專利名稱：一種檢測轉(zhuǎn)基因棉籽及其加工產(chǎn)品的試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及產(chǎn)品檢測技術(shù)，更具體地，本發(fā)明涉及定性與定量檢測轉(zhuǎn)基因棉籽及其加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分的檢測試劑盒和檢測方法。
背景技術(shù)：
近年來，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因作物迅速商品化，并通過貿(mào)易進(jìn)入國際市場。生物技術(shù)的發(fā)展顯著地提高了農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量，在一定程度上緩解了人口增長、自然資源匱乏、可耕作土地面積減少和不可預(yù)期的自然災(zāi)害帶來的影響等。然而，轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的安全問題引起人們極大的關(guān)注。
世界上許多國家如歐盟、日本、澳大利亞、新加坡等國家，紛紛以立法或其他形式對(duì)轉(zhuǎn)基因生物及其加工產(chǎn)品進(jìn)行嚴(yán)格的管理，例如要求進(jìn)口轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)入本國市場時(shí)，當(dāng)轉(zhuǎn)基因成分含量超過一定限度時(shí)應(yīng)加貼標(biāo)簽，以供消費(fèi)者選購時(shí)參考，歐盟規(guī)定轉(zhuǎn)基因成分高于1％適應(yīng)加貼標(biāo)簽，日本規(guī)定轉(zhuǎn)基因成分高于5％時(shí)應(yīng)加貼標(biāo)簽。
近年來，我國每年都種植大量的轉(zhuǎn)基因棉花，還有進(jìn)口的棉籽中有相當(dāng)數(shù)量的棉籽是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。然而，目前國內(nèi)外尚沒有對(duì)轉(zhuǎn)基因棉籽及其加工產(chǎn)品的定量檢測的報(bào)道。
在轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品檢測技術(shù)中，目前應(yīng)用最為廣泛的是以DNA為基礎(chǔ)的PCR相關(guān)檢測技術(shù)，目標(biāo)基因的擴(kuò)增需要內(nèi)標(biāo)基因來做對(duì)照以避免出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。同時(shí)內(nèi)標(biāo)基因的確立也有助于確定外源基因來源的物種。目前大豆，玉米，大米的內(nèi)標(biāo)基因均已經(jīng)被確定了，但是棉花的內(nèi)標(biāo)基因一直沒有被確定出來。目前還沒有一種檢測轉(zhuǎn)基因棉籽及其加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分含量的檢測方法和檢測試劑盒。
本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)對(duì)轉(zhuǎn)基因棉籽及其加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行定性與定量檢測的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高效、準(zhǔn)確、簡便的檢測轉(zhuǎn)基因棉籽或其產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分的試劑盒及其定性、定量檢測方法。
本發(fā)明提供了一種用于檢測轉(zhuǎn)基因棉籽及其加工產(chǎn)品的試劑盒，其特征在于它含有(1)擴(kuò)增SAD1基因的特異性引物對(duì)；(2)與SAD1基因擴(kuò)增產(chǎn)物特異性結(jié)合的探針；(3)擴(kuò)增外源基因的特異性引物對(duì)；(4)與外源基因擴(kuò)增產(chǎn)物特異性結(jié)合的探針；(5)標(biāo)準(zhǔn)參照樣品。
本發(fā)明所述試劑盒中擴(kuò)增SAD1基因的特異性引物對(duì)為上游引物 5’CCA CGA GAC AGC CTA TAC CAAAA 3’下游引物 5’CTT CTT CAT CAT GTC AGC AAA TGC 3’。
本發(fā)明所述試劑盒中與SAD1基因擴(kuò)增產(chǎn)物特異性結(jié)合的探針為5’CGT TGA AAA GCT GTT TGA GAT TGA TCC TGA TG 3’。
