專利名稱：菌根真菌在石斛大面積栽培中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及一項(xiàng)在石斛大面積栽培中應(yīng)用菌根真菌以縮短石斛生產(chǎn)周期，提高石斛產(chǎn)量和質(zhì)量的實(shí)用技術(shù)。

背景技術(shù)：
石斛是我國傳統(tǒng)的名貴中藥，具有益胃生津、滋陰清熱、潤肺止咳等功效。藥理學(xué)研究表明，石斛屬植物具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力，抗腫瘤，抗衰老，抗血小板凝聚等作用。我國目前供藥用的石斛屬(Dendrobium)植物有30多種，主要分布在華南及西南地區(qū)。中華人民共和國藥典(2005版)收載金釵石斛(D.nobile Lindl.)，鐵皮石斛(Dendrobium candidum Wall.exLindl.)或馬鞭石斛(D.fimbriatum Hook.Var.oculatum Hook.)及其近似種的新鮮或干燥莖可做中藥石斛使用。多年來，由于產(chǎn)區(qū)藥農(nóng)的過度采挖，使得中藥石斛的藥用資源受到嚴(yán)重破壞，金釵石斛和鐵皮石斛這兩種植物的自然資源已瀕臨枯竭，均已被列為國家重點(diǎn)保護(hù)的珍稀瀕危物種。
由于石斛屬植物種子細(xì)小，萌發(fā)困難，同時(shí)無性繁殖系數(shù)低，加上其特殊的生活環(huán)境，給此類藥材的大面積栽培帶來很大困難?？茖W(xué)工作者和藥農(nóng)最廣泛采用的是組織培養(yǎng)和人工栽培相結(jié)合的方法來繁殖鐵皮石斛和金釵石斛。該方法存在的主要問題是無菌組培苗的移栽成活率低，抗病性差，易感染病原菌；人工栽培石斛的生產(chǎn)周期長，一般要5-7年才能收獲。從目前情況看，石斛繁殖困難的問題還沒有從根本上得到解決，導(dǎo)致生產(chǎn)上無法提供大量產(chǎn)品供藥用。
根據(jù)蘭科植物與真菌形成菌根結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，我們自1987年開始從事自養(yǎng)型蘭科藥用植物菌根真菌的分離、培養(yǎng)，并進(jìn)行了利用菌根真菌促進(jìn)石斛、白芨等蘭科藥用植物生長和提高有效成分含量等方面的研究，并取得了較好效果。隨后，我們自1992年開始進(jìn)行蘭科菌根真菌在石斛等蘭科藥用植物生長中的應(yīng)用研究。我們從野生石斛的根中已經(jīng)分離獲得多種內(nèi)生真菌，對(duì)它們促進(jìn)石斛生長發(fā)育的關(guān)系進(jìn)行了系統(tǒng)研究，從中篩選出對(duì)石斛的生長發(fā)育具有促進(jìn)作用的優(yōu)良菌株。將這些菌株用于石斛的栽培生產(chǎn)，對(duì)于提高石斛的產(chǎn)量和質(zhì)量，保護(hù)石斛的自然資源具有重大的理論意義和實(shí)用價(jià)值。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種應(yīng)用菌根真菌大面積栽培石斛的方法，該方法石斛繁殖率高，栽培成活率高，可以縮短栽培石斛的生產(chǎn)周期，提高石斛的產(chǎn)量和質(zhì)量，解決石斛藥用資源短缺的問題。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)是先分別培養(yǎng)菌根真菌和石斛苗，當(dāng)石斛苗移栽到大田時(shí)加入菌根真菌共生栽培。本發(fā)明采用的4種小菇屬菌根真菌經(jīng)培養(yǎng)鑒定，分別為分離自鐵皮石斛的石斛小菇MD-1(Mycena dendrobii)，分離自天麻的紫萁小菇MO-1(Mycenaosmundicola)，分離自墨蘭的蘭小菇MO-2(Mycena orchidicola)和分離自福建金線蓮(花葉開唇蘭)的開唇蘭小菇MA-1(Mycena anoectochila)。這4種真菌于2002年1月14日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏單位地址北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)分別為MD-1CGMCC No.0685；MO-1CGMCC No.0689；MO-2CGMCC No.0688；MA-1CGMCC No.0687；保藏和存活證明見附件。
具體地說，本發(fā)明所述技術(shù)的步驟方法如下(除有特殊說明外，本發(fā)明中所述的比例均為重量百分比) 1.菌根真菌的培養(yǎng) 將上述4種菌根真菌自低溫保藏的斜面試管菌種活化后，分別轉(zhuǎn)接于PDA平皿中，于22-28℃恒溫培養(yǎng)10-20天，分別在菌落邊緣打孔成菌片，并以小碎塊接入液體培養(yǎng)基中分別進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)制成種子菌種。種子菌種可以進(jìn)一步接入液體或固體培養(yǎng)基進(jìn)行放大培養(yǎng)。
