專利名稱：重組胸腺素α1在大腸桿菌中的高分泌表達(dá)和分離純化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及通過(guò)基因工程方法制備重組胸腺素α1。
背景技術(shù)：
胸腺是人體最重要的免疫器官，在免疫系統(tǒng)中具有關(guān)鍵的地位，七十年代中期，人們從胸腺組織中分離得到一種混合的胸腺多肽制備物，稱之為TF5，TF5組分被認(rèn)為是強(qiáng)有力的免疫系統(tǒng)增強(qiáng)劑，可以促使T細(xì)胞分化成熟以及發(fā)揮正常功能，增加機(jī)體的抗體表達(dá)和免疫移植反應(yīng)，促進(jìn)MIF(巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子)的表達(dá)等等。
胸腺素α1(Thymosin α1，簡(jiǎn)稱Tα1)是最早從TF5組分中純化得到均一狀態(tài)的一個(gè)活性多肽，由28個(gè)氨基酸組成，N端被乙?；入婞c(diǎn)為pH4.2，分子量3108，不含甲硫氨酸，半胱氨酸和芳香氨基酸。在某些測(cè)活系統(tǒng)中如MIF誘導(dǎo)、E-玫瑰花結(jié)實(shí)驗(yàn)、誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞表面標(biāo)記產(chǎn)生等實(shí)驗(yàn)顯示，胸腺素α1比TF5活性高出10到1000倍，具有顯著的免疫活性，是TF5組分中主要免疫活性成分之一。
胸腺素α1是免疫系統(tǒng)有力的增強(qiáng)劑，能促進(jìn)免疫系統(tǒng)的多種功能，在臨床上適用于很多疾病的治療，如病毒性疾病乙型肝炎和丙型肝炎的治療、癌癥的輔助治療、免疫低下癥以及免疫性疾病的治療。
目前，市場(chǎng)上銷售的胸腺類產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝有兩種化學(xué)合成法和動(dòng)物組織提取法?；瘜W(xué)合成法的生產(chǎn)工藝復(fù)雜，得率低，成本高，產(chǎn)品價(jià)格十分昂貴；而動(dòng)物組織提取的產(chǎn)品是混合物，價(jià)格低，但質(zhì)量不穩(wěn)定，療效不如胸腺素α1，對(duì)有些病人有致敏性。這些都極大地限制了該產(chǎn)品在臨床上的應(yīng)用。如果能降低生產(chǎn)成本，大量提供優(yōu)質(zhì)廉價(jià)的胸腺素α1藥品，將會(huì)產(chǎn)生很高的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。
用基因工程方法生產(chǎn)多肽在基因工程領(lǐng)域中屬于比較新的課題，也是一個(gè)難題。因?yàn)槎嚯牡姆肿恿枯^小，在宿主菌菌體內(nèi)表達(dá)時(shí)很容易被蛋白酶水解，據(jù)報(bào)道直接表達(dá)的水平僅能達(dá)到每升幾個(gè)毫克的水平，因此，目前國(guó)內(nèi)外所采用的生產(chǎn)工藝大都限于用基因多拷貝表達(dá)或以融合蛋白的形式表達(dá)多肽，但用這些方法表達(dá)的產(chǎn)物還需經(jīng)過(guò)化學(xué)裂解或酶切等后加工步驟，生產(chǎn)工藝十分復(fù)雜、繁瑣。
本發(fā)明者們對(duì)直接分泌表達(dá)多肽進(jìn)行了潛心研究，利用大腸桿菌堿性磷酸酯酶啟動(dòng)子和信號(hào)肽基因所構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)直接分泌表達(dá)重組胸腺素α1(rTα-1)至培養(yǎng)基中，獲得了很高的分泌表達(dá)量，說(shuō)明用分泌表達(dá)的方式生產(chǎn)胸腺素α1不僅僅是可行的，而且是非常有效的生產(chǎn)方式，從而完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供重組胸腺素α1基因。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供分泌表達(dá)重組胸腺素α1的表達(dá)質(zhì)粒pKAT。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供分泌表達(dá)重組胸腺素α1的工程菌YKAT。
本發(fā)明的還有一個(gè)目的是提供高分泌表達(dá)重組胸腺素α1的工程菌株YKAT-8。
本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供直接分泌表達(dá)重組胸腺素α1的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供的重組胸腺素α1基因具有與序列表中SEQ ID NO.1所示的如下核苷酸序列至少90％同源性的序列5′-TCTGACGCTG CTGTTGACAC TTCTTCCGAA ATCACTACCA AAGACCTGAAAGAAAAGAAA GAAGTTGTAG AAGAGGCTGA AAACTAATAA-3′本發(fā)明提供的分泌表達(dá)重組胸腺素α1的表達(dá)質(zhì)粒pKAT包括與SEQ ID NO.1所示核苷酸序列至少90％同源性的重組胸腺素α1基因，在所述基因的上游含有啟動(dòng)表達(dá)和分泌重組胸腺素α1的堿性磷酸酯酶phoA啟動(dòng)子和信號(hào)肽基因。