本發(fā)明所述試劑盒中外源基因沒有特別限制，可以是任何外源基因，可選自GOX基因、CP4-EPSPS基因、FMV35S基因、CRY1AC基因中的一種或多種。
本發(fā)明所述外源基因?yàn)镃P4-EPSPS基因時(shí)，其特異性引物對(duì)為上游引物5’CTG CTT TCC CAT TGG TTG CT 3’下游引物5’ACC AGT ACG GGT TGG GTT CA 3’；相應(yīng)的，與CP4-EPSPS基因特異性結(jié)合的探針為5’TTC CAG GTT CCGACG TCACCATCC 3’。
本發(fā)明所述試劑盒中探針是用標(biāo)記物標(biāo)記的探針，其與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交時(shí)能夠產(chǎn)生可檢測信號(hào)；用于本發(fā)明的可檢測信號(hào)沒有限制，可以是任何核酸檢測領(lǐng)域中常用的檢測信號(hào)，可檢測信號(hào)的種類取決于探針上所用的標(biāo)記物，所述探針標(biāo)記物可以選自生物素-親和素、地高辛、放射性同位素、熒光標(biāo)記中的一種或多種；優(yōu)選地，所述探針是Taqman型熒光探針。
本發(fā)明所述試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)參照樣品是一組轉(zhuǎn)基因棉籽DNA與非轉(zhuǎn)基因棉籽DNA按梯度比例混合的混合物；優(yōu)選地，各混合物中轉(zhuǎn)基因棉籽DNA的含量分別為0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、5％。
本發(fā)明試劑盒中還可以含有10×PCR反應(yīng)緩沖液、10×25mM MgCl2、10mM dNTP、1U/μl UNG酶、5U/μl Taq DNA聚合酶、滅菌超純水等組分。
本發(fā)明提供了一種定性檢測轉(zhuǎn)基因棉籽及其加工產(chǎn)品的方法，它包括以下步驟(1)提取棉籽或其加工產(chǎn)品的DNA作為模版；(2)用本發(fā)明所述試劑盒進(jìn)行檢測，將模版DNA分別加入擴(kuò)增SAD1基因和外源基因各自的反應(yīng)體系，在PCR擴(kuò)增儀上孵育，分別擴(kuò)增SAD1基因和外源基因；其中擴(kuò)增SAD1基因和外源基因的定性PCR反應(yīng)體系各組分體積配比均為10×PCR反應(yīng)緩沖液5體積份、10×25mM MgCl25體積份、10mM dNTP 5體積份、Taq DNA聚合酶0.4體積份、5μM上游引物1體積份、5μM下游引物1體積份、滅菌超純水30.6體積份、加入的模版DNA2體積份；定性PCR循環(huán)參數(shù)為95℃預(yù)變性3min；94℃變性20s；54℃退火40s；72℃延伸40s，循環(huán)40次；最后在72℃延伸10min；(3)將定性PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測；(4)將PCR產(chǎn)物回收純化、測序。
本發(fā)明還提供了一種定量檢測轉(zhuǎn)基因棉籽及其加工產(chǎn)品的方法，它包括以下步驟(1)提取棉籽或其加工產(chǎn)品的DNA作為模版；(2)用本發(fā)明所述試劑盒進(jìn)行檢測，將模版DNA分別加入擴(kuò)增SAD1基因和外源基因各自的定量反應(yīng)體系，在定量PCR擴(kuò)增儀上孵育，分別擴(kuò)增SAD1基因和外源基因；其中擴(kuò)增SAD1基因和外源基因的定量反應(yīng)體系各組分體積配比均為10×PCR反應(yīng)緩沖液5體積份、10×25mM MgCl210體積份、10mM dATP 1體積份、1mM dGTP 1體積份、1mM dUTP 1體積份、1mM dCTP 1體積份、1U/μl UNG酶0.5體積份、5U/μl Taq DNA聚合酶0.5體積份、5μM上游引物4體積份、5μM下游引物4體積份、20μM探針1體積份、滅菌超純水19體積份、加入的模版DNA 2體積份；定量PCR循環(huán)參數(shù)為50℃10min；95℃10min；95℃15s；60℃1min，循環(huán)50次。
(3)分別將擴(kuò)增產(chǎn)物與各自探針雜交，檢測雜交所產(chǎn)生的可測信號(hào)，獲取數(shù)據(jù)；(4)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線將標(biāo)準(zhǔn)參照物作為模板，按步驟(2)進(jìn)行擴(kuò)增；按步驟(3)進(jìn)行測定，獲取數(shù)據(jù)，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線；(5)將步驟(3)測定的數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，定量檢測棉籽或其加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分。
