專利名稱：一種白血病相關(guān)基因ash2l在白血病分子分型診斷中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因重組、抗體制備和臨床診斷領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及一種白血病相關(guān)基因ASH2L的N-端部分的重組基因工程及蛋白純化工藝，涉及ASH2L相互作用蛋白DPY-30-like全長的重組基因工程及蛋白純化工藝，涉及運(yùn)用該兩種純化蛋白制備高特異性抗體，涉及ASH2L在PMA刺激K562細(xì)胞分化過程中被特異性下調(diào)，涉及含有ASH2L部分基因的重組質(zhì)粒和表達(dá)該蛋白的重組菌株和它們在白血病分子分型診斷中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
白血病的準(zhǔn)確分型是治療白血病的重要前提條件。目前，白血病的診斷和分型主要通過一些理化指標(biāo)來實(shí)現(xiàn)，具體而言是通過常規(guī)組化(主要是細(xì)胞形態(tài)檢測結(jié)果)作為分型的基礎(chǔ)。這些理化指標(biāo)主要是癌變細(xì)胞的外在表型，基本不涉及到細(xì)胞癌變分子機(jī)理過程，因此進(jìn)行診斷時(shí)細(xì)胞已經(jīng)大體完成了整個(gè)癌變過程，這樣的診斷手段可以對已發(fā)病病人進(jìn)行確診，但不能預(yù)判，對大規(guī)模篩查意義也較小。如果我們明確各種類型白血病在發(fā)病過程所特異表達(dá)的基因，或者在患病組織和細(xì)胞中能檢測到表達(dá)急劇變化的基因，將可以準(zhǔn)確、快速地確定類型，從而對治療起到很好的輔助作用。
經(jīng)過我們的研究，成功地發(fā)現(xiàn)ASH2L基因在造血組織中高表達(dá)，特別是在髓系多潛能分化前體細(xì)胞中高表達(dá)。在白血病來源的K562細(xì)胞向髓系方向分化的過程中，ASH2L的表達(dá)被明顯地下調(diào)，用PMA刺激8小時(shí)后，ASH2L的表達(dá)完全停止(汪俊華等，2001，J.Molecular Medicine，79399-405)。因此，ASH2L基因在白血病分子分型診斷方面存在潛在的應(yīng)用價(jià)值。但是在缺乏ASH2L作用機(jī)理方面深入理解的情況下，我們?nèi)匀徊磺宄cASH2L在功能上相關(guān)的分子是否如ASH2L樣在PMA刺激的K562分化過程中有類似的表達(dá)特點(diǎn)，換言之，ASH2L的表達(dá)特點(diǎn)是否是特異的還不能確定。在這些細(xì)節(jié)還沒有研究清楚之前，ASH2L在分子分型診斷方面的應(yīng)用將受到限制。因此在本發(fā)明中，主要通過對與ASH2L相互作用的分子進(jìn)行鑒定，以確定其起功能的方式，同時(shí)對ASH2L在功能上密切相關(guān)的基因在PMA刺激的K562細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行了檢測，以確定ASH2L在該過程中的表達(dá)調(diào)控是否是特異的；同時(shí)我們對特異的抗ASH2L的抗體制備方面進(jìn)行了研究，高質(zhì)量的抗體是進(jìn)行基礎(chǔ)研究和臨床診斷必不可少的手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是在用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選出與ASH2L相互作用蛋白的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，根據(jù)該相互作用提供的信息確定了ASH2L作用的分子機(jī)理，并通過實(shí)驗(yàn)確證了該分子機(jī)理。在這樣的工作基礎(chǔ)上，本發(fā)明的目的在于提供ASH2L在K562分化過程中表達(dá)變化的獨(dú)特性證據(jù)，同時(shí)提供了可以特異檢測到真核細(xì)胞中表達(dá)的ASH2L的抗體的生產(chǎn)工藝，包括選取ASH2L上特異的基因片段、重組表達(dá)質(zhì)粒、重組菌，并提供了抗原蛋白(ASH2L.N)純化方法和抗體免疫方法，為白血病分子分型診斷提供有力的工具。與此同時(shí)，還提供了與ASH2L相互作用蛋白DPY-30-like的純化和抗體制備方法，為相關(guān)的基礎(chǔ)研究提供工具。