本發(fā)明的表達(dá)質(zhì)粒pKAT中，所述的啟動(dòng)子和信號(hào)肽基因還包括可以啟動(dòng)表達(dá)和分泌重組胸腺素α1的所有原核啟動(dòng)子和信號(hào)肽基因。
本發(fā)明提供的工程菌YKAT是表達(dá)質(zhì)粒pKAT轉(zhuǎn)化入大腸桿菌YK537而得到的具有卡那霉素抗性的所有菌株。
本發(fā)明還提供分泌表達(dá)重組胸腺素α1的工程菌株YKAT-8，所述工程菌株是從工程菌YKAT中篩選出的表達(dá)量最高的菌株。
本發(fā)明提供的直接分泌表達(dá)重組胸腺素α1的方法包括如下步驟
1.利用大腸桿菌偏愛密碼子按照天然胸腺素α1的氨基酸序列設(shè)計(jì)并合成重組胸腺素α1基因；2.以pTZ18R為起始質(zhì)粒，以大腸桿菌堿性磷酸酯酶phoA啟動(dòng)子和信號(hào)肽基因作為重組胸腺素α1基因的上游序列，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pKAT；3.接入卡那霉素抗性基因；4.構(gòu)建和篩選出基因工程菌株YKAT-8；5.基因工程菌YKAT-8的發(fā)酵培養(yǎng)；6.表達(dá)產(chǎn)物的分離純化。
本發(fā)明提供的重組胸腺素α1分離純化方法是采用超濾、陰離子交換柱層析、凝膠過(guò)濾層析和反相高壓液相色譜的組合方式。
本發(fā)明的特征在于利用大腸桿菌偏愛密碼子按照天然胸腺素α1的氨基酸序列設(shè)計(jì)了胸腺素α1在大腸桿菌表達(dá)的基因序列，并首次應(yīng)用直接分泌表達(dá)的方式生產(chǎn)重組胸腺素α1，成功地直接分泌表達(dá)重組胸腺素α1至培養(yǎng)基中，目前的分泌表達(dá)水平已達(dá)到每升500毫克，經(jīng)分離純化，得到N端非乙?；闹亟M胸腺素α1純品，其純度大于95％。實(shí)驗(yàn)證明，純化的重組胸腺素α1和化學(xué)合成的胸腺素α1有類似的生物活性，而比胸腺肽的混合制備物活性高。本發(fā)明的方法步驟簡(jiǎn)單，與化學(xué)合成以及大腸桿菌融合表達(dá)生產(chǎn)胸腺素α1的方法比較，在生產(chǎn)費(fèi)用和生產(chǎn)周期上明顯減少和縮短，從而使大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)、大規(guī)模臨床應(yīng)用成為可能。


圖1是pAAT質(zhì)粒構(gòu)建示意圖。
圖2是pKAT質(zhì)粒構(gòu)建示意圖。
圖3是質(zhì)粒pAAT的酶切鑒定圖。圖中，第1泳道是pAAT經(jīng)PstI、HindIII酶切后的電泳條帶；第2泳道是DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量。
圖4是工程菌YKAT搖瓶篩選的SDS-PAGE凝膠電泳圖。圖中，第1-5，8-13，15泳道是300μl搖瓶培養(yǎng)基上清，依次為工程菌YKAT1-12；第6泳道是300μl不含質(zhì)粒的YK537培養(yǎng)基上清；第7，14泳道是化學(xué)合成的胸腺素α1標(biāo)準(zhǔn)品。
圖5是工程菌株YKAT-8在發(fā)酵罐中表達(dá)上清的SDS-PAGE凝膠電泳圖。圖中，第1-3泳道是10μl發(fā)酵液上清，依次為培養(yǎng)14小時(shí)，16小時(shí)，18小時(shí)；第4-8泳道是化學(xué)合成的胸腺素α1標(biāo)準(zhǔn)品，依次為0.5μg，1μg，2μg，3μg，5μg。
圖6是Q Sepharose Fast Flow離子交換純化圖。
圖7是Sephadex G-50凝膠過(guò)濾純化圖。
圖8是反相HPLC純化圖。
圖9是純化產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳分析圖。圖中，第1泳道為10μg純化的重組胸腺素α1；第2泳道為10μg化學(xué)合成的胸腺素α1標(biāo)準(zhǔn)品。
圖10是純化產(chǎn)物的反相HPLC檢定圖。
圖11是純化產(chǎn)物的N端氨基酸序列檢定圖(1)。
圖12是純化產(chǎn)物的N端氨基酸序列檢定圖(2)。
圖13是純化產(chǎn)物的N端氨基酸序列檢定圖(3)。
下面用實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。這些實(shí)施例僅僅是舉例說(shuō)明，并不對(duì)本發(fā)明構(gòu)成任何限制。
實(shí)施例1 設(shè)計(jì)并合成重組胸腺素α1基因我們?cè)O(shè)計(jì)了如下兩個(gè)片段(序列表中的SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4)，下劃線部分為兩片段互補(bǔ)區(qū)。在設(shè)計(jì)合成片段時(shí)，充分遵循了以下原則按照天然胸腺素α1的氨基酸序列(序列表中的SEQ ID NO.10)，選用大腸桿菌偏愛的密碼子；AT、GC含量接近且分布均勻；片段內(nèi)避免二級(jí)結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生；片段間避免重復(fù)序列；在基因的3’端加入兩個(gè)終止密碼子。