本發(fā)明中SAD1基因是硬脂酸脫氫酶基因，它是棉花的內(nèi)源標(biāo)記基因。在進(jìn)行PCR定量檢測時(shí)，需要檢測該作物本身固有的內(nèi)源特異標(biāo)記基因，來測定樣品中轉(zhuǎn)基因作物和非轉(zhuǎn)基因作物的模板總量，這是進(jìn)行定量檢測的基礎(chǔ)。例如，用于轉(zhuǎn)基因大豆檢測的內(nèi)源特異標(biāo)記基因可選用Lectin基因；用于轉(zhuǎn)基因玉米檢測的內(nèi)源特異標(biāo)記基因可選用Zein基因或IVR基因。本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入地研究，通過序列特異性分析，PCR檢測分析和southern blot的方法，確定了SAD1基因是優(yōu)選的棉花的內(nèi)源參照基因，在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
本文所用，術(shù)語“SAD1特異性引物”指能特異性地?cái)U(kuò)增硬脂酸脫氫酶基因或其片段的引物。
本文所用，術(shù)語“外源基因特異性引物”指能特異性地?cái)U(kuò)增出轉(zhuǎn)入植物的外源基因或其片段的引物。應(yīng)理解，外源基因特異性引物隨外源基因的不同而變化，相應(yīng)的與外源基因擴(kuò)增產(chǎn)物特異性結(jié)合的探針也隨外源基因的不同而變化；例如，當(dāng)外源基因是CP4-EPSPS基因時(shí)，選用的外源基因特異性引物就是CP4-EPSPS基因特異性引物，即能特異性地?cái)U(kuò)增CP4-EPSPS基因或其片段的引物；相應(yīng)的與外源基因擴(kuò)增產(chǎn)物特異性結(jié)合的探針也就是CP4-EPSPS基因或其片段的探針。本發(fā)明所述試劑盒中外源基因沒有特別限制，可以是任何外源基因，可以是一種或多種GOX基因、CP4-EPSPS基因、FMV35S基因、CRY1AC基因等。
本發(fā)明所述試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)參照樣品是一組轉(zhuǎn)基因棉籽DNA與非轉(zhuǎn)基因棉籽DNA按梯度比例混合的混合物；它們分別含有一定比例的轉(zhuǎn)基因棉籽DNA和非轉(zhuǎn)基因棉籽的DNA；優(yōu)選地，標(biāo)準(zhǔn)參照物是將分離的轉(zhuǎn)基因棉籽DNA和非轉(zhuǎn)基因棉籽的DNA均稀釋到30ng/ul，按體積比例將兩種DNA混合，配成轉(zhuǎn)基因棉籽DNA含量分別占5％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％的DNA溶液，作為定量檢測的DNA參照樣品。參照樣品中轉(zhuǎn)基因棉籽DNA隨外源基因的改變相應(yīng)地改變。
可用于本發(fā)明的DNA提取技術(shù)沒有特別限制，可以是本領(lǐng)域常用的各種提取技術(shù)。一種優(yōu)選的方法是磁珠提取法，例如用Promega公司生產(chǎn)的磁珠法DNA提取試劑盒提取棉籽中的DNA。
本發(fā)明定量檢測的原理通過檢測棉籽內(nèi)源參照基因SAD1基因測定樣品中棉花DNA的總模板量，通過檢測外源基因，測定樣品中轉(zhuǎn)基因DNA的模板量，然后以轉(zhuǎn)基因DNA的模板量除以棉花總DNA的模板量，從而計(jì)算出樣品中轉(zhuǎn)基因棉花含量的百分比。外源基因和內(nèi)源基因SAD1基因的檢測分別同時(shí)在兩個(gè)反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件均相同。通過標(biāo)準(zhǔn)參照物繪制出ΔCt值(Ct外源基因-CtSAD1基因)與轉(zhuǎn)基因成分含量百分比的標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線的比對(duì)，就可定量確定同一或相同條件下測定的未知棉花籽及其加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分。
本發(fā)明反應(yīng)體系中模板量的測定是通過PCR擴(kuò)增，與特異性探針結(jié)合，并根據(jù)結(jié)合所發(fā)出的可檢測信號(hào)進(jìn)行檢測?？捎糜诒景l(fā)明的可檢測信號(hào)沒有限制，可以是任何核酸檢測領(lǐng)域中常用的檢測信號(hào)?？蓹z測信號(hào)的種類取決于探針上所用的標(biāo)記物，其中可以是生物素-親和素、地高辛、放射性同位素、熒光標(biāo)記等。優(yōu)選的探針是Taqman型探針。