本發(fā)明研究證明，ASH2L編碼的蛋白可以與低等生物劑量補(bǔ)償機(jī)制上游調(diào)控因子DPY-30基因的人同源基因DPY-30-like所編碼蛋白相互作用，可以通過真核細(xì)胞內(nèi)蛋白免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證該相互作用。
本發(fā)明從ASH2L上選取N-端編碼1-99aa的基因片段以及DPY-30-like的全長片段，通過分子生物學(xué)方法分別獲得含有該兩個(gè)片段的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(BL21)進(jìn)行重組表達(dá)含有該兩個(gè)片段的GST-融合蛋白，并通過GST-親和層析進(jìn)行純化。運(yùn)用該蛋白免疫家兔，獲得高特異性抗血清。
本發(fā)明運(yùn)用抗ASH2L.N和DPY-30-like的抗血清可以實(shí)施上述真核細(xì)胞蛋白免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，證明ASH2L與DPY-30-like之間的相互作用的確存在。通過生物信息學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)在低等生物如酵母中，ASH2L和DPY-30-like的同源蛋白被包含于同一個(gè)蛋白復(fù)合體(SET1蛋白復(fù)合體)中，該復(fù)合體具有組蛋白3-賴氨酸4甲基化轉(zhuǎn)移酶活性(Nagy P.L.，et al.2002.ProcNatl Acad Sci.9990-4.)。本發(fā)明運(yùn)用上述ASH2L和DPY-30-like的抗血清，在K562細(xì)胞中實(shí)施了蛋白免疫沉淀，并檢測發(fā)現(xiàn)沉淀得到的蛋白組分具有組蛋白3-賴氨酸4甲基轉(zhuǎn)移酶活性，證明了該蛋白復(fù)合體的存在。
根據(jù)文獻(xiàn)分析可知，含有ASH2L的組蛋白3-賴氨酸4甲基化轉(zhuǎn)移酶蛋白復(fù)合體中還包括一個(gè)穩(wěn)定成員WDR5(Roguev A.，et al.2001.Embo J.207137-48.；Roguev A.，et al.2003.J Biol Chem.2788487-93.)，根據(jù)NCBI上提供的基因序列，設(shè)計(jì)引物成功的從K562細(xì)胞的cDNA中克隆到該基因。本發(fā)現(xiàn)檢測了上述三個(gè)基因ASH2L、DPY-30-like和WDR5在PMA刺激的K562細(xì)胞分化過程中的表達(dá)特點(diǎn)。為實(shí)現(xiàn)該目的，分別設(shè)計(jì)了三個(gè)基因用于Northern雜交用探針，用同一張RNA雜交膜(含有PMA刺激后不同時(shí)間段的細(xì)胞總RNA)進(jìn)行雜交。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有ASH2L在PMA刺激后表達(dá)明顯下調(diào)，在8個(gè)小時(shí)后，表達(dá)完全停止。另外兩個(gè)成員的表達(dá)雖有波動，但始終維持在較高水平，說明ASH2L的高表達(dá)與K562細(xì)胞的癌變狀態(tài)呈現(xiàn)正相關(guān)的關(guān)系，同時(shí)也說明與ASH2L功能相關(guān)的其他分子并沒有呈現(xiàn)出與K562癌變狀態(tài)的這種相關(guān)性，因此ASH2L與K562高增殖癌變狀態(tài)的正相關(guān)關(guān)系是相對獨(dú)特的。這種獨(dú)特性可使ASH2L作為白血病分子分型診斷的侯選標(biāo)志物，從而具備潛在的應(yīng)用價(jià)值。
小結(jié)本發(fā)明涉及的基因ASH2L，通過組蛋白3-賴氨酸4甲基化復(fù)合體起作用，且在PMA刺激K562分化過程中的表達(dá)被明顯下調(diào)，表現(xiàn)為ASH2L的高表達(dá)與K562細(xì)胞癌變增殖狀態(tài)的正相關(guān)關(guān)系；同時(shí)與ASH2L在功能上密切聯(lián)系的其他基因比較，ASH2L的高表達(dá)與K562細(xì)胞高增殖狀態(tài)的正相關(guān)關(guān)系是獨(dú)特的；同時(shí)本發(fā)明提供了一種制備ASH2L特異抗體的方法，可以有效地檢測真核細(xì)胞中表達(dá)的ASH2L蛋白，它們可以在臨床診斷即白血病的分子分型診斷中起輔助作用；同時(shí)提供了DPY-30-like的特異性抗體制備方法，可以應(yīng)用到相關(guān)的基礎(chǔ)研究中。