片段15′-TCTGACGCTGCTGTTGACACTTCTTCCGAAATCACTACCAAAGACCTGAAAGAAAAG-3′片段25′-CCCAAGCTTATTAGTTTTCAGCCTCTTCTACAACTTCTTTCTTTTCTTTCAGGTC-3′將上述化學(xué)合成的兩個(gè)基因片段各10D，在95℃退火5分鐘，再緩慢冷卻到室溫，加入5U klenow酶(TaKaRa公司)、8μl 2.5mM dNTP(TaKaRa公司)和10μl 10×klenow酶緩沖液(TaKaRa公司)，補(bǔ)充蒸餾水至100μl，37℃聚合2小時(shí)，在1.5％的瓊脂糖凝膠中電泳，割取97bp片斷，用DNA膠回收試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，按試劑盒提供的方法回收該DNA片段，即為重組胸腺素α1基因(序列表中的SEQ ID NO.1)。相應(yīng)的天然人胸腺素α1基因見序列表中的SEQ ID NO.2。
實(shí)施例2 化學(xué)合成堿性磷酸酯酶phoA啟動(dòng)子和信號(hào)肽基因我們完全按照大腸桿菌堿性磷酸酯酶phoA啟動(dòng)子(phoA-P)和信號(hào)肽(sig)的天然基因序列(序列表中的SEQ ID NO.5)合成該基因。先合成如下4個(gè)片段(片段3-6)(序列表中依次為SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ IDNO.9)，下劃線部分為片段間互補(bǔ)區(qū)。在phoA-P的5’端加上PstI、BglII、XbaI的酶切位點(diǎn)，以便于構(gòu)建。
片段35′-AACTGCAGATCTAGAGCTCGTCAGTAAAAAGTTAATCTTTTCAACAGCTGTCATAAAGTT-3′片段45′-TTAAAAAATAAAAACAAAGCGACTATAAGTCTCGGCCGTGACAACTTTATGACAGCTGTT-3′片段55′-TTTGTTTTTATTTTTTAATGTATTTGTACATGGAGAAAATAAAGTGAAACAAAGCACTAT-3′片段65′-CGCTTTTGTCACAGGGGTAAACAGTAACGGTAAGAGTGCCAGTGCAATAGTGCTTTGTTTCACT-3′將上述化學(xué)合成的四個(gè)基因片段各1OD，在95℃退火5分鐘，再緩慢冷卻到室溫，加入5U klenow酶(TaKaRa公司)、8μl 2.5mM dNTP(TaKaRa公司)和10μl 10×klenow酶緩沖液(TaKaRa公司)，補(bǔ)充蒸餾水至100μl，37℃聚合2小時(shí)，在1.5％的瓊脂糖凝膠中電泳，割取190bp片斷，用DNA膠回收試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，按試劑盒提供的方法回收該DNA片段，即為堿性磷酸酯酶phoA啟動(dòng)子和信號(hào)肽基因。
實(shí)施例3 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建(圖1)3.1載體的酶切處理以質(zhì)粒pTZ18R(Pharmacia公司)作為出發(fā)質(zhì)粒。取5微克pTZ18R加入20UPstI酶(TaKaRa公司)和10μl 10×PstI酶緩沖液(TaKaRa公司)，補(bǔ)充蒸餾水至100μl，37℃酶切4小時(shí)，再加入10μl 3M乙酸鈉，200μl的無(wú)水乙醇，充分混勻，12000rpm離心10分鐘，棄去上清，加入200μl 70％乙醇，充分混勻，12000rpm離心2分鐘，棄上清。待沉淀晾干后，加入20U HindIII酶(TaKaRa公司)和5μl10×HindIII酶緩沖液(TaKaRa公司)，補(bǔ)充蒸餾水至50μl，37℃酶切過(guò)夜，酶切混合物在1％瓊脂糖凝膠中電泳，割取約2.9kb條帶，用DNA膠回收試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，按試劑盒提供的方法回收該DNA片段，即獲得兩端含有PstI、HindIII粘性末端的線性載體。
3.2堿性磷酸酯酶phoA啟動(dòng)子和信號(hào)肽基因與重組胸腺素α1基因的連接與擴(kuò)增將實(shí)施例1得到的重組胸腺素α1基因與實(shí)施例2得到的堿性磷酸酯酶phoA啟動(dòng)子和信號(hào)肽基因以1∶1的比例加入T4DNA連接酶(TaKaRa公司)的反應(yīng)體系(按T4DNA連接酶使用說(shuō)明書配制)中，16℃連接過(guò)夜。在500μl小離心管中加入1μl上述連接混合物、50pmol片段2(序列表中的SEQ ID NO.4)、50pmol片段3(序列表中的SEQ ID NO.6)、8μl 2.5mM dNTP(TaKaRa公司)、10μl 10×pfu DNA聚合酶緩沖液(TaKaRa公司)、2.5U pfu DNA聚合酶(TaKaRa公司)，并補(bǔ)充水至100μl，然后在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增方法94℃2分鐘，1個(gè)循環(huán)；94℃30秒，72℃45秒，30個(gè)循環(huán)；72℃2分鐘。將擴(kuò)增混合物在1％的瓊脂糖凝膠中電泳，割取287bp片斷，用DNA膠回收試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，按試劑盒提供的方法回收該DNA片段，即為連接順序?yàn)?’-堿性磷酸酯酶啟動(dòng)子和信號(hào)肽+重組胸腺素α1-3’的基因(如圖1)。