結(jié)果表明，本發(fā)明試劑盒及其檢測方法可以滿足轉(zhuǎn)基因棉籽的定量檢測需求，有利于對(duì)轉(zhuǎn)基因棉籽及其加工產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)識(shí)。此外，采用本發(fā)明的統(tǒng)一的參照樣品有利于消除不同的實(shí)驗(yàn)室間的測試差異。
應(yīng)用本發(fā)明試劑盒可以使檢測研究機(jī)構(gòu)準(zhǔn)確快速地對(duì)抽檢樣品進(jìn)行標(biāo)識(shí)，有效地貫徹落實(shí)我國關(guān)于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的法律法規(guī)，有效地保護(hù)了消費(fèi)者的知情權(quán)，同時(shí)建立起我國自己的轉(zhuǎn)基因棉籽及其加工產(chǎn)品檢測技術(shù)體系，準(zhǔn)確鑒定和防止國外未經(jīng)標(biāo)簽和安全性評(píng)價(jià)的轉(zhuǎn)基因棉籽及其加工產(chǎn)品進(jìn)入我國，對(duì)我國生態(tài)環(huán)境和人民健康造成不利影響；同時(shí)也為我國加入WTO后利用技術(shù)性貿(mào)易壁壘的合法性保護(hù)本國農(nóng)產(chǎn)品市場及出口提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。


圖1SAD1基因引物和探針對(duì)參照樣品(5％、2％、1％、0.5％、、0.1％、0.05％、0.01％轉(zhuǎn)基因抗草甘膦棉籽DNA樣品)進(jìn)行定量PCR測試的線性圖。
圖2轉(zhuǎn)基因抗草甘膦棉籽的定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖3CP4-EPSPS基因引物和探針對(duì)參照樣品(5％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％轉(zhuǎn)基因抗草甘膦棉籽DNA樣品)進(jìn)行定量PCR測試的線性圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
1.材料和儀器1.1植物材料轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因抗草甘膦棉籽標(biāo)樣由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，為抗草甘膦除草劑的轉(zhuǎn)基因棉花，種籽純度為100％。陰性非轉(zhuǎn)基因棉籽以及棉粕由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。
1.2試劑1.2.1DNA提取的有關(guān)試劑1)電泳專用瓊脂糖。
2)TAE(50×)242g Tris-堿，57.1ml冰醋酸，100ml 0.5mol/lEDTA(pH8.0)，溶于水中，定容至1L。
3)液氮。
4)70％乙醇。
5)TE(pH8.0)量取10ml 1mol/L Tris.HCl(pH8.0)和2ml0.5mol/L EDTA(pH8.0)。加水定容至1000ml。分裝后高壓滅菌備用。
6)溴化乙錠10mg/ml。
7)100-2000bp ladder DNA Marker科昊達(dá)生物公司產(chǎn)品。
8)6×Loading BufferPromega公司產(chǎn)品。
9)總DNA回收試劑盒上海生工生物技術(shù)公司產(chǎn)品。
10)Promega磁珠法DNA提取試劑盒。
1.2.2 PCR反應(yīng)的有關(guān)試劑1)10×Buffer(PCR反應(yīng)緩沖液)(5μl)500mmol/l KCl，100mmol/l Tris.HCl pH 8.3室溫，15mmol/l MgCl2Promega公司產(chǎn)品。
2)10×Mg2+(25mM)Promega公司產(chǎn)品；3)10×dNTP(2mM)Promega公司產(chǎn)品；4)引物上海生工生物工程公司合成，先配成100μM-20℃儲(chǔ)存，稀釋為終濃度5μM供使用；5)探針上海生工生物工程公司合成，稀釋成20μM供使用；6)Taq DNA聚合酶，5unit/μlPromega公司產(chǎn)品；7)UNG酶(1U/μl)(Applied Biosystems公司產(chǎn)品)8)超純水(dd H2O)Easy Pure純水儀制得。
9)TaqManTM PCR試劑盒貨號(hào)N808-0228美國AppliedBiosystems生產(chǎn)。
