專利名稱：用于食物中毒病原菌檢測的染色指引法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于病原菌檢測技術(shù)，特別是用于食物中毒病原菌快速檢測的新方法。
背景技術(shù)：
由病原菌(霉菌)污染食品引起的食物中毒是當(dāng)今世界上發(fā)生最廣泛、最常見的疾病之一。在食品工業(yè)化生產(chǎn)和食品貿(mào)易日益規(guī)?；?、全球化的今天，病原菌污染食品的來源和方式也越來越顯隱蔽性、復(fù)雜性和可塑性。同時，由于人口和環(huán)境的變化、人類生活和行為方式的改變等原因，食物中毒的流行病學(xué)也正在發(fā)生迅速變化，老的病原菌引發(fā)食物中毒的發(fā)病率在不斷上升，新的病原菌引發(fā)食物中毒又不斷出現(xiàn)，致病菌耐藥性也在不斷增強(qiáng)。食物中毒發(fā)生分布的廣泛性，對世界各國都存在嚴(yán)重威脅，因而病原菌污染食品和引發(fā)食物中毒已成為一個共同關(guān)注的世界性公共衛(wèi)生問題，直接威脅著人類，特別是對兒童的健康危害最大，同時，也直接或間接造成不同程度的經(jīng)濟(jì)損失。
目前資料表明，食物中毒病原菌的檢測方法還沒有一個標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)一規(guī)程，迄今仍參照國家制定的食品衛(wèi)生微生物檢測方法(國標(biāo))進(jìn)行。各地在食物中毒的流行病學(xué)調(diào)查中對病原菌的監(jiān)測、病原檢測、病原溯源分析最常見的方法是采取假設(shè)的做盡可能多的多線培養(yǎng)檢測，檢樣首先選擇性增菌培養(yǎng)→劃種選擇性培養(yǎng)基→涂片染色鏡檢→血清學(xué)生化鑒定→動物毒力試驗。結(jié)果，病原菌項目檢測局限，盲目性大，而且有可能對調(diào)查產(chǎn)生誤導(dǎo)。同時，也存在漏檢率高，不易發(fā)現(xiàn)新病原菌(霉菌)，檢測時間長，檢出率低，耗材料，工作量大等諸多問題，從而明顯制約了及時準(zhǔn)確處理突發(fā)性食物中毒事件的時效性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種簡化、準(zhǔn)確、高效確定食物中毒致病原菌檢測的新方法。
本發(fā)明檢測方法，也稱“染色指引法”，按以下檢測步驟進(jìn)行a、將食物中毒樣本直接進(jìn)行懸滴、涂片、革蘭氏染色鏡檢；b、確定檢樣中的優(yōu)勢菌系和非優(yōu)勢菌系；c、將優(yōu)勢菌直接接種于選擇對口培養(yǎng)基，將培養(yǎng)出的優(yōu)勢菌落作生化、血清學(xué)檢測后作出初步報告，并進(jìn)行動物毒力試驗或基因毒素測定后作出確診報告；d、補(bǔ)漏檢測，對確定的非優(yōu)勢菌系先結(jié)合流行病學(xué)特征與相關(guān)臨床癥狀作選擇性增菌，然后進(jìn)入對口培養(yǎng)基，將培養(yǎng)出的非優(yōu)勢菌系作涂片染色鏡檢、定科生化試驗作出初步報告，并再進(jìn)行動物毒力試驗或基因毒素測定后作出確診報告。
所述優(yōu)勢菌是指同一形態(tài)、染色、動力占整個視野的60％以上。
培養(yǎng)出的非優(yōu)勢菌系作定科生化試驗后進(jìn)行一次定屬、群、種、型生化和血清學(xué)測定作出初步報告，并再進(jìn)行動物毒力試驗或基因毒素測定后作出確診報告。
本發(fā)明“染色指引法”的優(yōu)點1、對檢樣先進(jìn)行直接涂片染色鏡檢觀察，根據(jù)病原菌的染色反應(yīng)與形態(tài)，確定篩選優(yōu)勢菌和甄別非優(yōu)勢菌，而后選擇對口培養(yǎng)基，減少盲目性，提高了陽性檢出率，減少了漏檢率。