3.3堿性磷酸酯酶啟動(dòng)子和信號(hào)肽+重組胸腺素α1基因的酶切處理在3.2得到的堿性磷酸酯酶啟動(dòng)子和信號(hào)肽+重組胸腺素α1基因中加入50UPstI酶(TaKaRa公司)和10μl 10×PstI酶緩沖液(TaKaRa公司)，補(bǔ)充蒸餾水至100μl，37℃酶切過(guò)夜，再加入10μl 3M乙酸鈉，200μl的無(wú)水乙醇，充分混勻，12000rpm離心10分鐘，棄去上清，加入200μl 70％乙醇，充分混勻，12000rpm離心2分鐘，棄上清。待沉淀晾干后，加入50U HindIII酶(TaKaRa公司)和5μl10×HindIII酶緩沖液(TaKaRa公司)，補(bǔ)充蒸餾水至50μl，37℃酶切過(guò)夜，酶切混合物在1％瓊脂糖凝膠中電泳，割取約280bp條帶，用DNA膠回收試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，按試劑盒提供的方法回收該DNA片段，即獲得5’端含有PstI粘端、3’端含有HindIII粘端的插入片段。
3.4連接
將3.1得到的含有兩粘端的線性載體與3.3得到的含有兩粘端的堿性磷酸酯酶啟動(dòng)子和信號(hào)肽+重組胸腺素α1基因以1∶5的比例加入T4DNA連接酶(TaKaRa公司)的反應(yīng)體系(按T4DNA連接酶使用說(shuō)明書配制)中，16℃連接過(guò)夜。
3.5感受態(tài)細(xì)胞的制備接種大腸桿菌Top10F’甘油菌[F’{proAB，lacIq，lacZΔM15，Tn10(TetR)}mcrA，Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)，Φ80lacZΔM15，ΔlacX74，deoR，recA1，araD139，Δ(ara-leu)7697，galU，galK，rpsL(StrR)，endA1，nupGλ-](購(gòu)自Invitrogen公司)至3mL LB培養(yǎng)基(10g/L蛋白胨，5g/L酵母抽提物，10g/L氯化鈉)中，37℃200rpm培養(yǎng)過(guò)夜。取100μl轉(zhuǎn)接入3mL新鮮的LB培養(yǎng)基中，37℃200rpm繼續(xù)培養(yǎng)至A600介于0.3～0.4，4000rpm離心10分鐘，棄上清，菌體以預(yù)冷的鈣溶液(0.1mol/LCaCl2)洗滌，4000rpm離心10分鐘，重懸于200μl的鈣溶液中。
3.6連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化取3.4得到的連接混合物，加入3.5制備的感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30分鐘，42℃熱休克90秒，隨后加入800μl新鮮的LB培養(yǎng)基，37℃，100rpm，緩慢振搖30分鐘，取100μl涂布含有100微克/毫升氨芐青霉素的LB平板(10g/L蛋白胨，5g/L酵母抽提物，10g/L氯化鈉，15g/L瓊脂)上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。
3.7質(zhì)粒的小量制備用滅菌牙簽挑取3.6得到的單菌落于3mL含有100微克/毫升氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃200rpm培養(yǎng)8～10小時(shí)后，用質(zhì)粒小抽試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，按試劑盒提供的方法抽取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定，完成表達(dá)質(zhì)粒pAAT的構(gòu)建。
實(shí)施例4 表達(dá)質(zhì)粒的鑒定取1μg實(shí)施例3獲得的小量制備的質(zhì)粒，加入5U PstI酶(TaKaRa公司)和5U HindIII酶(TaKaRa公司)，再加入2μl 10×K緩沖液(TaKaRa公司)，補(bǔ)充蒸餾水至20μl，37℃酶切2小時(shí)，酶切混合物在1％瓊脂糖凝膠中電泳，紫外燈下觀測(cè)，切出約為280bp大小的片段，與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)預(yù)期的相一致(圖3)。
委托上海博亞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果表明在構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒pAAT中，堿性磷酸酯酶phoA啟動(dòng)子和信號(hào)肽基因序列(序列表中的SEQ ID NO.5)以及重組胸腺素α1基因序列(序列表中的SEQ ID NO.1)都完全正確，并且堿性磷酸酯酶啟動(dòng)子和信號(hào)肽基因位于重組胸腺素α1基因的上游，與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)一致(見圖1)。
實(shí)施例5 表達(dá)質(zhì)粒的抗性改造(圖2)5.1pAAT質(zhì)粒的大量制備(1)將含有pAAT質(zhì)粒的大腸桿菌Top10F’接入200mL LB培養(yǎng)基，37℃200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。
