專利名稱：黃病毒復制子包裝系統(tǒng)的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及黃病毒起源的病毒樣顆粒的生產(chǎn)。更特別地，本發(fā)明涉及一種誘導型黃病毒包裝系統(tǒng)，其促進黃病毒RNA包裝必需的黃病毒結構蛋白在動物細胞中的誘導型表達。特別地，本發(fā)明提供了一種與Kunjin或其它黃病毒表達系統(tǒng)相容的四環(huán)素誘導型包裝系統(tǒng)，其產(chǎn)生出乎意料的高效價病毒樣顆粒。所述包裝系統(tǒng)的一特殊應用是產(chǎn)生病毒樣顆粒，該病毒樣顆粒包裝包含黃病毒復制子并編碼異源蛋白或肽的RNA以在動物細胞中表達。
背景技術：
正鏈RNA病毒的基于復制子的載體已經(jīng)被開發(fā)用于抗病毒和抗癌疫苗(參見Khromykh，2000.Curr Opin Mol Ther.2555-569)。一些特征使得這些載體成為開發(fā)高效并安全的疫苗的一種合適的選擇。這些特征包括(i)由于復制子RNA擴增自身的能力使得編碼的異源基因(HG)高水平表達，(ii)只在胞質復制消除了與核剪接和/或染色體整合相關的任何可能的并發(fā)癥，(iii)復制子RNA不能從轉染的(或感染的)細胞中逃脫，因此限制了疫苗載體在免疫的對象中的傳播，使得這些載體是生物學安全的，(iv)相對小的基因組大小(7-9kb)使得易于操作其cDNA及產(chǎn)生重組體。
對于代表性的大多數(shù)正鏈RNA病毒科已經(jīng)開發(fā)了基于復制子的表達載體，所述病毒科包括α病毒、小核糖核酸病毒和黃病毒(參見Khromykh，2000，文獻如前)。
一般地，已經(jīng)示出VLP輸送在誘導哺乳動物體內(nèi)保護性免疫應答方面最有效。
特別地，已經(jīng)示出利用Kunjin(KUN)黃病毒VLP的表達系統(tǒng)誘導對病毒蛋白的保護性免疫應答，如國際申請PCT/AU02/01598所述。
然而，將KUN復制子RNA包裝成VLP相對精細及耗時，并且需要兩個連續(xù)的轉染，首先用KUN復制子RNA轉染，在24-36小時后用SFV復制子(表達KUN結構基因的RNA)轉染(Khromykh，etal.，1998.J Virol.72 5967-5977)。另外，使用這種系統(tǒng)產(chǎn)生的VLP的最大效價僅為大約2-5×106感染性VLP/ml(Khromykh etal.，1998，文獻如前；Varnavski & Khromykh，1999，Virology.255 366-375)，這樣使得難以大規(guī)模生產(chǎn)VLP。
黃病毒結構蛋白看起來是導致病毒致細胞病變性和病毒誘導的凋亡的主要原因之一(Nunes Duarte dos Santos etal.，2000.Virology 274292-308)。黃病毒復制子與全長RNA(1，2，4，9-11，13，14)相比較低致細胞病變性也表明了結構蛋白對病毒致細胞病變的主要作用。盡管已經(jīng)產(chǎn)生了表達來自DEN2和JE病毒的的prM和E盒的穩(wěn)定細胞系，但是當使用天然的prM-E基因時表達水平較低(Hunt etal.，2001，J.Virol.Methods.97133-149)。建立表達相對高量prM-E顆粒的穩(wěn)定細胞系需要prM蛋白中弗林蛋白酶切割位點的失活以產(chǎn)生低融合活性的不成熟的prM-E顆粒(Konishi et al.，J Virol.752204-2212)或者需要抗凋亡bcl-2基因的共表達(Konishi & Fujii，2002，Vaccine.201058-1067)。這些穩(wěn)定的細胞系無一同時表達所有三種黃病毒結構蛋白。
本發(fā)明人先前嘗試產(chǎn)生同時表達在各自獨立啟動子控制下的所有三種KUN結構基因的穩(wěn)定細胞系(獨立表達C和prM-E)，但表達顯著不穩(wěn)定，在幾次細胞傳代之后僅產(chǎn)生10-20％陽性表達。使用這些細胞系產(chǎn)生KUN復制子VLP的嘗試導致非常低的VLP效價。
發(fā)明目的本發(fā)明的一個目的是提供一種黃病毒包裝系統(tǒng)，其實現(xiàn)與現(xiàn)有技術中的包裝系統(tǒng)相比更有效和/或更高的VLP產(chǎn)量。
發(fā)明概述本發(fā)明廣義上涉及一種調控型黃病毒包裝系統(tǒng)、包裝構建體和/或包含其的包裝細胞。