2、檢測效率和準(zhǔn)確性明顯提高。尤其是通過直接涂片快速確定優(yōu)勢菌，可及時有效對食物中毒現(xiàn)場及病人作出針對性處理。通過對58起疑難病原菌食物中毒的現(xiàn)場應(yīng)用驗證表明，利用本發(fā)明方法檢測，其食物中毒的病原菌陽性檢出率高達(dá)88.89％，如果現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查人員樣本采集及時、正確，方法規(guī)范，則病原菌陽性檢出率可達(dá)100％。經(jīng)國內(nèi)外文獻(xiàn)報道檢索表明，本方法效果顯著高于國內(nèi)外同類實驗室報道的食物中毒病原菌為40-60％的陽性率水平。
3、檢測時間與“國標(biāo)”方法比較明顯縮短二分之一(“國標(biāo)”法需5-6天)，同時又節(jié)約材料，明顯減少工作量。


附圖表示了本發(fā)明所述檢測流程圖。
具體實施例方式參照附圖，首先采集樣品，比如涉嫌食物、病人嘔吐物、糞便等。一般常見的病原菌包括G+球菌，如金黃色葡萄球菌+計數(shù)、溶血性鏈球菌、糞鏈球菌；G+粗桿菌有芽胞，如臘樣芽胞桿菌+計數(shù)、肉毒梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌；G+短小桿菌，如單核細(xì)胞增生李斯特菌；有動力G-桿菌，如沙門菌、致瀉大腸埃希菌、變形桿菌、椰毒假單胞菌酵米面亞種、氣單胞菌、鄰單胞菌；無動力G-桿菌，如志賀菌；G-彎曲菌(細(xì)長)，如空腸彎曲菌；G-弧菌，如副溶血性弧菌、溶藻性弧菌；菌絲或孢子，如酵母菌、霉菌。
將食物中毒樣本直接進(jìn)行懸滴、涂片、革蘭氏染色鏡檢，對于同一形態(tài)、染色、動力占整個視野的60％以上的菌落認(rèn)定為優(yōu)勢菌系，對其余小比例的各種菌落認(rèn)定為非優(yōu)勢菌系；
然后，選擇對口培養(yǎng)基，將培養(yǎng)出的優(yōu)勢菌落作生化、血清學(xué)檢測后作出初步報告，并進(jìn)行動物毒力試驗或基因毒素測定后作出確診報告；將檢測出的非優(yōu)勢菌系結(jié)合流行病學(xué)特征與相關(guān)臨床癥狀作選擇性增菌，然后進(jìn)入對口培養(yǎng)基，將培養(yǎng)出的非優(yōu)勢菌作涂片染色鏡檢、定科生化試驗、定屬、群、種、型生化和血清學(xué)試驗后作出初步報告，并再進(jìn)行動物毒力試驗或基因毒素測定后作出確診報告。
實施例145起微生物性食物中毒病原菌檢測結(jié)果。45起微生物性食物中毒檢出病原菌40起，檢出率為88.89％，其中細(xì)菌性38起(2起均由金黃色葡萄球菌與嘔吐型臘樣芽胞桿菌混合感染)，霉菌性2起。被檢出的40起微生物性食物中毒共分離到菌株42株13種，其中細(xì)菌性40株，分別為嘔吐型臘樣芽胞桿菌7株；金黃色葡萄球菌與副溶血性弧菌各6株；腹瀉型臘樣芽胞桿菌與大腸埃希菌(ETEC)各4株；溶藻性弧菌與大腸埃希菌各3株；普通、奇異變形桿菌、鼠傷寒沙門菌各2株；大腸埃希菌1株。霉菌性2株，分別為雜色曲霉與圓弧青霉，而這種霉菌用常規(guī)方法是無法檢出的。
實施例245起微生物性食物中毒優(yōu)勢菌與非優(yōu)勢菌檢測結(jié)果。45起微生物性食物中毒樣本經(jīng)直接涂片染色，鏡檢下找出優(yōu)勢菌37起，非優(yōu)勢菌8起。37起優(yōu)勢菌經(jīng)培養(yǎng)，病原菌作科、屬、群、種(型)鑒定，檢出率為100％。8起非優(yōu)勢菌經(jīng)選擇性增菌、培養(yǎng)，病原菌經(jīng)科、屬、群、種(型)鑒定，檢出病原菌3起，檢出率37.50％。
實施例313種病原菌與食物中毒樣本侵染關(guān)系。檢出病原菌的40起微生物性食物中毒，共采集到樣本761份，其中嘔吐物122份，糞便180份，可疑殘余食物388份、餐具47份、砧板2份、菜刀2份、抹布14份、炊事員糞便6份。結(jié)果，嘔吐物122份。檢出病原菌102份，占83.61％，其中金黃色葡萄球菌、嘔吐型臘樣芽胞桿菌檢出率分別為100％、93.02％。糞便180份，檢出病原菌153份，占85.00％，其中副溶性弧菌、嘔吐型臘樣芽胞桿菌、大腸埃希菌EIEC和圓弧青霉檢出率均為100％；大腸埃希菌ETEC、奇異變形桿菌、腹瀉型臘樣芽胞桿菌、大腸埃希菌EPEC、鼠傷寒沙門菌檢出率分別為93.10％、88.89％、83.33％、82.14％、80.00％。