真菌液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基含有葡萄糖、無機(jī)鹽類成分和天然添加物，其中葡萄糖的加入量為1.5-4％；無機(jī)鹽類成分可以為硫酸鎂，磷酸二氫鉀，或磷酸氫二鉀，或磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀以任意比例混合的混合物，其加入量為硫酸鎂0.1-0.3％，磷酸二氫鉀0.1-0.5％，或磷酸氫二鉀0.1-0.5％，或磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀的混合物0.1-0.5％；天然添加物可以為麥麩(煮汁)，其加入量為2-5％。培養(yǎng)基pH 5.0-6.5。三角瓶或其他容器振蕩培養(yǎng)或發(fā)酵罐通氣培養(yǎng)，培養(yǎng)容器裝量10-60％。培養(yǎng)基滅菌后接入上述菌根真菌，種子菌種接種量為培養(yǎng)容器裝量的5-20％。菌根真菌液體培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為振蕩轉(zhuǎn)速80-150轉(zhuǎn)/分鐘，18-28℃暗培養(yǎng)10-30天。培養(yǎng)結(jié)束后可直接使用或用勻漿機(jī)打碎培養(yǎng)產(chǎn)物備用。
菌根真菌固體培養(yǎng)的培養(yǎng)基中天然纖維性或淀粉性物質(zhì)可以為闊葉樹鋸末、麥麩和碎玉米粒，這3種原料加入量之間的比例按重量計(jì)為闊葉樹鋸末∶麥麩∶碎玉米粒＝0.5-1.5∶0.5-1.5∶0.2-1.5。固體培養(yǎng)基的加水量為以上3種原料總重量的1-4倍。培養(yǎng)基pH 5.0-6.5。試管、玻璃罐頭瓶或塑料袋等器皿靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)容器裝量50-80％。培養(yǎng)基滅菌后接入液體培養(yǎng)的小菇屬真菌的種子菌種，種子菌種的接種量為培養(yǎng)容器裝量的5-15％。固體培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為18-28℃暗培養(yǎng)，待菌絲從培養(yǎng)基頂部長入底部或長滿培養(yǎng)基時(shí)(2個(gè)月左右)取出備用。
2.石斛苗的培養(yǎng) 石斛原球莖經(jīng)過原球莖增殖、原球莖分化成苗、壯苗等步驟的培養(yǎng)，培育成苗。壯苗步驟可以將苗接在壯苗培養(yǎng)基上單獨(dú)培養(yǎng)，也可以在壯苗培養(yǎng)的后期接入菌根真菌的PDA平皿培養(yǎng)的菌片，菌片直徑3-15mm，每瓶苗接入1-5片菌片，或接入菌根真菌的液體培養(yǎng)物0.2-1.5ml，或接入菌根真菌的固體培養(yǎng)物0.2-1.5g，菌苗共培養(yǎng)時(shí)間為10-90天。經(jīng)壯苗后的石斛苗可以在繼代培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)。各步驟所用培養(yǎng)基及培養(yǎng)時(shí)間分別為 (1)用于原球莖增殖的培養(yǎng)基是以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)和激動(dòng)素(KT)，其加入量為每升(L)培養(yǎng)基加入NAA0.1-1.0mg，IBA0.1-0.8mg，KT0.1-0.8mg。培養(yǎng)時(shí)間45-120天。
(2)用于原球莖分化的培養(yǎng)基是以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加IBA和KT，其加入量為每升(L)培養(yǎng)基加入IBA0.2-1.0mg，KT0.2-1.0mg。培養(yǎng)時(shí)間45-120天。
(3)用于壯苗的培養(yǎng)基是以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加NAA、IBA和KT，其加入量為每升(L)培養(yǎng)基加入NAA0.2-1.5mg，IBA0.2-1.5mg，KT0.2-1.5mg。培養(yǎng)時(shí)間60-120天。
(4)用于石斛苗繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基是以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，每升(L)培養(yǎng)基附加馬鈴薯(煮汁)100-300g。培養(yǎng)時(shí)間60-120天。
石斛原球莖增殖、原球莖分化成苗、壯苗和苗的繼代培養(yǎng)中，所用的每升(L)1/2MS基本培養(yǎng)基中均要添加蔗糖15-35g、肌醇50-150mg、瓊脂6-15g。原球莖分化成苗、壯苗和苗的繼代培養(yǎng)中，所用的每升(L)培養(yǎng)基中均要添加活性炭0.5-4g。培養(yǎng)基pH 5.0-6.5。用玻璃三角瓶或玻璃罐頭瓶等器皿靜置光照培養(yǎng)，培養(yǎng)容器裝量10-50％。苗的培養(yǎng)條件為15-28℃光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度1500-5000Lux，光照時(shí)間8-12小時(shí)/天。