盡管國際申請WO 99/28487簡要地提及了穩(wěn)定及可誘導地表達黃病毒結構蛋白的細胞系的建立對于VLP的生產(chǎn)是一種有益的方案，但是本發(fā)明人令人驚奇地發(fā)現(xiàn)C和prM-E的誘導型表達自身不足以實現(xiàn)VLP包裝的高產(chǎn)量及高效率。
在調控型黃病毒包裝系統(tǒng)的建立和實踐中，本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)結構蛋白C、prM和E必須表達為單一的前體翻譯產(chǎn)物而不是表達為獨立的C和prM-E蛋白才能產(chǎn)生本領域期望的更高量的VLP。
本發(fā)明的一個特殊優(yōu)點是VLP效價是使用現(xiàn)有技術包裝系統(tǒng)典型獲得的效價的至少500倍。
本發(fā)明的另一個特殊優(yōu)點是調控型黃病毒包裝系統(tǒng)可用于包裝衍生自任何各種黃病毒亞群的復制子。
第一方面，本發(fā)明提供了一種包裝構建體以在動物細胞中可調節(jié)地表達黃病毒結構蛋白，所述載體包含與編碼一種黃病毒結構蛋白翻譯產(chǎn)物的核苷酸序列可操縱地連接的調控型啟動子，所述黃病毒結構蛋白翻譯產(chǎn)物包含C蛋白、prM蛋白和E蛋白。
第二方面，本發(fā)明提供了一種包裝細胞，其包含第一方面所述的包裝構建體。
第三方面，本發(fā)明提供了一種黃病毒表達系統(tǒng)，其包含(i)用于在動物細胞中可調節(jié)表達黃病毒結構蛋白的包裝構建體，所述載體包含與編碼黃病毒結構蛋白的核苷酸序列可操縱地連接的調節(jié)型啟動子；(ii)一種黃病毒表達構建體，其包含(a)一種黃病毒復制子；(b)一種異源核酸；及(c)與所述復制子可操縱地連接的啟動子。
優(yōu)選地，根據(jù)前述方面所述調控型啟動子是四環(huán)素誘導型啟動子。
第四方面，本發(fā)明提供了一種包裝細胞，其包含本發(fā)明的黃病毒表達系統(tǒng)。
第五方面，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生黃病毒VLP的方法，包括如下步驟(i)將第一方面所述的包裝構建體導入宿主細胞中，從而產(chǎn)生包裝細胞；(ii)將所述包裝細胞導入一種黃病毒表達構建體中，所述黃病毒表達構建體包含(a)一種黃病毒復制子；(b)一種異源核酸；及(c)與所述復制子可操縱地連接的啟動子；以及(iii)誘導所述包裝細胞產(chǎn)生一或多種VLP。
第六方面，本發(fā)明提供了根據(jù)第五方面的方法生產(chǎn)的黃病毒VLP。
第七方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包含第六方面的VLP及一種藥物可接受的載體稀釋劑或賦形劑。
第八方面，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)重組蛋白的方法，包括用第六方面的VLP感染宿主細胞的步驟，從而編碼所述蛋白質的異源核酸在所述宿主細胞中表達。
適當?shù)?，所表達的蛋白質隨后被純化。
第九方面，本發(fā)明提供了一種免疫動物的方法，包括給予動物第七方面所述的藥物組合物的步驟，從而在動物體內(nèi)誘導免疫應答。
優(yōu)選地，所述動物是哺乳動物。
更優(yōu)選地，所述哺乳動物是人。
優(yōu)選地，根據(jù)前述方面所述C、prM和E結構蛋白源于Kunjin病毒(KUN)。
優(yōu)選地，根據(jù)前述方面所述黃病毒復制子源于Kunjin病毒、西尼羅病毒或登革病毒。
在特殊的實施方案中，所述黃病毒復制子編碼一或多種突變的非結構蛋白。
在本說明書中，除非特別說明，術語“包含”是指包含在內(nèi)而不是除外，由此一指定整數(shù)或整數(shù)組可包括一或多個其它未指出的整數(shù)或整數(shù)組。
附圖簡述

圖1穩(wěn)定的包裝細胞系tetKUNCprME的產(chǎn)生和鑒定。(A)用于產(chǎn)生穩(wěn)定的包裝細胞系tetKUNCprME的質粒構建體的示意圖。使用pEF-tTA-IRESpuro質粒產(chǎn)生第一種穩(wěn)定的BHK細胞系BHK-Tet-Off，其從人延伸因子1α啟動子(pEF-1a)連續(xù)表達四環(huán)素反式激活蛋白(tTA)。從四環(huán)素誘導型CMV啟動子(PminCMV)表達KUN結構基因C、prM和E(KUN CprME)的tetKUNCprME是通過將pTRE2CprME-IRESNeo質粒DNA轉染進BHK-Tet-Off細胞并選擇在存在G418和嘌呤霉素的情況下生長的細胞而建立的(見正文所述)。在未誘導的tetKUNCprME細胞中，強力霉素(DOX，一種具有較高比活性的四環(huán)素形式)結合tTA，并防止其結合四環(huán)素應答元件(TRE)及進而防止其激活從CMV啟動子轉錄CprME mRNA。