(2)4000rpm離心10分鐘沉淀菌體，加入5mL溶液I，振蕩器上打散菌體后加入10mL溶液II，室溫放置3分鐘后加入7.5mL溶液III，冰浴5分鐘后12000rpm離心10分鐘。
(3)取上清，加入兩倍體積乙醇，混勻，12000rpm離心10分鐘，棄上清，晾干沉淀，溶于1mL TE中，加入RNaseA至50μg/mL，37℃水浴30分鐘。然后利用Sepharose CL-2B柱進(jìn)行純化，用TE洗脫，收集第一個(gè)峰。
(4)加入等體積酚/氯仿(1∶1)振蕩后，12000rpm離心5分鐘，吸取上層溶液。
(5)重復(fù)步驟(4)兩次。
(6)加入1/10體積的3M NaAc和2倍體積的無(wú)水乙醇，混勻后12000rpm離心10分鐘，用70％乙醇洗滌一次，晾干沉淀，并溶于TE中。
溶液I50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-Cl，10mmol/L EDTA，pH8.0。
溶液II0.2mol/L NaOH，1％SDS。
溶液III5mol/L乙酸鉀60mL，冰乙酸11.5mL，無(wú)菌水28.6mL。
TE10mM Tris HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH8.0)RNaseA10mg RNaseA粉末溶解于1mL蒸餾水，100℃加熱15分鐘，離心后上清保存于4℃。
5.2質(zhì)粒pET-24a(+)和質(zhì)粒pAAT的酶切處理用10U Eco57I酶(華美生物工程公司)分別酶切10μg質(zhì)粒pET-24a(+)(Novogen公司)和5.1制備的10μg質(zhì)粒pAAT，在100μl酶切體系(按Eco57I酶使用說(shuō)明書配制)中，37℃酶切2小時(shí)，再分別加入100μl的酚∶氯仿(1∶1)充分混勻，12000rpm離心5分鐘，吸取上層溶液，加入10μl 3M乙酸鈉，200μl的無(wú)水乙醇，充分混勻，12000rpm離心10分鐘，棄去上清。待沉淀晾干后，分別加入30U Hind III酶和5μl 10×HindIII酶緩沖液(TaKaRa公司)，補(bǔ)充蒸餾水至50μl，37℃酶切過(guò)夜，酶切混合物在1％瓊脂糖凝膠中電泳，割取從pET-24a(+)中切出的1200bp卡那霉素抗性基因片斷以及切去氨芐青霉素抗性基因的pAAT大片段，用DNA膠回收試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，按試劑盒提供的方法回收DNA片段。
5.3卡那霉素抗性基因的接入按3.4方法將5.2得到的兩回收DNA片段連接，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Top10F’感受態(tài)細(xì)胞中，涂布含50微克/毫升卡那霉素的LB平板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單菌落，于3mL含有50微克/毫升卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃200rpm培養(yǎng)8～10小時(shí)后，用質(zhì)粒小抽試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，按試劑盒提供的方法抽取質(zhì)粒，再進(jìn)行酶切鑒定。
5.4鑒定酶切鑒定方法同實(shí)施例4，酶切鑒定正確的質(zhì)粒為表達(dá)質(zhì)粒pKAT。進(jìn)一步委托上海博亞生物技術(shù)有限公司對(duì)質(zhì)粒pKAT進(jìn)行DNA序列測(cè)定，序列測(cè)定結(jié)果表明堿性磷酸酯酶phoA啟動(dòng)子和信號(hào)肽基因序列(序列表中的SEQ ID NO.5)以及重組胸腺素α1基因序列(序列表中的SEQ ID NO.1)完全正確，并都已正確地連入卡那霉素抗性質(zhì)粒中(見圖2)。
實(shí)施例6 基因工程菌YKAT的構(gòu)建和篩選6.1基因工程菌YKAT的構(gòu)建按3.5方法制備大腸桿菌YK537[supE44 hsdR hsdM recA1 phoA8 leuB6 thilacY rpsL20 galK2 ara-14xyl-5mtl-1](由Dr.Yamasaki惠贈(zèng))的感受態(tài)細(xì)胞，按3.6方法將表達(dá)質(zhì)粒pKAT轉(zhuǎn)化入YK537中，涂布含50微克/毫升卡那霉素的LB平板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。
6.2基因工程菌YKAT的誘導(dǎo)表達(dá)挑取6.1獲得的單菌落放入3毫升LB培養(yǎng)基中，37℃200rpm培養(yǎng)過(guò)夜，然后按1∶100的比例轉(zhuǎn)接入LB培養(yǎng)基中，6小時(shí)后利用5N NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至7.0，每1小時(shí)調(diào)節(jié)一次，繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)，取1mL培養(yǎng)液作為試樣，離心后取上清，在上清中加入4倍體積的丙酮，冰浴10分鐘后12000rpm離心5分鐘，傾去溶液，晾干沉淀，用于進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析。
