專利名稱：一種去除哺乳動物卵母細胞細胞核的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種去除哺乳動物卵母細胞細胞核的方法。
背景技術：
哺乳動物體細胞克隆技術(mammalian somatic cell cloning)又稱體細胞核移植技術(somatic cell nuclear transfer)，是指通過特殊的人工手段，即以顯微操作、電融合、復合活性化處理等技術為主線，將體細胞作為核供體，移入到成熟的、去核的、未受精的卵母細胞中，進行體外重構、體外培養(yǎng)、胚胎移植，從而達到擴繁同種基因型哺乳動物種群的目的。
卵母細胞的去核是體細胞核移植技術的關鍵技術環(huán)節(jié)，去核效率的高低直接關系到所構建克隆胚胎體外發(fā)育和受體移植妊娠率及產犢率的高低。McGrath報道了一步法去核，即在注入核供體細胞的同時將卵母細胞核吸引除去(McGrath，Solter D.Nuclear transplantation in the mouse embryo bymicrosurgery and cell fusion.[J]Science.1983.2201300-1302)，此操作只需要一個顯微操作管，顯微操作針直接與受核卵母細胞質接觸，顯微操作針的前部尖端易造成卵母細胞質的直接損傷，去核率僅有68.7％，重構胚的囊胚發(fā)育率僅有18.0％。Willadsen報道的吸引除核法(Willadsen.S M.Nucleartransplantation in sheep embryos[J].Nature，32063-65)，其缺點是操作繁瑣，第一步需要用顯微操作針在受核卵母細胞透明帶第一極體的附近切口，切好之后需更換顯微操作管。Shiga建立的一步擠壓除核法(Shiga K，Fujite T，Hirose K.Production of calves by transfer of nuclei from cultured somaticcells obtained from Japanese black bulls.[J].j Theriogenology.1999，52527-535)，是用顯微切割針在第一極體附近，將卵母細胞透明帶切開1/3，調準切口，使其與切割針成垂直方向，固定卵母細胞，調節(jié)顯微切割針，將切割針橫壓在卵母細胞的直徑部位，垂直向下微微輕壓，除去第一極體連同下面的一小部分細胞質，此時要掌握好顯微操作針下壓的尺度，要求操作者樹立微觀意識，避免損傷卵母細胞質。上述吸引法和擠壓法在操作過程中都需要與細胞質的直接或間接接觸，容易對細胞質造成損傷。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種去除哺乳動物卵母細胞細胞核的方法。
本發(fā)明所提供的去除哺乳動物卵母細胞細胞核的方法，是將剛放出第一極體的卵母細胞的裸卵的透明帶，在第一極體處切開周長的1/3，再點擊所述透明帶，除去第一極體連同下面的核物質。
剛放出第一極體的卵母細胞的裸卵均可按照常規(guī)方法獲得。
所述點擊透明帶的位置是3點鐘的位置。
所述哺乳動物卵母細胞可來自于牛、羊、貓狗等動物。
所述哺乳動物卵母細胞優(yōu)選來自于牛。
所述剛放出第一極體的牛卵母細胞可按照以下方法獲得將牛的卵母細胞在CR2aa+10％SCS+0.01mg/ml FSH+100IU/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素的培養(yǎng)基中成熟培養(yǎng)18-22小時，得到剛放出第一極體的卵母細胞。
所述成熟培養(yǎng)的時間優(yōu)選為18小時。
本發(fā)明的點擊去核法避開顯微切割針與細胞質的接觸，減少顯微切割針對細胞質的損傷，而吸引法和擠壓法在操作過程中都需要與細胞質的直接或間接接觸，容易對細胞質造成損傷；操作簡單，去核效率高；本發(fā)明的“點擊去核法”恰恰解決了吸引法和擠壓法所存在的不足，可大大的提高核移植胚胎的囊胚發(fā)育率，點擊去核法的去核率為90％，顯著高于擠壓法的88％和吸引法的68.7％；點擊去核法的囊胚發(fā)育率34.1％極顯著的高于吸引法的20.9％，顯著高于擠壓法的18％。本發(fā)明的點擊去核法對牛體外成熟培養(yǎng)18-22h的卵母細胞去核，效果明顯，因為卵母細胞在體外成熟培養(yǎng)18-22h的時候，剛剛放出第一極體，紡錘體距離第一極體很近，去核時容易；成熟培養(yǎng)到24h的時候，紡錘體已經移行到卵母細胞質的中心，遠離第一極體，使去核的難度增大。本發(fā)明的去核方法是高動物克隆效率的有效途徑。