為誘導KUNCprME基因表達，將DOX從培養(yǎng)基中去除導致釋放tTA，tTA結合TRE的，及激活從CMV啟動子轉錄CprME mRNA。tetR-Tet阻抑蛋白；VP16-單純皰疹病毒VP16激活結構域；IRES-EMCV內(nèi)部核糖體進入位點；puro-嘌呤霉素N-乙酰轉移酶；TRE-四環(huán)素應答元件；Neo-新霉素抗性基因；SV40polyA-SV40轉錄終止子/poly(A)信號；β-珠蛋白polyA-β-珠蛋白轉錄終止子/poly(A)信號。(B)在存在和不存在KUN復制子RNA的情況下在誘導的和未誘導的tetKUNCprME細胞中分泌的E蛋白和VLP的產(chǎn)生?！?RNA”圖(左側)示出無復制子RNA轉染的實驗結果，“+RNA”圖(右側)示出用KUN復制子RNA-RNAleu電穿孔的另一個實驗的結果。將tetKUNCprME細胞用KUN復制子RNA電穿孔(+RNA)或未電穿孔(-RNA)，并在有(未誘導的)或無(誘導的)0.5μg/ml強力霉素的培養(yǎng)基中保持48小時。如“材料和方法”章節(jié)所述通過抗原捕獲ELISA進行分泌的KUN E蛋白的檢測(白色條柱)及通過在Vero細胞上的感染性分析進行VLP效價的確定(黑色條柱)(以感染單位(IU)/ml表示)。這兩個實驗中的陰性對照(Cont)是來自正常BHK細胞的培養(yǎng)液。每個實驗中使用的KUN病毒陽性對照(KUN)的效價通過在BHK細胞上的噬斑分析而確定。
圖2Kunjin病毒結構蛋白C、prM和E的加工示意圖。切割位點示作□NS2B-NS3(病毒)蛋白酶；·宿主細胞信號酶；←宿主細胞弗林蛋白酶。
圖3除去強力霉素對KUN結構基因在tetKUNCprME細胞中表達的誘導。(A)從誘導的(-DOX)和未誘導的(+DOX)tetKUNCprME和BHK細胞中提取的RNA的Northern印跡雜交分析。將20μg每種RNA在1％聚丙烯酰胺-瓊脂糖凝膠上分離，然后通過毛細管印跡移至Hybond N膜上。(B)從誘導的(-DOX)和未誘導的(+DOX)tetKUNCprME和BHK細胞中提取的RNA的Western印跡雜交分析。將5μg總蛋白質在12.5％聚丙烯酰胺凝膠上分離，然后移至Hybond P膜上。將該膜與KUN抗E單克隆抗體保溫，結合的KUN E蛋白通過化學發(fā)光檢測。
圖4tetKUNCprME細胞中KUN復制子VLP的擴增與傳播。將tetKUNCprME和BHK21細胞的蓋玻片用0.1MOI(感染復數(shù))的RNAleuMpt VLP感染，并在感染后第2天和第3天用KUN抗NS3抗體通過IF分析。
圖5用高效價的KUN VLP復制子免疫的小鼠中CD8T細胞應答。(A)將C57BL/6小鼠(4只/組)經(jīng)腹膜內(nèi)用如下制劑免疫PBS(天然的)，108IU的不編碼重組抗原的KUN VLP(KUN VLP對照)，或者指定劑量的編碼鼠多表位KUN-Mpt VLP(Anraku et al.，2002，J Virol.76 3791-3799)的KUN VLP。2周后，取出脾細胞并通過IFNγELISPOT分析(H-2Kb限制的)SIINFEKL-特異性應答。(B，C)將BALB/c小鼠(3只/組)經(jīng)腹膜內(nèi)用2.5×107IU的編碼呼吸道合胞病毒基質2蛋白的KUN VLP(KUN-M2VLP)，2.5×107IU的不編碼重組抗原的KUN VLP(KUN VLP對照)免疫，或者如先前所述(Elliott etal.，1999，Vaccine.17 2009-2019)用與破傷風毒素在Montanide ISA 720中配制的含有H-2Kd限制的RSV M2表位SYIGSINNI的肽疫苗(SYIGSINNI/TT/M720)皮下免疫接種。2周后，取出脾細胞并通過(B)IFNγELISPOT及(C)標準鉻釋放分析(黑色方塊—用SYIGSINNI肽敏化的P815靶細胞，白色方塊—未用肽敏化的P815靶細胞)分析SYIGSINNI特異性應答，所述分析如前所述(Anraku et al.，2002，文獻如前)。