6.3培養(yǎng)上清經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分析(圖4)，篩選出表達(dá)量最高的工程菌株YKAT-8。SDS-PAGE電泳方法如下(1)SDS-PAGE電泳分離膠(17％)的配制將3.2mL 38％丙烯酰胺貯液、2.33mL分離膠緩沖液、1.5mL 50％甘油、100μl 10％過(guò)硫酸銨和100μl 10％TEMED混合。配制好后立即使用，膠的上層用水封好，以隔絕氧氣。
(2)SDS-PAGE電泳堆積膠(5％)的配制將0.5mL 30％丙烯酰胺貯液、0.38mL堆積膠緩沖液、2mL H2O、60μl 0.5M EDTA(pH8.0)、60μl 10％過(guò)硫酸銨和60μl 10％TEMED混合。配制好后立即使用，膠凝固后放置1小時(shí)后使用。
(3)安裝好電泳儀，加入內(nèi)槽電泳緩沖液和外槽電泳緩沖液，待用。
(4)將6.2獲得的晾干試樣溶于15μl 1×SDS加樣緩沖液中，在沸水浴中放置5分鐘即可上樣進(jìn)行電泳，待溴酚蘭走出凝膠后停止電泳。
38％丙烯酰胺貯液35.76g丙烯酰胺，2.24g甲叉雙丙烯酰胺，加蒸餾水定容至100mL，過(guò)濾后避光4℃保存。
30％丙烯酰胺貯液29g丙烯酰胺，1g甲叉雙丙烯酰胺，加蒸餾水定容至100mL，過(guò)濾后避光4℃保存。
分離膠緩沖液3M Tris堿，0.3％g SDS，pH為8.9。
堆積膠緩沖液1M Tris堿，pH為6.8。
10×內(nèi)槽電泳緩沖液1M Tris堿，1M Tricine，1％SDS。
5×外槽電泳緩沖液1M Tris堿，pH為8.9。
1×上樣緩沖液(10mL)0.2mg溴酚蘭，0.15g二巰基乙醇，0.2g SDS，1mL甘油，1.25mL堆積膠緩沖液，補(bǔ)充水至10mL。
實(shí)施例7 基因工程菌YKAT-8在20L發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)將實(shí)施例6篩選得到的菌株YKAT-8按1∶100的比例接入200mL LB培養(yǎng)基，37℃200rpm振蕩培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，轉(zhuǎn)接入發(fā)酵罐10L培養(yǎng)基。培養(yǎng)過(guò)程中通過(guò)攪拌速度的調(diào)節(jié)將溶氧控制在20％左右，利用氨水將pH控制在7.0。培養(yǎng)8小時(shí)后開始補(bǔ)料，補(bǔ)料速度為1.5mL/分鐘；培養(yǎng)12小時(shí)后每隔2小時(shí)取樣1mL，離心后取上清待檢測(cè)。培養(yǎng)18-20小時(shí)后放罐。放罐后，培養(yǎng)液4000rpm離心取上清以備后面的純化。
發(fā)酵液按6.3方法進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，經(jīng)掃描分析表明重組胸腺素α1被分泌到培養(yǎng)基中，其最高表達(dá)量超過(guò)500mg/L培基(圖5)。
發(fā)酵培養(yǎng)基1％酵母抽提物，2％蛋白胨，0.5％酪蛋白氨基酸，0.2％MgSO4，0.2％NH4Cl，0.2％(NH4)2SO4，0.1％NaCl，0.6％葡萄糖；補(bǔ)料300g/L葡萄糖，5g/L酪蛋白氨基酸；實(shí)施例8 表達(dá)產(chǎn)物的分離純化8.1超濾將實(shí)施例7獲得的培養(yǎng)基上清液用截留分子量100,000的超濾膜除去一些大分子量的雜蛋白。
8.2離子交換柱(Q-Sepharose Fast Flow)層析離子交換柱Q-Sepharose FF(Φ26×100mm)用平衡緩沖液(10mM TrispH7.2)平衡，將超濾過(guò)的發(fā)酵液用平衡緩沖液稀釋至電導(dǎo)率為5以下，上樣，流速為10ml/分鐘。待上樣完畢再用平衡緩沖液洗柱，將未被吸附的蛋白洗盡。然后在平衡緩沖液中依次加入0.05M、0.1M、2M NaCl進(jìn)行階段洗脫，收集0.1M NaCl的洗脫峰(圖6)。
8.3Sephadex G-50凝膠過(guò)濾將8.2收集的洗脫組份冷凍干燥，然后溶解在小體積的蒸餾水中，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，上Sephadex G-50柱(Φ100×900mm)進(jìn)行純化。緩沖液為5mM PB(pH7.2)，流速為20ml/分鐘，收集2#峰(圖7)。
8.4反相HPLC將8.3獲得的2#組份冷凍干燥，然后溶解在小體積的重蒸餾水中，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，然后用Waters公司的高壓液相色譜儀進(jìn)行純化，收集主峰(圖8)。
C8反相柱ULTRASPHERE(Φ10.0mm×25cm)。
緩沖液A0.1％TFA。
緩沖液B0.1％TFA，50％乙腈。
梯度0％～50％B，25分鐘內(nèi)。
流速3ml/分鐘。
實(shí)施例9 純化產(chǎn)物的檢定