3.石斛苗與菌根真菌的共生栽培、田間管理及收獲 石斛苗與菌根真菌的共生栽培基質(zhì)有以下幾種 (1)基質(zhì)1中可以有蛭石、珍珠巖、鋸末加刨花和碎石頭，這4種材料加入量之間的比例按重量計(jì)為蛭石∶珍珠巖∶鋸末加刨花∶碎石頭＝1-2∶1∶2-5∶1-3； (2)基質(zhì)2中可以有闊葉樹樹皮、腐殖土和碎石頭，這3種材料加入量之間的比例按重量計(jì)為闊葉樹樹皮∶腐殖土∶碎石頭＝3-6∶1-2∶1-5； (3)基質(zhì)3中可以有泥炭土、珍珠巖、鋸末加刨花和闊葉樹樹皮，這4種材料加入量之間的比例按重量計(jì)為泥炭土∶珍珠巖∶鋸末加刨花∶闊葉樹樹皮＝1-2∶1∶2-5∶3-6； (4)基質(zhì)4中可以有鋸末加刨花和闊葉樹樹皮，這2種材料加入量之間的比例按重量計(jì)為鋸末加刨花∶闊葉樹樹皮＝1-3∶2-6； (5)基質(zhì)5中可以有鋸末加刨花、闊葉樹樹皮和碎石頭，這3種材料加入量之間的比例按重量計(jì)為鋸末加刨花∶闊葉樹樹皮∶碎石頭＝1-3∶2-6∶2-5； (6)基質(zhì)6中可以有碎磚、闊葉樹樹皮和碎木炭，這3種材料加入量之間的比例按重量計(jì)為碎磚∶闊葉樹樹皮∶碎木炭＝1-5∶2-8∶1-4； (7)基質(zhì)7中可以有鋸末加刨花、碎木炭和闊葉樹樹皮，這3種材料加入量之間的比例按重量計(jì)為鋸末加刨花∶碎木炭∶闊葉樹樹皮＝2-5∶1-3∶3-7； (8)基質(zhì)8中可以有闊葉樹樹皮和蕨樹根，這2種材料加入量之間的比例按重量計(jì)為闊葉樹樹皮∶蕨樹根＝2-5∶1-3； 上述栽培基質(zhì)中用到的材料的大小為碎刨花、碎木炭直徑0.5-2cm，闊葉樹樹皮直徑0.5-4cm，碎石頭、碎磚直徑1-5cm，蕨樹根直徑0.5-3cm； 栽培中還要用到山毛櫸科Fagaceae植物櫟樹或其他雜木樹的自然落葉，用時(shí)粉碎并浸濕，碎樹葉直徑0.5-2cm； 上述材料中的闊葉樹樹皮、鋸末和刨花、蕨樹根、腐殖土等可直接使用，或高溫滅菌，或提前兩個(gè)月鋪好使其熟化，或堆積并蓋塑料布發(fā)酵1-2個(gè)月，使其熟化以消除病蟲害。
4種菌根真菌的液體培養(yǎng)物或固體培養(yǎng)物，在用于與石斛的共生栽培時(shí)，可以單獨(dú)使用，或分別培養(yǎng)后任意選擇兩種或兩種以上共同使用。石斛苗和菌根真菌按以下方法共生栽培 (1)地上遮陽栽培在具有遮陽網(wǎng)的露天大棚，或塑料薄膜溫室，或玻璃溫室中進(jìn)行栽培，栽培基質(zhì)厚度5-20cm。栽培時(shí)以2-5株石斛苗為一叢進(jìn)行栽培，先在石斛苗根的基部放置0.5-5g濕的碎樹葉，再在石斛苗根部放置以上備好的菌根真菌液體培養(yǎng)物0.4-2.5ml，或菌根真菌固體培養(yǎng)物0.3-2.0g，最后用栽培基質(zhì)埋住石斛苗的根部，苗叢栽培的株、行距為8-18cm。
(2)立體遮陽栽培在地上搭架分層立體栽培，在硬質(zhì)材料的盆或盒等容器的底部平鋪一層共生栽培基質(zhì)，栽培基質(zhì)厚度3-10cm。栽培時(shí)以2-5株石斛苗為一叢進(jìn)行栽培，先在石斛苗根的基部0.5-5g濕的碎樹葉，再在石斛苗根部放置以上備好的菌根真菌液體培養(yǎng)物0.4-2.5ml，或菌根真菌固體培養(yǎng)物0.3-2.0g，最后用栽培基質(zhì)埋住石斛苗的根部。叢苗栽培的株、行距為8-18cm。
石斛苗與菌根真菌共生栽培后需要的生長條件環(huán)境溫度為5-30℃，光照量為正常日光量的1/3或1/2，避免直射光，或照度為2000-10000Lux；在石斛與菌根真菌共生的過程中每年可以補(bǔ)施液體培養(yǎng)或固體培養(yǎng)的菌根真菌0-5次。
與菌根真菌共生栽培的石斛，在上述栽培條件下生長2-3年可以收獲，收獲時(shí)采用“存一去二或存二去三”的方法收獲栽培石斛的莖，即剪去二年或三年生的莖，保存一年或二年以下的幼莖；或采用“存二去三或存三去四”的方法收獲栽培石斛的莖，即剪去三年或四年生的老莖，保存二或三年以下的幼莖；收獲的新鮮石斛莖直接加工成產(chǎn)品，或陰干，或60℃以下烘干。

具體實(shí)施例方式 實(shí)施例一 1.紫萁小菇MO-1(Mycena osmundicola)的培養(yǎng) 將MO-1自低溫保藏的斜面試管菌種活化一次后，轉(zhuǎn)接于PDA平皿中，25℃恒溫培養(yǎng)18天，用φ8mm的打孔器分別在平皿中的菌落邊緣打孔成菌片，分別以小碎塊接入液體培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)。液體培養(yǎng)基的組成按重量百分含量計(jì)算為葡萄糖2.5％，磷酸二氫鉀0.15％，磷酸氫二鉀0.1％，硫酸鎂0.15％，麥麩3％(煮汁)。培養(yǎng)基pH 5.6，500mL三角瓶裝培養(yǎng)基250mL，高壓滅菌后接入MO-1真菌。培養(yǎng)條件為搖床震蕩轉(zhuǎn)速120轉(zhuǎn)/分鐘，23℃暗培養(yǎng)25天后用勻漿機(jī)打碎菌體及發(fā)酵物備用。
2.鐵皮石斛苗的培養(yǎng) 鐵皮石斛種子在無菌條件下萌發(fā)、分化形成原球莖，原球莖經(jīng)過原球莖增殖、原球莖分化成苗和壯苗等步驟的培養(yǎng)，培育成苗。
原球莖增殖的培養(yǎng)基是以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，每升(L)培養(yǎng)基加入蔗糖30g，肌醇100mg，萘乙酸(NAA)0.2mg，吲哚丁酸(IBA)0.2mg，激動(dòng)素(KT)0.2mg，瓊脂7.5g。培養(yǎng)基pH 5.6。100mL玻璃三角瓶裝量35mL，121℃滅菌20分鐘，接入鐵皮石斛原球莖。培養(yǎng)條件24-26℃光照培養(yǎng)80天，光照強(qiáng)度3000Lux，光照時(shí)間10小時(shí)/天。
原球莖分化的培養(yǎng)基是以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，每升(L)培養(yǎng)基加入蔗糖20g，肌醇80mg，吲哚丁酸(IBA)0.5mg，激動(dòng)素(KT)0.5mg，活性炭1g，瓊脂7.0g。培養(yǎng)基pH 5.8。100mL玻璃三角瓶裝量30mL，121℃滅菌20分鐘，接入鐵皮石斛原球莖。培養(yǎng)條件24-26℃光照培養(yǎng)60天，光照強(qiáng)度3000Lux，光照時(shí)間10小時(shí)/天。