圖6使用KUN VLP和IL-2的腫瘤治療。將4組小鼠經(jīng)s.c.在背部注射5×104LLOva。一旦LLOva腫瘤可以觸知(＞1mm2)，則將小鼠在圖中指定的時間用有和沒有IL-2的KUN VLPMpt或PBS(對照)接種2次。(A)監(jiān)測腫瘤大小并經(jīng)ANOVA對比各組，VLP vsVLP+IL-2組，p＝0.34；對照組vs對照組+IL-2，p＝0.96；對照組vsVLP，p＜0.001；對照組vs VLP+IL-2，p＜0.001。(B)同一實驗的以KaplanMeier圖表示的存活力(當1個腫瘤達到15×15mm2時將動物安樂死)。通過Log Rank統(tǒng)計學對比各組VLP vs VLP+IL-2，p＝0.11；對照組vs對照組+IL-2，p＝0.41；對照組vs VLP，p＝0.0015；對照組vs VLP+IL-2，p＜0.001。
圖7適應性突變對于在用復制子VLP感染后在BHK21、HEp-2和293細胞中建立KUN復制子RNA持久復制能賦予優(yōu)勢。將BHK21、HEK293和HEp-2細胞用野生型rep/PAC-gal復制子VLP或每種突變體分別以0.01、1和10的MOI感染。感染48小時后，將1μg/ml(HEK293和HEp-2)和5μg/ml(BHK21)的嘌呤霉素加入培養(yǎng)基中并將細胞額外增殖7天。將嘌呤霉素抗性細胞集落在4％甲醛中固定，用結晶紫(BHK21)或者用X-gal(HEK293和HEp-2)染色。
圖8tetKUNCprME細胞在增強從Kunjin復制子載體表達異源基因中的應用。將24孔平板中95％鋪滿的KUN包裝A8細胞系和BHK21細胞用KUNrepPAC/β-gal VLP以MOI＝1感染，并在感染2、4和6天后通過X-gal染色(A)和β-gal分析(B)進行分析?？招臈l柱表示BHK21細胞，實心條柱表示A8細胞的KUN包裝。每個條柱均表示一式兩份樣品的平均值。誤差桿表示標準誤差。
發(fā)明詳述本發(fā)明揭示了一種穩(wěn)定的包裝構建體和包裝細胞系tetKUN-CprME，該包裝細胞系能實現(xiàn)KUN復制子VLP的簡化的(即一次RNA轉染)誘導生產(chǎn)。在本發(fā)明的穩(wěn)定包裝細胞系中，KUN結構基因C、prM和E從四環(huán)素誘導型CMV啟動子表達(圖1)。在這個包裝細胞系的增殖和維持期間，毒性KUN結構基因產(chǎn)物的產(chǎn)生通過向培養(yǎng)基中加入四環(huán)素(或強力霉素)而抑制。在KUN復制子RNA轉染進tetKUN-CME細胞中之后從培養(yǎng)基中除去強力霉素導致KUN結構基因表達的誘導，其產(chǎn)物然后將復制中的KUN復制子RNA包裝成分泌的VLP(圖1)。
令人驚奇地，從本發(fā)明的這個包裝構建體中產(chǎn)生的KUN結構蛋白能將轉染的和自身擴增的Kunjin復制子RNA包裝成分泌的VLP，效價高至約109VLP/ml。這表示比先前應用致細胞病變的SemlikiForest病毒復制子RNA瞬時表達Kunjin結構基因的包裝方案改良了約1500倍。分泌的KUN復制子VLP可以連續(xù)收獲3-4次，直至RNA轉染后8天，從3×106個轉染的細胞產(chǎn)生總量高至約5.4×1010VLP(表3)。VLP在Vero細胞上的傳代及將VLP經(jīng)顱內(nèi)注射進2-4天齡哺乳幼鼠中示出在VLP制備物中無任何感染性Kunjin病毒存在的跡象。用編碼人呼吸道合胞病毒M2基因的KUN復制子VLP免疫小鼠可誘導格外強的CD8+T細胞應答。包裝細胞也能包裝來自遠緣相關的黃病毒2型登革病毒的復制子RNA以及西尼羅病毒復制子，表明這些細胞包裝任何黃病毒復制子RNA的潛力。
來自C-prM-E前體翻譯產(chǎn)物的黃病毒結構蛋白加工為產(chǎn)生病毒顆粒(或者復制子VLP)所需的單獨的C、prM(M)和E蛋白是一個復雜的過程，需要細胞信號酶、細胞弗林蛋白酶和病毒編碼的蛋白酶NS2B-NS3的5次切割(圖2)。根據(jù)本發(fā)明應用的鄰近的C-prM-E前體翻譯產(chǎn)物因此在不提供從復制子RNA中表達的病毒蛋白酶的前體下不能被正確加工。如圖1示出在誘導C-prM-E表達時從tetKUNCprME細胞中無分泌的E蛋白(分泌的VLP的一個指征)產(chǎn)生，除非細胞用復制子RNA轉染。天然的黃病毒C-prM接點的切割需要由病毒和細胞蛋白酶雙重切割，并且除非已經(jīng)發(fā)生了病毒蛋白酶切割，否則細胞信號酶切割不能進行下去(Stocks & Lobigs，1998，JVirol.722141-2149)。這導致ER中未切割的C-prM產(chǎn)物積聚，可能觸發(fā)對細胞有害的ER應激應答。另外，如果prM不從C中切割，則其不能參與分泌的病毒顆粒產(chǎn)生所必需的prM-E異源二聚體的形成。盡管可以設計C和prM之間的疏水序列中的突變使得prM通過細胞信號酶而不用病毒蛋白酶即可從C中有效切割，它們看起來不能產(chǎn)生病毒顆粒(Lee etal.，2000，J Virol.74 24-32.)，提示細胞和病毒蛋白酶對C-prM接點的協(xié)調切割對分泌的病毒顆粒的產(chǎn)生的重要作用。因此，本發(fā)明應用編碼C-prM-E前體翻譯產(chǎn)物的核苷酸序列的表達聯(lián)合編碼病毒蛋白酶的復制子RNA的轉染，提供了正確加工KUN結構蛋白及產(chǎn)生高效價分泌的復制子VLP的有利條件。
