專利名稱：硒代蛋氨酸標記的蛋白高產(chǎn)表達培養(yǎng)基配方及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及硒代蛋氨酸標記的蛋白高產(chǎn)表達培養(yǎng)基配方及其應(yīng)用；具體地說是一種含L-硒代蛋氨酸的高產(chǎn)培養(yǎng)基提高目的蛋白在大腸桿菌中的表達量及在蛋白晶體結(jié)構(gòu)解析中起不可替代的作用。
背景技術(shù)：
硒已被世界衛(wèi)生組織確認為人體必需微量元素，具有較強的抗腫瘤和提高機體免疫力作用。與無機硒相比，有機硒毒性低，生物利用度高，藥理活性強，硒代蛋氨酸是一種天然有機硒產(chǎn)物，其來源極少，因此，通過化學合成的方法制備顯得尤其重要。在腫瘤對人類健康威脅日益嚴重的今天，使用硒代蛋氨酸來預(yù)防和治療具有十分重要的意義。在美國，硒代蛋氨酸已作為藥品廣泛用于癌癥預(yù)防和治療。將硒添加到一些飲料和食品中作為微量元素，可用于提高機體的免疫能力以及防治各種缺硒病。本品可研制開發(fā)成藥品、保健品及食品添加劑和動物飼料添加劑。
另外，在結(jié)晶學中常運用MAD(Multi-wavelength anomalous dispersion，多波長反常散射)推定相位。和硫原子相比，重原子硒的反常散射信號更加清晰，因此用硒代蛋氨酸標記蛋白在MAD解析相位實驗中運用越來越廣泛。
首先，硒的化學性質(zhì)和硫非常接近；其次，硒代蛋氨酸能完全代替蛋氨酸而不改變被取代蛋白的性質(zhì)；再者，大部分硒代蛋氨酸取代蛋氨酸的蛋白晶體與相應(yīng)的天然蛋白晶體是同形晶體。培養(yǎng)硒代蛋氨酸的蛋白晶體步驟分為以下四步表達、細胞生長、純化和結(jié)晶。
在大腸桿菌中表達硒代蛋氨酸取代蛋氨酸的蛋白可以有以下三種選擇將含目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌蛋氨酸缺陷型(met-)菌株，制造能生產(chǎn)目的基因的大腸桿菌蛋氨酸缺陷型(met-)菌株，以及最近普遍運用的阻斷蛋氨酸合成的通路。其中第三種方法的原理是在大腸桿菌中，高濃度異亮氨酸、賴氨酸和蘇氨酸能通過抑制天(門)冬氨酸激酶活性從而阻斷蛋氨酸合成，且苯基丙氨酸和亮氨酸與賴氨酸起協(xié)同作用。因此，非營養(yǎng)缺陷型菌株能在無蛋氨酸卻含足量硒代蛋氨酸和已知能抑制蛋氨酸合成的氨基酸。
除了疏水性稍強、可溶性略差外，純化得到的含硒代蛋氨酸蛋白性質(zhì)與天然蛋白相似。為避免硒代蛋氨酸氧化為硒氧化物，要對所有的緩沖液脫氣，并加入DTT(5-20mM)，以及諸如EDTA(0.2mM)的螯合劑去除可能有助于氧化的金屬離子，要盡量減少純化時間，例如運用FPLC系統(tǒng)。
含硒代蛋氨酸蛋白結(jié)晶條件與天然蛋白也是相似的。通常含硒代蛋氨酸的蛋白可溶性稍差，所以應(yīng)該相應(yīng)地降低蛋白或沉淀劑的濃度。除了需要形成二硫鍵的蛋白，一般含硒代蛋氨酸的蛋白結(jié)晶培養(yǎng)需要DTT和EDTA。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種蛋白高產(chǎn)表達培養(yǎng)基配方，具體地說是一種含L-硒代蛋氨酸的蛋白高產(chǎn)表達培養(yǎng)基配方。
本發(fā)明另一目的是提供一種上述高產(chǎn)培養(yǎng)基配方的應(yīng)用，該高產(chǎn)培養(yǎng)基不僅能夠大幅提高蛋白表達量，且使目的蛋白中的蛋氨酸輕而易舉地被硒代蛋氨酸取代，有利于后續(xù)晶體結(jié)構(gòu)解析。
本發(fā)明的高產(chǎn)培養(yǎng)基配方由下述五類物質(zhì)組成1.配方A.M9 salt磷酸氫二鈉(Na2HPO4)3.0至15.0g，磷酸二氫鉀(KH2PO4)1.0至8.0g，NaCl 0至3.0g，一水合葡萄糖(Glucose·H2O)2.0至9.0g，NH4Cl 0至4.0g，Na2SO40至1.5g；11種氨基酸L-谷氨酸(L-glutamic acid)、L-天(門)冬氨酸(L-aspartic acid)、L-精氨酸(L-arginine)、L-組氨酸(L-histidine acid)、L-丙氨酸(L-alanine acid)、L-脯氨酸(L-proline acid)、L-甘氨酸(L-glycine acid)、L-絲氨酸(L-serine acid)、L-谷氨酰胺(L-glutamine acid)、L-天冬酰胺(L-asparagine acid)、L-色氨酸(L-tryptophan acid)各0至0.5g；B.金屬無機鹽混合物MgCl20.75至1.45g，一水合硫酸錳(MnSO4·H2O)0至0.3g，七水合硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)0至0.25g，CaCl2(anhydrous)0至0.5g，七水合硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)0至0.35g，五水合硫酸銅(CuSO4·5H2O)0至0.2g以及六水合氯化鎳(NiCl2·6H2O)0至0.15g；C.維生素維生素B10至0.2g，維生素B120至0.2g；抗生素根據(jù)需要可以添加以下相應(yīng)的一種或多種抗生素氨芐青霉素0至0.5g，卡那霉素0至0.5g，氯霉素0至0.5g.