壯苗培養(yǎng)的培養(yǎng)基是以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，每升(L)培養(yǎng)基加入蔗糖30g，肌醇120mg，萘乙酸(NAA)0.5mg，吲哚丁酸(IBA)0.5mg，激動(dòng)素(KT)0.2mg，活性炭2g，瓊脂8.5g。培養(yǎng)基pH 5.7。100mL玻璃三角瓶裝量40mL，121℃滅菌20分鐘，接入鐵皮石斛苗。培養(yǎng)條件24-26℃光照培養(yǎng)100天，光照強(qiáng)度3000Lux，光照時(shí)間10小時(shí)/天。鐵皮石斛苗培養(yǎng)至株高3.5cm以上，有節(jié)3個(gè)以上的壯苗即可進(jìn)行栽培。
石斛苗繼代的培養(yǎng)基是以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，每升(L)培養(yǎng)基加入馬鈴薯(煮汁)200g，蔗糖25g，肌醇100mg，活性炭2g，瓊脂7g。培養(yǎng)基pH 5.8。100mL玻璃罐頭瓶裝量30％，121℃滅菌20分鐘，接入鐵皮石斛的壯苗。培養(yǎng)條件為24-26℃光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度3000Lux，光照時(shí)間10小時(shí)/天。暫時(shí)不能移栽的鐵皮石斛的壯苗可以在此培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
3.鐵皮石斛苗與紫萁小菇MO-1的共生栽培 共生栽培的基質(zhì)選用基質(zhì)5，其中鋸末加刨花、闊葉樹樹皮和碎石頭的加入量之間的比例按重量計(jì)為鋸末加刨花∶闊葉樹樹皮∶碎石頭＝2∶2∶3。鋸末加刨花和闊葉樹樹皮直接使用。采用立體遮陽的方法進(jìn)行栽培。在木質(zhì)托盤的基部平鋪一層4-6cm厚的共生栽培基質(zhì)，栽培時(shí)以3株鐵皮石斛苗為一叢進(jìn)行栽培，先在鐵皮石斛苗根的基部放置2g左右的濕的碎樹葉，再在石斛苗根部放置以上備好的紫萁小菇MO-1液體培養(yǎng)物2ml左右，使鐵皮石斛的根與MO-1菌接觸，最后用栽培基質(zhì)埋住石斛苗的根部。叢苗栽培的株、行距為10cm。
在露天搭架，分層放置木質(zhì)托盤，并架設(shè)遮陽網(wǎng)，避免直射光，最忌夏秋中午前后的直射光，光照量為正常日光量的1/3左右，照度2000-5000Lux，每天光照9-11h。石斛適宜的環(huán)境溫度為18-23℃，其空氣溫度夏天應(yīng)控制在25℃以下，冬天應(yīng)控制在18℃以上。石斛生長需較高的空氣濕度，但栽培基質(zhì)中不宜積水。
鐵皮石斛苗與紫萁小菇MO-1共生栽培后，每年在春秋兩季補(bǔ)施液體培養(yǎng)或固體培養(yǎng)的紫萁小菇MO-12-4次。鐵皮石斛培養(yǎng)2-4年收獲，采用存二去三或存三去四的方法，即收獲生長了三或四年的老莖，保存二或三年以下的幼莖。收獲的鐵皮石斛陰干。
實(shí)施例二 1.石斛小菇MD-1(Mycena dendrobii)和蘭小菇MO-2(Mycena orchidicola)的培養(yǎng)將MD-1和MO-2分別自低溫保藏的斜面試管菌種活化一次后，分別轉(zhuǎn)接于PDA平皿中，25℃恒溫培養(yǎng)10天，用φ8mm的打孔器分別在平皿中的菌落邊緣打孔成菌片，分別以小碎塊接入液體培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)。液體培養(yǎng)基的組成按重量百分含量計(jì)算為葡萄糖3％，磷酸二氫鉀0.3％，硫酸鎂0.15％，麥麩3％(煮汁)。培養(yǎng)基pH 6.0。500mL三角瓶裝培養(yǎng)基200mL，高壓滅菌后分別接入MD-1和MO-2真菌。培養(yǎng)條件為搖床震蕩轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分鐘，25℃暗培養(yǎng)10天，作為MD-1和MO-2真菌的種子菌種。
將液體培養(yǎng)的MD-1和MO-2真菌的種子菌種分別接入固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。固體培養(yǎng)基的組成為闊葉樹鋸末、麥麩和碎玉米粒，這3種原料加入量之間的比例按重量計(jì)為闊葉樹鋸末∶麥麩∶碎玉米粒＝1∶1∶0.5。固體培養(yǎng)基的加水量為以上3種原料總重量的2.5倍。培養(yǎng)基pH 5.5。培養(yǎng)基裝在玻璃罐頭瓶中，培養(yǎng)容器裝量60-70％。培養(yǎng)基滅菌后分別接入液體培養(yǎng)的MD-1和MO-2真菌的種子菌種，種子菌種的接種量為培養(yǎng)容器裝量的10％左右。培養(yǎng)條件為22-23℃靜置暗培養(yǎng)。待MD-1和MO-2真菌的菌絲從培養(yǎng)基頂部長入底部或長滿培養(yǎng)基時(shí)取出，將兩種菌根真菌培養(yǎng)物按約1∶1的比例混合，備用。
2.金釵石斛苗的培養(yǎng) 金釵石斛種子在無菌條件下萌發(fā)、分化形成原球莖，原球莖經(jīng)過原球莖增殖、原球莖分化成苗和壯苗等步驟的培養(yǎng)，培育成苗。
原球莖增殖的培養(yǎng)基是以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，每升(L)培養(yǎng)基加入蔗糖15g，肌醇90mg，萘乙酸(NAA)0.2mg，吲哚丁酸(IBA)0.2mg，激動(dòng)素(KT)0.1mg，瓊脂7.5g。培養(yǎng)基pH 5.7。100mL玻璃三角瓶裝量25mL，121℃滅菌20分鐘，接入金釵石斛原球莖。培養(yǎng)條件24-26℃光照培養(yǎng)60天，光照強(qiáng)度2000Lux，光照時(shí)間10小時(shí)/天。