更特別地，本發(fā)明的誘導型表達系統(tǒng)通過向細胞培養(yǎng)基中加入四環(huán)素而提供了一種“關閉”具有潛在毒性的C-prM-E前體翻譯產(chǎn)物表達的能力。這使得可以選擇并維持tetKUNCprME穩(wěn)定的包裝細胞系而不降低C-prM-E表達，并因此可以高水平、可誘導地產(chǎn)生高效價的復制子VLP。
應意識到本發(fā)明因此對黃病毒復制子包裝可具有如下廣泛的應用(i)具有包裝任何黃病毒復制子的能力；和/或(ii)具有表達對于黃病毒復制子包裝充分必要的任何黃病毒結構蛋白的能力。
如本文所用術語“黃病毒”是指黃病毒科內(nèi)黃病毒屬的成員，含有65或更多個相關的病毒種。典型地，黃病毒是小型包膜RNA病毒(直徑大約45nm)，具有包含一個單一糖蛋白E的包膜粒。其它的結構蛋白稱為C(核心)和M(膜樣)。單鏈RNA是感染性的并典型地具有大約為4×106的分子量，在5’末端有一個m7G“帽”，但在3’末端無poly(A)序列；其行使唯一信使的功能。黃病毒廣泛的感染脊椎動物，許多是通過節(jié)肢動物如蜱和蚊傳播的，盡管有單獨一組黃病毒稱為無已知載體(NKV)。
特別地，黃病毒的非限制性實例是西尼羅病毒、Kunjin病毒、黃熱病病毒、日本腦炎病毒、登革病毒、蜱傳播腦炎、Murray Valley腦炎、Sent Louis腦炎、Montana Myotis白質腦炎病毒、Usutu病毒及Alkhurma病毒。
本文所用術語“核酸”是指單鏈或雙鏈的mRNA、RNA、cRNA、RNA-DNA雜交體及包含cDNA及基因組DNA的DNA。
優(yōu)選地，本發(fā)明的包裝構建體是雙鏈質粒DNA包裝構建體。
術語“蛋白質”是指氨基酸聚合物。氨基酸可包括天然的(即遺傳編碼的)、非天然的、D-及L-氨基酸，這些為本領域所熟知。
術語“肽”是指具有少于50個氨基酸的蛋白質。
術語“多肽”是指具有50或更多個氨基酸的蛋白質。
根據(jù)本發(fā)明，術語“包裝構建體”包含與編碼一或多個黃病毒結構蛋白的一或多個核苷酸序列可操縱地連接的一個可調節(jié)啟動子。
適當?shù)?，所述包裝構建體包含編碼結構蛋白C、prM和E的核苷酸序列。
本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)編碼C、prM和E結構蛋白的鄰近氨基酸序列可誘導的表達為“前體”或“前蛋白”是迄今為止最有效的產(chǎn)生VLP的系統(tǒng)。這與典型的現(xiàn)有技術中C和prM-E蛋白分別由單獨的核苷酸序列編碼的方法相反。
在這點上，根據(jù)本發(fā)明結構蛋白C、prM和E在動物細胞中可表達為單一的前體翻譯產(chǎn)物，其經(jīng)歷隨后的蛋白酶解產(chǎn)生VLP產(chǎn)生所需的單獨的C、prM和E結構蛋白。
提議的描述前體翻譯產(chǎn)物加工的模型概括示于圖2。盡管加工通常依賴于細胞蛋白酶和復制子編碼的蛋白酶同時存在，但也預期可以將另外的蛋白酶切割位點工程化進入一或多個結構蛋白C、prM和E中，與動物宿主細胞對合適的蛋白酶表達一起可以提供另一種通常發(fā)生的加工系統(tǒng)。
這種系統(tǒng)在C、prM和E翻譯產(chǎn)物的加工中不需要黃病毒復制子編碼的蛋白酶。
在一個優(yōu)選的實施方案中，所述結構蛋白是KUN結構蛋白C、prM和E。
然而，可以使用任何其它黃病毒的結構蛋白。已經(jīng)非常清楚一個黃病毒中的結構蛋白用另一個或其它黃病毒的結構蛋白置換可以產(chǎn)生嵌合黃病毒(Monath etal.，2000，J.Virol.741742；Guirakhoo etal.，2000，J.Virol.74 5477；Pletnev etal.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA8910532)，這表明一種黃病毒的結構蛋白能包裝另一種黃病毒的RNA。最近已經(jīng)示出(i)黃熱病病毒復制子能通過提供黃熱病prME和西尼羅或登革病毒核心蛋白而包裝，(ii)西尼羅復制子可以通過提供病毒而包裝。
也應意識到結構蛋白C、prM和E包括并涵蓋了一或多種這些蛋白質中的任何突變或其它序列變化，這種突變不阻止或不顯著損害翻譯產(chǎn)物的加工和/或病毒包裝。
