專利名稱：一種利用pon2基因第九外顯子多態(tài)性預(yù)測2型糖尿病易感性的方法及試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用PON2基因第九外顯子多態(tài)性預(yù)測2型糖尿病易感性的方法及試劑，該方法可用于疾病的輔助診斷、治療和新藥開發(fā)，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
糖尿病是一種暫時(shí)無法治愈的慢性疾病，并可引發(fā)多種合并癥，累及眼、腎、神經(jīng)、心臟、血管等多種組織器官。糖尿病患者常伴有血脂代謝紊亂、高血壓、肥胖等疾病，其發(fā)生冠心病、腦血管病的危險(xiǎn)性也明顯高于非糖尿病人群。糖尿病已經(jīng)成為威脅人類健康的主要疾病之一，它帶來的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)也與日劇增。目前認(rèn)為，糖尿病(diabetes mellitus，DM)不是一種簡單疾病，而是一種內(nèi)分泌、代謝異常綜合征，是由遺傳因素與后天環(huán)境因素聯(lián)合作用而導(dǎo)致的一種機(jī)體慢性高血糖狀態(tài)。按1999年世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的糖尿病分型意見，目前主要?jiǎng)澐譃?種類型，即1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病和其他特殊類型糖尿病，其中近90％為2型糖尿病。2型糖尿病患者多見于40歲以上的中、老年人，但也可發(fā)生于其他任何年齡，曾被稱為非胰島素依賴型糖尿病(non-insulin-dependent diabetes mellitus，NIDDM)。其發(fā)病具有較強(qiáng)的遺傳易感性，且發(fā)病率隨著年齡和體重的增加、運(yùn)動減少而增長，肥胖尤其是中心性肥胖是此類糖尿病的明顯誘發(fā)因素，易引起胰島素抵抗(IR)并伴有胰島素分泌的相對不足。隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們生活方式的改變，糖尿病的發(fā)病率逐年升高。
研究表明，2型糖尿病可由于一種以上基因異常及致病環(huán)境因子與基因呈正性或負(fù)性相互作用而引起，遺傳因素在2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制中起非常重要的作用。2型糖尿病主要存在兩種遺傳模式(1)單基因模式，即由單個(gè)基因的突變引起，但突變位點(diǎn)位于基因關(guān)鍵位點(diǎn)，其突變嚴(yán)重影響了基因功能；此類疾病表型往往較嚴(yán)重，如MODY等，這一模式在T2DM患者中比較罕見，只占發(fā)病人數(shù)的5％。(2)多基因模式，單一或少數(shù)幾個(gè)基因變異的效應(yīng)不足以引起疾病明顯表型的出現(xiàn)，只有多個(gè)基因變異效應(yīng)累積達(dá)到某一閾值時(shí)才出現(xiàn)疾病表型；而且可能不同的基因變異組合將引起不同的表型變化；不同的人群也有不同的易感基因位點(diǎn)組合。中國北方人T2DM的易感基因組合仍不清楚。但是人們將這些突變基因組合分為兩種1)主效基因作用模式，即1-2個(gè)主效基因?qū)膊∫赘行云鹬鲗?dǎo)作用，且其基因變異在群體中的發(fā)生頻率較高，其余的次要基因?qū)?型糖尿病易感性貢獻(xiàn)率很小。這種模式在T2DM研究中，還沒有肯定的證據(jù)；據(jù)推測，這一模式可能存在于30歲以前發(fā)病的患者中。2)微效基因作用模式，即源于多個(gè)位點(diǎn)的大多數(shù)風(fēng)險(xiǎn)等位基因在群體中的發(fā)生頻率都很低，它們之間有相互作用，效應(yīng)具有可累加性，符合數(shù)量性狀的劑量-效應(yīng)關(guān)系，它們對T2DM遺傳易感性的共同貢獻(xiàn)，使易感人群達(dá)到疾病發(fā)生的臨界閾值。