圖1a為22h體外成熟培養(yǎng)的卵母細胞照片圖1b為22h體外成熟培養(yǎng)的卵母細胞裸卵的Hoechlst 33342染色照片圖1c為顯微針在第一極體的位置插入透明帶的照片圖1d為切開透明帶的照片圖1e為吸引法去核照片圖1f為點擊去核法去核照片
具體實施例方式
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
下述實施例培養(yǎng)基中的百分數，均為質量百分含量。
實施例1、去除牛卵母細胞細胞核的方法1、核供體細胞的準備從屠宰場取來的牛胎兒皮膚上皮細胞，用DMSO液在-35℃的低溫冰箱中保存3個月。解凍后，用含有10％FCS的DMEM細胞培養(yǎng)液以3000rpm/分的速度離心5分鐘，清洗2次；去上清，沉淀物用含有10％FCS的DMEM的細胞培養(yǎng)液吹打分散，稀釋之后接種到φ35mm的小平皿中進行增殖培養(yǎng)。當細胞長滿皿底后進行細胞傳代，篩選皮膚上皮細胞，用2.5mg/ml胰蛋白酶+0.1％Na2EDTA的Hank’s液進行5分鐘靜置消化處理，用細胞培養(yǎng)液2次離心洗滌，去上清液，加培養(yǎng)液，吹打分散細胞塊，稀釋后接種。經5-6代傳代篩選培養(yǎng)，在使用前，一組進行5-6天的血清饑餓培養(yǎng)，做細胞周期同期化處理，一組常規(guī)培養(yǎng)，使用時的處理方法與細胞傳代培養(yǎng)處理方法相同。
2、卵母細胞成熟培養(yǎng)將采集的卵巢，從滅菌的35℃生理鹽水中取出，放在持有滅菌紙巾的左手上，選擇直徑為2-6mm的卵泡，用接有18G針頭的5ml注射器吸取卵泡液，將抽取的含有卵母細胞的卵泡液注入15ml的離心管中，置于35℃保溫水浴槽內，待沉淀后棄掉上清液，洗滌2次，將沉淀物移入到中央劃有方格的平皿中，在實體顯微鏡下，選擇有卵丘細胞附著，細胞質亮度均一，形態(tài)良好的卵母細胞，用成熟培養(yǎng)液洗滌2次后，移入4孔培養(yǎng)皿，置于39℃、5％CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中，分別進行18、22、24h的成熟培養(yǎng)。卵母細胞成熟培養(yǎng)液采用CR2aa+10％SCS(Superovulated Cow Serum)+0.01mg/ml FSH(Follicle Stimulating Hormone)+100IU/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素。其中，CR2aa的培養(yǎng)基成分如表1。
表1、CR2aaEmbryo Culture medium


其中，22h體外成熟培養(yǎng)的卵母細胞如圖1a所示，卵丘細胞膨脹。分別將成熟培養(yǎng)18、22、24h的一部分卵母細胞用0.1％透明質酸酶-HSOF(-Ca2+、-Mg2+)(2mg/ml透明質酸酶+HSOF(-Ca2+、-Mg2+))除去卵丘細胞后，用2μg/ml Hoechlst 33342(Calbiochem制)對裸卵進行染色，觀察卵母細胞核的成熟情況。其中，22h體外成熟培養(yǎng)的卵母細胞裸卵的2.5μg/ml Hoechlst 33342染色結果如圖1b所示，箭頭所指方向為細胞核所在位置。其中，HSOF(-Ca2+、-Mg2+)液的組成如表2。
表2 HSOF(-Ca2+、-Mg2+)液的配方

3、受核卵母細胞的去核將經過18、22、24h成熟培養(yǎng)的卵母細胞，在含有0.1％透明質酸酶(Sigma制)，不含Ca2+、Mg2+的HSOF液中，吹打除掉卵丘細胞，裸卵以放出第一極體的位置，作為顯微操作去核的標志。