本發(fā)明的主要技術(shù)特征在于(1)ASH2L，一個(gè)造血系統(tǒng)高表達(dá)基因，與DPY-30-like相互作用，并一起參與組蛋白3賴氨酸4甲基化轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體；在該復(fù)合體的成員中，ASH2L的高表達(dá)與K562細(xì)胞的高增殖狀態(tài)成正相關(guān)關(guān)系，且相對獨(dú)特；(2)含有編碼ASH2L 1-99aa的DNA序列的重組質(zhì)粒pGEX-ASH2L.N；(3)含有編碼DPY-30-like的DNA序列的重組質(zhì)粒pGEX-DPY-30-like；(4)含有重組質(zhì)粒pGEX-ASH2L.N的重組菌BL21-ASH2L(5)含有重組質(zhì)粒pGEX-DPY-30-like的重組菌BL21-DPY-30-like附圖表說明下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。


圖1，重組質(zhì)粒pGEX-ASH2L.N和pGEX-DPY-30-like構(gòu)建2，純化后GST-ASH2L.N和GST-DPY-30-like蛋白的SDS-PAGE電泳圖和用其制備的抗體檢測真核細(xì)胞表達(dá)的ASH2L和DPY-30-like蛋白圖3，ASH2L和DPY-30-like的相互作用(CoIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果)圖4，ASH2L和DPY-30-like所在復(fù)合體組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶活性圖5，ASH2L、DPY-30-like和WDR5三個(gè)基因在PMA刺激K562細(xì)胞分化過程中的表達(dá)變化
具體實(shí)施例方式
在下面的實(shí)施例中進(jìn)一步說明了本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1本發(fā)明中使用的引物序列及用途

實(shí)施例2ASH2L、DPY-30-like和WDR5基因的克隆K562細(xì)胞于10cm培養(yǎng)皿上，用含10％FBS的R1640培養(yǎng)基于37度，5％CO2培養(yǎng)至細(xì)胞數(shù)量達(dá)到2×107以上，收獲細(xì)胞提取總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄使用PROMEGA公司試劑盒進(jìn)行，方法見試劑盒說明。以該cDNA為模板，擴(kuò)增ASH2L、DPY-30-like和WDR5三個(gè)基因。使用的引物分別為ASH2L-1/2、DPY-1/2以及WDR5-1/2(序列見實(shí)施例1)。PCR反應(yīng)的條件分別是ASH2L，退火溫度為64度，延伸7分鐘；DPY-30-like，退火溫度為60度，延伸1分鐘；WDR5的退火溫度為60度，延伸1.5分鐘；其他條件同普通PCR條件，使用Pfu酶。
PCR產(chǎn)物，經(jīng)過Taq酶在72度條件下進(jìn)行加尾反應(yīng)10分鐘后，直接和pGEM-T載體(PROMEGA公司產(chǎn)品)連接，連接反應(yīng)按照試劑盒說明進(jìn)行，在4度過夜或者室溫進(jìn)行1-2小時(shí)。轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物于感受態(tài)DH5a細(xì)菌，涂布于含氨卞青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37度培養(yǎng)8小時(shí)以上，挑選單克隆進(jìn)行PCR鑒定，條件同上。陽性克隆培養(yǎng)于LB液體培養(yǎng)基，提取質(zhì)粒即得到三基因全長cDNA克隆。可進(jìn)行測序以進(jìn)一步確定序列。