2型糖尿病被認(rèn)為是復(fù)雜遺傳病，即多基因疾病，不僅受到基因與基因之間相互作用的影響，而且受到環(huán)境因素的修飾。近年來，在確定2型糖尿病易感基因方面取得了很大的成功。使人們對2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制有了更深入的認(rèn)識。目前尋找多基因遺傳疾病易感基因的方法有兩種候選基因篩選法和全基因組掃描定位克隆法。候選基因法指通過選擇與血糖調(diào)節(jié)或能量代謝有關(guān)蛋白的編碼基因作為研究對象，并假設(shè)它們的基因變異與2型糖尿病的遺傳易感性有關(guān)，通過病例一對照關(guān)聯(lián)研究等求證方法證實(shí)這些基因與2型糖尿病易感性的相關(guān)性，是一種簡單直接的方法。如果已知候選基因的功能，采用這一方法則相對容易。
PON2基因與PON1和PON3基因均定位于7q21-22，屬于同一基因家族。在此基因位置上，Prochazka等人在皮瑪印第安人中進(jìn)行的基因組掃描研究中發(fā)現(xiàn)2型糖尿病的易感基因。PON2具有抗氧化功能，可以分解芳香脂類化合物，對肝臟解毒具有一定的作用。PON2基因的變異主要有Prochazka等發(fā)現(xiàn)的Ser 311/Cys和Mochizuki等發(fā)現(xiàn)的Ala148/Gly。群體研究中，Hegele等在Oji-Cree人群發(fā)現(xiàn)Gly148等位基因純合子與空腹高血糖和2型糖尿病有關(guān)；在中國南方2型糖尿病患者中發(fā)現(xiàn)PON2基因C311S與缺血性休克相關(guān)。此外，更多的研究表明PON基因家族多態(tài)與心血管疾病相關(guān)。這些都表明PON2基因的變異可能對2型糖尿病的發(fā)生具有潛在的關(guān)聯(lián)，是一個(gè)有價(jià)值的候選基因。
簡言之，以上背景表明，2型糖尿病是一種受遺傳和環(huán)境雙重影響的復(fù)雜代謝性疾病，通過候選基因法可以發(fā)現(xiàn)對2型糖尿病易感性有重要影響的關(guān)鍵功能基因并用于2型糖尿病的預(yù)測和預(yù)防。芳香酯酶2(Paraoxonase 2，PON2)是一種高度保守的生物酶。研究者認(rèn)為，它與肝臟的解毒功能和有機(jī)體的抗氧化過程密切相關(guān)。(Pharmacogenetics 2003May 13(5)291-5)經(jīng)過現(xiàn)有國內(nèi)外文獻(xiàn)檢索，未見有PON2基因第九號外顯子多態(tài)性與2型糖尿病易感性相關(guān)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是提供一種利用PON2基因第九外顯子預(yù)測2型糖尿病易感性的方法及試劑。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種預(yù)測2型糖尿病的試劑，包括PCR引物和含有該引物的試劑盒。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種預(yù)測2型糖尿病易感性的方法，通過提取宿主細(xì)胞的基因組DNA，測定受試者PON2基因第九號外顯子的SEQ ID NO1所示序列第105位的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNP)的基因型，預(yù)測受試者對2型糖尿病的易感性第105位的基因型為C/C時(shí)，受試者的易感性較低；第105位的基因型為C/G或G/G時(shí)，受試者的易感性較高。
其中，單核苷酸多態(tài)性(SNP)主要指基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異引起的DNA序列多態(tài)性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種，是第三代分子標(biāo)記，在所有的已知多態(tài)性中占絕對優(yōu)勢。
基因分型及等位基因頻率分布是指同一生物群體中，相同等位基因核苷酸序列順序分析，在此表示相同SNP位點(diǎn)在不同個(gè)體中的組成成分的確定，為基因分型。等位基因頻率是指所研究的同一種類型的等位基因里，所期望出現(xiàn)的等位基因占的比例，即變異等位基因所占的比例。
疾病易感性(2型糖尿病易感性)是指人群對疾病的易患程度或可能性。
病例-對照關(guān)聯(lián)分析是指一種由果及因的回顧性研究。它先按照疾病狀態(tài)確定調(diào)查對象，分為病例和對照組，通過比較病例組與對照組間所研究的遺傳標(biāo)志出現(xiàn)頻率的差異而獲得該標(biāo)志與疾病間關(guān)聯(lián)的信息。