在這點上，參考前述可能性提示可以將另外的蛋白酶切割位點工程化進入一或多個結構蛋白C、prM和E中。另外，由病毒和細胞蛋白酶識別的切割位點的緊鄰上游或下游序列可以加以修飾以增強切割效力(Stocks & Lobigs etal.，1998，J Virol，72 2141-2149)，這可以導致VLP的切割和/或分泌改良。
典型地，預期突變的和/或變體結構蛋白與C、prM或E蛋白氨基酸序列分別具有至少80％，優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％或者有益地至少95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列相同性。
因此，應意識到編碼突變的和/或變體結構蛋白的核苷酸序列與編碼C、prM或E蛋白的核苷酸序列具有至少70％，優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少90％或者有益地至少95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸序列相同性。
本文所用短語“序列相同性百分比”是通過氨基酸或核苷酸與參考序列的精確匹配數(shù)除以重疊區(qū)域中殘基數(shù)確定的百分比。重疊的最小區(qū)域典型地為至少6、12或20個相鄰殘基。氨基酸序列相同性可以通過標準方法學確定，包括可在www.ncbi.nlm.nih.gov上獲得的NCBI BLAST搜索方法學，包含無缺口的BLAST和有缺口的Blast2.0。然而，也可考慮使用美國專利5,691,179和Altschul et al.，1997，Nucleic Acids Res.253389-3402所述的序列分析方法學。
本發(fā)明的包裝構建體的一個特征是存在與編碼黃病毒結構蛋白翻譯產(chǎn)物的核苷酸序列可操縱地連接的一個可調控啟動子。
“可調控啟動子”是指在動物細胞中可操縱的任何啟動子，其中啟動子活性在應答一或多種調節(jié)劑中是可控制的。調節(jié)劑可以是物理性的(例如溫度)或者可以是化學性的(例如類固醇激素、重金屬、抗生素)。
這種啟動子例如包括熱休克誘導型啟動子、蛻皮激素誘導型啟動子、四環(huán)素誘導型/抑制型啟動子、金屬硫蛋白誘導型啟動子及通過細菌lac操縱子誘導型哺乳動物可操縱的啟動子(例如lac調節(jié)的CMV或RSV啟動子)。
優(yōu)選的可調控啟動子是“tet關閉”啟動子，其在存在強力霉素的情況下被抑制并通過除去強力霉素而誘導。
根據(jù)這個實施方案的一個特別的優(yōu)選形式，所述可調控啟動子包含與四環(huán)素應答元件(TRE)連接的一個CMV啟動子，其促進對由一個單獨的構建體編碼的四環(huán)素反式激活蛋白(tTA)的應答。
本發(fā)明的包裝構建體可進一步包含其它調節(jié)序列如內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)，3′聚腺苷酸化和轉錄終止子序列(例如β-球蛋白或SV40-衍生的)及一個可選擇的標記基因(例如新霉素、潮霉素或嘌呤霉素抗性基因)以便于穩(wěn)定的轉化體的選擇。
在一個特別優(yōu)選的方式中，本發(fā)明的包裝構建體包含一個IRES-新霉素核苷酸序列以便于穩(wěn)定的轉化體的選擇。
在這個實施方案的一優(yōu)選形式中，所述包裝構建體進一步包含一個β-球蛋白聚腺苷酸化信號。
根據(jù)本發(fā)明，穩(wěn)定的包裝細胞系典型地在兩個階段產(chǎn)生(i)確定表達四環(huán)素(強力霉素)反式激活蛋白的穩(wěn)定細胞系；(ii)使用(i)中產(chǎn)生的穩(wěn)定細胞系以在除去強力霉素后產(chǎn)生能可誘導地表達KUN結構基因的包裝細胞。
在一特殊的實施方案中，步驟(i)中的穩(wěn)定細胞系是通過將包含與人延伸因子α啟動子可操縱地連接的四環(huán)素反式激活蛋白核苷酸序列的四環(huán)素反式激活構建體轉染進入細胞中而產(chǎn)生。
然而，應意識到在這點上可以使用其它啟動子，非限制性地例如RSV、SV40、α晶體蛋白、腺病毒和CMV啟動子。
“可操縱地連接”是指所述可調控啟動子被定位于起始并可調節(jié)地控制編碼所述黃病毒結構蛋白的RNA的胞內(nèi)轉錄。
優(yōu)選地，所述四環(huán)素反式激活構建體進一步包含一個IRES嘌呤霉素選擇標記，其促進穩(wěn)定的轉染物的選擇。
在步驟(ii)，本發(fā)明的包裝構建體轉染進入表達四環(huán)素反式激活蛋白的穩(wěn)定細胞系中。
