專(zhuān)利名稱(chēng)：低氧誘導(dǎo)因子小干擾rna質(zhì)粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種基因工程質(zhì)粒，進(jìn)一步的，本發(fā)明涉及一種可在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定且高效表達(dá)的低氧誘導(dǎo)因子小干擾RNA質(zhì)粒。
背景技術(shù)：
RNA干擾(或稱(chēng)為RNA干涉，RNA interference，RNAi)指的是細(xì)胞內(nèi)由雙鏈RNA(dsRNA)誘導(dǎo)降解與其配對(duì)的特定mRNA的過(guò)程。在一些生物系統(tǒng)中，少量拷貝的dsRNA能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)所有同源基因的降解。這個(gè)現(xiàn)象在進(jìn)化過(guò)程中保守而且廣泛，許多基因在這個(gè)過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。這個(gè)現(xiàn)象在線(xiàn)蟲(chóng)、昆蟲(chóng)、哺乳動(dòng)物、植物和真菌中廣泛存在。
當(dāng)長(zhǎng)鏈的dsRNA進(jìn)入細(xì)胞時(shí)，它被一種Dicer核酸水解酶所識(shí)別，剪切成21-25個(gè)堿基的小的干擾RNA(SiRNA)，雙鏈的SiRNA被RNA解鏈酶解鏈，以單鏈的形式與另一核酸水解酶結(jié)合形成RNA酶復(fù)合體，復(fù)合體中的單鏈RNA引導(dǎo)酶復(fù)合體識(shí)別與之互補(bǔ)的mRNA序列并將其水解，從而特異性地抑制基因的翻譯表達(dá)。在線(xiàn)蟲(chóng)和植物中，單鏈SiRNA除了上述作用外，還可作為聚合反應(yīng)的引物，在RdRP的作用下，以mRNA為模板，單鏈的SiRNA為引物合成互補(bǔ)鏈，使得單鏈的mRNA成為雙鏈RNA，新合成的dsRNA則又被核酸酶Dicer剪切成SiRNA。RdRP的作用使RNAi的信號(hào)得到放大，只要極微量的dsRNA就能引起強(qiáng)烈的基因表達(dá)抑制。
RNAi可高效且專(zhuān)一地抑制基因表達(dá)，因此在基因的功能研究方面具有廣泛的應(yīng)用，并且也為一些目前難以治療的疾病提供一種潛在的治療手段。目的基因mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)不會(huì)影響RNAi的效率，只要微量的dsRNA就能引起強(qiáng)烈的基因表達(dá)抑制。
RNAi技術(shù)應(yīng)用于哺乳動(dòng)物系統(tǒng)的關(guān)鍵是制備SiRNA。目前，SiRNA設(shè)計(jì)均根據(jù)SiRNA設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)，在多條備選片斷中選取，因此抑制效率有差異。在現(xiàn)有技術(shù)中，經(jīng)常出現(xiàn)SiRNA片段的選擇無(wú)特異性，RNA鏈穩(wěn)定性差，易降解，不利于進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)染效率等問(wèn)題。
與本發(fā)明相比較，最接近的現(xiàn)有技術(shù)是德國(guó)Jorg Hanze(Medical School of theJustus-liebig-University)設(shè)計(jì)的針對(duì)HIF-1α的片斷，但所合成的為RNA雙鏈，而非穩(wěn)定性較高的質(zhì)粒。
本發(fā)明總結(jié)了現(xiàn)有技術(shù)的經(jīng)驗(yàn)，設(shè)計(jì)出了SiRNA-HIF-1α片段，能夠在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定高效地表達(dá)。本發(fā)明結(jié)合SiRNA設(shè)計(jì)軟件選取抑制性片段，抑制效果顯著；同時(shí)，只需化學(xué)合成1/10SiRNA的量就可得到同樣效果，從而使轉(zhuǎn)染效率更高。體外連接pSilence-1.0(Ambion公司)載體后使構(gòu)建的質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)；便于進(jìn)一步連接病毒載體，提高質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種低氧誘導(dǎo)因子小干擾RNA質(zhì)粒，由針對(duì)HIF-1α設(shè)計(jì)的抑制性SiRNA插入到pSilence U6-1.0載體構(gòu)建而成。
更特別的，在所述的低氧誘導(dǎo)因子小干擾RNA質(zhì)粒中，所述針對(duì)HIF-1α設(shè)計(jì)的抑制性SiRNA具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示的基因結(jié)構(gòu)。