D.氨基酸、L-硒代蛋氨酸混合物L-異亮氨酸(L-isoleucine)、L-亮氨酸(L-leucine)、L-賴氨酸(L-lysine)、L-纈氨酸(L-valine)、L-蘇氨酸(L-threonine)、L-苯丙氨酸(L-phenyalanine)各0至0.5g；L-硒代蛋氨酸混合，0至0.35g。
E.IPTG(Isopropyl-1-thio-b-D-galactopyranoside，異丙基硫代半乳糖苷)0至0.9g。
本發(fā)明的高產(chǎn)培養(yǎng)基可以用于蛋白表達的高產(chǎn)培養(yǎng)，尤其適用于用于含L-硒代蛋氨酸的高產(chǎn)培養(yǎng)，該方法如下1).由磷酸氫二鈉(Na2HPO4)3.0至15.0g，磷酸二氫鉀(KH2PO4)1.0至8.0g，NaCl 0至3.0g，一水合葡萄糖(Glucose·H2O)2.0至9.0g，NH4Cl 0至4.0g，Na2SO40至1.5g組成的M9鹽和由L-谷氨酸(L-glutamic acid)、L-天(門)冬氨酸(L-aspartic acid)、L-精氨酸(L-arginine)、L-組氨酸(L-histidine acid)、L-丙氨酸(L-alanine acid)、L-脯氨酸(L-proline acid)、L-甘氨酸(L-glycine acid)、L-絲氨酸(L-serine acid)、L-谷氨酰胺(L-glutamine acid)、L-天冬酰胺(L-asparagine acid)、L-色氨酸(L-tryptophan acid)各0至0.5g組成的11種氨基酸混合物中加入950ml水；2).1)的溶液中加入由MgCl20.75至1.45g，一水合硫酸錳(MnSO4·H2O)0至0.3g，七水合硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)0至0.25g，CaCl2(anhydrous)0至0.5g，七水合硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)0至0.35g，五水合硫酸銅(CuSO4·5H2O)0至0.2g，六水合氯化鎳(NiCl2·6H2O)0至0.15g組成的金屬無機鹽混合物；3).2)的溶液中加入由維生素維生素B10至0.2g，維生素B120至0.2g；根據(jù)自身需要添加以下相應(yīng)的一種或多種抗生素氨芐青霉素0至0.5g，卡那霉素0至0.5g，氯霉素0至0.5g.
