一種用于檢測hhv-6a/6b型的數(shù)字pcr絕對定量分型檢測試劑盒及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子診斷生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測HHV-6A/6B型的數(shù)字 PCR絕對定量分型檢測試劑盒及檢測方法。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003] 皰瘆病毒是一組具有包膜的DNA病毒，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)100多種以上。皰瘆病毒在人群中 的感染非常普遍，它主要侵染外胚層來源組織，包括皮膚、粘膜和神經(jīng)組織，感染部位和引 起的疾病多種多樣，并有潛伏感染的趨向。感染后的常見癥狀為：神經(jīng)節(jié)腺體、腎淋巴組織、 淋巴組織熱性皰瘆；唇、眼、腦感染；生殖器皰瘆水痘；帶狀皰瘆單核細(xì)胞增多癥，眼、腎、腦 和先天感染傳染性單核細(xì)胞增多癥、Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌、嬰兒急診和其他一些如未知 腹痛等病癥。近年發(fā)現(xiàn)HHV-6還可以引起兒童病毒性腦炎，并可能導(dǎo)致死亡和嚴(yán)重的神經(jīng) 系統(tǒng)后遺癥；HHV-6A和HHV-6B在病毒學(xué)和流行病學(xué)上具有顯著差別，在引起腦炎的致病性 上也存在差異，因此在臨床診斷HHV-6感染時有必要進(jìn)行準(zhǔn)確的病原學(xué)分型。
[0004] 診斷HHV感染的金標(biāo)準(zhǔn)方法是病毒培養(yǎng)分離，但是由于該方法檢測周期較長，操 作繁瑣，對標(biāo)本要求高，使其在臨床上的應(yīng)用受到限制。免疫診斷學(xué)方法包括HHV抗原抗體 的檢測，是目前實驗診斷方法，然而在病毒抗原含量低時該方法的檢測靈敏度低，且抗體的 測定主要用于流行病學(xué)調(diào)查和原發(fā)性感染的回顧性診斷，對于恢復(fù)期或復(fù)發(fā)性感染的臨床 意義不大。因此，HHV的分子診斷對于快速、準(zhǔn)確地診斷HHV感染，保證早期、合理治療、降 低HHV傳染性和危害性具有重要的臨床實用價值。
[0005] 目前，HHV的分子診斷主要包括核酸雜交方法、PCR方法等。核酸雜交技術(shù)是利用 HHV DNA某段特異序列合成或克隆互補性探針序列，進(jìn)行HHV核酸檢測。目前常用生物素、 地高辛等非放射性標(biāo)記探針進(jìn)行核酸雜交檢測；但是雜交步驟較為繁瑣，大樣本研宄耗時 較長，易導(dǎo)致交叉污染。目前常用的檢測HHV DNA的PCR技術(shù)有普通PCR技術(shù)、多重PCR技 術(shù)及熒光定量PCR技術(shù)等。普通PCR方法由于敏感度高，易因污染導(dǎo)致假陽性；多重PCR方 法通過一次檢測就可以檢測多種病毒，但是只屬于定性檢測方法；雖然定性PCR具有很高 的靈敏度，但是它不能反映患者感染的嚴(yán)重程度和治療效果，從而促進(jìn)了定量PCR方法的 出現(xiàn)和發(fā)展；熒光定量PCR技術(shù)可以真實地反映病毒感染和DNA復(fù)制量的關(guān)系，在臨床上常 用于抗病毒療效的檢測。
[0006] 數(shù)字PCR技術(shù)是近年興起的第三代PCR絕對定量技術(shù)，與實時熒光定量PCR技術(shù) 相比，數(shù)字PCR不依賴于擴增曲線的閾值（CT)進(jìn)行定量，不受擴增效率的影響，也不必采用 看家基因和標(biāo)準(zhǔn)曲線，具有很好的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性，可以實現(xiàn)絕對定量分析。在現(xiàn)階段的低 豐度因子檢測中，實時熒光定量PCR技術(shù)都因受到背景DNA或雜質(zhì)的干擾，使得檢測靈敏度 及精確性都達(dá)不到精準(zhǔn)定量的要求，而數(shù)字PCR檢測系統(tǒng)通過微滴化處理，使得稀有檢測 片段從大量的復(fù)雜背景中分離出來，從而提高檢測的靈敏度和精確性。然而，目前并沒有用 于檢測HHV6A/6B的數(shù)字PCR絕對定量分型檢測試劑盒及其檢測方法。