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了PON2基因第九號外顯子所編碼的蛋白序列中第311位Cys(C)→Ser(S)多態(tài)(即第九號外顯子上第26位C→G多態(tài)性存在與中國人群，并在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
根據(jù)對2型糖尿病人PON2基因測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)該SNP存在于中國人群，該SNP導(dǎo)致第311位氨基酸由Cys(C)→Ser(S)。由于這是不同性質(zhì)氨基酸的置換，因此，會導(dǎo)致PON2基因第九號外顯子所編碼的蛋白活性發(fā)生改變。
本發(fā)明提供了一種分離核酸，具有SEQ ID NO.1所示的堿基序列，在第105位為G。該核酸序列為PON2基因第九號外顯子，其中氨基酸編碼區(qū)為第80-238位。PON2基因的基因組全序列和mRNA及蛋白質(zhì)序列可以由Genebank中獲得?；蚪M序列在Genebank中的編號為gi27658001。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員都清楚，有很多分析方法可以用于檢測PON2基因第九號外顯子中所述位點(diǎn)是否存在單核苷酸多態(tài)性。這些技術(shù)包括(但并不限于)DNA測序、雜交測序、DNA芯片、PCR-RFLP、PCR-SSCP、酶促錯(cuò)配切割、變性梯度凝膠電泳、變性高效液相色譜(DHPLC)等。
用于本發(fā)明方法或檢測試劑盒的引物，根據(jù)PON2基因第九外顯子和其5’端內(nèi)含子與3’端非編碼區(qū)的基因組序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，并可用常規(guī)的合成技術(shù)進(jìn)行合成。本發(fā)明提供了一組等位基因特異性的引物，具有SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的堿基序列，其長度為18-26bp，且特異性的雜交并擴(kuò)增出含人PON2基因第九號外顯子的SEQ ID NO.1所示序列中第105位單核苷酸多態(tài)性的擴(kuò)增產(chǎn)物。
用于本發(fā)明的測試樣品沒有特別限制，對于檢測SNP而言，可以是從血液、組織等樣品中抽提出的基因組DNA。對于檢測PON2基因第九號外顯子活性而言，可以任何表達(dá)PON2基因第九號外顯子的樣品，如血液、肝臟組織勻漿等。
另一方面，本發(fā)明的檢測方法被用于評估個(gè)體患2型糖尿病及其他PON2基因第九號外顯子相關(guān)疾病的易感性。
本發(fā)明提供了一種檢測T2DM易感性的診斷試劑盒，其中含有本發(fā)明特異性擴(kuò)增PON2基因第九號外顯子序列的引物對和用于PCR擴(kuò)增檢測的試劑盒的常規(guī)組件、試劑、緩沖液等，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知這些常規(guī)組件和檢測方法。檢測擴(kuò)增產(chǎn)物與正常PON2基因第九號外顯子第26位SNP相互對比是否存在變異時(shí)，所需的化學(xué)試劑還包括特異性內(nèi)切酶等。本發(fā)明試劑盒中的全部組分、含量、來源和使用方法如下本發(fā)明試劑盒供10人份檢測應(yīng)用，其組分、含量和來源包括20ul 10×PCR緩沖液(Pharmacia)，4ul 10mM dNTP混合液(Pharmacia)，2ul(5unit/ul)Taq DNA聚合酶(Takara)，各10ul(10pmol/ul)F1(SEQ ID NO.2)和R1(SEQ ID NO.3)引物(自制)，1.5ml純水(自制)，10ul 10×限制酶反應(yīng)緩沖液(Biolab)，4ul(5unit/ul)限制酶Dde I(Biolab)。
使用方法
1)通過PCR擴(kuò)增PON2基因第九號外顯子基因制備混合液，加入基因組DNA溶液100ng、2ul 10×PCR緩沖液、0.4ul 10mM dNTP、1.0單位Taq DNA聚合酶和10pmolF1和R1分別為有義引物和反義引物，實(shí)施例2敘述的每種引物。接著，加入純水，使總體積為20ul。反應(yīng)在94℃0.5分鐘，58℃0.5分鐘，72℃0.5分鐘，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后，將3ul每種PCR反應(yīng)液在8％的聚丙烯酰胺凝膠上電泳檢測，如擴(kuò)增了331bp的片段，獲得了單一條帶，即為擴(kuò)增成功。