實(shí)施例3抗ASH2L、DPY-30-like特異性抗體的制備抗原制備從ASH2L和DPY-30-like的cDNA模板上PCR擴(kuò)增所需要的片段，引物分別為ASH2L-6P-UP/ASH2L-6P-DOWN和DPY-6P-UP/DPY-6P-DOWN兩對(序列見實(shí)施例1)。ASH2L上的目的片段為N-端1-99aa編碼區(qū)，DPY-30-like則為其全長。PCR片段兩端含有限制性酶切位點(diǎn)EcoR I和Xho I，所以用這兩種酶消化PCR產(chǎn)物和載體質(zhì)粒pGEX-6P-1。然后用T4連接酶將消化后的PCR片段和載體進(jìn)行連接，形成重組質(zhì)粒(見圖1)。
PCR條件退火溫度為65度，延伸時(shí)間為1分鐘，其他條件同普通的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)產(chǎn)物50ul(大約5ug)和載體質(zhì)粒(pGEX-6P-1)6-10ug分別用EcoR I和Xho I進(jìn)行消化后用瓊脂糖電泳回收DNA片段，在10ul體系中進(jìn)行連接，其中含有1ul 10x連接緩沖液、1ul T4連接酶、100ng消化后的PCR片段、200ng消化后的載體片段、水補(bǔ)足10ul。在16度連接10小時(shí)以上。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，涂布于含氨卞青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37度培養(yǎng)8小時(shí)后，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定，PCR條件同上。挑取PCR陽性克隆，經(jīng)過含氨卞青霉素LB液體培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，經(jīng)過EcoR I/Xho I雙酶切鑒定得到陽性克隆。
將上述重組陽性克隆轉(zhuǎn)化BL21大腸桿菌。挑取單克隆，在液體LB培養(yǎng)基中37度培養(yǎng)6-8小時(shí)，當(dāng)菌液在OD260＝0.6或者略高于該值時(shí)，按照0.0125％的濃度加入1M的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。30度誘導(dǎo)4-6小時(shí)后收集菌體(5000rpm 30分鐘)。將濕菌用30％原培養(yǎng)基體積的PBS重懸洗滌一次，再次離心收集菌體(5000rpm 30分鐘)。用10％原培養(yǎng)基體積的PBS溶解濕菌后進(jìn)行超聲破菌(在冰上操作)。超聲條件為100W功率情況下，超聲10秒，間歇10秒，共進(jìn)行50次。然后12,000rpm離心30分鐘。收集上清，經(jīng)過0.45um的濾膜過濾除雜質(zhì)后，上柱(GST親和層析柱)，柱上結(jié)合10分鐘以上，也可反復(fù)結(jié)合。用PBS緩沖液洗滌柱子數(shù)次，每次10倍柱床體積，流出液用考馬斯亮蘭G250檢測，到流出液不含有任何蛋白或者含有很微量蛋白為止。然后用2x GST洗脫液進(jìn)行洗脫，洗脫液為柱床體積的0.8倍左右。SDS-PAGE電泳檢測蛋白濃度和純度(圖3)，同時(shí)通過分光光度計(jì)檢測確定蛋白濃度。
取上述蛋白進(jìn)行抗體制備，具體步驟為1)第一次基礎(chǔ)免疫取300-500μg抗原與等體積弗氏完全佐劑混合，直至形成油包水狀乳濁液，采用背部多點(diǎn)注射20-30個(gè)。
2)二次加強(qiáng)免疫兩周以后，200-300μg抗原與等體積弗氏不完全佐劑充分混勻，背部多點(diǎn)注射。免疫后7-10天后耳緣部取血ELISA測抗體效價(jià)。若滴度小于1∶1000，進(jìn)一步加強(qiáng)免疫。
3)第三次加強(qiáng)免疫抗原200-300μg與等體積不完全佐劑混合，背部多點(diǎn)注射。7-10天后耳緣部取血，ELISA測抗體效價(jià)。
要求每兩周免疫一次，達(dá)到所需滴度后的第10天頸動脈放血，收集抗血清，ELISA檢測抗體滴度。滴度未達(dá)到，則繼續(xù)加強(qiáng)免疫。待滴度達(dá)到要求后，頸動脈放血，收集血清，分裝后-70℃保存。
實(shí)施例4ASH2L和DPY-30-like相互作用的驗(yàn)證K562細(xì)胞于10cm培養(yǎng)皿上，用含10％FBS的R1640培養(yǎng)基于37度，5％CO2培養(yǎng)至細(xì)胞數(shù)量達(dá)到2×107以上。收集細(xì)胞后進(jìn)行CoIP實(shí)驗(yàn)如下1)用PBS洗兩細(xì)胞兩次。收集細(xì)胞至1ml冰上預(yù)冷的EBC緩沖液，置冰上10分鐘。
