專利名稱：含有抑制癌細(xì)胞增殖的因子的條件培養(yǎng)基及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及運用瓊脂糖和膠原膠囊化細(xì)胞隨后用瓊脂糖包被的方法，并涉及含有抑制癌細(xì)胞增殖的因子的條件培養(yǎng)基及其制備方法。
背景技術(shù)：
用生物相容性物質(zhì)膠囊化各種生物物質(zhì)是運用了一段時間的技術(shù)，盡管成功率有限。該技術(shù)的例子是美國專利5,227,298(Weber等)；5,053,332(Cook等)；4,997,443(Walthall等)；4,971,833(Larsson等)；4,902,295(Walthall等)；4，798,786(Tice等)；4,673,566(Goosen等)；4,647,536(Mosbach等)；4,409,331(Lim)；4,392,909(Lim)；4,352,883(Lim)；和4,663,286(Tsang等)。另一個例子是共同未決申請08/483,738(1995年6月7日提交，申請人Jain等，本文一并參考)。Jain等較詳細(xì)地討論了用各種生物相容性物質(zhì)膠囊化分泌細(xì)胞的方法。如其中所討論的，分泌細(xì)胞是分泌生物產(chǎn)物的細(xì)胞。一般而言，分泌細(xì)胞具有內(nèi)分泌細(xì)胞的至少某些性質(zhì)，并且一般可以作為本質(zhì)上是內(nèi)分泌細(xì)胞的細(xì)胞等同物對待。所說的共同未決申請討論了，例如將產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞(優(yōu)選的以胰島形式)膠囊化到包被有瓊脂糖的瓊脂糖-膠原珠中的方法。所形成的產(chǎn)物在患者需要胰島素治療的疾病(如糖尿病)的治療中是有用的。
Jain等的申請較詳細(xì)地討論了移植治療中的技術(shù)所采用的現(xiàn)有方法。這里也總結(jié)了這些。
大家知道保護(hù)所移植的組織使之免受宿主的免疫反應(yīng)主要有五種方法。所有方法均涉及將所移植的組織與宿主的免疫系統(tǒng)隔開的嘗試。至今采用的免疫分離技術(shù)包括血管外擴(kuò)散室，血管內(nèi)擴(kuò)散室，血管內(nèi)超濾室，微囊化，以及大膠囊化。然而，所有這些方法都是失敗的，因為存在下列問題中一種或多種宿主對植入材料的纖維化反應(yīng)，植入材料的不穩(wěn)定性，透過半透膜營養(yǎng)擴(kuò)散的有限性，促分泌素和產(chǎn)物的通透性，以及透過半透膜障礙擴(kuò)散的時間落后性。
例如，用于將活細(xì)胞，組織，以及其它易變的膜包裹在半透膜中的微囊化作用方法于1978年由Lim研制(Lim，研究報導(dǎo)，Damon公司(1978))。Lim采用藻酸鹽和聚L-賴氨酸微膠囊來密封朗氏胰島。1980年，在糖尿病研究中報導(dǎo)了體內(nèi)應(yīng)用這一新奇技術(shù)的首次成功(Lim等，科學(xué)210908(1980))。這些微膠囊化朗氏胰島的植入使患糖尿病的動物維持血糖量正常狀態(tài)。然而，其它研究者重復(fù)這些實驗，發(fā)現(xiàn)藻酸鹽引起組織反應(yīng)，且不能再現(xiàn)Lim等的結(jié)果(Lamberti等，應(yīng)用生物化學(xué)和生物技術(shù)10101(1984)；Dupuy等，生物醫(yī)學(xué)材料和研究雜志，221061(1988)；Weber等，移植49396(1990)；和Doon-shiong等，移植進(jìn)展22754(1990))?，F(xiàn)在認(rèn)為是這些聚合物的水溶解性造成體內(nèi)這些微膠囊有限的穩(wěn)定性和生物相容性(Dupuy等，同上，Weber等，同上，Doon-shiong等，同上，以及Smidsrod，化學(xué)學(xué)會Faraday討論，57263(1974))。
