專利名稱：用發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化獲得產(chǎn)鬼臼毒素的西藏桃兒七毛狀根的方法及產(chǎn)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)、生理學(xué)、育種學(xué)以及基因工程等領(lǐng)域，涉及一種利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得產(chǎn)鬼臼毒素西藏桃兒七毛狀根的方法，具體涉及發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化西藏桃兒七并獲得產(chǎn)鬼臼毒素的西藏桃兒七毛狀根的具體過程。本發(fā)明還提供利用基因工程獲得的產(chǎn)鬼臼毒素的西藏桃兒七毛狀根及其培養(yǎng)的子代、再生植株、植物組織或種子。
背景技術(shù)：
植物次生代謝產(chǎn)物具有極其復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)，至今仍沒有找到有效的或經(jīng)濟(jì)的合成方法。相對(duì)于常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，毛狀根培養(yǎng)系統(tǒng)具有生長(zhǎng)快速、不需外源植物激素、合成次生代謝物質(zhì)能力強(qiáng)而且穩(wěn)定、向培養(yǎng)液釋放部分代謝產(chǎn)物等優(yōu)點(diǎn)。由于Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的毛狀根生長(zhǎng)快，易于培養(yǎng)，有效成分高，具有表達(dá)完整的代謝通路，為藥用植物次生代謝產(chǎn)物的工業(yè)化生產(chǎn)提供了廣闊前景。
目前，雖然國(guó)內(nèi)外采用發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化藥用植物獲得生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的毛狀根的相關(guān)研究較多，但對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化遺傳轉(zhuǎn)化西藏桃兒七獲得產(chǎn)鬼臼毒素毛狀根的研究仍是空白。西藏桃兒七為我國(guó)西藏所特有的小檗科植物，含有重要的抗癌(或抑癌)藥物成分鬼臼毒素和脫氧鬼臼毒素，對(duì)于皮膚癌、宮頸癌有顯著療效，其衍生物對(duì)乳癌、子宮癌、結(jié)腸癌有一定的治愈功效，具有重要的藥用價(jià)值和開發(fā)利用前景。(這里需要進(jìn)一步闡述三個(gè)問題1、自然生長(zhǎng)的西藏桃兒七的稀缺，2、利用自然生長(zhǎng)的西藏桃兒七生產(chǎn)鬼臼毒素與保護(hù)自然資源之間的矛盾，3、以及現(xiàn)有方法獲得鬼臼毒素的產(chǎn)率低。以為我們的方法的創(chuàng)造性做鋪墊)本發(fā)明利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒的T-DNA導(dǎo)入西藏桃兒七細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)化毛狀根，通過篩選優(yōu)良無性系，獲得鬼臼毒素及其衍生物含量相對(duì)較高而穩(wěn)定的毛狀根無性系，為鬼臼毒素的生產(chǎn)提供優(yōu)質(zhì)新型藥源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一目的就是提供一種轉(zhuǎn)基因技術(shù)遺傳轉(zhuǎn)化西藏桃兒七獲得產(chǎn)鬼臼毒素毛狀根的方法，該方法將發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒的T-DNA導(dǎo)入西藏桃兒七中，獲得西藏桃兒七毛狀根；在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種用上述方法轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，這種經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞發(fā)育為毛狀根。在實(shí)例中該宿主細(xì)胞是西藏桃兒七。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種獲得產(chǎn)鬼臼毒素西藏桃兒七毛狀根的方法和利用該方法獲得的產(chǎn)鬼臼毒素的西藏桃兒七毛狀根，該毛狀根是一種采用本發(fā)明所用方法創(chuàng)造的新生命體。
其步驟如下(1)獲得無菌的西藏桃兒七外植體；獲得植物的無菌外植體已有多種現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明可采用其中任何一種手段，但最好的手段是本發(fā)明實(shí)施例中顯示的方法。
(2)采用轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)移發(fā)根農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒的T-DNA到西藏桃兒七細(xì)胞、組織、器官、植株中；(3)在特定的條件下篩選和鑒定毛狀根；(4)在適合的條件下培養(yǎng)西藏桃兒七毛狀根，用于生產(chǎn)鬼臼毒素。