[0007]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測HHV-6A/6B的 數(shù)字PCR絕對定量分型檢測試劑盒，其中包括有HHV-6A/6B通用引物和各自特異的檢測探 針。
[0009] 本發(fā)明的另一目的是提供一種用于檢測HHV-6A/6B的數(shù)字PCR絕對定量分型檢測 方法，利用上述試劑盒中兩條不同的探針對HHV DNA模板進(jìn)行檢測，根據(jù)熒光類型和熒光微 滴數(shù)HHV-6A/6B進(jìn)行分型和絕對定量檢測。
[0010] 實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種用于檢測HHV-6A/6B的數(shù)字PCR絕 對定量分型檢測試劑盒，包括DNA提取液、數(shù)字PCR反應(yīng)緩沖液A、數(shù)字PCR反應(yīng)緩沖液B、 HHV-6A病毒基因陽性質(zhì)控、HHV-6B病毒基因陽性質(zhì)控、陰性質(zhì)控和內(nèi)標(biāo)溶液； 所述DNA提取液包括50 mM pH 8. 3的Tris-HCl、0. 5 M NaCl、5 mM EDTA、質(zhì)量濃度為 L 5% 的 CTAB 和 2 mM 的 DTT ; 所述數(shù)字PCR反應(yīng)緩沖液A包括HHV-6A型的引物及探針和HHV-6B型的引物及探針； 所述數(shù)字PCR反應(yīng)緩沖液B包括內(nèi)標(biāo)的引物及探針；所述HHV-6A、HHV-6B和內(nèi)標(biāo)的引物及 探針如下所示： HHV-6A型和HHV-6B型通用上游引物： CCGTGGGATCGTCTAAAATTATAGATGT ； HHV-6A型和HHV-6B型通用下游引物： CCACACTAGTCCGGACGGATAA ； HHV-6A 型探針：CTGGAACTGTATAATAGG ; HHV-6B 型探針：CTGGAGCTGTACAACAG ; 內(nèi)標(biāo)上游引物：CTGCCGTTACTGCCCTGTG ; 內(nèi)標(biāo)下游引物：TTGGTCTCCTTAAACCTGTCTTG ; 內(nèi)標(biāo)探針：ACCACCAACTTCATCCACGTTCACC ; 所述HHV-6A型探針5'端熒光報告基因為FAM，HHV-6B型探針5'端熒光報告基團為 VIC，內(nèi)標(biāo)探針5'端熒光報告基團為VIC，所有探針3'端淬滅基團均為BHQ ; 所述HHV-6A病毒基因陽性質(zhì)控為100 copies/ μ L的HHV-6A的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)?；旌弦海凰?HHV-6B病毒基因陽性質(zhì)控為100 copies/ μ L的HHV-6B的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒混合液； 所述陰性質(zhì)控為滅菌生理鹽水； 所述內(nèi)標(biāo)溶液為100 copies/ul的β-globin的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒溶液。