2)通過用限制酶處理PCR反應(yīng)產(chǎn)物測定PON2基因第9號外顯子的多態(tài)性。往5ul上述擴(kuò)增的PCR反應(yīng)產(chǎn)物中加入1ul限制酶反應(yīng)緩沖液、0.4ul限制酶Dde I，并在37℃水浴中消化過夜。之后，在8％的聚丙烯酰胺凝膠上電泳。
3)多態(tài)性定型用限制酶Dde I處理片段，在第105個(gè)堿基是C等位基因時(shí)，出現(xiàn)128bp、105bp、67bp和31bp的條帶。如為G等位基因時(shí)，出現(xiàn)172bp、128bp和31bp的條帶。
在進(jìn)行本發(fā)明的基因診斷時(shí)，優(yōu)選使用用于測定根據(jù)PON2基因第九號外顯子的突變類型存在的診斷試劑，診斷試劑包括作為必要成分的特定試劑，其對應(yīng)于用于測定PON2基因第九號外顯子基因突變類型的方法。特定的試劑按采用的測定方法來適當(dāng)?shù)剡x擇。試劑的特征是，組成測定由PON2基因定義的突變類型的手段是必要的，如，DNA片段/和/或作為用于測定的特異限制酶。試劑，例如特定制備的用于PCR擴(kuò)增步驟的引物，該步驟用于包含PON2基因第九號外顯子的突變點(diǎn)的特定擴(kuò)增片段，不被認(rèn)為是本發(fā)明診斷試劑的必要成分，它們也包含于本發(fā)明的診斷試劑之中。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明首次闡明了PON2基因第九號外顯子第26位SNP與T2DM的相關(guān)性，提供了一種預(yù)測T2DM易感性的方法，該方法可用于T2DM的預(yù)防、輔助診斷和治療，還可以用于新藥研發(fā)。
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步敘述，以使公眾對發(fā)明內(nèi)容有更深入的了解，并非對本發(fā)明的限制。


圖1為PON2基因外顯子9 Ser311Cys多態(tài)PCR-RFLP分型電泳圖譜，右側(cè)第一泳道為Marker。
具體實(shí)施例方式
下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
用于下列實(shí)施例中表示試劑的英文縮寫如下。
需要時(shí)，用高壓鍋(120℃，20分鐘)滅菌EDTA乙二胺四乙酸二鈉SDS十二烷基硫酸鈉TE10mM Tris-HCl(pH7.5)，1mM EDTA(pH8.0)10×PCR緩沖液100mM Tris-HCl(pH8.3)，500mM KCl，15mM氯化鎂(MgCl2)0.01％(W/V)白明膠dNTP脫氧核苷三磷酸甲酰胺顏料95％去離子甲酞胺，0.05％葡聚糖藍(lán)APS過硫酸銨→10×TBETris(108g)，硼酸(55g)，EDTA2Na(9.3g)，溶于純水中，總體積為1升。
實(shí)施例1血液樣本收集和基因組DNA的提取按WHO(1999)標(biāo)準(zhǔn)明確診斷入選病例，須經(jīng)空腹8-12小時(shí)口服溶入300ml溫水中的75g無水葡萄糖，2小時(shí)后檢測其血漿葡萄糖值≥11.1mmol/L或者以前經(jīng)由縣市以上級別醫(yī)院明確診斷的糖尿病患者，共計(jì)收集來自黑龍江和北京的無親緣關(guān)系T2DM患者396例，平均年齡50.0歲±12.7歲，其中男性191例，同地區(qū)的健康對照志愿者319例，平均年齡45.2歲±5.7歲，其中男性181例。所有受檢者均為漢族，且簽署知情同意書，這一研究也得到了本單位倫理委員會批準(zhǔn)。