對于VLP包裝的合適的宿主細胞可以是適合轉錄、翻譯和蛋白表達所需的任何轉錄后和/或翻譯后加工或者修飾的任何真核細胞系、動物或哺乳動物細胞系。典型用于核酸轉染和蛋白質表達的哺乳動物細胞非限制性的例如是COS、Vero、CV-1、BHK21，293、HEK、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NIH 3T3、Jurkat、WEHI 231、HeLa MRC-5及B16黑素瘤細胞。
優(yōu)選地，所述宿主細胞是BHK21。
應意識到本發(fā)明產(chǎn)生的包裝細胞隨后可用于包裝編碼一或多種蛋白質的黃病毒復制子RNA。
本發(fā)明涵蓋的黃病毒復制子包括衍生自黃病毒RNA的任何自身復制成分，如國際公開WO 99/28487和國際申請02/01598所述。這些復制子非限制性包括基于DNA的復制子構建體，其中復制子cDNA被置于哺乳動物表達啟動子如CMV的控制下，并以質粒DNA的形式輸送；包括基于RNA的復制子構建體，其中復制子cDNA被置于噬菌體RNA聚合酶啟動子如SP6、T7、T3的控制下，使得可以使用相應的DNA依賴性RNA聚合酶在體外產(chǎn)生復制子RNA，其中所述復制子RNA可以裸RNA或包裝成VLP中的RNA形式輸送。
盡管本發(fā)明優(yōu)選的黃病毒復制子衍生自Kunjin病毒，但本領域技術人員意識到本發(fā)明的包裝系統(tǒng)可用于包裝任何黃病毒復制子。
相對被充分研究的黃病毒復制子的實例包括西尼羅毒株譜系I(Shi et al.，Virology，2002，296 219-233)和譜系II(Yamshchikov et al.，2001，Virology，281 294-304)、2型登革熱病毒(Pang et al.，2001，BMCMicrobiology，118)和黃熱病病毒(Molenkamp et al.，2003，J.Virol.，771644-1648)的復制子。
在一個特殊的實施方案中，所述黃病毒復制子可編碼一或多個突變的結構蛋白，包括NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和/或NS5。
在一個特殊的實施方案中，NS1蛋白的亮氨酸殘基250由脯氨酸取代。
在另一個特殊的實施方案中，非結構蛋白NS2A中丙氨酸30由脯氨酸取代。
在又一個特殊的實施方案中，非結構蛋白NS2A中天冬酰胺101由天冬氨酸取代。
在再一個特殊的實施方案中，非結構蛋白NS5中脯氨酸270由絲氨酸取代。
也應意識到可以使用另外的氨基酸，從而在復制子中導入細胞適應的突變。
根據(jù)本發(fā)明，“黃病毒表達載體”包含黃病毒復制子及一或多個其它調節(jié)核苷酸序列。這種調節(jié)序列包括但非限于啟動子，內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)，用于插入一或多個異源核酸的限制酶位點，聚腺苷酸化序列及其它序列如肝炎δ病毒核酶(HDVr)的抗原性序列，以分別保證轉錄終止和3’末端的精確切割。
在特殊優(yōu)選的形式中，黃病毒表達載體包含一個CMV啟動子，其促進編碼C、prM和E的可操縱地連接的核苷酸序列在包裝細胞中的表達。然而，應意識到在這點上也可以使用其它啟動子，非限制性的例如RSV、SV40、α晶體蛋白、腺病毒和人延伸因子啟動子。
因此，“黃病毒表達構建體”是這樣的一個表達載體，其中已經(jīng)插入了一個異源核酸，可以RNA和/或編碼的蛋白質的形式表達。
所述異源核酸可編碼一或多種肽或多肽，或者編碼與靶序列基本相同或者基本互補的核苷酸序列。
所述異源核酸可編碼可在動物細胞中表達的任何蛋白質。
另外，黃病毒復制子可以被修飾、調整或另外工程化為能包括所述異源核酸，典型地通過導入一或多個克隆位點而進行，例如國際公開WO 99/28487所述。
將四環(huán)素反式激活構建體、包裝構建體或黃病毒表達構建體導入動物宿主細胞可以通過適合動物細胞的任何方法進行。這些方法包括磷酸鈣沉淀、電穿孔、通過脂質轉染胺試劑(lipofectamine)，脂質轉染試劑(lipofectin)及其它親脂性制劑輸送、DEAE-Dextran轉染、微粒轟擊、顯微注射和原生質體融合。
從前文所述可意識到本發(fā)明的包裝系統(tǒng)可用于在動物細胞優(yōu)選在哺乳動物細胞中表達蛋白質。
這樣可以促進需要的動物細胞提供的翻譯后加工和/或修飾的任何真核蛋白的表達。這種蛋白質的非限制性實例包括激素、生長因子、轉錄因子、酶、重組免疫球蛋白(recombinant immunoglogulin)或其片段、抗原、免疫原等等。