4).取10ml LB培養(yǎng)基菌液培養(yǎng)物接種入上述3)的溶液中，37℃培養(yǎng)至OD值達0.6～1.5；所述的LB培養(yǎng)基菌液培養(yǎng)物是采用通常的方法，將待表達的目的蛋白基因構(gòu)建于合適的質(zhì)粒載體，如pET系列，并轉(zhuǎn)化入合適的大腸桿菌菌株，如BL21(DE3)；挑單克隆菌接種入適量Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)過夜，8～12小時而成。
5).再加入氨基酸和L-硒代蛋氨酸混合物。即再加入異亮氨酸(L-isoleucine)、L-亮氨酸(L-leucine)、L-賴氨酸(L-lysine)、L-纈氨酸(L-valine)、L-蘇氨酸(L-threonine)、L-苯丙氨酸(L-phenyalanine)各0至0.5g；L-硒代蛋氨酸混合，0至0.35g；6).再加入0至0.9g的IPTG(Isopropyl-1-thio-b-D-galactopyranoside，異丙基硫代半乳糖苷)。
然后10至30℃下培養(yǎng)8～12小時。
采用通常的如下的方法，可以將目的蛋白純化收獲菌體，加入破胞液破菌，離心取上清；通過合適的方法，如通常的親和層析方法等，將目的蛋白從上清中純化出來。
上述的蛋白基因是PTPα(Protein Tyrosine Phosphataseα)蛋白酪氨酸磷酸酯酶α、DPPIV(Dipeptidyl Peptidase IV)二肽酶IV、BACEl(beta-Secretasel)β分泌酶、GSK3β(Glycogen Synthase Kinase 3β)糖原合成酶激酶3β、IKKβ(IKappa-BKinase Beta)轉(zhuǎn)錄因子NF-kB激酶β、AMPK(AMP-activated Protein Kinase)腺苷一磷酸(AMP)激活的蛋白激酶、MetAPs(Methionine Aminopeptidases)甲硫氨酰氨肽酶、IGF-I(Insulin-like Growth Factor-I)胰島素樣生長因子I、PKCθ(ProteinKinase C-theta)蛋白激酶Cθ等。
在本發(fā)明中采用的對比配方是原M9基本培養(yǎng)基配方，其配方如下Na2HPO46.8g，KH2PO43.0g，NaCl 0.5g，NH4Cl 1.0g，MgSO40.24g，CaCl20.01g，Glucose·H2O 4g。
采用本發(fā)明的蛋白高產(chǎn)表達培養(yǎng)基可以提高蛋白表達量，如蛋白酪氨酸磷酸酯酶α(PTPα，Protein Tyrosine Phosphatase α)、二肽酶IV(DPPIV，DipeptidylPeptidase IV)、β分泌酶(BACE1，beta-Secretasel)、糖原合成酶激酶3β(GlycogenSynthase Kinase 3β)、轉(zhuǎn)錄因子NF-kB激酶β(IKappa-B Kinase Beta)、腺苷一磷酸(AMP)激活的蛋白激酶(AMP-activated Protein Kinase)、甲硫氨酰氨肽酶(Methionine Aminopeptidases)、胰島素樣生長因子I(Insulin-like Growth Factor-I)、蛋白激酶Cθ(Protein Kinase C-theta)等，分別可以比原M9基本培養(yǎng)基配方所獲得的結(jié)果提高1.3～2.1倍。
具體實施例方式
通過下述實施例將有助于理解本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明的內(nèi)容。
實施例(一)方法1.將待表達的目的蛋白基因構(gòu)建于合適的質(zhì)粒載體，如pET系列，并轉(zhuǎn)化入合適的大腸桿菌菌株，如BL21(DE3)；2.挑單克隆菌接種入適量Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)過夜，8～12小時；3.將“A”加入950ml水；4.加入“B”；5.加入“C”；6.取上述10ml LB培養(yǎng)基菌液培養(yǎng)物接種入上述溶液，37℃培養(yǎng)至OD值達0.6～1.5；7.加入“D”，培養(yǎng)溫度降至較低溫度，如10至30℃；8.加入“E”；9.較低溫度，10至30℃下培養(yǎng)過夜，約8～12小時；10.收獲菌體，加入破胞液破菌，離心取上清；11.通過合適的方法，如通常的親和層析方法等方法，將目的蛋白從上清中純化出來。
其中，所述的A，B，C，D和E如前所述。
(二)結(jié)果采用對比配方是原M9基本培養(yǎng)基配方，其配方如下Na2HPO46.8g，KH2PO43.0g，NaCl 0.5g，NH4Cl 1.0g，MgSO40.24g，CaCl20.01g，Glucose·H2O 4g。
變更目的蛋白的蛋白表達量如下


權(quán)利要求