根據(jù)下列方法，用人外周血制備基因組DNA。在抗凝劑EDTA存在下，將收集的10ml人外周血在2500rpm，離心分離30分鐘除去血清。接著加入0.2％NaCl溶液，使總體積為50ml。輕輕振蕩溶液5-6次，并使其放置于冰上15分鐘。此后，在2500rpm離心分離30分鐘，借此收集沉淀物。用0.2％的NaCl溶液，以類似于前面的方式再進(jìn)行洗滌。在如此獲得的沉淀物中，加入10mMTris-HCl(pH8.0)和10mM EDTA(4ml)，以懸浮該沉淀物。將10％SDS，25mg/ml的蛋白酶K和10mg/ml的RNaseA加入懸液中，其加入量分別為4ml、16ul和20ul，接著上下顛倒懸液輕輕混合。然后，在37℃過夜溫育懸液。過夜后，加入4ml酚/Tris溶液，上下顛倒混合物混合所得的混合物。以3000rpm進(jìn)行離心分離10分鐘除去水層。將水層和4ml酚/氯仿溶液混合，接著逆混合并以3000rpm離心分離10分鐘。除去水層。最后，用氯仿提取兩次，以獲得水相，往其中加1/10，3M NaAC(pH5.2)，兩倍量的冷無水乙醇，使DNA沉淀。用70％的乙醇洗滌以獲得基因組DNA。使這樣獲得的DNA，基因組DNA溶解于TE中，然后定量測定混合物在260nm的吸收率。DNA工作液濃度校正至50ng/ul，置-20℃冰箱保存。
實(shí)施例2 SNP的識別確定本發(fā)明采用PCR-RFLP和PCR測序技術(shù)對PON2基因第九號外顯子進(jìn)行檢測。
1)特異性引物如下上游引物5’-tggaaaacagggcttattgatga-3’(SEQ ID NO2)下游引物5’-ctgggtcaatgttgctggttaaa-3’(SEQ ID NO3)2)PCR擴(kuò)增PON2基因第九號外顯子片段反應(yīng)容器中加入實(shí)施例1制備的基因組DNA溶液100ng、2ul 10×PCR緩沖液、0.4ul 10mM dNTP、1.0單位Taq DNA聚合酶和10pmol上述步驟1)敘述的每種引物。加入純水，使總體積為20ul。反應(yīng)在94℃0.5分鐘，58℃0.5分鐘，72℃0.5分鐘，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后，將3ul每種PCR反應(yīng)液在8％的聚丙烯酰胺凝膠上電泳獲得了單一的條帶，觀察在BioRad成像儀，應(yīng)用Gel Doc 2000程序。
3)擴(kuò)增得到了331bp的片段，直接進(jìn)行測序。委托華大中生科技發(fā)展有限公司進(jìn)行序列測定工作?！巴?ul上述擴(kuò)增的PCR反應(yīng)產(chǎn)物中加入1ul限制酶反應(yīng)緩沖液、0.4ul限制酶DdeI，并在37℃消化過夜。此后，在8％的聚丙烯酰胺凝膠上電泳。多態(tài)性的測定為用限制酶Dde I處理片段，在第105個(gè)堿基是C等位基因時(shí)，出現(xiàn)128bp、105bp、67bp和31bp的條帶。如為G等位基因時(shí)，出現(xiàn)172bp、128bp和31bp的條帶?！睂?shí)施例3 2型糖尿病易感基因PON2基因第九號外顯子內(nèi)SNP的相關(guān)研究統(tǒng)計(jì)方法利用SPSS11.0軟件中Pearson卡方檢驗(yàn)計(jì)算PON9基因多態(tài)性的Hardy-Weinberg平衡檢測，并計(jì)算等位基因頻率、基因型頻率在病例對照群體中分布的差異性，統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著性水平設(shè)定為P＜0.05。采用單因素Logistic回歸分析計(jì)算T2DM的患病風(fēng)險(xiǎn)0R值及其95％可信區(qū)間(CI)。
1.中國北方漢族人群2型糖尿病患者及正常對照標(biāo)本的收集2型糖尿病組外周血樣本采自北京人民醫(yī)院內(nèi)分泌科門診，正常對照組樣本采自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)，標(biāo)本來源均為我國北方地區(qū)漢族，分別以北京和黑龍江為主。糖尿病可為散發(fā)，也可為糖尿病家系成員(同一家系中具有血緣關(guān)系的成員僅能入選一人)，正常對照要求家庭三代以內(nèi)無糖尿病患者(包括I型糖尿病)，對照組與患病組年齡及性別相匹配。共收集樣本614份，其中病例組295份，對照組319份，每個(gè)入選成員均應(yīng)在知情同意書上簽字。
2型糖尿病的診斷嚴(yán)格按照WHO于1997年頒發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，即空腹血葡萄糖濃度≥7.8mmol/L或餐后與口服75克葡萄糖2小時(shí)血糖≥11.1mmol/L為糖尿病，服糖后2小時(shí)葡萄糖濃度＜7.8mmol/L為正常。入選的每個(gè)成員記錄基本情況，包括性別、年齡、身高、體重、心率、血壓等。對病例組還增加了發(fā)病年齡、用藥情況、合并癥、家族史等指標(biāo)內(nèi)容。