前不久，Iwata等，(Iwata等，生物醫(yī)學(xué)材料和研究雜志.26967(1992))用瓊脂糖對異源胰腺胰島進(jìn)行微囊化作用，并且發(fā)現(xiàn)它能作為制備微珠的介質(zhì)。在他們的研究中，將1500-2000個胰島在5％瓊脂糖中分別進(jìn)行微膠囊化，并且植入鏈脲佐菌素引起的糖尿病的小鼠中。移植物存活了一段較長的時間，接受者確實保持血糖量正常。
然而，他們的方法有一些弊端，其麻煩及不精確。例如，許多珠只是部分地涂布有一層瓊脂糖并有幾百?？盏沫傊切问降闹椤＿@樣要求額外時間把膠囊化的胰島與空的珠分離。此外，大多數(shù)植入的微珠聚集在骨盆溝槽，要求大量完全被包被的胰島個體珠來維持血糖量正常。此外，所移植的珠很難重新取出，易于破碎，并且在輕微破壞下即容易釋放胰島。
也試驗了大膠囊化方法。將采用各種不同材料(如聚-2-羥乙基-甲基丙烯酸，聚氯乙烯-c-丙烯酸，和乙酸纖維素)的大膠囊用做朗氏胰島的免疫分離物。(參見Altman等，糖尿病35625(1986)；Altman等，移植人造內(nèi)部的器官的美國學(xué)會30382(1984)；Ronel等，生物醫(yī)學(xué)材料和研究雜志，17855(1983)；Klomp等，生物醫(yī)學(xué)材料和研究雜志17865-871(1983))。在所有這些研究中，僅僅一例糖血癥短時間內(nèi)達(dá)到正常化。
Archer等(外科研究期刊2877(1980))利用丙烯酸共聚物的中空纖維臨時阻止胰島異種移植的排斥作用。他們報導(dǎo)在中空纖維中分散的幼鼠胰腺移植物(其被移植入患糖尿病的倉鼠中)能長期的存活。前不久，Lacy等，科學(xué)2541782-1784(1991)證實了他們的結(jié)果，但是發(fā)現(xiàn)血糖量正常狀態(tài)時間很短。他們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將胰島注射入纖維，它們在中空的管內(nèi)聚集，導(dǎo)致胰島塊中央部分形成壞死區(qū)。中央壞死區(qū)排除了移植物的長時間存活。為解決這一問題，它們利用藻酸鹽分散纖維內(nèi)的胰島。然而，這一實驗還沒有廣泛重復(fù)。因此，作為人類胰島移植的介質(zhì)的膜的機(jī)能尚存在問題。
因而，需要實現(xiàn)分泌細(xì)胞的移植，尤其是，不使用慢性免疫抑制劑的胰腺胰島的異源和異種移植物的存活。
在Jain等上述討論的工作中，發(fā)明人報導(dǎo)了在親水凝膠材料中膠囊化分泌細(xì)胞形成一種有功能的，非免疫原性的材料，這一材料可以移植入動物中，并能長時間存活。該膠囊化分泌細(xì)胞技術(shù)為分泌細(xì)胞的移植提供了一種更有效和更便于施用的技術(shù)。該膠囊化技術(shù)對密封其它生物成分同樣有用，例如酶，微生物，營養(yǎng)劑包括重組產(chǎn)生的營養(yǎng)劑，細(xì)胞毒性劑，和化學(xué)化療劑。討論了膠囊化的生物制劑對治療已知對生物試劑有反應(yīng)的疾病很有用。
所說的申請沒有深入討論可產(chǎn)生擴(kuò)散性生物物質(zhì)細(xì)胞的摻入方法，這些細(xì)胞在治療中有用。本文中區(qū)別了分泌細(xì)胞與產(chǎn)生擴(kuò)散性生物材料的細(xì)胞二者之間的差異。前者，在如Jain的申請中所給出的每個例子中，一般地指產(chǎn)物如激素，細(xì)胞信號劑等等，這些通常被認(rèn)為是生物″信使″。相反地，擴(kuò)散性生物物質(zhì)指這樣的物質(zhì)如MHC呈遞的肽，細(xì)胞表達(dá)調(diào)節(jié)物如抑制子，啟動子，誘導(dǎo)子，等等。如下列所討論的，在腫瘤學(xué)等領(lǐng)域中將顯示其差異。