原球莖分化的培養(yǎng)基是以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，每升(L)培養(yǎng)基加入蔗糖25g，肌醇80mg，吲哚丁酸(IBA)0.3mg，激動(dòng)素(KT)0.2mg，活性炭1.5g，瓊脂9.0g。培養(yǎng)基pH 6.0。100mL玻璃三角瓶裝量30mL，121℃滅菌20分鐘，接入金釵石斛原球莖。培養(yǎng)條件24-26℃光照培養(yǎng)50天，光照強(qiáng)度2000Lux，光照時(shí)間10小時(shí)/天。
壯苗培養(yǎng)的培養(yǎng)基是以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，每升(L)培養(yǎng)基加入蔗糖35g，肌醇120mg，萘乙酸(NAA)0.5mg，吲哚丁酸(IBA)0.8mg，激動(dòng)素(KT)0.1mg，活性炭3g，瓊脂8.5g。培養(yǎng)基pH 5.6。100mL玻璃三角瓶裝量40mL，121℃滅菌20分鐘，接入金釵石斛苗。培養(yǎng)條件24-26℃光照培養(yǎng)100天，光照強(qiáng)度2000Lux，光照時(shí)間10小時(shí)/天。在壯苗培養(yǎng)至70天時(shí)，向培養(yǎng)基中接入蘭小菇MO-2的固體培養(yǎng)物約2g，與金釵石斛苗共同培養(yǎng)至出瓶移栽。金釵石斛苗培養(yǎng)至株高3.5cm以上，有節(jié)3個(gè)以上的壯苗即可進(jìn)行栽培。
3.金釵石斛苗與MD-1石斛小菇和蘭小菇MO-2的共生栽培 共生栽培的基質(zhì)選用基質(zhì)2，其中闊葉樹樹皮、腐殖土和碎石頭的加入量之間的比例按重量計(jì)為闊葉樹樹皮∶腐殖土∶碎石頭＝2∶1∶2。闊葉樹樹皮和腐殖土提前兩個(gè)月左右堆積使其熟化后使用。采用地上遮陽的方法，在塑料薄膜溫室中進(jìn)行栽培。在溫室鋪一層10-12cm厚的共生栽培基質(zhì)，栽培時(shí)以3-4株金釵石斛苗為一叢進(jìn)行栽培，先在金釵石斛苗根的基部放置2g左右的濕的碎樹葉，再在石斛苗根部放置以上備好的MD-1和MO-2真菌固體培養(yǎng)物的混合物1.5g左右，使金釵石斛苗的根與MD-1和MO-2的混合物接觸，最后用栽培基質(zhì)埋住石斛苗的根部。苗叢栽培的株、行距為10cm。
石斛適宜的環(huán)境溫度為18-23℃，其空氣溫度夏天應(yīng)控制在25℃以下，冬天應(yīng)控制在18℃以上。溫室內(nèi)要有遮陽網(wǎng)，避免直射光，最忌夏秋中午前后的直射光，光照量為正常日光量的1/3左右，照度2000-5000Lux，每天光照9-11h。石斛生長需較高的空氣濕度，但栽培基質(zhì)中不宜積水。
金釵石斛苗與石斛小菇MD-1和蘭小菇MO-2共生栽培后，每年在春秋兩季補(bǔ)施液體培養(yǎng)或固體培養(yǎng)的石斛小菇MD-1和蘭小菇MO-22-4次。金釵石斛培養(yǎng)2-4年收獲，采用存二去三或存三去四的方法，即收獲生長了三或四年的老莖，保存二或三年以下的幼莖。收獲的金釵石斛陰干。
比較例 菌根真菌對(duì)石斛苗生長的影響 將石斛小菇MD-1(Mycena dendrobii)和開唇蘭小菇MA-1(Mycena anoectochila)分別用液體培養(yǎng)基搖床震蕩暗培養(yǎng)15天。液體培養(yǎng)基組成按重量百分含量計(jì)算為葡萄糖2％，磷酸二氫鉀0.25％，硫酸鎂0.15％，麥麩2％(煮汁)。培養(yǎng)基pH 5.6，將兩種菌的液體培養(yǎng)物等量混合，用勻漿機(jī)打碎，備用。
由原球莖分化的鐵皮石斛苗和金釵石斛苗，分別單獨(dú)在壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)90天。壯苗培養(yǎng)基是以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，每升(L)培養(yǎng)基加入蔗糖30g，肌醇100mg，萘乙酸(NAA)0.5mg，吲哚丁酸(IBA)0.5mg，激動(dòng)素(KT)0.1mg，活性炭2g，瓊脂7.5g。培養(yǎng)基pH5.8。
在共生栽培基質(zhì)1上，用石斛苗與液體培養(yǎng)的MD-1和MA-1混合培養(yǎng)物進(jìn)行共生栽培，考察菌根真菌對(duì)鐵皮石斛和金釵石斛生長的影響。以不加菌根真菌栽培的鐵皮石斛和金釵石斛的生長情況作為對(duì)照。共生栽培在玻璃溫室中進(jìn)行?；|(zhì)1中蛭石、珍珠巖、鋸末加刨花和碎石頭的加入量之間的比例按重量計(jì)為蛭石∶珍珠巖∶鋸末加刨花∶碎石頭＝1∶0.5∶2∶1。
在溫室鋪一層10-12cm厚的共生栽培基質(zhì)，栽培時(shí)均以3株石斛苗為一叢進(jìn)行栽培，先在石斛苗根的基部放置2g左右的濕的碎樹葉，再在石斛苗根部放置以上備好的MD-1和MA-1真菌液體培養(yǎng)物的混合物1.5ml左右，使石斛苗的根與MD-1和MA-1的混合物接觸，最后用栽培基質(zhì)埋住石斛苗的根部。對(duì)照則用栽培基質(zhì)埋住石斛苗的根部直接栽培即可。苗叢栽培的株、行距為10cm。
石斛適宜的環(huán)境溫度為18-23℃，其空氣溫度夏天應(yīng)控制在25℃以下，冬天應(yīng)控制在18℃以上。溫室內(nèi)要有遮陽網(wǎng)，避免直射光，最忌夏秋中午前后的直射光，光照量為正常日光量的1/3左右，照度2000-5000Lux，每天光照9-11h。石斛生長需較高的空氣濕度，但栽培基質(zhì)中不宜積水。