用上述方法獲得的生命體，它是可生產(chǎn)鬼臼毒素的西藏桃兒七毛狀根。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“生命體”指西藏桃兒七的細(xì)胞、組織、器官、植株。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“任何轉(zhuǎn)基因方法”包括發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化、基因槍法介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化、花粉管通道介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、生殖細(xì)胞浸泡法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“在特定的條件下篩選和鑒定轉(zhuǎn)化子”是指用在離體培養(yǎng)的條件下根據(jù)毛狀根特殊的形態(tài)學(xué)特征初步鑒定轉(zhuǎn)化子；可以使用PCR、Southern雜交、Northern雜交和Western印跡等方法來鑒定轉(zhuǎn)化子。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“在適合的條件下培養(yǎng)西藏桃兒七毛狀根”是指對(duì)經(jīng)過鑒定的西藏桃兒七毛狀根離體培養(yǎng)，并檢測(cè)鬼臼毒素含量，篩選鬼臼毒素含量提高的優(yōu)良轉(zhuǎn)化子進(jìn)行培養(yǎng)，獲得其后代。
在本發(fā)明中，我們采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，用發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化西藏桃兒七，獲得了產(chǎn)鬼臼毒素的西藏桃兒七毛狀根，為鬼臼毒素的生產(chǎn)提供了一種新型優(yōu)質(zhì)的可持續(xù)使用的藥源。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如《分子克隆》(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1西藏桃兒七無菌外植體的獲得方法一利用外植體建立西藏桃兒七無菌外植體采取西藏桃兒七(西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院林學(xué)系藏藥材種植園提供)根狀莖萌發(fā)出來的幼芽，流水沖洗1小時(shí)；然后用2％(M/V)NaClO溶液浸泡10分鐘，用無菌水沖洗3次；再用0.1％(M/V)升汞(HgCl2)溶液浸泡15分鐘，用無菌水沖洗6次；然后接種在添加無菌叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基盛于150ml的三角瓶中，于121℃滅菌20分鐘)，該培養(yǎng)基配方為MS基本培養(yǎng)基，添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物2.0mg/L BA(芐基腺嘌呤)，0.3mg/L NAA(萘乙酸)，30g/L蔗糖和0.6g/L PVP(聚乙烯吡咯烷酮)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值為5.8，再添加5％瓊脂粉。在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)西藏桃兒七的幼芽，培養(yǎng)條件為25℃，12小時(shí)光照，光照強(qiáng)度為55μmo1.m-2.s-1。40天后，即可獲得無菌的西藏桃兒七無菌外植體，等到葉片長(zhǎng)到3cm×3cm大小時(shí)可用于遺傳轉(zhuǎn)化。
方法二利用西藏桃兒七種子在無菌條件下萌發(fā)獲得無菌外植體采取西藏桃兒七成熟的種子(西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院林學(xué)系藏藥材種植園提供)，用2％(M/V)NaClO溶液浸泡20分鐘，用無菌水沖洗3次；再用0.1％(M/V)升汞(HgCl2)溶液浸泡30分鐘，用無菌水沖洗6次；在無菌條件下去除其堅(jiān)硬的種皮；將西藏桃兒七胚接種在種子萌發(fā)培養(yǎng)基上(培養(yǎng)基盛于150ml的三角瓶中，于121℃滅菌20分鐘)，該培養(yǎng)基配方為MS基本培養(yǎng)基，添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物1.0mg/L BA(芐基腺嘌呤)，0.1mg/L 2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)，30g/L蔗糖和0.6g/L PVP(聚乙烯吡咯烷酮)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值為5.8，再添加5％瓊脂粉。在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)西藏桃兒七的幼芽，培養(yǎng)條件為25℃，黑暗條件下培養(yǎng)。待種子萌動(dòng)后，改變培養(yǎng)條件為25℃，12小時(shí)光照，光照強(qiáng)度為25μmol.m-2.s-1。等到葉片長(zhǎng)到3cm×3cm大小時(shí)可用于遺傳轉(zhuǎn)化。