2)4℃高速離心(15000rpm)15分鐘，將上清轉(zhuǎn)入一離心管，加入50ul Protein-Aagarose于4℃孵育30分鐘。
3)4℃高速離心(15000rpm)15分鐘，將上清轉(zhuǎn)入一離心管，加入2ul抗體(本發(fā)明中用上述抗DPY-30-like的多克隆抗血清)后于4℃孵育60分鐘。
4)加入50ul Protein-A agarose于4℃孵育30分鐘。
5)離心，棄上清(留用部分檢測未結(jié)合的目的蛋白)，用含100mM氯化鈉的NETN溶液洗滌Protein-A珠子3次，最后用NETN洗滌1次。
6)加入50ul PBS和50ul 2×SDS-PAGE loading buffer，變性后進(jìn)行(12％)SDS-PAGE電泳并進(jìn)行Western Blot檢測。Western Blot檢測時(shí)使用抗ASH2L的多克隆抗血清。
EBC緩沖掖配制50mM Tris-Cl(pH 8.0)
120mM NaCl0.5％ NP-4010ug/ul aprotinin(用前加入)1ug/ul leupeptin(用前加入)50ug/ml PMSF(用前加入)100mM NaFNETN緩沖液配制20mM Tris-Cl(pH 8.0)100mM NaCl1mM EDTA(pH 8.0)0.5％ NP-40實(shí)施例5ASH2L和DPY-30-like所在蛋白復(fù)合體的組蛋白3賴氨酸4甲基化轉(zhuǎn)移酶活性檢測A、首先培養(yǎng)并收集細(xì)胞、提取核抽提物。K562細(xì)胞用含10％FBS的R1640培養(yǎng)基于37度，5％CO2培養(yǎng)至細(xì)胞數(shù)量達(dá)到2×107以上。收集細(xì)胞后進(jìn)行核抽提實(shí)驗(yàn)如下1)收集細(xì)胞，2000rpm 10分鐘2)冰浴PBS洗細(xì)胞兩次3)1∶5重懸于Buffer A中，冰浴，勻漿器勻漿至細(xì)胞破碎達(dá)95％以上(臺盼藍(lán)監(jiān)測)，6500g離心20秒。
4)沉淀重懸于Buffer B中，冰浴，勻漿器勻漿至細(xì)胞核破碎達(dá)95％以上(臺盼藍(lán)監(jiān)測)，13000g離心10分鐘。
5)取上清，用1∶50 Buffer C透析，4℃，2小時(shí)。
6)離心4℃，15000rpm，30min，取上清，Brandford法測蛋白濃度。
7)核抽提物中蛋白濃度1mg/ml注Buffer ApH＝7HEPES 10mMMgcl21.5mMKCl 10mM
DTT 0.5mMNP-40 0.5％PMSF0.5mMAprotinin 100ug/mlLeupeptin 5ug/mlPepstain A 1ug/mlBuffer BHEPES 20mMMgCl21.5mMNaCl420mMEDTA0.2mMGlycerol25％(v/v)Aprotinin 100ug/mlLeupeptin 5ug/mlPepstain A 1ug/mlBuffer CHEPES 10mMKcl 50mMEDTA0.2mMDTT 0.5mMGlycerol20％(v/v)Aprotinin 100ug/mlLeupeptin 5ug/mlPepstain A 1ug/mlB、免疫沉淀1)預(yù)清除在上述細(xì)胞核抽提物(0.5ml)中加入10ul protein-A agarose，4℃孵育和顛倒混勻0.5小時(shí)，4℃13000rpm離心15分鐘，取上清；2)在上述上清中加入2ul抗體(抗ASH2L或DPY-30-like)，4℃孵育和顛倒混勻1小時(shí)；3)加入Protein-A agrose 30ul，4℃孵育和顛倒混勻1小時(shí)；4)用PBS反復(fù)沖洗/離心(13000rpm)5次；
C、組蛋白3賴氨酸4甲基化轉(zhuǎn)移酶活性檢測1)混合組分在50ul體系中，加入2ul S-adenosyl[methyl-3H]methionine；組蛋白5ul；通過IP分離的細(xì)胞核抽提的各組分10ul；用酶緩沖液補(bǔ)足體積至50ul。