石斛苗與石斛小菇MD-1和開唇蘭小菇MA-1共生栽培后，每隔4個(gè)月補(bǔ)施一次石斛小菇MD-1和開唇蘭小菇MA-1固體培養(yǎng)物的混合物。石斛苗于栽培2年后收獲，將與菌根真菌共生栽培的石斛苗和對(duì)照石斛苗連根取出，洗凈培養(yǎng)基質(zhì)，觀察苗的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)接菌栽培的石斛苗與對(duì)照石斛苗相比，節(jié)間明顯膨大。收獲的石斛苗于55℃干燥后稱量苗的干重，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，與對(duì)照鐵皮石斛苗相比，接菌栽培的鐵皮石斛苗的干重有顯著提高，提高了24％；與對(duì)照金釵石斛苗相比，接菌栽培的金釵石斛苗的干重有顯著提高，提高了19％。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，用苯酚-硫酸法測(cè)定鐵皮石斛苗中多糖的含量，結(jié)果表明，與對(duì)照鐵皮石斛苗相比，接菌栽培的鐵皮石斛苗中多糖含量提高了2-3倍，多糖含量最高可達(dá)15.1％，已接近野生藥材。以石斛堿為標(biāo)準(zhǔn)品，用酸性染料比色法測(cè)定金釵石斛苗中總生物堿的含量，結(jié)果表明，與對(duì)照金釵石斛苗相比，接菌栽培的金釵石斛苗中總生物堿含量能提高30-50％，總生物堿含量最高可達(dá)2.3％。
從以上結(jié)果可以看出，這4種菌根真菌對(duì)石斛的生長發(fā)育有明顯促進(jìn)作用。采用該項(xiàng)新技術(shù)，石斛生長周期可由傳統(tǒng)栽培的5-7年縮短到2至3年；產(chǎn)量提高20％。與不接菌根真菌栽培的石斛苗(對(duì)照)相比，該項(xiàng)技術(shù)使石斛苗中多糖和生物堿等化學(xué)成分含量提高至接近野生石斛含量水平，從而保證了菌根共生后石斛藥材的質(zhì)量，為今后菌根真菌應(yīng)用于石斛規(guī)范化栽培提供了科學(xué)依據(jù)。另外，該技術(shù)栽培方法簡(jiǎn)單、投資少、不施任何化肥和農(nóng)藥，生產(chǎn)出的石斛為綠色產(chǎn)品。
權(quán)利要求
1.一種應(yīng)用菌根真菌大面積栽培石斛的方法，包括步驟
(1)菌根真菌的發(fā)酵培養(yǎng)
將4種菌根真菌MD-1，MO-1，MO-2，MA-1自低溫保藏的斜面試管菌種活化后，分別轉(zhuǎn)接于含PDA培養(yǎng)基的平皿中，于22-28℃恒溫培養(yǎng)10-20天，分別在菌落邊緣打孔成菌片，并以小碎塊接入液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；
由平皿固體菌種轉(zhuǎn)接液體培養(yǎng)的MD-1，MO-1，MO-2和MA-1真菌可以直接使用，也可以作為種子菌種，種子菌種再進(jìn)一步接入液體或固體培養(yǎng)基進(jìn)行放大培養(yǎng)；
真菌液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基含有葡萄糖、無機(jī)鹽類成分和天然添加物，真菌用三角瓶或其他容器振蕩或發(fā)酵罐通氣暗培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后可直接使用或用勻漿機(jī)打碎培養(yǎng)產(chǎn)物備用；
真菌固體培養(yǎng)的培養(yǎng)基含有天然纖維性或淀粉性物質(zhì)，真菌用試管、玻璃罐頭瓶或塑料袋等器皿靜置暗培養(yǎng)，待菌絲大部分或全部長滿培養(yǎng)基時(shí)取出備用；
(2)石斛苗的培養(yǎng)
石斛苗由石斛原球莖經(jīng)過原球莖增殖、原球莖分化成苗、壯苗等步驟的培養(yǎng)，用玻璃三角瓶或玻璃罐頭瓶等器皿靜置光照培養(yǎng)，培育成苗；經(jīng)壯苗后的石斛苗可以在繼代培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)；
壯苗步驟可以將苗接在壯苗培養(yǎng)基上單獨(dú)培養(yǎng)，也可以在壯苗培養(yǎng)的后期接入菌根真菌共生培養(yǎng)一段時(shí)間，再出瓶用于大面積栽培；
原球莖增殖、原球莖分化成苗、壯苗、苗的繼代培養(yǎng)等步驟所用的培養(yǎng)基是以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加蔗糖、肌醇、瓊脂，或添加活性炭、添加不同種類和濃度的植物激素，或添加馬鈴薯提取物；
(3)石斛苗與菌根真菌的共生栽培、田間管理及收獲
石斛苗與菌根真菌大面積共生栽培的栽培基質(zhì)含有樹皮、樹葉、蕨樹根、鋸末、刨花、木炭、石頭、磚、蛭石、珍珠巖、腐殖土、泥炭土；
石斛苗和菌根真菌按以下方法共生栽培
①地上遮陽栽培在具有遮陽網(wǎng)的露天大棚，或塑料薄膜溫室，或玻璃溫室中進(jìn)行栽培，栽培時(shí)先在石斛苗根的基部放置少量碎樹葉，再在石斛苗根部放置以上備好的液體或固體菌根真菌適量，最后用栽培基質(zhì)埋住石斛苗的根部；
②立體遮陽栽培在地上搭架分層立體栽培，在硬質(zhì)材料的盆或盒等容器的底部平鋪一層共生栽培基質(zhì)，栽培時(shí)先在石斛苗根的基部放置適量碎樹葉，再在石斛苗根部放置以上備好的液體或固體菌根真菌適量，最后用栽培基質(zhì)埋住石斛苗的根部；
在石斛生長的過程中可以根據(jù)需要補(bǔ)施液體或固體菌根真菌；
石斛苗出瓶后與菌根真菌共生栽培2-3年后即可收獲。