廣泛癌研究包括關(guān)于異源細(xì)胞的提取物，以及各種細(xì)胞組分的工作。通過利用單克隆抗體，現(xiàn)有技術(shù)已確定相關(guān)的癌抗原，例如，GM2，TF，STn MUC-1，以及由此衍生的各種抗原決定基。當(dāng)前的理論提出從各種腫瘤標(biāo)記中衍生的抗原決定基與MHC分子非共價復(fù)合，因而通過特異性溶細(xì)胞T細(xì)胞而形成不同類型。這一機(jī)理不同于各種對病毒感染的生物反應(yīng)中所牽涉的各種機(jī)制。Van der Bruggen等，科學(xué)2541643-1647(1991)；Boon等，5,405,940，以及Boon等，5,342,774(本文一并參考)描述了這一點，所有這些并入?yún)⒖贾小?br> 平行于該工作的另外的研究(關(guān)于鑒定所謂的癌抗原決定基)集中在研究癌增殖的調(diào)節(jié)，例如通過抑制或更常見地，是生物調(diào)節(jié)。參見，例如，Mitchell，臨床藥理學(xué)雜志，322-91992)；Maclean等，加拿大腫瘤學(xué)雜志，4249-254(1994)。結(jié)合所有這些各種各樣的對付癌的方法，其目標(biāo)是宿主免疫反應(yīng)的修飾作用，以引起患者癥狀的某些改善。
所有這些方法的關(guān)鍵是一種或多種擴(kuò)散性生物產(chǎn)物的活性，其與其它材料相協(xié)調(diào)以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。Boon等以及Van der Bruggen等，例如，揭示了小肽分子。Mitchell討論了起作用的大分子，如抑制子。
使用這些材料的所有治療方法的一個問題是如何以一種安全，有效的形式進(jìn)行遞送。這不容易完成?，F(xiàn)在已經(jīng)驚人地發(fā)現(xiàn)，Jain等的教導(dǎo)(其對需要分泌細(xì)胞產(chǎn)物的疾病的治療法的開發(fā)中非常有用)現(xiàn)在可以用于其它領(lǐng)域中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明包括包含瓊脂糖包被的固體瓊脂糖膠原珠或包含固體狀瓊脂糖包被的含瓊脂糖珠的組合物以及這些組合物的制備方法，本發(fā)明還包括上述組合物在制備一種用于將抑制癌細(xì)胞增殖的因子施用到受治療者的植入物中的應(yīng)用。此外，含有抑制癌細(xì)胞增殖的因子的條件培養(yǎng)基及其制備方法也是本發(fā)明的內(nèi)容。本發(fā)明的其他方面和實施方案進(jìn)一步詳細(xì)描述如下。
具體實施例方式
實施例1這一實施例及以下那些實施例采用RENCA細(xì)胞。這些是BALB/C小鼠的自發(fā)性腎癌細(xì)胞(其可供廣泛地獲得)，保持在體外和體內(nèi)培養(yǎng)物中。參見，F(xiàn)ranco等，溶細(xì)胞誘發(fā)腫瘤免疫原性，181-193(1994)。
將凍結(jié)的RENCA細(xì)胞的樣品在37℃解凍，然后放置在含Dulbecco修飾培養(yǎng)基(D-MEM)的組織培養(yǎng)瓶中，其已補(bǔ)充了10％牛血清，青霉素(100u/ml)和鏈霉素(50ug/ml)，以給出此后所指的″完全培養(yǎng)基″。
待細(xì)胞培育至匯合生長，則進(jìn)行胰酶消化，接著用Hank平衡鹽溶液洗滌，然后用以上所提及的完全培養(yǎng)基洗滌。
為了鑒定RENCA細(xì)胞是否有效地產(chǎn)生腫瘤，以106個該細(xì)胞對兩只BALB/C小鼠腹膜內(nèi)注射。觀察小鼠3-4周。臨床上，頭兩周它們表現(xiàn)健康，并表現(xiàn)出正?；钚浴４撕?，癌癥臨床表現(xiàn)明顯。一只小鼠23天后死去，并且第二只25天后也死去。小鼠死亡后，對其檢查，注意到有許多各種大小的腫瘤。其中一些腫瘤也顯示出血性。
將從一只小鼠取下的一個腫瘤樣品固定在10％福爾馬林中，以進(jìn)行組織學(xué)檢查。
實施例2依據(jù)RENCA細(xì)胞確實在體內(nèi)生長的情況，進(jìn)行研究以測定依據(jù)本發(fā)明這些細(xì)胞是否在珠中生長。如前所述，待細(xì)胞培育至匯合生長，則進(jìn)行胰酶消化，接著洗滌(同樣如前所述)。制備60,000個到90,000個細(xì)胞樣品。然后將細(xì)胞以750rpm離心，移走液體。接著將細(xì)胞懸浮在1％的atelocollagen溶液(在pH為6.5的磷酸緩沖鹽溶液中)中。
在最小基本培養(yǎng)基(MEM)中制備1％低粘度的瓊脂糖溶液，在60℃下保存，然后，加100ul至上述RENCA細(xì)胞和atellocollagen的懸浮液中。然后立即將材料以一大滴的形式轉(zhuǎn)移到無菌室溫礦物油中。混合物形成單一，光滑，半固性的珠。重復(fù)這一操作以制備大量珠。