2)37℃孵育60min；；3)離心后將上清吸出，加入SDS-PAGE loading buffer，95℃變性5分鐘(注意防止輻射)后進(jìn)行SDS-PAGE電泳；4)進(jìn)行放射自顯影(兩周以上)注a)組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶緩沖液50mMTris，pH 8.5，20mM KCl，10mM MgCl2，10mMb-mercaptoethanol，250mM sucrose1mM PMSF0.5mM DTTb)組蛋白混合物 用上述Buffer溶解組蛋白為0.2mg/ml(購自ROCHE公司)c)S-adenosyl[methyl-3H]methionine 0.8-1mM(購自SIGMA公司)實(shí)施例6檢測ASH2L、DPY-30-like和WDR5在PMA刺激的K562細(xì)胞中的表達(dá)變化培養(yǎng)K562細(xì)胞于添加10％FBS、2mM谷胺酰胺、50UI/ml青霉素和50mg/ml鏈霉素的R-1640培養(yǎng)基中，在37℃5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收獲對數(shù)生長期細(xì)胞，并重懸于新鮮的含10％FBS的R-1640培養(yǎng)基中，將細(xì)胞濃度調(diào)整到4-5×105/ml。PMA溶于二甲基亞砜(DMSO)，儲存濃度為1mg/mL(1.6×10-3M)避光保存于-20℃。使用時(shí)以R-1640培養(yǎng)基將其稀釋100倍，每10毫升細(xì)胞加稀釋后的PMA31μl，終濃度為50×10-9M。分別于誘導(dǎo)0.5，1，2，4，8小時(shí)后收獲細(xì)胞提取總RNA。將收獲的RNA進(jìn)行甲醛-瓊脂糖凝膠電泳分離及轉(zhuǎn)膜。然后進(jìn)行Northern雜交1)雜交液(購自CLONETECH公司)68℃預(yù)熱，將膜先放在6×SSC緩沖液中浸濕，小心置于雜交管中，核酸面朝向管腔，并使膜與雜交管之間沒有氣泡。
3)加入5ml雜交液，68℃預(yù)雜交30min。
4)棄去預(yù)雜液。將32P標(biāo)記的探針在98℃變性5min，然后與預(yù)熱的雜交液混勻，加到雜交管內(nèi)，68℃雜交60min。
5)洗膜雜交結(jié)束后，將膜小心的從管內(nèi)取出。置于2×SSC，0.5％SDS中室溫洗三次，共30-40分鐘。然后置于0.1×SSC，0.1％SDS中，68℃洗膜兩次，每次20分鐘。
6)將濕膜置于保鮮膜內(nèi)，壓X光膠片，-70℃曝光注a)探針模板DNA的制備用引物ASH2L-N1/N2、DPY-N1/N2以及WDR5-N1/N2分別從三個(gè)基因的全長模板上克隆相應(yīng)片段。PCR反應(yīng)的退火溫度分別是65度、59度和57度，延伸時(shí)間為1分鐘。PCR反應(yīng)使用Taq酶進(jìn)行，產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳回收后直接和pGEM-T載體(PROMEGA公司試劑盒)連接，連接反應(yīng)按照試劑盒說明進(jìn)行，在4度過夜或者室溫進(jìn)行1-2小時(shí)。轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物于感受態(tài)DH5a細(xì)菌，涂布于含氨卞青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37度培養(yǎng)8小時(shí)以上，挑選單克隆進(jìn)行PCR鑒定，條件同上。陽性克隆培養(yǎng)于LB液體培養(yǎng)基，提取質(zhì)粒即得到三基因的探針模板DNA。
b)探針標(biāo)記方法取約25ng的探針模板DNA，于0.5ml離心管中，用不含DNA酶的水補(bǔ)足至30μl，98℃變性4分鐘，迅速放到冰上。雜交探針用隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒標(biāo)記(Promega-a-GeneRLabeling System)。依次在上述離心管中加入以下試劑

室溫標(biāo)記1小時(shí)，取1μl用于測定標(biāo)記效率。剩余的探針98℃變性4分鐘后加入雜交液中。將1μl標(biāo)記產(chǎn)物稀釋500倍，取5μl用于測定標(biāo)記效率。方法為三氯乙酸沉淀法。探針的比活度一般約為1×108-1×109cpm/μg。
權(quán)利要求
1.一種在白血病來源的細(xì)胞系中高表達(dá)的基因ASH2L，其表達(dá)的蛋白在PMA刺激的K562分化過程中相對獨(dú)特，可作為白血病分子分型診斷的侯選標(biāo)志物。
2.一種含有權(quán)利要求1所述的ASH2L基因N-端部分序列的原核表達(dá)載體，是pGEX-ASH2L.N。