實(shí)施例2發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化西藏桃兒七獲得毛狀根1、活化發(fā)根農(nóng)桿菌
A、發(fā)根農(nóng)桿菌A4，R1000，R1601(西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院林學(xué)系植物生理教研室培養(yǎng))。使用前自冰箱取出，接種于50ml YEB液體培養(yǎng)(添加卡那霉素達(dá)到終濃度為100mg/L)，28℃，200rpm振蕩培養(yǎng)兩次；B第二次活化OD600達(dá)0.3時(shí)，加100μmol/mL乙酰丁香酮，繼續(xù)28℃，200rpm振蕩培養(yǎng)，OD600達(dá)0.6時(shí)，室溫下4000rpm離心10分鐘。
3C棄上清，菌體用MS液體培養(yǎng)基(100μmol/mL乙酰丁香酮)懸浮，稀釋到原體積的5倍，在28℃，200rpm振蕩培養(yǎng)，使菌液濃度達(dá)到的OD600＝0.3左右；稱轉(zhuǎn)化液；可用于西藏桃兒七的遺傳轉(zhuǎn)化。
2、發(fā)根農(nóng)桿菌與西藏桃兒七的共培養(yǎng)取無菌西藏桃兒七頂芽、側(cè)芽、葉、莖、根等植物不同部位，將莖切成1cm小段，或?qū)⑷~片切成2cm2左右，用無菌的解剖刀劃以“+”字形傷口，放入上述轉(zhuǎn)化液中，侵染10分鐘后取出，用無菌衛(wèi)生紙吸干，接入添加100μmol/mL乙酰丁香酮的MS固體培養(yǎng)基中共培養(yǎng)2天，培養(yǎng)條件為25℃，黑暗條件下培養(yǎng)。。
3、西藏桃兒七的除菌培養(yǎng)共培養(yǎng)結(jié)束后轉(zhuǎn)移至無植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物的MS固體培養(yǎng)基(添加250mg/L頭孢菌素以達(dá)到除菌的目的)中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為25℃，黑暗條件下培養(yǎng)。10天后，在西藏桃兒七受傷的部位開始出現(xiàn)毛狀根。。
4、西藏桃兒七毛狀根的獲得與繼代培養(yǎng)待從西藏桃兒七轉(zhuǎn)化外植體上誘導(dǎo)出的毛狀根長(zhǎng)到2cm左右是，分別切下單條的毛狀根，接種在無植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物的1/2MS固體培養(yǎng)基上(添加250250mg/L頭孢菌素以達(dá)到除菌的目的)繼代培養(yǎng)；在無植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物的1/2MS固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的西藏桃兒七毛狀根表現(xiàn)出毛狀根特有的形態(tài)學(xué)特征生長(zhǎng)十分迅速、分枝很多、生長(zhǎng)失去向地性。以后每25天繼代培養(yǎng)一次，繼代5次后，農(nóng)桿菌可以去除桿菌；然后僅在1/2MS固體培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)方可。
實(shí)施例3西藏桃兒七毛狀根的分子檢測(cè)1、西藏桃兒七毛狀根基因組DNA的提取，方法如下1)取少量西藏桃兒七毛狀根，放入1.5ml的Eppendorf管中，加500微升抽提buffer。
2)用小玻棒充分研磨后放于60℃水浴50min，其間經(jīng)常顛倒混勻；3)12000rpm，室溫離心10分鐘；
4)取上清液，加500ul飽和酚[Tris-HCl(pH8.0)飽和，吸取下層]，輕輕混勻，4℃靜置5分鐘至分層；5)12000rpm，室溫離心10min；6)吸上清(約250微升)，加2倍體積的無水乙醇(-20℃儲(chǔ)存)，充分混勻，室溫靜置至DNA析出；7)8000rpm，4℃離心5分鐘；8)用75％的乙醇洗2次，稍離心，吸凈殘余乙醇，室溫放置，使乙醇揮發(fā)完全。
9)加50ul TE(100ug/ml RNaseA，50mM Tris.Cl，10mM EDTA，pH 8.0)，溶解DNA。37℃水浴1小時(shí)。
10)加40ul氯仿/異戊醇(24∶1)，輕輕混勻，靜置5分鐘至分層。
11)12000rpm，室溫離心10分鐘。
12)吸取上清(約35ul)到新Eppendorf管中，-20℃保存，用于PCR檢測(cè)。抽提緩沖液配方如下100mM Tris-HCl(pH8.0)2.5％(v/v)巰基乙醇500mM NaCl20mM EDTA1.5％(w/v)SDS2、西藏桃兒七毛狀根中rolB和rolC基因的PCR檢測(cè)，方法如下誘發(fā)并維持毛狀根形態(tài)的rolB和rolC基因是來源于發(fā)根農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒上。rolB基因檢測(cè)使用的上游引物為frolb(5’-GCTCTTGCAGTGCTAGATTT-3’)，下游引物為rrolb(5’-GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3’)；rolC基因檢測(cè)使用的上游引物為(5’-CTCCTGACATCAAACTCGTC-3’)，下游引物為rrolc(5’-TGCTTCGAGTTATGGGTACA-3’)。