9.1電泳檢定按6.3方法進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，經(jīng)掃描分析，純化的重組胸腺素α1純度大于95％(圖9)。
9.2反相HPLC檢定分析結(jié)果(圖10)表明，純化的重組胸腺素α1純度大于95％。
RP-300(Φ2.1×30mm)HPLC分析條件緩沖液A0.1％TFA。
緩沖液B0.1％TFA，90％乙腈。
梯度0％～45％B，35分鐘內(nèi)。
流速0.4ml/分鐘。
9.3N端氨基酸序列分析委托中科院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所用ABI公司Protein Sequencer491型測(cè)序儀進(jìn)行N端氨基酸序列分析(見圖11-13)，共測(cè)出了純化的重組胸腺素α1N端15個(gè)氨基酸，其序列依次為Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp，與天然胸腺素α1N端氨基酸序列(序列表中SEQ ID NO.10)一致，證明信號(hào)肽已被正確切除。
9.4玫瑰花結(jié)法測(cè)定活性(1)T細(xì)胞的制備新鮮小牛胸腺1個(gè)，去脂并剪碎，加適量Hank′s液，含T細(xì)胞的混濁細(xì)胞液經(jīng)100目篩過(guò)濾，濾液加入有1/3體積淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，2000rpm離心20分鐘，小心吸出中間的白色胸腺細(xì)胞，放入另一離心管中，加入5毫升Hank′s液洗滌(振搖均勻)，1500rpm離心3分鐘，棄上清液，再加5毫升Hank′s液，反復(fù)三次。最后，加入3毫升Hank′s液搖勻，45℃恒溫水浴30分鐘、1500rpm離心3分鐘，棄上清液，用Hank′s液反復(fù)洗三次，最后用Hank′s稀釋并計(jì)數(shù)，使其最終濃度為3-5×106細(xì)胞/毫升。
(2)綿羊紅血球的制備取新鮮綿羊血，用適量Hank′s液洗三次，棄上清液，加適量Hank′s液稀釋并計(jì)數(shù)，使最終濃度為T細(xì)胞的10倍，約3-5×107細(xì)胞/毫升。
(3)測(cè)定將不同濃度的胸腺素α1加入1毫升稀釋好的T細(xì)胞液中，37℃保溫1小時(shí)，1500rpm離心3分鐘，棄上清液，用Hank′s反復(fù)洗三次，加入稀釋好的綿羊紅細(xì)胞懸液及Hank′s液各1毫升，混勻，1500rpm離心3分鐘，放入4℃冰箱過(guò)夜。次日取出，棄上清液(留少許)，各管分別涂片，加固定液各1滴，搖勻后靜置至固定液快干時(shí)，加染色液2滴，搖勻，靜置30分鐘左右，先用Hank′s沖洗去染色液，最后用清水沖洗一次，在光學(xué)顯微鏡上計(jì)數(shù)，共數(shù)100-200個(gè)T細(xì)胞，計(jì)算出E玫瑰花結(jié)成的百分?jǐn)?shù)(指結(jié)合4個(gè)以上綿羊紅血球的淋巴細(xì)胞)。
Hank′s液含0.8％氯化鈉、0.1％葡萄糖、0.04％氯化鉀、0.015％磷酸二氫鉀和0.038％磷酸氫二鈉溶液，用4％碳酸鈉溶液調(diào)pH至7.20。
固定液25％戊二醛，3.5％碳酸氫鈉。
染色液取姬姆薩原液2毫升，加Hank′s液6毫升，混勻，離心取上清液。
(4)活性檢定結(jié)果見表1，結(jié)果表明純化的重組胸腺素α1和化學(xué)合成的胸腺素α1有類似的生物活性，比胸腺肽的混合制備物活性要高。
表1玫瑰花結(jié)試驗(yàn)結(jié)果

以上描述的具體實(shí)施方式
旨在闡述本發(fā)明的最佳實(shí)施方式而不是以任何形式限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的啟示，結(jié)合本領(lǐng)域的常識(shí)所做的各種變更，均落在本發(fā)明申請(qǐng)權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
序列表<110>上海普洛藥物研究院有限公司<120>重組胸腺素α1在大腸桿菌中的高分泌表達(dá)和分離純化<130>021252<160>10<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>90<212>DNA<213>人工合成<400>1tctgacgctg ctgttgacac ttcttccgaa atcactacca aagacctgaa agaaaagaaa60gaagttgtag aagaggctga aaactaataa90<210>2<211>84<212>DNA<213>人(human)<400>2tcagacgcag ccgtagacac cagctccgaa atcaccacca aggacttaaa ggagaagaag60gaagttgtgg aagaggcaga aaat 84<210>3<211>57<212>DNA<213>人工合成<400>3tctgacgctg ctgttgacac ttcttccgaa atcactacca aagacctgaa agaaaag 57<210>4<211>55<212>DNA<213>人工合成<400>4cccaagctta ttagttttca gcctcttcta caacttcttt cttttctttc aggtc55<210>5<211>175<212>DNA<213>人工合成<400>5