2.SNP位點(diǎn)基因型分析采用PCR-RFLP進(jìn)行SNP分型此SNP改變了限制性內(nèi)切酶Dde I的酶切位點(diǎn)，可以先進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用內(nèi)切酶Dde I消化，電泳后根據(jù)條帶位置判斷基因型，完全酶切產(chǎn)生兩條帶的為野生型GG純合子，不能被酶切產(chǎn)生一條帶的為突變型純合子，不完全酶切的為CG雜合子，請參閱圖1。
3.病例一對照關(guān)聯(lián)分析在病例、對照組中，分型的PON2基因第九號外顯子SNP位點(diǎn)均符合哈代-溫伯格平衡。經(jīng)SPSS統(tǒng)計(jì)軟件10.0版進(jìn)行卡方分析，PON2基因第九號外顯子SNP位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率的分布在兩組中的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(對基因型頻率和等位基因頻率分別為P＜0.01，P＜0.05)，如表1所示。
表1病例組與對照組PON2基因第九號外顯子SNP分型SPSS統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

如上表可以看出，位于PON2基因第九號外顯子的SNP位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率在病例組和對照組存在顯著差異，因此提示此SNP位點(diǎn)與2型糖尿病相關(guān)，G等位基因是2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)等位基因，可以顯著升高2型糖尿病的發(fā)病幾率，OR值為1.43，95％置信區(qū)間為1.08-1.89。從而提示PON2基因?yàn)橐粋€(gè)新的2型糖尿病易感基因。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動和修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
實(shí)施例4 檢測試劑盒制備檢測T2DM相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，包含有可擴(kuò)增出PON2基因第九號外顯子的SNP位點(diǎn)的引物對，及其PCR-RFLP相應(yīng)試劑，成分和含量如下，于-20℃保存20u1 10×PCR緩沖液(Pharmacia)，4ul 10mM dNTP混合液(Pharmacia)，2ul(5unit/ul)Taq DNA聚合酶(Takara)，各10ul(10pmol/ul)F1(SEQ ID NO.2)和R1(SEQ ID NO.3)引物(自制)，1.5ml純水(自制)，10ul 10×限制酶反應(yīng)緩沖液(Biolab)，4ul(5unit/ul)限制酶Dde I(Biolab)。
序列表<110>衛(wèi)生部北京醫(yī)院<120>一種利用PON2基因第九外顯子多態(tài)性預(yù)測2型糖尿病易感性的方法及試劑<130>
<160>3<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>331<212>DNA<213>人屬，人種(Homo sapiens，human)<400>1tggaaaacag ggcttattga tgattgagtg acatgcatgt acggtggtct tatattcata60ctttgtatcc cctgaatagg ttctccgcat ccagaacatt ctatctgaga agcctacagt120gactacagtt tatgccaaca atgggtctgt tctccaagga agttctgtag cctcagtgta180tgatgggaag ctgctcatag gcactttata ccacagagcc ttgtattgtg aactctaaat240tgtacttttg gcatgaaagt gcgataactt aacaattaat tttctatgaa ttgctaattc300tgagggaatt taaccagcaa cattgaccca g 331