一分鐘之后，在37℃下，將珠轉(zhuǎn)移到上述完全培養(yǎng)基中。用最小基本培養(yǎng)基(包含前面所列的抗生素)將珠洗滌三次。然后在37℃、5％CO2的濕潤的空氣中過夜溫育珠。溫育后，將已為固體的珠轉(zhuǎn)移到盛有1ml在最小基本培養(yǎng)基中的5％瓊脂糖的無菌勺中。將珠在溶液中翻滾2-3次以使它們均勻地涂布一層瓊脂糖。在瓊脂糖固化之前，將珠轉(zhuǎn)移到礦物油中，以形成平滑的外表面。60秒后，在37℃，用完全培養(yǎng)基洗滌珠五次以去掉油。接著過夜溫育(37℃，5％CO2的濕潤空氣)。
這些包含RENCA的珠用于以下的實驗中。
實施例3在體內(nèi)研究開展之前，有必要檢測RENCA細(xì)胞是否能在以上述方式制備的珠中生長。
為證實這一點，將實施例2中所制備的珠，按所列出的條件，在如實施例2中所述的培養(yǎng)基中溫育三周。然后將這些珠的三個切成小片，在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，直接與燒瓶和培養(yǎng)基相接觸。
對這些培養(yǎng)物的觀察表明細(xì)胞能生長并形成標(biāo)準(zhǔn)的RENCA集落。這表明細(xì)胞在珠中仍然能存活。
實施例4然后在體內(nèi)進(jìn)行實驗。實驗中將珠在37℃溫育七天，然后讓受試小鼠接收珠移植。為做到這一點，對四只小鼠中的每只做一個深至腹膜內(nèi)的中等切口。移植進(jìn)三粒均包含60,000個RENCA細(xì)胞的珠。然后利用可吸收縫合線縫合切口(兩層縫合)。四只雄性小鼠(BALB/C)均正常，重量為24-26克之間，并且表現(xiàn)健康。建立兩組對照。在第一組中，兩只小鼠接收不包含任何RENCA細(xì)胞的三粒珠，而第二組，兩只小鼠未經(jīng)任何處理。
在植入三周后，所有小鼠接收106RENCA細(xì)胞的腹膜內(nèi)注射。再過十八天，一組對照組的小鼠死去。然后處死所有剩下的小鼠，進(jìn)行觀察。
對照組小鼠出現(xiàn)了許多腫瘤，而接收了珠-膠囊化細(xì)胞移植的小鼠只在腹腔中出現(xiàn)隨機(jī)小結(jié)。
這些令人鼓舞的結(jié)果使得提出下面實施例中的實驗設(shè)計。
實施例5在這些實驗中，對六只BALB/C小鼠的每只進(jìn)行腎膜內(nèi)RENCA細(xì)胞的注射，而產(chǎn)生癌。十五天后，將小鼠分成兩小組。如前實施例4所描述的，將第一組中的三只小鼠分別接收三粒珠。第二小組(對照組小組)接收不含RENCA細(xì)胞的珠。
4-5天之后，曾接收含RENCA細(xì)胞的移植物的小鼠看上去無生氣，皮毛變得粗短刺狀，而對照組小組仍然是精力旺盛，其皮毛狀況沒有發(fā)生變化。
然而，植入十天后(RENCA細(xì)胞注射25天后)，對照組小鼠變得行動遲緩，并且腹部脹大。珠移植十四天后，對照組三只小鼠的一只死去。然后處死小鼠。
對照組小鼠的體腔內(nèi)顯示出大量出血，有很多的腫瘤遍布營養(yǎng)消化道，肝，胃部和肺臟。整個腹腔因為猖獗的腫瘤生長而無法分辨出。然而曾接收了膠囊化RENCA細(xì)胞的珠的小鼠無任何出血，僅僅在消化道癌上有一些小結(jié)節(jié)。試驗組與對照組的比較說明在試驗組中腫瘤沒有發(fā)展。
實施例6當(dāng)與膠囊化RENCA細(xì)胞同時溫育時，自由接種的RENCA細(xì)胞的生長則被抑制。進(jìn)一步進(jìn)行了一組實驗以檢測這一影響是否對其它細(xì)胞也明顯。
從美國典型培養(yǎng)物保藏中心獲得腺癌細(xì)胞系，即MMT(小鼠乳房腫瘤)。如上述，用MMT細(xì)胞制備膠囊化的MMT細(xì)胞，產(chǎn)生每珠包含120,000個或者240,000個細(xì)胞的珠。制備珠后，用它們來檢測其是否能抑制RENCA細(xì)胞在體外的增殖。具體地說，準(zhǔn)備兩個六孔培養(yǎng)平板，并在4ml培養(yǎng)基中每孔接種1×104RENCA細(xì)胞。在每個平板中，三個孔作為對照組，另三個為試驗組。讓每平板中的三個對照組的一個孔接收一粒珠。其它兩孔的每孔接收兩個或者三個空的珠。同樣處理第二組，點樣孔中分別接收一粒，兩?；蛘呷：?20,000個或者240,000個MMT細(xì)胞的珠。37℃下溫育點樣孔一周，在之后用胰酶消化RENCA細(xì)胞，洗滌，并且利用血細(xì)胞計來計數(shù)。結(jié)果如下