1.3儀器設(shè)備1)PCR擴(kuò)增儀美國MJ RESEARCH Minicycler PTC-150型；2)定量PCR擴(kuò)增儀美國生物技術(shù)公司ABI Prism SequenceDetector 7000型；3)電泳儀美國Continental Lab Products75.2314型；4)凝膠成像系統(tǒng)美國BIO-RAD Gel DOC-2000型；5)離心機(jī)德國Eppendorf5415D型；6)微量加樣器德國Eppendorf產(chǎn)品 有2.5、10、20、100、200、1000μl等規(guī)格；7)天平德國Sartorius；
8)高壓滅菌鍋日本Tomy SS-325型。
9)DNA冷凍濃縮儀美國CentriVap Console Labconco產(chǎn)品。
2.試驗(yàn)方法2.1棉籽粕總DNA的提取使用CTAB法提取DNA，具體操作程序如下。
稱取100mg樣品，轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管；加入700μl CTAB提取緩沖液；65℃溫浴30分鐘，期間不時(shí)顛倒混勻；13000g，離心10分鐘；轉(zhuǎn)移上清至1.5ml離心管；加入2/3體積異丙醇，顛倒混勻10-15次，室溫30分鐘；12000g，離心10分鐘；取沉淀用350μl TE溶解；用等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)抽提兩遍；兩倍無水乙醇沉淀2小時(shí)；12000g，離心10分鐘；用70％的乙醇洗滌沉淀；用冷凍濃縮儀抽干液體；加入100μl雙蒸水，震蕩混勻，65℃溫浴10min。將離心管在離心管架上保留1min，小心將液體轉(zhuǎn)移至另一新管中；取1μl做PCR。
2.2PCR測試2.2.1引物設(shè)計(jì)本試驗(yàn)所用的引物序列及擴(kuò)增片斷長度見表1表1本試驗(yàn)所用的引物、探針序列及擴(kuò)增片斷長度

2.2.2PCR反應(yīng)體系定量PCR測試的反應(yīng)體系見表2；定性PCR測試的反應(yīng)體系見表3。
表2定量PCR測試的反應(yīng)體系

表3定性PCR測試的反應(yīng)體系

2.2.3PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)定量PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)50℃10min；95℃10min；95℃15s；60℃1min，循環(huán)50次。
定性PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)95℃預(yù)變性3min；94℃變性20s；54℃退火40s；72℃延伸40s，循環(huán)40次；最后在72℃延伸10min；2.3定性PCR產(chǎn)物的凝膠電泳檢測1)配制瓊脂糖凝膠將50×TAE稀釋成1×TAE溶液，用1×TAE配制瓊脂糖(濃度為2％)，凝膠用微波爐蒸煮融化，待降溫至60℃，加入溴化乙錠至終濃度為5‰，倒入電泳槽凝膠板中凝固；
2)點(diǎn)樣取20μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加2μl上樣緩沖液點(diǎn)樣進(jìn)行電泳，并加入DNA分子標(biāo)記同時(shí)電泳，以判斷PCR產(chǎn)物片斷的大小。
3)電泳條件電壓根據(jù)電泳槽的長度而定3-5V/cm，電泳時(shí)間根據(jù)溴酚藍(lán)的移動(dòng)位置來確定。
4)結(jié)果電泳檢測結(jié)果用凝膠分析成像系統(tǒng)或紫外檢測儀記錄。
2.4PCR產(chǎn)物的測序PCR產(chǎn)物用上海生工生物技術(shù)公司PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒回收純化，PCR產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)公司測序。
實(shí)施例1、轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因抗草甘膦棉籽標(biāo)準(zhǔn)參照樣品的制備本發(fā)明將純的轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因抗草甘膦棉籽和非轉(zhuǎn)基因棉籽分別用CTAB法提取DNA，并均稀釋到50ng/ul，按體積比例將兩種DNA混合，配成轉(zhuǎn)基因抗草甘膦棉籽DNA含量分別占5％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％的DNA溶液，作為定量檢測的參照樣品。