3.一種含有權(quán)利要求2所述表達(dá)載體的原核重組菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組菌，其中所述的重組菌是含有重組質(zhì)粒pGEx-ASH2L.N的重組大腸桿菌BL21-ASH2L.N。
5.一種制備高特異性抗ASH2L多克隆抗血清的方法，步驟如下(1)按照權(quán)利要求4所述的重組菌BL21-ASH2L.N；(2)重組菌通過微生物發(fā)酵和純化工藝制備高純度GST-ASH2L.N蛋白；(3)用高純度ASH2L.N蛋白免疫家兔，可以得到高特異性的多克隆抗血清；(4)通過該方法得到的高特異性抗血清可以運(yùn)用于白血病的基礎(chǔ)研究及臨床診斷。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗體，可以免疫沉淀到含有ASH2L的蛋白復(fù)合體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的蛋白復(fù)合體，它具有組蛋白3-賴氨酸4甲基化轉(zhuǎn)移酶的活性。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述具有組蛋白3-賴氨酸4甲基化轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白復(fù)合體，ASH2L、DPY-30-like和WDR5是其中的重要成員，檢測這些成員在PMA刺激K562分化過程中表達(dá)變化的方法，步驟如下(1)按照權(quán)利要求12所述，ASH2L、DPY-30-like和WDR5是該蛋白復(fù)合體的成員；(2)根據(jù)ASH2L、DPY-30-like和WDR5的序列特點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異性的Northern雜交探針；(3)用ASH2L、DPY-30-like和WDR5的特異性探針實(shí)施Northern雜交，以檢測ASH2L、DPY-30-like和WDR5在PMA刺激K562細(xì)胞分化過程中的表達(dá)變化；(4)用該方法可以確證，ASH2L的表達(dá)在PMA刺激K562分化過程中被特異地持續(xù)下調(diào)，而DPY-30-like和WDR5的變化在該過程中沒有如ASH2L的規(guī)律變化；(5)根據(jù)ASH2L在PMA刺激K562分化過程中表達(dá)變化的特異性，ASH2L可作為白血病分子分型診斷的侯選標(biāo)志物。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗ASH2L的多克隆抗血清和權(quán)利要求8所述ASH2L在PMA刺激K562分化過程中表達(dá)變化的特異性，該抗血清可用于白血病分子分型診斷中。
全文摘要
白血病相關(guān)基因ASH2L編碼的蛋白可與基因DPY－30－like編碼的蛋白相互作用，二者是組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體的成員。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)ASH2L的表達(dá)在PMA刺激K562分化過程中被特異地下調(diào)，與ASH2L功能相關(guān)的DPY－30－like以及復(fù)合體另一個(gè)穩(wěn)定成員WDR5的表達(dá)則沒有如ASH2L的規(guī)律性變化，證明ASH2L的表達(dá)與K562增殖狀態(tài)的正相關(guān)性是相對獨(dú)特的，因此ASH2L可作為白血病分子分型診斷的侯選標(biāo)志物。同時(shí)本發(fā)明構(gòu)建了原核表達(dá)ASH2L的N－端蛋白和DPY－30－like全長蛋白的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)相應(yīng)蛋白；純化該蛋白后以此為抗原可制備高質(zhì)量的抗體，可應(yīng)用于白血病分子分型診斷中。
文檔編號C12N1/21GK1869225SQ200510071959
公開日2006年11月29日 申請日期2005年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月27日
發(fā)明者彭勇, 汪俊華, 袁建剛, 彭小忠, 強(qiáng)伯勤 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所