<210>2<211>23<212>DNA<213>人工合成<400>2tggaaaacag ggcttattga tga 23<210>3<211>23<212>DNA<213>人工合成<400>3ctgggtcaat gttgctggtt aaa 2權(quán)利要求
1.一種預(yù)測2型糖尿病易感性的方法，通過提取宿主細(xì)胞的基因組DNA，測定受試者PON2基因第九號外顯子的SEQ ID NO1所示序列第105位的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型，預(yù)測受試者對2型糖尿病的易感性第105位的基因型為C/C時(shí)，受試者的易感性較低；第105位的基因型為C/G或G/G時(shí)，受試者的易感性較高。
2.一種分離核酸，具有序列表SEQ ID NO.1所示的堿基序列，在第105位為G。
3.一組預(yù)測2型糖尿病易感性的引物，其長度為18～26bp，能特異性地?cái)U(kuò)增出含PON2基因第九外顯子SEQ ID NO.1所示序列中的第105位SNP的擴(kuò)增產(chǎn)物，具有序列表SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的堿基序列。
4.一種預(yù)測2型糖尿病易感性的試劑盒，其特征在于，含有權(quán)利要求3所述的引物序列和以下試劑，包括20ul 10X PCR緩沖液，4ul 10mM dNTP混合液，2ul TaqDNA聚合酶，各10ul F1和R1引物，1.5ml純水，10ul 10X限制酶反應(yīng)緩沖液，4ul限制酶Dde I；本試劑盒供10人份檢測應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20℃。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種預(yù)測2型糖尿病易感性的試劑盒，其特征在于，所述F1和R1引物的序列分別具有序列表SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的堿基序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種預(yù)測2型糖尿病易感性的試劑盒，其特征在于，所述F1和R1引物的濃度為10pmol/ul。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種預(yù)測2型糖尿病易感性的試劑盒，其特征在于，所述限制酶Dde I的濃度為5unit/ul。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種預(yù)測2型糖尿病易感性的試劑盒，其特征在于，所述Taq DNA聚合酶的濃度為5unit/ul。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用PON2基因第九外顯子多態(tài)性預(yù)測2型糖尿病易感性的方法及試劑，通過提取宿主細(xì)胞的基因組DNA，測定受試者PON2基因第九號外顯子的SEQ ID NO1所示序列第105位的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNP)的基因型，預(yù)測受試者對2型糖尿病的易感性第105位的基因型為C/C時(shí)，受試者的易感性較低；第105位的基因型為C/G或G/G時(shí)，受試者的易感性較高。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是首次闡明了PON2基因第九號外顯子第26位的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與T2DM的相關(guān)性，提供了一種預(yù)測T2DM易感性的方法，該方法可用于T2DM的預(yù)防、輔助診斷和治療，還可以用于新藥研發(fā)。
文檔編號C12N15/11GK1766125SQ20051010905
公開日2006年5月3日 申請日期2005年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月18日
發(fā)明者楊澤, 屈彥純, 唐雷, 孫宏, 朱小泉, 孫亮, 張寧, 史曉紅, 紀(jì)立農(nóng), 蔡曉凌 申請人:衛(wèi)生部北京醫(yī)院