實(shí)施例2、檢測轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因棉籽及其加工產(chǎn)品的試劑盒試劑盒含有(1)擴(kuò)增SAD1基因的特異性引物對(duì)上游引物 5’CCA CGA GAC AGC CTA TAC CAA AA 3’下游引物 5’CTT CTT CAT CAT GTC AGC AAA TGC 3’100uM各100μl；(2)與SAD1基因擴(kuò)增產(chǎn)物特異性結(jié)合的探針100ng5’CGT TGA AAA GCT GTT TGA GAT TGA TCC TGA TG 3’；(3)擴(kuò)增CP4-EPSPS基因的特異性引物對(duì)；上游引物5’CTG CTT TCC CAT TGG TTG CT 3’下游引物5’ACC AGT ACG GGT TGG GTT CA 3’
100uM各100μl；(4)與CP4-EPSPS基因擴(kuò)增產(chǎn)物特異性結(jié)合的探針100ng5’TTC CAG GTT CCGACG TCA CCATCC 3’；(5)標(biāo)準(zhǔn)參照樣品由實(shí)施例1制備的轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因抗草甘膦棉籽標(biāo)準(zhǔn)參照樣品，DNA濃度為30ng/μl，各200μl。
其中(2)、(4)的探針是Taqman型熒光探針，5’端均采用熒光激發(fā)染料FAM標(biāo)記，3’端均采用熒光淬滅染料TAMRA標(biāo)記。
試劑盒中還可以含有10×PCR反應(yīng)緩沖液、10×25mM MgCl2、10mM dNTP、1U/μl UNG酶、5U/μl Taq DNA聚合酶、滅菌超純水等組分。
實(shí)施例3、用實(shí)施例2的試劑盒進(jìn)行定性檢測步驟如下(1)用Promega公司生產(chǎn)的磁珠法DNA提取試劑盒提取待測棉籽中的DNA作為模版；(2)實(shí)施例2試劑盒進(jìn)行檢測，將模版DNA分別加入擴(kuò)增SAD1基因和CP4-EPSPS基因各自的反應(yīng)體系，在PCR擴(kuò)增儀上孵育，分別擴(kuò)增SAD1基因和CP4-EPSPS基因；擴(kuò)增SAD1基因和CP4-EPSPS基因的定性PCR反應(yīng)體系(25μ1反應(yīng)體系)，其中組分均為10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5μl、10×25mMMgCl22.5μl、10mM dNTP 2.5μl、Taq DNA聚合酶0.2μl、5μM上游引物0.5μl、5μM下游引物0.5μl、滅菌超純水15.3μl、加入的模版DNA 1μl(約30ng DNA)。
定性PCR循環(huán)參數(shù)為95℃預(yù)變性3min；94℃變性20s；54℃退火40s；72℃延伸40s，循環(huán)40次；最后在72℃延伸10min；
(3)將定性PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測；結(jié)果用凝膠分析成像系統(tǒng)或紫外檢測儀記錄；結(jié)果PCR產(chǎn)物片斷SAD1基因擴(kuò)增長度為91bp；CP4-EPSPS基因擴(kuò)增長度為85bp；符合定量PCR檢測的引物設(shè)計(jì)要求。
(4)PCR產(chǎn)物用上海生工生物技術(shù)公司PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒回收純化，PCR產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)公司測序。
實(shí)施例4、用實(shí)施例2的試劑盒進(jìn)行定量檢測步驟如下(1)用Promega公司生產(chǎn)的磁珠法DNA提取試劑盒提取待測棉籽中的DNA作為模版；(2)用實(shí)施例2試劑盒進(jìn)行檢測，將模版DNA分別加入擴(kuò)增SAD1基因和CP4-EPSPS基因各自的定量反應(yīng)體系，在定量PCR擴(kuò)增儀上孵育，分別擴(kuò)增SAD1基因和CP4-EPSPS基因；擴(kuò)增SAD1基因和CP4-EPSPS基因的定量反應(yīng)體系(50μl反應(yīng)體系)，其中組分均為10×PCR反應(yīng)緩沖液5μl、10×25mM MgCl210μl、10mM dATP 1μl、1mM dGTP 1μl、1mM dUTP 1μl、1mM dCTP 1μl、1U/μl UNG酶0.5μl、5U/μl Taq DNA聚合酶0.5μl、5μM上游引物4μl、5μM下游引物4μl、20μM探針1μl、滅菌超純水19μl、加入的模版DNA 2μl(約30ng DNA)；定量PCR循環(huán)參數(shù)為50℃10min；95℃10min；95℃15s；60℃1min，循環(huán)50次。