[0011] 一種用于檢測HHV-6A/6B的數(shù)字PCR絕對定量分型檢測方法，采用上述用于檢測 HHV-6A/6B的數(shù)字PCR絕對定量分型檢測試劑盒進(jìn)行檢測，具體檢測方法包括如下步驟： (1)受檢樣品處理：將待測樣品用無菌生理鹽水洗滌并離心棄去上清液后，加入滅菌水 震蕩混勻，向震蕩混勻后的溶液中加入所述試劑盒中的DNA提取液和內(nèi)標(biāo)溶液，劇烈震蕩 混勻，并于l〇〇°C恒溫處理10分鐘，再于12, 000 rpm離心5分鐘，取上清液，獲得PCR擴增 DNA模板； (2) 質(zhì)控品的處理：分別取所述試劑盒中的HHV-6A病毒基因陽性質(zhì)控、HHV-6B病毒基 因陽性質(zhì)控和陰性質(zhì)控，按照與步驟（1)相同的方法處理，得到相應(yīng)的DNA模板； (3) 配制數(shù)字PCR反應(yīng)混合液：向步驟（1)和步驟（2)處理后得到的DNA模板中分別加 入滅菌水和所述試劑盒中的數(shù)字PCR反應(yīng)緩沖液，分別配制得到樣品、HHV-6A病毒基因陽 性質(zhì)控、HHV-6B病毒基因陽性質(zhì)控和陰性質(zhì)控的數(shù)字PCR反應(yīng)混合液；其中，陽性質(zhì)控和陰 性質(zhì)控的數(shù)字PCR反應(yīng)混合液均采用數(shù)字PCR反應(yīng)緩沖液A配制，樣品的數(shù)字PCR反應(yīng)混 合液分為兩種，分別由數(shù)字PCR反應(yīng)緩沖液A和數(shù)字PCR反應(yīng)緩沖液B配制； (4) 將步驟（3)制備的數(shù)字PCR混合液制作為油包水PCR微反應(yīng)液滴，生成的微反應(yīng)液 滴數(shù)量為10, 〇〇〇~20, OOO個；然后對所述微反應(yīng)液滴進(jìn)行PCR擴增反應(yīng)；其中，數(shù)字PCR擴 增反應(yīng)條件為：95°C變性5分鐘；95°C變性10秒，60°C延伸60秒，共進(jìn)行30個循環(huán)；98°C 變性10分鐘，4 °C停止反應(yīng)； (5) 讀取熒光信號：步驟（4)PCR擴增后，將PCR反應(yīng)板放入熒光讀取儀器中，分別在 FAM和VIC通道中進(jìn)行HHV-6A和HHV-6B的分型檢測，通過儀器配套Quanta soft軟件進(jìn)行 定量分析，計算出HHV-6A型和HHV-6B型的拷貝數(shù)。
[0012] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于： 1、本發(fā)明基于數(shù)字PCR平臺，對HHV進(jìn)行絕對定量檢測，不依賴于擴增曲線的閾值（CT ) 進(jìn)行定量，不受擴增效率的影響，也不必采用看家基因和標(biāo)準(zhǔn)曲線，具有很好的準(zhǔn)確度和重 現(xiàn)性，可以實現(xiàn)HHV的絕對精準(zhǔn)定量分析。
[0013] 2、本發(fā)明方法在HHV含量極低的組織樣品檢測中，對樣品溶液采用微滴化處理， 數(shù)字PCR檢測系統(tǒng)通過微滴化處理，可以大大減少背景和基質(zhì)的干擾，靈敏度可以低至1個 拷貝，提尚檢測的靈敏度和精確性。
[0014] 3、本發(fā)明方法無需設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)熒光類型、熒光微滴個數(shù)的結(jié)果，可以直接 判讀HHV型別和拷貝數(shù)，大大簡化操作步驟。
[0015] 4、本發(fā)明提供的方法和試劑盒可以在具有數(shù)字PCR的實驗室完成，檢測時間僅需 要3小時，結(jié)果判讀直觀可靠，具有可以穩(wěn)定實施的特點。
[0016] 5、本發(fā)明試劑盒和方法可滿足早期、準(zhǔn)確、分型定量診斷HHV-6感染的要求，為 HHV-6致病機理、流行病學(xué)調(diào)查以及針對性治療提供依據(jù)，具有良好的發(fā)展應(yīng)用前景。
[0017]
【附圖說明】
[0018] 圖1為設(shè)計的HHV-6A/6B的引物及探針序列圖； 圖2為FAM通道檢測HHV-6A/6B引物及探針特異性； 圖3為VIC通道檢測HHV-6A/6B引物及探針特異性； 圖4為VIC通道檢測HHV-6B/6A引物及探針特異性； 圖5為FAM通道檢測HHV-6B/6A引物及探針特異性； 圖6為陰性樣品的熒光檢測結(jié)果； 圖7為HHV-6B感染樣品的熒光檢測結(jié)果； 圖8為HHV-6A感染樣品的熒光檢測結(jié)果； 圖9為HHV-6A/6