實施例7接著實施例6的結(jié)果，利用1×104MMT細(xì)胞而非RENCA細(xì)胞進(jìn)行了相同的實驗。實驗精確地按實施例6進(jìn)行。結(jié)果如下所示。

這些結(jié)果促進(jìn)了體內(nèi)實驗的應(yīng)用。這點在實施例8中說明。
實施例8如前面實施例中使用的RENCA細(xì)胞是腎癌細(xì)胞。為更完全顯示本發(fā)明的普遍效應(yīng)，利用不同類型的癌細(xì)胞進(jìn)行了研究。具體地說，即利用腺癌細(xì)胞。
從美國典型培養(yǎng)物保藏中心獲得小鼠乳房腫瘤細(xì)胞系(MMT)。利用前面的方案，制備每珠包含120,000個細(xì)胞，和包含240,000個細(xì)胞的植入物。
所利用實驗?zāi)Ｐ褪乔懊娴男∈竽Ｐ汀⒍恍∈髣澐殖?只、9只、9只各組。第一小組，即對照組，進(jìn)一步劃分成三組分別為兩只，一只，一只。第一亞組所接收的植入物是不包含任何細(xì)胞的一粒珠。一只小鼠接收兩個空的珠，同時另一只接收三個空的珠。
在實驗小組A(9只動物)中是包含120,000個細(xì)胞的珠，而在B小組中是包含240,000個細(xì)胞的珠。在小組″A″和″B″中，再分組為三個亞組，每亞組有三只小鼠。亞組中小鼠分別接收一粒，兩?；蛘呷０琈MT細(xì)胞的珠。
植入二十一天后，給所有動物注射40,000個RENCA細(xì)胞。注射后，小鼠立即無生氣，毛發(fā)粗短刺狀。大約持續(xù)五天，在這之后觀察到正常的行為。
二十天之后，對照組小鼠腹部脹大，毛發(fā)表現(xiàn)明顯粗短刺狀。在注射25天后，一只對照組小鼠死去，且余下的對照組小鼠呈現(xiàn)將死狀態(tài)。處死所有小鼠，觀察腫瘤發(fā)展情況。觀察記錄如下

這些結(jié)果表明，檢驗的十八只小鼠中，有十三只不顯示任何疾病。在小組A中，一只小鼠有少量模塊，另一只小鼠有少量腫瘤。接收兩粒珠的一只小鼠有一些腫瘤。
在小組B中，接收一粒珠的一只小鼠，及接收兩粒珠的一只小鼠，顯示出一些圍繞腸的腫瘤。接收三粒珠的一只小鼠長了一個大的實體腫瘤，并且呈現(xiàn)明顯病態(tài)。但是，總體結(jié)果表明膠囊化的小鼠乳腺瘤細(xì)胞抑制腫瘤形成。
實施例9如前述，本發(fā)明的實踐產(chǎn)生一些物質(zhì)或因子，它們抑制和/或防止腫瘤細(xì)胞增殖。這點在以下實驗中作進(jìn)一步探討。
除不加atellocallogen外，按照前面實施例2所述制造出另外的珠。因此，這些珠是瓊脂糖/瓊脂糖珠。將上述的RENCA細(xì)胞再一次按如上所述摻入到這些珠中。
然后，用三個為一組的兩套六孔平板分別作為對照組和實驗組。在對照組中，在孔中加入4ml RPMI完全培養(yǎng)基(10％胎牛血清和11ml/l青霉素)。然后給每一對照組接種10,000個RENCA細(xì)胞。
實驗組中，在含50ml RPMI完全培養(yǎng)基的35×100mm培養(yǎng)平板中，加入經(jīng)溫育10粒包含RENCA的免疫-隔離的珠(每珠含120,000個細(xì)胞)而得到的物質(zhì)，調(diào)節(jié)RPMI完全培養(yǎng)基條件。溫育五天后，從平板收集培養(yǎng)基，并將4ml的培養(yǎng)基放置在每一檢驗孔中。然后給這些孔接種10,000個RENCA細(xì)胞。
所有平板(對照組和實驗組)在37℃溫育五天。溫育后，用胰蛋白酶消化洗滌細(xì)胞，并用血細(xì)胞計計數(shù)。胰蛋白酶消化后，將平板中每個孔中的細(xì)胞集中起來，并且計數(shù)，結(jié)果如下。

這些結(jié)果表明這些細(xì)胞當(dāng)限制在本發(fā)明珠中時產(chǎn)生某些抑制腫瘤細(xì)胞增殖的因子。這些細(xì)胞由于陷入珠中而產(chǎn)生限制性抑制因子，其不同于其它物質(zhì)，如當(dāng)細(xì)胞相互接觸時產(chǎn)生的接觸性抑制因子。