更特別的，在所述的低氧誘導(dǎo)因子小干擾RNA質(zhì)粒中，所述pSilence U6-1.0載體具有SEQ ID NO3所述的基因結(jié)構(gòu)。
更特別的，在針對(duì)HIF-1α設(shè)計(jì)的抑制性SiRNA上設(shè)計(jì)特定的酶切位點(diǎn)EcoRI和ApaI，連接到pSilence U6-1.0載體相應(yīng)的酶切位點(diǎn)上，構(gòu)建成上述的目的質(zhì)粒。
進(jìn)一步的，所述的低氧誘導(dǎo)因子小干擾RNA質(zhì)粒具有SEQ ID NO5所示的基因結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題還在于提供所述低氧誘導(dǎo)因子小干擾RNA質(zhì)粒的制備方法，通過(guò)特定的酶切位點(diǎn)，將針對(duì)HIF-1α選擇和設(shè)計(jì)的SiRNA插入到pSilence U6-1.0載體，構(gòu)建成重組質(zhì)粒。
進(jìn)一步的，在本發(fā)明所述的方法中，所述針對(duì)HIF-1α設(shè)計(jì)的抑制性SiRNA通過(guò)http//www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html所提供的方法進(jìn)行設(shè)計(jì)和選擇。
進(jìn)一步的，所述的酶切位點(diǎn)為EcoRI和ApaI。
通過(guò)本發(fā)明的技術(shù)獲得的重組質(zhì)?？稍诩?xì)胞內(nèi)穩(wěn)定且高效地表達(dá)，所述SiRNA的簡(jiǎn)單使用，就可以強(qiáng)烈抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞中獨(dú)立基因的表達(dá)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中發(fā)現(xiàn)，在RNA水平，SiRNA抑制HIF-1α轉(zhuǎn)錄效率很高(大于70％)，其下游靶基因VEGF(血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子)表達(dá)也明顯下降。針對(duì)HIF-1αCDNA編碼序列產(chǎn)生的RNA干擾在抑制HIF-1α的前提下，顯著抑制了HIF的氧依賴(lài)區(qū)(ODD)與VEGF啟動(dòng)子DNA的結(jié)合及轉(zhuǎn)錄活性。對(duì)HIF-1α的抑制不但顯著降低了VEGF水平，同時(shí)HIF-1作為廣譜的轉(zhuǎn)錄因子，紅細(xì)胞生成素及糖代謝途徑也可能被同時(shí)抑制，起到了多途徑抑制效果。
并且，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中發(fā)現(xiàn)，在SiRNA-HIF-1α干擾后，HIF-1α蛋白合成明顯受抑制，胞核顯棕色的數(shù)量及程度明顯減少。
更深層次的，本發(fā)明可用于1.進(jìn)一步與病毒載體連接，包裝為病毒質(zhì)粒，提高轉(zhuǎn)染效率；2.潛在可抑制哺乳動(dòng)物腫瘤的發(fā)展；3.用于缺血模型，與HIF-1α質(zhì)粒成組比較，從反面驗(yàn)證HIF-1α基因與內(nèi)皮祖細(xì)胞成血管活性的關(guān)系。4.以細(xì)胞為載體的基因轉(zhuǎn)染為臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。


圖1顯示了本發(fā)明一種低氧誘導(dǎo)因子小干擾RNA質(zhì)粒構(gòu)建和抑制細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的原理圖。
圖2顯示了將本發(fā)明的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后進(jìn)行基因檢測(cè)，獲得的電泳結(jié)果。其中，圖1A為轉(zhuǎn)染后20小時(shí)HIF-1αCDNA電泳；圖1B為轉(zhuǎn)染后20小時(shí)VEGFCDNA電泳。
圖3顯示了低氧中SiRNA-HIF-1α抑制HIF-1α蛋白。A為HIF-1α陰性對(duì)照(PBS代替一抗)；B為低氧6小時(shí)HIF-1α蛋白；C為低氧，轉(zhuǎn)SiRNA12小時(shí)后HIF-1α蛋白。
圖4顯示了本發(fā)明所用的pSilence U6-1.0載體。
圖5顯示了在SiRNA序列上酶切位點(diǎn)的設(shè)計(jì)。
具體實(shí)施例方式
