGAAAAA301GGATTTTACC ATGAAGCTCC GAGCGACGAC ACCGCTTACT ACTTTTGCTT CCCCTTTCTT361CATCGGGTCG ACCTATTCCA AGCGCCGGAC TGGGTAAAAG ACACAGTATG GTATCAAATT421TTCCCCGAGC GGTTCGCCAA CGGCAACCCG GCCATCAGTC CGAAAGGGGC GCGGCCGTGG481GGAAGCGAGG ACCCGACGCC GACGAGCTTT TTCGGCGGCG ACTTGCAAGG AATCATCGAT541CACCTTGACT ATTTGGCTGA TCTCGGTATT ACCGGCATTT ACTTGACGCC GATTTTCCGC601GCACCGTCGA ATCATAAATA CGACACCGCT GATTATTTTG AAATCGACCC GCACTTTGGG661GACAAAGAGA CATTGAAAAC ACTTGTCAAA CGCTGCCATG AAAAAGGAAT CCGCGTCATG721CTCGATGCGG TCTTCAATCA TTGCGGCTAT GAGTTTGGCC CGTTTCAAGA TGTGTTAAAA781AACGGCGCAG CGTCTAGGTA TAAAGATTGG TTCCATATTC GCGAGTTTCC GCTCCAAACG841GAGCCGCGCC CGAATTACGA CACGTTTGCG TTCGTGCCGC AAATGCCCAA ACTCAATACC901GCCCATCCGG AAGTGAAGCG CTACTTGCTT GATGTCGCGA CGTACTGGAT TCGCGAGTTT961GATATTGACG GCTGGCGGCT CGATGTGGCA AACGAAATCG ATCACCAATT TTGGCGCGAA1021 TTCCGTCAGG CGGTGAAGGC GCTAAAGCCC GATGTGTACA TTCTCGGCGA GATTTGGCAT1081 GATGCCATGC CTTGGCTGCG CGGCGACCAG TTTGACGCCG TCATGAACTA CCAGTTGGCG1141 GACGCGGCGC TCCGCTTTTT CGCCAAAGAA GACATGAGCG CCAGCGAGTT TGCCGACCGA1201 TTGATGCATG TGCTTCATTC CTATCCAAAA CAGGTCAACG AAGCGGCATT CAACTTGCTT1261 GGCAGCCATG ATACACCAAG GCTGCTCACT GTTTGCGGCG GCGACGTCCG CAAAGTGAAG1321 TTGTTGTTTT TGTTCCAGCT CACGTTCACT GGTTCGCCGT GTATTTACTA TGGCGATGAG1381 ATCGGCATGA CGGGTGGAAA CGATCCGGAA TGCCGGAAAT GTATGGTGTG GGATCCAGAG1441 AAGCAAAACA AAGAACTGTA TGAACATGTT AAGCAACTGA TCGCTCTTCG CAAGCAATAT1501 CGGGCGCTTC GACGCGGCGA TGTCGCTTTT CTCGCCGCCG ATGATGAAGT GAACCATCTT1561 GTTTATGCAA AAACGGATGG CAATGAAACG GTCATGATCA TCATCAACCG GAGCAACGAA1621 GCAGCAGAAA TTCCCATGCC GATCGATGCG CGTGGAAAAT GGCTGGTCAA CCTTCTGACA1681 GGGGAGCGGT TCGCTGCAGA GGCGGAAACA CTTTGCGTCT CCTTGCCGCC GTACGGGTTT1741 GTGCTTTACG CGGTCGAAAG CTGGTAASEQ NO.21 MRKEAIHHRS TDNFAYAYDS ETLHLRLQTK KNDVDHVELL FGDPYEWHDG AWQFQTMPMR61 KTGSDGLFDY WLAEVKPPYR RLRYGFVLRA GGEKLVYTEK GFYHEAPSDD TAYYFCFPFL121HRVDLFQAPD WVKDTVWYQI FPERFANGNP AISPKGARPW GSEDPTPTSF FGGDLQGIID181HLDYLADLGI TGIYLTPIFR APSNHKYDTA DYFEIDPHFG DKETLKTLVK RCHEKGIRVM241LDAVFNHCGY EFGPFQDVLK NGAASRYKDW FHIREFPLQT EPRPNYDTFA FVPQMPKLNT301AHPEVKRYLL DVATYWIREF DIDGWRLDVA NEIDHQFWRE FRQAVKALKP DVYILGEIWH361DAMPWLRGDQ FDAVMNYQLA DAALRFFAKE DMSASEFADR LMHVLHSYPK QVNEAAFNLL421GSHDTPRLLT VCGGDVRKVK LLFLFQLTFT GSPCIYYGDE IGMTGGNDPE CRKCMVWDPE481KQNKELYEHV KQLIALRKQY RALRRGDVAF LAADDEVNHL VYAKTDGNET VMIIINRSNE541AAEIPMPIDA RGKWLVNLLT GERFAAEAET LCVSLPPYGF VLYAVESW
權(quán)利要求
1.一種熱穩(wěn)定麥芽糖基淀粉酶，其具有SEQ NO.1基因序列的蛋白質(zhì)。
2.一種熱穩(wěn)定麥芽糖基淀粉酶，是指具有SEQ NO.2氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或者是將序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸取代、缺失或添加，并且具有序列2的相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
3.一種嗜熱菌的麥芽糖基淀粉酶基因重組質(zhì)粒，其特征在于連接有SEQNO.2氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
4.一種重組工程菌，其含有重組質(zhì)粒pMA，保藏號為CGMCC NoM205090。
5.一種制備高溫麥芽糖基淀粉酶的方法，其步驟是1).高溫麥芽糖基淀粉酶基因的克隆。2).高溫麥芽糖基淀粉酶重組工程菌的構(gòu)建。3).重組工程菌按微生物發(fā)酵和酶工程技術(shù)制備高溫麥芽糖基淀粉酶。
全文摘要
本發(fā)明屬于酶基因工程和酶工程領(lǐng)域。具體地說，涉及一種含嗜熱菌(Bacillus species)WPD616麥芽糖基淀粉酶基因的重組質(zhì)粒和表達相應(yīng)酶的重組工程菌株BL21－MA，及利用該工程菌制備熱穩(wěn)定麥芽糖基淀粉酶的方法和應(yīng)用。
文檔編號C12N15/63GK1955284SQ200510118950
公開日2007年5月2日 申請日期2005年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月27日
發(fā)明者章曉波, 劉斌 申請人:國家海洋局第三海洋研究所