(3)分別將擴(kuò)增產(chǎn)物與各自探針雜交，檢測雜交所產(chǎn)生的熒光信號(hào)，獲取數(shù)據(jù)，結(jié)果見附圖1、3；(4)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線將標(biāo)準(zhǔn)參照物作為模板，按步驟(2)進(jìn)行擴(kuò)增；按步驟(3)進(jìn)行測定，獲取數(shù)據(jù)，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線，見附圖2；用CP4-EPSPS基因的引物和探針對(duì)參照樣品進(jìn)行定量PCR測試的圖譜如圖3所示；用SAD1基因的引物和探針對(duì)參照樣品進(jìn)行定量PCR測試的圖譜如圖1所示；通過對(duì)上述CP4-EPSPS基因和SAD1基因的引物和探針進(jìn)行定量PCR反應(yīng)所得的ΔCt值經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，可以得出得到轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因抗草甘膦棉籽定量監(jiān)測的標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖2)和線性方程Y＝-3.1241X+28.479；R2＝0.9987。
(5)將步驟(3)測定的數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，定量檢測棉籽或其加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分。

在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測轉(zhuǎn)基因棉籽及其加工產(chǎn)品的試劑盒，其特征在于它含有(1)擴(kuò)增SAD1基因的特異性引物對(duì)；(2)與SAD1基因擴(kuò)增產(chǎn)物特異性結(jié)合的探針；(3)擴(kuò)增外源基因的特異性引物對(duì)；(4)與外源基因擴(kuò)增產(chǎn)物特異性結(jié)合的探針；(5)標(biāo)準(zhǔn)參照樣品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中擴(kuò)增SAD1基因的特異性引物對(duì)為上游引物5’CCA CGA GAC AGC CTA TAC CAA AA 3’下游引物5’CTT CTT CAT CAT GTC AGC AAA TGC 3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其中與SAD1基因擴(kuò)增產(chǎn)物特異性結(jié)合的探針為5’CGT TGA AAA GCT GTT TGA GAT TGA TCC TGA TG 3’。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中外源基因選自GOX基因、CP4-EPSPS基因、FMV35S基因、CRY1AC基因中的一種或多種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的試劑盒，其中外源基因?yàn)镃P4-EPSPS基因時(shí)，其特異性引物對(duì)為上游引物5’CTG CTT TCC CAT TGG TTG CT 3’下游引物5’ACC AGT ACG GGT TGG GTT CA 3’，相應(yīng)的，與CP4-EPSPS基因擴(kuò)增產(chǎn)物特異性結(jié)合的探針為5’TTC CAG GTT CCG ACG TCA CCA TCC 3’。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中探針是用標(biāo)記物標(biāo)記的探針，當(dāng)其與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交時(shí)能夠產(chǎn)生可檢測信號(hào)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其中探針標(biāo)記物選自生物素-親和素、地高辛、放射性同位素、熒光標(biāo)記中的一種或多種。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其中探針是Taqman型熒光探針。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中標(biāo)準(zhǔn)參照樣品是一組轉(zhuǎn)基因棉籽DNA與非轉(zhuǎn)基因棉籽DNA按梯度比例混合的混合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其中標(biāo)準(zhǔn)參照樣品是一組轉(zhuǎn)基因棉籽DNA與非轉(zhuǎn)基因棉籽DNA的混合物，各混合物中轉(zhuǎn)基因棉籽DNA的含量分別為0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、5％。