實施例10前面進(jìn)行的實驗表明，在條件培養(yǎng)基中RENCA細(xì)胞生長率是對照組培養(yǎng)基中細(xì)胞生長率的一半。此處進(jìn)行的實驗用于檢查在條件培養(yǎng)基被冷凍之后抑制因子是否仍能保持活性。
溫育10粒包含免疫分離的RENCA的珠五天，從而制備RENCA條件培養(yǎng)基。37℃，在35×100mm培養(yǎng)平板中，用50ml RMPI完全培養(yǎng)基進(jìn)行溫育。溫育后，收集培養(yǎng)基并存放于-20℃。溫育包含免疫分離的MMT(小鼠乳房腫瘤)細(xì)胞的珠，從而制備條件培養(yǎng)基。每個珠包含240,000個細(xì)胞；其它所有條件都相同。
冷凍培養(yǎng)基在37℃下解凍，然后用于下列檢驗。三個六孔平板分別用于每種處理，即(1)RMPI對照組培養(yǎng)基，(2)RENCA冷凍的條件培養(yǎng)基，(3)MMT冷凍的條件培養(yǎng)基?？偣矠?ml的培養(yǎng)基分配到每個孔中。然后給所有孔接種10,000個RENCA細(xì)胞，37℃溫育五天。溫育后，從兩個平板的每個孔中取出樣品，用胰酶消化，集中起來并且用血細(xì)胞計計數(shù)。八天后，將余下的三個平板的每個孔以相同的方法進(jìn)行檢驗。
結(jié)果如下

將結(jié)果與前面實施例6的結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)盡管冷凍/解凍的RENCA條件培養(yǎng)基不能抑制生長達(dá)未冷凍培養(yǎng)基所能達(dá)到的相同程度(比較實施例6和7)，但是它仍然抑制生長。采用MMT細(xì)胞的冷凍條件培養(yǎng)基比未冷凍的MMT條件培養(yǎng)基更能抑制生長。這些結(jié)果表明18只檢驗小鼠中，13只無任何疾病。小組(A)的小鼠中，一只小鼠有少量模塊，另一只小鼠有少量腫瘤。
前面所提及的內(nèi)容描述了可植入珠的制造，其含有一個或多個類型的能產(chǎn)生一種擴(kuò)散性生物產(chǎn)物的細(xì)胞，在這里定義這一詞組。擴(kuò)散性生物產(chǎn)物是一種對植入了珠的受治療者有作用的物質(zhì)。優(yōu)選的這一作用是免疫調(diào)節(jié)，如刺激免疫反應(yīng)，或者抑制反應(yīng)。在癌癥的情況下，例如，擴(kuò)散性生物產(chǎn)物可能是一種肽，其與受治療者中癌細(xì)胞上的MHC分子復(fù)合，由此引起CTL作用，反過來導(dǎo)致降低受治療者中腫瘤出現(xiàn)。擴(kuò)散性產(chǎn)物也可以是腫瘤生長的抑制劑。與此治療形式有關(guān)的，在所確定的腫瘤內(nèi)或附近放置所植入的珠是可能的(雖然不一定是優(yōu)選的)。
此處所使用的″擴(kuò)散性生物產(chǎn)物″指諸如蛋白質(zhì)，糖蛋白，脂蛋白，碳水化合物，類脂，糖脂，以及肽。更具體地說，例如抗體，細(xì)胞因子，激素，酶，等等之類的物質(zhì)，但不僅僅指所包括的這些物質(zhì)類型。已知的細(xì)胞過程中的″終產(chǎn)物″，如CO2和H2O不包括在內(nèi)。
如實驗所示，可植入的珠也能用于預(yù)防。大家知道，癌患者人群中至少一部分易于再發(fā)病。本文所描述的實驗表明，植入物可以通過擴(kuò)散性產(chǎn)物對受治療者系統(tǒng)的生物效應(yīng)而抑制癌的發(fā)生或者再發(fā)生。
本發(fā)明的討論集中于體內(nèi)方法。同樣必須了解本發(fā)明也包括體外方法，在這里討論了一些。例如，眾所周知，能產(chǎn)生所需產(chǎn)物的許多細(xì)胞在體外培養(yǎng)時，需要存在飼養(yǎng)細(xì)胞。針對飼養(yǎng)細(xì)胞總有些爭論，它們可能比所需細(xì)胞生長快，從而導(dǎo)致了感興趣物質(zhì)的″窒息″。此外，存在飼養(yǎng)細(xì)胞層產(chǎn)生各種有毒產(chǎn)物的問題。本發(fā)明的可植入的珠幾乎作為細(xì)胞溫箱起作用，保護(hù)摻入進(jìn)的細(xì)胞，同時使擴(kuò)散性產(chǎn)物進(jìn)入培養(yǎng)基，例如，可收集它們的地方。