檢測(cè)rolB和rolC的PCR程序?yàn)?4℃5min→34循環(huán)(94℃for 40sec→56℃for 40sec→72℃for 1min)→72℃6min。陽(yáng)性對(duì)照為相應(yīng)的工程菌，西藏桃兒七的天然葉片作為陰性對(duì)照。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外檢測(cè)。rolb的擴(kuò)增條帶大小為423bp，rolc為626bp。
實(shí)施例4西藏桃兒七毛狀根中鬼臼毒素和西藏桃兒七野生根中的含量比較
1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備參照劉蕾等人建立的方法(1997年)。
2、西藏桃兒七中鬼臼毒素含量的測(cè)定精密稱取西藏桃兒七毛狀根和野生根干燥粉末(40目)各1g左右，分別在沙氏提取器中用95％乙醇回流提至無色(12h)，回收乙醇，用95％乙醇定量轉(zhuǎn)移至5ml容量瓶中并定容至刻度，分別精密吸取毛狀根樣品液20μl和野生根樣品液20μl點(diǎn)于硅膠GF254(20cm×10cm)板上用氯仿∶甲醇(9.5∶0.5)展開，用鬼臼毒素作對(duì)照，在紫外燈下定位，刮下相對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn)，放入10ml具塞試管中，準(zhǔn)確加入新配制的變色酸(0.1g/ml)0.5ml，以下操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線制備(以薄層板上空白硅膠同樣操作為空白)，離心，取上清液在570nm處測(cè)吸收度，根據(jù)回歸方程計(jì)算含量。結(jié)果為西藏桃兒七毛狀根中含鬼臼毒素1.12％，野生根中含鬼臼毒素0.86％。
權(quán)利要求
1.一種獲得產(chǎn)鬼臼毒素西藏桃兒七毛狀根的方法，特征在于采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，用發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化西藏桃兒七的細(xì)胞、組織、器官、植株；其步驟如下(1)西藏桃兒七無菌外植體的獲得；(2)采用轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)移發(fā)根農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒的T-DNA到西藏桃兒七細(xì)胞、組織、器官、植株中，轉(zhuǎn)基因方法選擇發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化、基因槍法介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化、花粉管通道介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化或生殖細(xì)胞浸泡法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化，步驟如下A、活化發(fā)根農(nóng)桿菌；B、發(fā)根農(nóng)桿菌浸染西藏桃兒七無菌外植體；C、發(fā)根農(nóng)桿菌與西藏桃兒七無菌外植體的共培養(yǎng)；D、西藏桃兒七的除菌培養(yǎng)；(3)西藏桃兒七毛狀根的獲得與繼代培養(yǎng)；(4)西藏桃兒七毛狀根的分子檢測(cè)；(5)西藏桃兒七毛狀根中鬼臼毒素的檢測(cè)。
2.用權(quán)利要求1所述方法獲得的生命體，其特征在于它是可生產(chǎn)鬼臼毒素的西藏桃兒七的毛狀根，其基因組中整合了來至于Ri質(zhì)粒的誘導(dǎo)毛狀根的基因。
3.用權(quán)利要求1所述方法獲得西藏桃兒七毛狀根的后代。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用基因工程技術(shù)遺傳轉(zhuǎn)化西藏桃兒七，獲得生產(chǎn)鬼臼毒素的西藏桃兒七的毛狀根的方法。涉及包含發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化西藏桃兒七的方法，遺傳轉(zhuǎn)化獲得可生產(chǎn)鬼臼毒素的西藏桃兒七毛狀根。其過程是用發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化西藏桃兒七，獲得了西藏桃兒七毛狀根，經(jīng)分子檢測(cè)確為遺傳轉(zhuǎn)化的毛狀根，HPLC檢測(cè)表明遺傳轉(zhuǎn)化獲得的西藏桃兒七毛狀根能夠生產(chǎn)鬼臼毒素。本方法可以為鬼臼毒素的生產(chǎn)提供一種新型可持續(xù)的新型藥源。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1769444SQ20051005728
公開日2006年5月10日 申請(qǐng)日期2005年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月21日
發(fā)明者蘭小中, 鮑隆友, 廖志華, 李春燕 申請(qǐng)人:蘭小中, 鮑隆友, 廖志華, 李春燕