11.一種定性檢測轉(zhuǎn)基因棉籽及其加工產(chǎn)品的方法，它包括以下步驟(1)提取棉籽或其加工產(chǎn)品的DNA作為模版；(2)用任一權(quán)利要求1-10所述的之任一試劑盒進(jìn)行檢測，將模版DNA分別加入擴(kuò)增SAD1基因和外源基因各自的反應(yīng)體系，在PCR擴(kuò)增儀上孵育，分別擴(kuò)增SAD1基因和外源基因；其中擴(kuò)增SAD1基因和外源基因的定性PCR反應(yīng)體系各組分體積配比均為10×PCR反應(yīng)緩沖液5體積份、10×25mM MgCl25體積份、10mM dNTP 5體積份、Taq DNA聚合酶0.4體積份、5μM上游引物1體積份、5μM下游引物1體積份、滅菌超純水30.6體積份、加入的模版DNA 2體積份；定性PCR循環(huán)參數(shù)為95℃預(yù)變性4min；94℃變性20s；59℃退火30s；72℃延伸30s，循環(huán)40次；最后在72℃延伸10min；(3)將定性PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測；(4)將PCR產(chǎn)物回收純化、測序。
12.一種定量檢測轉(zhuǎn)基因棉籽及其加工產(chǎn)品的方法，它包括以下步驟(1)提取棉籽或其加工產(chǎn)品的DNA作為模版；(2)用任一權(quán)利要求1-10所述的之任一試劑盒進(jìn)行檢測，將模版DNA分別加入擴(kuò)增SAD1基因和外源基因各自的定量反應(yīng)體系，在定量PCR擴(kuò)增儀上孵育，分別擴(kuò)增SAD1基因和外源基因；其中擴(kuò)增SAD1基因和外源基因的定量反應(yīng)體系各組分體積配比均為10×PCR反應(yīng)緩沖液5體積份、10×25mM MgCl210體積份、10mM dATP 1體積份、1mM dGTP 1體積份、1mM dUTP 1體積份、1mM dCTP 1體積份、1U/μl UNG酶0.5體積份、5U/μl Taq DNA聚合酶0.5體積份、5μM上游引物4體積份、5μM下游引物4體積份、20μM探針1體積份、滅菌超純水19體積份、加入的模版DNA 2體積份；定量PCR循環(huán)參數(shù)為50℃10min；95℃10min；95℃15s；60℃1min，循環(huán)50次；(3)分別將擴(kuò)增產(chǎn)物與各自探針雜交，檢測雜交所產(chǎn)生的可測信號(hào)，獲取數(shù)據(jù)；(4)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線將標(biāo)準(zhǔn)參照物作為模板，按步驟(2)進(jìn)行擴(kuò)增；按步驟(3)進(jìn)行測定，獲取數(shù)據(jù)，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線；(5)將步驟(3)測定的數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，定量檢測棉籽或其加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于檢測轉(zhuǎn)基因棉籽及其加工產(chǎn)品的試劑盒及其定性、定量檢測方法，其定量方法包括提取待測樣品的DNA作為模板，用SAD1特異性引物對(duì)和外源基因特異性引物對(duì)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增；將各擴(kuò)增產(chǎn)物分別與探針雜交，并測定雜交所產(chǎn)生的可檢測信號(hào)；分析測定數(shù)據(jù)，從而定量地檢測出棉籽或其加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分含量。本發(fā)明可準(zhǔn)確、簡便地定量檢測棉籽及其加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1696309SQ200510011730
公開日2005年11月16日 申請(qǐng)日期2005年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月17日
發(fā)明者許文濤, 黃昆侖, 羅云波 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)