如圖1所示，本發(fā)明是一種低氧誘導(dǎo)因子小干擾RNA質(zhì)粒，將針對(duì)HIF-1αCDNA設(shè)計(jì)的抑制性SiRNA插入到pSilence U6-1.0載體構(gòu)建而成，通過(guò)電穿孔或脂質(zhì)體等方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞，質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞后，被特異性核酸內(nèi)切酶Dicer識(shí)別，結(jié)合在其結(jié)構(gòu)域上，Dicer隨以該序列為模板，識(shí)別mRNA；識(shí)別后，核酸酶在同樣位置對(duì)mRNA進(jìn)行切割并置換、釋放出原結(jié)構(gòu)域上的siRNA。這樣siRNA在細(xì)胞內(nèi)的數(shù)量會(huì)增加，以正反饋的形式對(duì)目的基因的mRNA進(jìn)行干擾，起到抑制基因的作用。
實(shí)施例1 SiRNA-HIF-1α的制備目的基因HIF-1αsiRNA序列的設(shè)計(jì)打開(kāi)siRNA設(shè)計(jì)工具h(yuǎn)ttp//www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html，將人低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)基因的CDS(HIF-1α的CDS(29-2509)見(jiàn)SEQID NO4)粘貼在輸入框中，選擇end with TT，提交后得到一系列21個(gè)堿基(nt)的輸出序列，選擇其中1到2個(gè)序列，通過(guò)Blast檢驗(yàn)確認(rèn)與其它基因沒(méi)有顯著相似性，將輸出序列轉(zhuǎn)化為正義鏈和反義鏈兩種插入序列。
選擇的序列如下獲得SiRNA-上游序列為(SEQ ID NO1)5′-TGTGAGTTCGCATCTTGATTTCAAGAGAATCAAGATGCGAACTCACATTTTTT-3′其中，TGTGAGTTCGCATCTTGAT為所得上游片段；TTCAAGAGA為特定的loop環(huán)；ATCAAGATGCGAACTCACA為上游片段的回文結(jié)構(gòu)。
獲得SiRNA-下游序列為(SEQ ID NO2)5′-AATTAAAAAATGTGAGTTCGCATCTTGATTCTCTTGAAATCAAGATGCGAACTCACAGGCC-3′；該下游序列與上游互補(bǔ)，5′-AATT為EcoRI酶切位點(diǎn)，GGCC-3′為ApaI酶切位點(diǎn)，與pSilence U6-1.0載體酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)；AAAAAA為終止信號(hào)。酶切位點(diǎn)的設(shè)計(jì)見(jiàn)圖5。
插入序列的處理設(shè)計(jì)好的序列送賽百盛生物技術(shù)公司(基因合成公司)合成，5’端磷酸化，合成后的序列進(jìn)行退火，使之形成雙鏈。將序列溶解于水中至濃度為1ug/ul，兩條鏈各取2ul，與46ul退火緩沖液(100mM KAc，30mM Hepes-KOH PH 7.4，2mM乙酸鎂)混勻，90℃水浴3分鐘，37℃水浴1小時(shí)。退火后的溶液可以直接用來(lái)連接，也可以在-20℃長(zhǎng)期保存。
載體的酶切和回收pSilence U6-1.0載體(Ambion公司，見(jiàn)圖4)的序列見(jiàn)SEQ ID NO3所示。將pSilence U6-1.0載體44ug(89ul)用ApaI0.5ul、EcoRI0.5ul、Y+/Tango緩沖液10ul構(gòu)成100ul酶切體系，37℃水浴3小時(shí)，通過(guò)膠回收純化將酶切片段回收。
載體片段與插入序列連接轉(zhuǎn)化將載體的酶切片段與相應(yīng)的插入序列以1∶2比例用T4連接酶連接，16℃水浴4小時(shí)，CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，瓊脂板鋪板。同時(shí)設(shè)置pSilence U6-1.0載體為空白對(duì)照。
重組子鑒定在陽(yáng)性平板上挑取一定數(shù)量的菌落，分別接種于Amp+LB培養(yǎng)液中，200轉(zhuǎn)/分，37℃搖過(guò)夜。次日質(zhì)粒小量抽提，用XhoI酶切鑒定。能被XhoI酶切開(kāi)的是假陽(yáng)性菌。酶切初步鑒定為正確的克隆由生工生物技術(shù)公司用T7正向引物測(cè)序鑒定。
插入了SiRNA的重組質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果見(jiàn)SEQ ID NO5。
實(shí)施例2 SiRNA-HIF-1α的檢測(cè)通過(guò)電穿孔法，將外源SiRNA-HIF-1α轉(zhuǎn)染入內(nèi)皮祖細(xì)胞，與未轉(zhuǎn)染SiRNA組作如下比較。