gctcgtcagt aaaaagttaa tcttttcaac agctgtcata aagttgtcac ggccgagact60tatagtcgct ttgtttttat tttttaatgt atttgtacat ggagaaaata aagtgaaaca120aagcactatt gcactggcac tcttaccgtt actgtttacc cctgtgacaa aagcg 175<210>6<211>60<212>DNA<213>人工合成<400>6aactgcagat ctagagctcg tcagtaaaaa gttaatcttt tcaacagctg tcataaagtt60<210>7<211>60<212>DNA<213>人工合成<400>7ttaaaaaata aaaacaaagc gactataagt ctcggccgtg acaactttat gacagctgtt60<210>8<211>60<212>DNA<213>人工合成<400>8tttgttttta ttttttaatg tatttgtaca tggagaaaat aaagtgaaac aaagcactat60<210>9<211>64<212>DNA<213>人工合成<400>9cgcttttgtc acaggggtaa acagtaacgg taagagtgcc agtgcaatag tgctttgttt60cact 64<210>10<211>28<212>PRT<213>人(human)<400>10Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu Ile Thr Thr Lys Asp Leu1 5 10 15Lys Glu Lys Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asn20 2權(quán)利要求
1.重組胸腺素α1基因，其具有與SEQ ID NO.1至少90％同源性的核苷酸序列。
2.分泌表達(dá)重組胸腺素α1的表達(dá)質(zhì)粒pKAT，其包含權(quán)利要求1所述的重組胸腺素α1基因，及位于所述重組胸腺素α1基因上游的啟動(dòng)表達(dá)和分泌重組胸腺素α1的堿性磷酸酯酶phoA啟動(dòng)子和信號(hào)肽基因。
3.如權(quán)利要求2所述的表達(dá)質(zhì)粒pKAT，其中所述的位于所述重組胸腺素α1基因上游的基因包含可以啟動(dòng)表達(dá)和分泌重組胸腺素α1的所有原核啟動(dòng)子和信號(hào)肽基因。
4.工程菌YKAT，所述工程菌是權(quán)利要求2所述表達(dá)質(zhì)粒pKAT轉(zhuǎn)化入大腸桿菌YK537而得到的具有卡那霉素抗性的所有菌株。
5.工程菌株YKAT-8，所述工程菌株是從權(quán)利要求4所述的工程菌YKAT中篩選出的重組胸腺素α1分泌表達(dá)量最高的菌株。
6.重組胸腺素α1的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)利用大腸桿菌偏愛密碼子按照天然胸腺素α1的氨基酸序列設(shè)計(jì)并合成重組胸腺素α1基因；(2)以pTZ18R為起始質(zhì)粒，以大腸桿菌堿性磷酸酯酶phoA啟動(dòng)子和信號(hào)肽基因作為重組胸腺素α1基因的上游序列，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pKAT；(3)接入卡那霉素抗性基因；(4)構(gòu)建和篩選出基因工程菌株YKAT-8；(5)基因工程菌YKAT-8的發(fā)酵培養(yǎng)；(6)表達(dá)產(chǎn)物的分離純化。
7.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其中所述的分離純化方法是采用超濾、陰離子交換柱層析、凝膠過(guò)濾層析和反相高壓液相色譜的組合方式。
全文摘要
本發(fā)明提供重組胸腺素α1(rTα－1)基因、表達(dá)質(zhì)粒pKAT、含有表達(dá)質(zhì)粒pKAT的工程菌YKAT以及從中篩選出的工程菌株YKAT－8。還提供重組胸腺素α1的制備方法，該方法利用大腸桿菌偏愛密碼子，設(shè)計(jì)并化學(xué)合成重組胸腺素α1基因，以大腸桿菌堿性磷酸酯酶的啟動(dòng)子和信號(hào)肽基因作為啟動(dòng)表達(dá)和分泌重組胸腺素α1的上游序列，構(gòu)建分泌表達(dá)質(zhì)粒pKAT，進(jìn)而構(gòu)建并篩選得到工程菌株YKAT－8，該菌株經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)，直接分泌表達(dá)rTα－1至培養(yǎng)基中，分泌表達(dá)量達(dá)到每升500毫克，經(jīng)分離純化，得到N端非乙酰化的重組胸腺素α1，純度大于95％。該方法步驟簡(jiǎn)單，明顯減少生產(chǎn)費(fèi)用和縮短生產(chǎn)周期，使大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)、大規(guī)模臨床應(yīng)用成為可能。
文檔編號(hào)C12N15/70GK1831126SQ20051002423
公開日2006年9月13日 申請(qǐng)日期2005年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月7日
發(fā)明者甘人寶, 張倩, 馮寶山, 錢悅, 杜鵬, 丁紅珍, 周慶瑋 申請(qǐng)人:上海普洛藥物研究院有限公司