2.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其中所述的4種小菇屬真菌分別為石斛小菇MD-1(Mycena dendrobii)，保藏編號(hào)CGMCC No.0685，紫萁小菇MO-1(Mycena osmundicola)，保藏編號(hào)CGMCC No.0689，蘭小菇MO-2(Mycena orchidicola)，保藏編號(hào)CGMCC No.0688，和開唇蘭小菇MA-1(Mycena anoectochila)，保藏編號(hào)CGMCC No.0687。
3.如權(quán)利要求1和2所述的方法，其特征在于小菇屬4種菌根真菌液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基中葡萄糖的加入量按重量計(jì)為1.5-4％；無機(jī)鹽類成分可以為硫酸鎂，磷酸二氫鉀，或磷酸氫二鉀，或磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀以任意比例混合的混合物，其加入量按重量計(jì)為硫酸鎂0.1-0.3％，磷酸二氫鉀0.1-0.5％，或磷酸氫二鉀0.1-0.5％，或磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀的混合物0.1-0.5％；天然添加物可以為麥麩(煮汁)，其加入量按重量計(jì)為2-5％；培養(yǎng)基pH5.0-6.5；三角瓶或其他容器振蕩培養(yǎng)或發(fā)酵罐通氣培養(yǎng)，培養(yǎng)容器裝量10-60％；培養(yǎng)基滅菌后接入上述4種小菇屬真菌，種子菌種接種量為培養(yǎng)容器裝量的5-20％；液體培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為振蕩轉(zhuǎn)速80-150轉(zhuǎn)/分鐘，18-28℃暗培養(yǎng)10-30天；培養(yǎng)結(jié)束后可直接使用或用勻漿機(jī)打碎培養(yǎng)產(chǎn)物備用。
4.如權(quán)利要求1和2所述的方法，其特征在于小菇屬4種菌根真菌固體培養(yǎng)的培養(yǎng)基中天然纖維性或淀粉性物質(zhì)可以為闊葉樹鋸末、麥麩和碎玉米粒，這3種原料加入量之間的比例按重量計(jì)為闊葉樹鋸末∶麥麩∶碎玉米粒＝0.5-1.5∶0.5-1.5∶0.2-1.5；固體培養(yǎng)基的加水量為以上3種原料總重量的1-4倍；培養(yǎng)基pH5.0-6.5；試管、玻璃罐頭瓶或塑料袋等器皿靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)容器裝量50-80％；培養(yǎng)基滅菌后接入液體培養(yǎng)的小菇屬真菌的種子菌種，種子菌種的接種量為培養(yǎng)容器裝量的5-15％；固體培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為18-28℃暗培養(yǎng)，待菌絲從培養(yǎng)基頂部長入底部或長滿培養(yǎng)基時(shí)取出備用。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于石斛苗的培養(yǎng)中，
(1)原球莖增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)基中添加的植物激素為萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)和激動(dòng)素(KT)，其加入量為每升(L)培養(yǎng)基加入NAA0.1-1.0mg，IBA0.1-0.8mg，KT0.1-0.8mg；培養(yǎng)時(shí)間45-120天；
(2)原球莖分化成苗的培養(yǎng)基中添加的植物激素為IBA和KT，其加入量為每升(L)培養(yǎng)基加入IBA0.2-1.0mg，KT0.2-1.0mg；培養(yǎng)時(shí)間45-120天；
(3)壯苗培養(yǎng)基中添加的植物激素為NAA、IBA和KT，其加入量為每升(L)培養(yǎng)基加入NAA0.2-1.5mg，IBA0.2-1.5mg，KT0.2-1.5mg；培養(yǎng)時(shí)間60-120天；
壯苗培養(yǎng)中，可以接入菌根真菌的PDA平皿培養(yǎng)的菌片，菌片直徑3-15mm，每瓶苗接入1-5片菌片，或接入菌根真菌的液體培養(yǎng)物0.2-1.5ml，或接入菌根真菌的固體培養(yǎng)物0.2-1.5g；菌苗共培養(yǎng)時(shí)間為10-90天；
(4)石斛苗繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基中添加馬鈴薯(煮汁)的量為每升(L)培養(yǎng)基加入100-300g；培養(yǎng)時(shí)間60-120天；
石斛原球莖增殖、原球莖分化成苗、壯苗和苗的繼代培養(yǎng)中，所用的每升(L)1/2MS基本培養(yǎng)基中均要添加蔗糖15-35g、肌醇50-150mg、瓊脂6-15g；原球莖分化成苗、壯苗和苗的繼代培養(yǎng)中，所用的每升(L)培養(yǎng)基中均要添加0.5-4g的活性炭；培養(yǎng)基pH5.0-6.5；用試管或玻璃瓶等器皿培養(yǎng)，培養(yǎng)容器裝量10-50％；苗的培養(yǎng)條件為15-28℃光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度1500-5000Lux，光照時(shí)間8-12小時(shí)/天。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于石斛苗與菌根真菌的共生栽培基質(zhì)有以下幾種