1.基因檢測(cè)培養(yǎng)3天后細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，分別置于常氧及低氧中孵育20小時(shí)，進(jìn)行RT-PCR，β-actin量化。電泳結(jié)果如圖2，其中，泳道1為100bp Marker；泳道2、4、6為常氧；泳道3、5、7為低氧；泳道2-3未轉(zhuǎn)染細(xì)胞；泳道4-5為pEGFP空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞；泳道6-7為SiRNA-HIF-1α轉(zhuǎn)染細(xì)胞。A為轉(zhuǎn)染后20小時(shí)HIF-1α電泳，B為轉(zhuǎn)染后20小時(shí)VEGF電泳。結(jié)果顯示HIF1αCDNA在常氧及低氧下均存在，其表達(dá)與氧濃度無(wú)關(guān)，SiRNA干擾使HIF1α抑制；VEGF在低氧誘導(dǎo)下表達(dá)上調(diào)，SiRNA干擾使VEGF表達(dá)減少。
可見(jiàn)，在RNA水平，SiRNA組抑制HIF-1α轉(zhuǎn)錄效率大于70％，其下游靶基因VEGF表達(dá)也明顯下降。針對(duì)HIF-1αCDNA編碼序列產(chǎn)生的RNA干擾在抑制HIF-1α的前提下，顯著抑制了HIF的氧依賴(lài)區(qū)(ODD)與VEGF啟動(dòng)子DNA的結(jié)合及轉(zhuǎn)錄活性。對(duì)HIF-1α的抑制不但顯著降低了VEGF水平，同時(shí)HIF-1作為廣譜的轉(zhuǎn)錄條件因子，紅細(xì)胞生成素及糖代謝途徑也可能被同時(shí)抑制，起到了多途徑抑制效果。
2.蛋白檢測(cè)圖3顯示了低氧中SiRNA-HIF-1α抑制HIF-1α蛋白。A為HIF-1α陰性對(duì)照(PBS代替一抗)；B為低氧6小時(shí)HIF-1α蛋白；C為低氧，轉(zhuǎn)SiRNA 12小時(shí)后HIF-1α蛋白。HIF-1α蛋白呈氧濃度依賴(lài)性，在常氧及低氧1小時(shí)時(shí)細(xì)胞核無(wú)染色，而低氧3小時(shí)HIF-1α蛋白開(kāi)始成倍出現(xiàn)，6小時(shí)達(dá)高峰，24小時(shí)回到基線(xiàn)水平。在SiRNA-HIF-1α干擾后，HIF-1α蛋白合成明顯受抑制，胞核顯棕色的數(shù)量及程度明顯減少；而pEGFP對(duì)照組質(zhì)粒對(duì)HIF-1α蛋白合成無(wú)影響。
可見(jiàn)，在SiRNA-HIF-1α干擾后，HIF-1α蛋白合成明顯受抑制，胞核顯棕色的數(shù)量及程度明顯減少。
序列表<110>上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬仁濟(jì)醫(yī)院王長(zhǎng)謙，姜萌<120>低氧誘導(dǎo)因子小干擾RNA質(zhì)粒<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>53<212>DNA<213>引物<400>1TGTGAGTTCG CATCTTGATT TCAAGAGAAT CAAGATGCGA ACTCACATTT TTT 53<210>2<211>61<212>DNA<213>引物<400>2AATTAAAAAA TGTGAGTTCG CATCTTGATT CTCTTGAAAT CAAGATGCGA ACTCACAGGC 60C 61<210>3<211>3292<212>DNA<213>載體<400>3ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120
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<212>DNA<213>重組質(zhì)粒<400>5ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tgggtacccg 660ctctagaact agtggatccg acgccgccat ctctaggccc gcgccggccc cctcgcacag 720acttgtggga gaagctcggc tactcccctg ccccggttaa tttgcatata atatttccta 780gtaactatag aggcttaatg tgcgataaaa gacagataat ctgttctttt taatactagc 840tacattttac atgataggct tggatttcta taagagatac aaatactaaa ttattatttt 900aaaaaacagc acaaaaggaa actcacccta actgtaaagt aattgtgtgt tttgagacta 960taaatatccc ttggagaaaa gccttgtttg ggcctgtgag ttcgcatctt gatttcaaga 1020gaatcaagat gcgaactcac attttttaat tcctgcagcc cgggggatcc actagttcta 1080gagcggccgc caccgcggtg gagctccagc ttttgttccc tttagtgagg gttaattgcg 1140cgcttggcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt 1200ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc 1260taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc 1320cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct 1380tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca 1440gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac 1500atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt 1560ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg 1620cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc 1680
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1.一種低氧誘導(dǎo)因子小干擾RNA質(zhì)粒，其特征在于，由針對(duì)HIF-1α設(shè)計(jì)的抑制性SiRNA插入到pSilence U6-1.0載體構(gòu)建而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低氧誘導(dǎo)因子小干擾RNA質(zhì)粒，其特征在于，所述針對(duì)HIF-1α設(shè)計(jì)的抑制性SiRNA具有SEQ ID NO1或SEQ IDNO2所示的基因結(jié)構(gòu)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低氧誘導(dǎo)因子小干擾RNA質(zhì)粒，其特征在于，所述的pSilence U6-1.0載體具有SEQ ID NO3所述的基因結(jié)構(gòu)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低氧誘導(dǎo)因子小干擾RNA質(zhì)粒，其特征在于，在針對(duì)HIF-1α設(shè)計(jì)的抑制性SiRNA上設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)EcoRI和ApaI，連接到pSilence U6-1.0載體相應(yīng)的酶切位點(diǎn)上，構(gòu)建成目的質(zhì)粒。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的低氧誘導(dǎo)因子小干擾RNA質(zhì)粒，其特征在于，具有SEQ ID NO5所示的基因結(jié)構(gòu)。
6.權(quán)利要求1所述的低氧誘導(dǎo)因子小干擾RNA質(zhì)粒的制備方法，其特征在于，通過(guò)特定的酶切位點(diǎn)，將針對(duì)HIF-1α設(shè)計(jì)的SiRNA插入到pSilence U6-1.0載體，構(gòu)建成重組質(zhì)粒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的低氧誘導(dǎo)因子小干擾RNA質(zhì)粒的制備方法，其特征在于，所述針對(duì)HIF-1α設(shè)計(jì)的抑制性SiRNA通過(guò)http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA finder.html所提供的方法進(jìn)行設(shè)計(jì)和選擇。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的低氧誘導(dǎo)因子小干擾RNA質(zhì)粒的制備方法，其特征在于，所述的酶切位點(diǎn)為EcoRI和ApaI。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，公開(kāi)了一種低氧誘導(dǎo)因子小干擾RNA(SiRNA－HIF－1α)質(zhì)粒，它是將針對(duì)HIF－1α設(shè)計(jì)的抑制性siRNA片段插入到pSilence U6－1.0載體，構(gòu)建而成的重組質(zhì)粒。本發(fā)明的質(zhì)?？稍诩?xì)胞內(nèi)穩(wěn)定且高效地表達(dá)，從而可以強(qiáng)烈抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞中獨(dú)立基因的表達(dá)。
文檔編號(hào)C12N15/66GK1831133SQ20051002424
公開(kāi)日2006年9月13日 申請(qǐng)日期2005年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月8日
發(fā)明者王長(zhǎng)謙, 姜萌 申請(qǐng)人:上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬仁濟(jì)醫(yī)院