1，一種含L-硒代蛋氨酸的蛋白高產(chǎn)表達培養(yǎng)基，其由下述M9鹽、金屬無機鹽混合物、維生素和抗生素、氨基酸和L-硒代蛋氨酸混合物、以及IPTG的物質(zhì)組成所述的M9鹽是由磷酸氫二鈉 3.0至15.0g、磷酸二氫鉀1至7g、NaCl0至3.0g、一水合葡萄糖 2.0至9.0g、NH4Cl 0至4.0g和Na2SO40至1.5g組成；所述的氨基酸混合物是由L-谷氨酸、L-天(門)冬氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸、L-甘氨酸、L-絲氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、以及L-色氨酸 各0至0.5g組成；所述的金屬無機鹽混合物是由MgCl215.0至30.0g、一水合硫酸錳 0至2.0g、七水合硫酸亞鐵 0至2g、無水CaCl20至3.0g、七水合硫酸鋅0至1.5g、五水合硫酸銅0至1.0g和六水合氯化鎳 0至1.0g組成；所述的維生素是由維生素B10至1.0g和維生素B120至1.0g；所述的抗生素是下述的一種或多種氨芐青霉素 0至0.5g、卡那霉素 0至0.5g或/和氯霉素 0至0.5g。所述的氨基酸和L-硒代蛋氨酸混合物是L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-纈氨酸、L-蘇氨酸或/和L-苯丙氨酸各0至0.5g，L-硒代蛋氨酸0至0.35g的混合物；所述的IPTG是0至0.9g的異丙基硫代半乳糖苷。
2，如權(quán)利要求1所述的一種含L-硒代蛋氨酸的蛋白高產(chǎn)表達培養(yǎng)基的應(yīng)用，其特征是用于在大腸桿菌中蛋白的表達。
3，如權(quán)利要求2所述的一種含L-硒代蛋氨酸的蛋白高產(chǎn)表達培養(yǎng)基的應(yīng)用，其特征是采用下述逐步方法1).由磷酸氫二鈉 3.0至15.0g、磷酸二氫鉀 1.0至8.0g、NaCl 0至3.0g、一水合葡萄糖 2.0至9.0g、NH4Cl 0至4.0g，Na2SO40至1.5g組成的M9鹽和由L-谷氨酸、L-天(門)冬氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸、L-甘氨酸、L-絲氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、L-色氨酸各0至0.5g組成的氨基酸混合物中加入950ml水；2).1)的溶液中加入由MgCl20.75至1.45g、一水合硫酸錳 0至0.3g、七水合硫酸亞鐵0至0.25g、無水CaCl20至0.5g、七水合硫酸鋅0至0.35g、五水合硫酸銅 0至0.2g、六水合氯化鎳 0至0.15g組成的金屬無機鹽混合物；3).2)的溶液中加入下述維生素和抗生素維生素B10至0.2g、維生素B120至0.2g、氨芐青霉素 0至0.5g、卡那霉素 0至0.5g以及氯霉素 0至0.5g；4).取10ml LB培養(yǎng)基菌液培養(yǎng)物接種入上述3)的溶液中，37℃培養(yǎng)至OD值達0.6～1.5；5).上述溶液中再加入L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-纈氨酸、L-蘇氨酸和L-苯丙氨酸各0至0.5g；并和0至0.35g L-硒代蛋氨酸混合；6).上述溶液中再加入0至0.9g的異丙基硫代半乳糖苷；在10至30℃下培養(yǎng)8～12小時。
4.如權(quán)利要求3所述的一種含L-硒代蛋氨酸的蛋白高產(chǎn)表達培養(yǎng)基的應(yīng)用，其特征是所獲得的菌體，加入破胞液破菌，離心取上清；通過通常的親和層析方法將目的蛋白從上清中純化出來。
5.如權(quán)利要求3所述的一種含L-硒代蛋氨酸的蛋白高產(chǎn)表達培養(yǎng)基的應(yīng)用，其特征是所述的LB培養(yǎng)基菌液培養(yǎng)物是將待表達的目的蛋白基因構(gòu)建于合適的質(zhì)粒載體，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株；挑單克隆菌接種入LB培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)8～12小時。
6.如權(quán)利要求3所述的一種含L-硒代蛋氨酸的蛋白高產(chǎn)表達培養(yǎng)基的用途，其特征是所述的目的蛋白是蛋白酪氨酸磷酸酯酶α、二肽酶IV、β分泌酶、糖原合成酶激酶3β、轉(zhuǎn)錄因子NF-kB激酶β、腺苷一磷酸激活的蛋白激酶、甲硫氨酰氨肽酶或胰島素樣生長因子I、蛋白激酶Cθ。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含硒代蛋氨酸的蛋白高產(chǎn)表達培養(yǎng)基和應(yīng)用，其由下述M9鹽和氨基酸混合物、金屬無機鹽混合物、維生素和抗生素、氨基酸和L－硒代蛋氨酸混合物，以及異丙基硫代半乳糖苷的物質(zhì)組成。用于大幅提高硒代蛋氨酸標記的目的蛋白表達量，如蛋白酪氨酸磷酸酯酶α、二肽酶IV、β分泌酶、糖原合成酶激酶3β、轉(zhuǎn)錄因子NF－kB激酶β、腺苷一磷酸(AMP)激活的蛋白激酶、甲硫氨酰氨肽酶、胰島素樣生長因子I、蛋白激酶Cθ等目的蛋白，可以提高1.3～2.1倍的表達量。
文檔編號C12R1/19GK1793335SQ200510110398
公開日2006年6月28日 申請日期2005年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月16日
發(fā)明者陳春麟, 毛晨, 張勁濤 申請人:上海美迪西生物醫(yī)藥有限公司