388份可疑殘余食物樣本13種病原菌均被檢出，檢出率為100％。餐具47份，檢出病原菌27份，占57.45％，其中副溶血性弧菌、溶藻性弧菌、雜色曲霉檢出率均為100％。砧板2份，檢出病原菌2份，分別為溶藻性弧菌和大腸埃希菌EPEC。菜刀2份，檢出病原菌1份，為普通變形桿菌。抹布14份，檢出病原菌10份，占71.43％，分別檢出金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、普通變形桿菌與大腸埃希菌EIEC。炊事員糞便6份，檢出病原菌2份，分別為鼠傷寒沙門菌與大腸埃希菌(ETEC)。
實施例413種病原菌毒素動物毒力試驗結(jié)果。將檢測獲得的13種病原菌毒素分別選擇幼貓、家兔、乳鼠、小白鼠、豚鼠作毒力試驗。結(jié)果，幼貓腹腔注射金黃色葡萄球菌、臘樣芽胞桿菌嘔吐型毒素試驗，陽性檢出率為100％。鼠傷寒沙門菌、大腸埃希菌(EPEC、ETEC)、臘樣芽胞桿菌、副溶血性弧菌、溶藻性弧菌與圓弧青霉毒素作家兔回腸段結(jié)扎試驗；小白鼠腹腔注射傷寒沙門菌、副溶血性弧菌、溶藻性弧菌、臘樣芽胞桿菌、奇異變形桿菌、大腸埃希菌、圓弧青霉與雜色曲霉毒素、大腸埃希菌(EIEC)致瀉毒素作豚鼠角膜試驗陽性率均為100％。
實施例5109份食物中毒病人急性、恢復(fù)期血清抗體測定比較結(jié)果。將食物中毒樣本檢測分離到的病原菌菌株與109份病人急性期、恢復(fù)期血清作試管定量凝集試驗，結(jié)果，恢復(fù)期比急性期抗體滴度高出四倍以上有87例。
權(quán)利要求
1.一種用于食物中毒病原菌檢測的染色指引法，其特征在于按以下檢測步驟進(jìn)行a、將食物中毒樣本直接進(jìn)行懸滴、涂片、革蘭氏染色鏡檢；b、確定檢樣中的優(yōu)勢菌系和非優(yōu)勢菌系；c、將優(yōu)勢菌直接接種于選擇對口培養(yǎng)基，將培養(yǎng)出的優(yōu)勢菌落作生化、血清學(xué)檢測后作出初步報告，并進(jìn)行動物毒力試驗或基因毒素測定后作出確診報告；d、補(bǔ)漏檢測，對確定的非優(yōu)勢菌系先結(jié)合流行病學(xué)特征與相關(guān)臨床癥狀作選擇性增菌，然后進(jìn)入對口培養(yǎng)基，將培養(yǎng)出的非優(yōu)勢菌系作涂片染色鏡檢、定科生化試驗作出初步報告，并再進(jìn)行動物毒力試驗或基因毒素測定后作出確診報告。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于食物中毒病原菌檢測的新方法，其特征在于所述優(yōu)勢菌是指同一形態(tài)、染色、動力占整個視野的60％以上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的病原菌檢測的染色指引法，其特征在于對培養(yǎng)出的非優(yōu)勢菌系作定科生化試驗后進(jìn)行一次定屬、群、種、型生化和血清學(xué)測定作出初步報告，并再進(jìn)行動物毒力試驗或基因毒素測定后作出確診報告。
全文摘要
本發(fā)明是一種用于食物中毒病原菌檢測的染色指引法，按以下檢測步驟進(jìn)行將食物中毒樣本直接進(jìn)行懸滴、涂片、革蘭氏染色鏡檢；確定檢樣中的優(yōu)勢菌系和非優(yōu)勢菌系；將培養(yǎng)出的優(yōu)勢菌落作生化、血清學(xué)檢測后作出初步報告，并進(jìn)行動物毒力試驗或基因毒素測定后作出確診報告；將培養(yǎng)出的非優(yōu)勢菌系作涂片染色鏡檢、定科生化試驗作出初步報告，并再進(jìn)行動物毒力試驗或基因毒素測定后作出確診報告。本發(fā)明可減少盲目性，提高陽性檢出率，減少漏檢率，檢測效率和準(zhǔn)確性明顯提高，尤其是通過快速確定優(yōu)勢菌，可及時進(jìn)行針對性診療。
文檔編號C12Q1/02GK1793848SQ20051006166
公開日2006年6月28日 申請日期2005年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月22日
發(fā)明者葛素君, 馮濟(jì)富, 許際華, 裘丹紅 申請人:臺州市疾病預(yù)防控制中心