如前所述，制備可植入的珠首先要求細(xì)胞懸浮在溶液中，優(yōu)選地是懸浮在含水膠原中。優(yōu)選地，膠原是約0.5％到約2％的atelocollagen溶液。根據(jù)所用細(xì)胞類型，在給定時間時，溶液中細(xì)胞數(shù)量，由此珠中的細(xì)胞數(shù)量都將變化。優(yōu)選地，每個珠用約10,000到約200,000個細(xì)胞，更優(yōu)選地，用約30,000到約100,000個細(xì)胞。最優(yōu)選地，用約40,000到約60,000個細(xì)胞。
將細(xì)胞懸浮在膠原溶液中后，加入瓊脂糖溶液。優(yōu)選地，瓊脂糖溶液從約0.5％到約5％的范圍，優(yōu)選地約1％。將混合物滴在惰性物質(zhì)上或滴入進(jìn)，如TEFLON或礦物油中，形成珠。這個珠是半固體。然后將半固體珠轉(zhuǎn)移到無菌培養(yǎng)基中，優(yōu)選地為包含抗生素的培養(yǎng)基，進(jìn)行洗滌，及溫育以使膠原聚合。膠原聚合是一種充分研究過的現(xiàn)象，這一現(xiàn)象發(fā)生的條件不必在這里詳細(xì)描述。
珠凝固后，用瓊脂糖包被，優(yōu)選地是通過使它在瓊脂糖溶液中翻滾包被。一種優(yōu)選的完成這一操作的方式是簡單的涂布有TEFLON的勺子，勺子盛有瓊脂糖的溶液(優(yōu)選為5％到10％)。
前面所提及的關(guān)于擴(kuò)散性生物產(chǎn)物的討論，不應(yīng)該限制在野生型的物質(zhì)。例如，人們可以容易地?fù)饺朕D(zhuǎn)導(dǎo)或者轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，如真核細(xì)胞(例如，293細(xì)胞，CHO細(xì)胞，COS細(xì)胞)，或甚至是原核細(xì)胞(如大腸桿菌)，這些細(xì)胞經(jīng)過處理以產(chǎn)生異源的蛋白質(zhì)，或者經(jīng)過修飾，如同源重組，而產(chǎn)生增加量的所需生物產(chǎn)物，其它材料，例如雜交瘤也可以使用，其擴(kuò)散性生物產(chǎn)物是單克隆抗體。
本發(fā)明的其它特性與方面對于技術(shù)人員來說很清楚，這里不必敘述。
采用的表達(dá)和術(shù)語用來作為描述的術(shù)語但不是限制的術(shù)語，無意于用這些術(shù)語和表達(dá)來排除所示的或所描述的特征的任何等同特征或者其部分，應(yīng)認(rèn)識到在本發(fā)明的范圍內(nèi)進(jìn)行各種修改是可能的。
權(quán)利要求
1.一種確定一種物質(zhì)組合物是否可用于抑制癌細(xì)胞增殖的方法，包括將一種非受限的癌細(xì)胞樣品加入至培養(yǎng)基中，其中所述培養(yǎng)基已經(jīng)被用于培養(yǎng)一種包含受限于一種珠中的癌細(xì)胞樣品的物質(zhì)組合物，將所述非受限的癌細(xì)胞樣品在所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段確定的時間，并將所述非受限的癌細(xì)胞樣品的增殖與同樣培養(yǎng)基中的一種所述非受限的癌細(xì)胞樣品的增殖進(jìn)行比較，其中所述培養(yǎng)基未被用于培養(yǎng)所述物質(zhì)組合物，其中增殖的下降指示所述物質(zhì)組合物可用于抑制所述非受限的癌細(xì)胞的增殖。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述的珠包含瓊脂糖。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述的珠是固體狀瓊脂糖包被的含瓊脂糖珠。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述受限的癌細(xì)胞是上皮性癌細(xì)胞。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述受限的癌細(xì)胞是乳腺癌細(xì)胞或腎癌細(xì)胞。