(1)“點擊去核法”將經過18、22、24h成熟培養(yǎng)的卵母細胞裸卵洗凈，每20個為一組移入7.5μg/ml的細胞松馳素B(CB)100μl微滴中，以顯微操作儀的左手油壓側控制顯微固定細管和右手側控制顯微切割針，在第一極體附近，將卵母細胞透明帶切開1/3(周長的1/3)，調準切口(圖1c和圖1d)，使其與切割針成垂直方向，固定卵母細胞，用顯微針點擊透明帶的3點鐘位置上的一點(圖1f，箭頭所指方向為第一極體)，除去第一極體連同下面的一小部分細胞質(核物質)。
將除掉的這一小部分細胞質，放入載有2.5μg/ml Hoechlst 33342液滴的載玻片上，10分鐘后壓片，在熒光顯微鏡下觀察，發(fā)藍色熒光的為去掉的DNA核。
不同培養(yǎng)時間對卵母細胞去核成功率的影響結果如表3所示，采用不同的培養(yǎng)時間對卵母細胞進行體外成熟培養(yǎng)，并且采用點擊去核法對成熟培養(yǎng)18h的卵母細胞進行去核，其去核率達90％，顯著高于22h組的75.8％(P＜0.05)，極顯著高于24h成熟培養(yǎng)的55.6％(P＜0.01)，22h組顯著高于24h組(P＜0.05)。
表3.體外培養(yǎng)成熟時間對牛卵母細胞去核率的影響

注a，cP＜0.01；a，b、b，cP＜0.05(2)擠壓法將經過18h成熟培養(yǎng)的卵母細胞裸卵洗凈，每20個為一組移入7.5μg/ml的細胞松馳素B(CB)100μl微滴中，以顯微操作儀的左手油壓側控制顯微固定細管和右手側控制顯微切割針，在第一極體附近，將卵母細胞透明帶切開1/3(周長的1/3)，調準切口，使其與切割針成垂直方向，固定卵母細胞，調節(jié)右手顯微切割針，將切割針橫壓在卵母細胞的直徑部位，垂直向下微微輕壓，除去第一極體連同下面的一小部分細胞質，此時要掌握好顯微操作針下壓的尺度，要求操作者樹立微觀意識，避免損傷卵母細胞質。DNA檢查方法同步驟(1)。
(3)吸引法將經過18h成熟培養(yǎng)的卵母細胞裸卵洗凈，每20個為一組移入7.5μg/ml的細胞松馳素B(CB)100μl微滴中，以顯微操作儀的左手油壓側控制顯微固定細管和右手側控制顯微切割針，在第一極體附近，固定卵母細胞，調節(jié)右手所控制的顯微吸引管，此管的前端磨成斜口，并將斜口的尖端拉成1μm長的尖，調準卵母細胞的第一極體到3點鐘的位置，在第一極體偏上的位置將顯微針管插入透明帶，順卵周間隙向前移動顯微管，使顯微操作管的斜口貼近卵母細胞質的質膜，但不能損傷質膜，微微向下壓顯微管，使其在具有一定壓力又不損傷卵母細胞質膜的情況下，使顯微管接近第一極體，順勢將第一極體連同其下一小部分細胞質吸入顯微管內(圖1e，箭頭所指方向的小圓亮點為第一極)，此時調節(jié)右手按鈕，將顯微管移出透明帶，去核完成，此法要求操作者動作精細、要十分準確，針尖很容易損傷質膜。DNA檢查方法同步驟(1)。
4、移核配制含有5％蔗糖的HSOF(-Ca2+、-Mg2+)液體(HSOF(-Ca2+、-Mg2+)+5％蔗糖)，作成100μl的微滴，將除核后的受體胞質，20個一組移入該液中，靜置5分鐘后，再將其移到同種液體的顯微操作液微滴(100μl)中，同時將洗滌好的核供體細胞，也移到此液滴中。此時，核供體細胞和受核卵母細胞質均處于脫水狀態(tài)，體積變小。顯微操作將核供體細胞，用微細吸管經切口處，注入受核卵母細胞卵周隙，抽出顯微移核細管，輕壓透明帶，使其切口閉合。
5、電融合及復合活性化處理將移核重構胚，移入含有0.25％蔗糖和10％FCS的HSOF(-Ca2+、-Mg2+)液(HSOF(-Ca2+、-Mg2+)+10％FCS+2.5％蔗糖)中，靜置5分鐘使其復水，然后用含有0.25％蔗糖和10％FCS的HSOF(-Ca2+、-Mg2+)液洗滌2次，使其核質完全復原之后，用ECM2001(BTX)融合儀、1mm間隔的融合室、含有0.05％BSA的融合液(0.3M甘露醇+0.5mM HEPES+0.05mM Ca(C2H3O2)+0.1mM Mg(C2H3O2)2+0.05％BSA)，分別采用0.50、0.75、1.025、1.25、1.50、1.75、2.00、2.25和2.50kv/cm的電場強度進行直流電脈沖處理，脈沖寬度為50μs，連續(xù)2次的融合條件進行電融合，將電融合處理后的移核重構胚洗滌2次，移入含有0.25％蔗糖和10％FCS的HSOF(-Ca2+、-Mg2+)液中，放入38.5℃、5％CO2、100％濕度的常壓CO2培養(yǎng)箱中，2小時后，觀察融合狀態(tài)，選擇融合的重構胚，以5μl/10ml