(1)基質(zhì)1中可以有蛭石、珍珠巖、鋸末加刨花和碎石頭，這4種材料加入量之間的比例按重量計(jì)為蛭石∶珍珠巖∶鋸末加刨花∶碎石頭＝1-2∶1∶2-5∶1-3；
(2)基質(zhì)2中可以有闊葉樹樹皮、腐殖土和碎石頭，這3種材料加入量之間的比例按重量計(jì)為闊葉樹樹皮∶腐殖土∶碎石頭＝3-6∶1-2∶1-5；
(3)基質(zhì)3中可以有泥炭土、珍珠巖、鋸末加刨花和闊葉樹樹皮，這4種材料加入量之間的比例按重量計(jì)為泥炭土∶珍珠巖∶鋸末加刨花∶闊葉樹樹皮＝1-2∶1∶2-5∶3-6；
(4)基質(zhì)4中可以有鋸末加刨花和闊葉樹樹皮，這2種材料加入量之間的比例按重量計(jì)為鋸末加刨花∶闊葉樹樹皮＝1-3∶2-6；
(5)基質(zhì)5中可以有鋸末加刨花、闊葉樹樹皮和碎石頭，這3種材料加入量之間的比例按重量計(jì)為鋸末加刨花∶闊葉樹樹皮∶碎石頭＝1-3∶2-6∶2-5；
(6)基質(zhì)6中可以有碎磚、闊葉樹樹皮和碎木炭，這3種材料加入量之間的比例按重量計(jì)為碎磚∶闊葉樹樹皮∶碎木炭＝1-5∶2-8∶1-4；
(7)基質(zhì)7中可以有鋸末加刨花、碎木炭和闊葉樹樹皮，這3種材料加入量之間的比例按重量計(jì)為鋸末加刨花∶碎木炭∶闊葉樹樹皮＝2-5∶1-3∶3-7；
(8)基質(zhì)8中可以有闊葉樹樹皮和蕨樹根，這2種材料加入量之間的比例按重量計(jì)為闊葉樹樹皮∶蕨樹根＝2-5∶1-3；
上述栽培基質(zhì)中用到的材料的大小為碎刨花、碎木炭直徑0.5-2cm，闊葉樹樹皮直徑0.5-4cm，碎石頭、碎磚直徑1-5cm，蕨樹根直徑0.5-3cm；
栽培中還要用到山毛櫸科Fagaceae植物櫟樹或其他雜木樹的自然落葉，用時(shí)粉碎并浸濕，碎樹葉直徑0.5-2cm；
上述材料中的闊葉樹樹皮、鋸末和刨花、蕨樹根、腐殖土等可直接使用，或高溫滅菌，或提前兩個(gè)月鋪好使其熟化，或堆積并蓋塑料布發(fā)酵1-2個(gè)月，使其熟化以消除病蟲害。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于石斛苗與菌根真菌共生栽培時(shí)，以2-5株石斛苗為一叢進(jìn)行栽培，先在每叢石斛苗根的基部放置0.5-5g濕的碎樹葉，再在每叢石斛苗的根部放置上述制備好的菌根真菌液體培養(yǎng)物0.4-2.5ml，或菌根真菌固體培養(yǎng)物0.3-2.0g，最后用栽培基質(zhì)壓住苗的根部；苗叢栽培的株、行距為8-18cm；
采用地上遮陽栽培的方法進(jìn)行石斛苗與菌根真菌共生栽培時(shí)，栽培基質(zhì)厚度5-20cm；
采用立體遮陽栽培的方法進(jìn)行石斛苗與菌根真菌共生栽培時(shí)，栽培基質(zhì)厚度3-10cm；
石斛苗與菌根真菌共生栽培后需要的生長條件環(huán)境溫度為5-30℃，光照量為正常日光量的1/3或1/2，或照度為2000-10000Lux；在石斛與菌根真菌共生的過程中每年可以補(bǔ)施液體培養(yǎng)或固體培養(yǎng)的菌根真菌0-5次。
8.如權(quán)利要求1和7所述的方法，其特征在于與菌根真菌共生栽培的石斛，在上述栽培條件下生長2-3年可以收獲，收獲時(shí)采用“存一去二或存二去三”的方法收獲栽培石斛的莖，即剪去二年或三年生的莖，保存一年或二年以下的幼莖；或采用“存二去三或存三去四”的方法收獲栽培石斛的莖，即剪去三年或四年生的老莖，保存二或三年以下的幼莖；收獲的新鮮石斛莖直接加工成產(chǎn)品，或陰干，或60℃以下烘干。
9.如權(quán)利要求1-8所述的方法，其特征在于4種菌根真菌的液體培養(yǎng)物或固體培養(yǎng)物，在用于與石斛的共生栽培時(shí)，可以單獨(dú)使用，或分別培養(yǎng)后任意選擇兩種或兩種以上共同使用。
10.用于任一權(quán)利要求1-9所述方法的菌根真菌為小菇屬真菌石斛小菇MD-1(Mycenadendrobii)，保藏編號(hào)CGMCC No.0685，紫萁小菇MO-1(Mycena osmundicola)，保藏編號(hào)CGMCC No.0689，蘭小菇MO-2(Mycena orchidicola)，保藏編號(hào)CGMCC No.0688，和開唇蘭小菇MA-1(Mycena anoectochila)，保藏編號(hào)CGMCC No.0687。
全文摘要
一種菌根真菌在石斛大面積栽培中的應(yīng)用技術(shù)，所用的4種菌根真菌為小菇屬真菌石斛小菇(Mycena dendrobii)，紫萁小菇(Mycen osmundicola)，蘭小菇(Mycena orchidicola)，開唇蘭小菇(Mycena anoectochila)；先分別培養(yǎng)菌根真菌和石斛苗，當(dāng)石斛苗移栽到大田時(shí)加入菌根真菌共生栽培。采用該項(xiàng)新技術(shù)，可以大大縮短石斛的生長周期，提高石斛藥材的產(chǎn)量和有效成分的含量。該項(xiàng)技術(shù)栽培方法簡(jiǎn)單、易于大面積推廣、投資少、不施任何化學(xué)肥料、激素和農(nóng)藥，生產(chǎn)出的石斛藥材為綠色產(chǎn)品。
文檔編號(hào)C12N1/14GK1961652SQ20051011770
公開日2007年5月16日 申請(qǐng)日期2005年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月7日
發(fā)明者郭順星, 陳曉梅, 宋經(jīng)元, 王春蘭, 孟志霞, 肖培根 申請(qǐng)人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所