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述受限的癌細(xì)胞是人類癌細(xì)胞。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述受限的癌細(xì)胞是小鼠癌細(xì)胞。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述珠含有10,000～240,000個癌細(xì)胞。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述珠含有30,000～240,000個癌細(xì)胞。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述受限的癌細(xì)胞的類型不同于所述非受限的癌細(xì)胞。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述受限的癌細(xì)胞的類型與所述非受限的癌細(xì)胞相同。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述非受限的癌細(xì)胞是人類癌細(xì)胞。
13.一種確定一種物質(zhì)組合物是否可用于抑制癌細(xì)胞增殖的方法，包括將一種非受限的癌細(xì)胞樣品、培養(yǎng)基和一種包含受限于一種珠中的癌細(xì)胞樣品的物質(zhì)組合物進(jìn)行混合以形成一種第一混合物，將所述混合物培養(yǎng)一段確定的時間，并將所述非受限的癌細(xì)胞的增殖與一種第二混合物進(jìn)行比較，所述第二混合物由所述培養(yǎng)基和所述非受限的癌細(xì)胞構(gòu)成，不含所述物質(zhì)組合物，且經(jīng)過同樣時間的培養(yǎng)，其中所述第一混合物的增殖的下降指示所述物質(zhì)組合物可用于抑制所述非受限的癌細(xì)胞的增殖。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述的珠包含瓊脂糖。
15.權(quán)利要求13的方法，其中所述的珠是固體狀瓊脂糖包被的含瓊脂糖珠。
16.權(quán)利要求13的方法，其中所述受限的癌細(xì)胞是上皮性癌細(xì)胞。
17.權(quán)利要求13的方法，其中所述受限的癌細(xì)胞是乳腺癌細(xì)胞或腎癌細(xì)胞。
18.權(quán)利要求13的方法，其中所述受限的癌細(xì)胞是人類癌細(xì)胞。
19.權(quán)利要求13的方法，其中所述受限的癌細(xì)胞是小鼠癌細(xì)胞。
20.權(quán)利要求13的方法，其中所述珠含有10,000～240,000個癌細(xì)胞。
21.權(quán)利要求13的方法，其中所述珠含有30,000～240,000個癌細(xì)胞。
22.權(quán)利要求13的方法，其中所述受限的癌細(xì)胞的類型不同于所述非受限的癌細(xì)胞。
23.權(quán)利要求13的方法，其中所述受限的癌細(xì)胞的類型與所述非受限的癌細(xì)胞相同。
24.權(quán)利要求13的方法，其中所述非受限的癌細(xì)胞是人類癌細(xì)胞。
全文摘要
可植入的珠(其由瓊脂糖和膠原組成，和/或包被有一層瓊脂糖)內(nèi)已經(jīng)摻入細(xì)胞樣品。所說的細(xì)胞產(chǎn)生擴(kuò)散性生物產(chǎn)物。這些珠可以用作植入物來調(diào)節(jié)接受者的免疫反應(yīng)。這些珠也可以用于在體外環(huán)境中促進(jìn)特定類型的細(xì)胞生長，從而在培養(yǎng)物中產(chǎn)生所需產(chǎn)物，或者也可以用于抑制某些細(xì)胞的生長。在施用到受治療者后，所說的植入物也可以抑制某些細(xì)胞生長。
文檔編號C12N5/00GK1769430SQ20051011861
公開日2006年5月10日 申請日期1997年3月21日 優(yōu)先權(quán)日1996年4月3日
發(fā)明者坎蒂·賈殷, 阿爾伯特·L·魯賓, 希林·阿西納, 伯里·史密斯, 庫爾特·施滕策爾 申請人:羅格森研究所