Ca-離子載體HSOF(+Ca2+、+Mg2+)液(5μl鈣離子載體液+10ml HSOF(+Ca2+、+Mg2+)，其中鈣離子載體液的配方為1mg鈣離子載體+0.191ml DMSO)，在避光下處理4分鐘，然后移入6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)SOF(+Ca2+、+Mg2+)液(2mM 6-DMAP+SOF(+Ca2+、+Mg2+)+10％FCS)中，放入38.5℃、5％CO2、100％濕度的常壓CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)4小時，進行復合活性化處理。其中，SOF(+Ca2+、+Mg2+)液的配方如表4。
表4 SOF(+Ca2+、+Mg2+)液的配方


6、移核重構胚的體外發(fā)育培養(yǎng)將復合活性化處理的移核重構胚洗滌2次，采用CR2aa+10％FCS+10ul/ml胰島素+100IU/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素培養(yǎng)液進行發(fā)育培養(yǎng)，168h后觀察移核重構胚的囊胚發(fā)育情況。
采用吸引法、擠壓法和點擊法對卵母細胞去核率和囊胚發(fā)育率進行比較，結果如表5所示，表明點擊法的去核成功率最高，并獲得了較高的囊胚發(fā)育率。
表5 不同去核方法對牛卵母細胞的去核率及囊胚發(fā)育率的影響

注a，bP＜0.01 a，cP＜0.05*試驗次數
權利要求
1.一種去除哺乳動物卵母細胞細胞核的方法，是將剛放出第一極體的卵母細胞的裸卵的透明帶，在第一極體處切開周長的1/3，再點擊所述透明帶，除去第一極體連同下面的核物質。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述點擊透明帶的位置是3點鐘的位置。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述哺乳動物卵母細胞來自于牛、羊、豬、貓或狗。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于所述哺乳動物卵母細胞來自于牛。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述剛放出第一極體的牛卵母細胞按照以下方法獲得將牛的卵母細胞在CR2aa+10％SCS+0.01mg/mlFSH+100IU/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素的培養(yǎng)基中成熟培養(yǎng)18-22小時，得到剛放出第一極體的卵母細胞。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述成熟培養(yǎng)的時間為18小時。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種去除哺乳動物卵母細胞細胞核的方法。本發(fā)明所提供的去除哺乳動物卵母細胞細胞核的方法，是將剛放出第一極體的卵母細胞的裸卵的透明帶，在第一極體處切開周長的1/3，再點擊透明帶，除去第一極體連同下面的核物質。本發(fā)明的點擊去核法避開顯微切割針與細胞質的接觸，減少顯微切割針對細胞質的損傷；操作簡單，去核效率高；點擊去核法的去核率為90％，顯著高于擠壓法的88％和吸引法的68.7％；點擊去核法的囊胚發(fā)育率34.1％極顯著的高于吸引法的20.9％，顯著高于擠壓法的18％。本發(fā)明的去核方法是高動物克隆效率的有效途徑。
文檔編號C12N15/01GK1769442SQ20051010934
公開日2006年5月10日 申請日期2005年10月13日 優(yōu)先權日2005年10月13日
發(fā)明者董雅娟, 柏學進 申請人:萊陽農學院