在一特殊的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的VLP可用于感染合適的動物細胞并從而促進編碼的蛋白質在細胞中表達。然后可使用合適的蛋白質純化技術分離及純化表達的蛋白質。
這種系統(tǒng)可使用能高水平表達復制子編碼的異源蛋白質的動物細胞，非限制性例如CHO細胞。
在一個特殊的實施方案中，所述異源核酸可編碼衍生自或得自病原生物體如病毒、真菌、細菌、原生動物、無脊椎動物如寄生蟲和節(jié)肢動物的免疫原性蛋白質或肽，或者可編碼衍生自或得自動物包括動物和人的突變的、致癌的或腫瘤蛋白質如腫瘤抗原。異源核酸也可編碼合成的或人工的蛋白質如構建的以誘導免疫的免疫原性表位。
本發(fā)明的免疫治療性組合物可用于預防性或治療性地免疫動物如人。
針對病毒、腫瘤、細菌、原生動物及其它無脊椎動物寄生蟲的免疫應答可以通過表達本發(fā)明的VLP編碼的合適的免疫原性蛋白質或肽表位而激發(fā)或誘導。優(yōu)選地，所述免疫應答包含CTL的誘導。
根據(jù)這個實施方案，本發(fā)明產(chǎn)生的VLP可用于免疫治療性組合物或疫苗組合物的制備中，所述組合物進一步包含一種可接受的載體、稀釋劑或賦形劑和/或佐劑。
“藥物可接受的載體、稀釋劑或賦形劑”是指可安全地用于全身性給予的固體或液體充填劑、稀釋劑或膠囊化物質。根據(jù)特殊的給予途徑，可以使用本領域熟知的各種載體。這些載體可選自糖、淀粉、纖維素及其衍生物、麥芽、明膠、滑石、硫酸鈣、植物油、合成油、多元醇、褐藻酸、磷酸鹽緩沖溶液、乳化劑、等滲鹽水及鹽如無機酸鹽包括氫氯酸鹽、溴化物和硫酸鹽、有機酸鹽如乙酸鹽、丙酸鹽和丙二酸鹽，及無熱原水組成的一組。
關于藥物可接受的載體、稀釋劑和賦形劑的有益的參考文獻是Remington的Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.N.J.USA，1991)，在此并入?yún)⒖肌?br> 可以應用任何安全的給予途徑以為患者提供本發(fā)明的組合物。例如可以應用口服、直腸、非腸道、舌下、口腔、靜脈內(nèi)、關節(jié)內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、吸入、眼內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦室內(nèi)及經(jīng)皮給予等方式。
本領域理解“佐劑”是指增強疫苗組合物的免疫原性和/或效力的一或多種物質。合適的佐劑的非限制性實例包括鯊烷和鯊烯(或者源于動物的其它油)、封閉聚合物、去污劑如Tween-80、QuilA、礦物油如Drakeol或Marcol、植物油如花生油、棒狀桿菌衍生的佐劑如小棒桿菌(Corynebacterium parvum)、丙酸桿菌屬(Propionibacterium)衍生的佐劑如瘡皰丙酸桿菌(Propionibacterium acne)、牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)(Bacille Calmette和Guerin或BCG)、白細胞介素如白細胞介素2和白細胞介素12、單核因子如白細胞介素1、腫瘤壞死因子、干擾素如γ干擾素、組合物如皂苷-氫氧化鋁或Quil-A氫氧化鋁、脂質體、ISCOM和ISCOMATRIXS佐劑、分枝桿菌細胞壁提取物、合成的糖肽如胞壁酰二肽或其它衍生物、阿夫立定(Avridine)、脂質A衍生物、葡聚糖硫酸酯、DEAE-葡聚糖或者具有磷酸鋁、羧基聚亞甲如Carbopol′EMA、丙烯酸共聚物乳狀液如Neocryl A640(例如美國專利No.5,047,238)、痘苗或動物痘病毒蛋白、亞病毒顆粒佐劑如霍亂毒素，或其混合物。
本發(fā)明的包含免疫治療性組合物的藥物組合物及免疫方法可給予任何動物，非限制性包括哺乳動物和人。
因此，本發(fā)明涵蓋了獸醫(yī)和醫(yī)學治療，這種治療根據(jù)所要治療的疾病或病變而治療性和/或預防性給予。
參考如下非限制性實施例可容易地理解本發(fā)明并付諸于實踐。
實施例材料和方法質粒質粒pEF-tTA-IRESpuro由昆士蘭大學的Rick Sturn惠贈，該質粒是pEFIRES-P(Hobbs et al，1998 Biochem Biophys Res Commun 252，368-72)的衍生物并含有編碼四環(huán)素反式激活蛋白的序列(圖1A)。編碼在四環(huán)素誘導型啟動子控制下的KUN CprME基因盒的質粒pTRE2CprME-IRESNeo(圖1A)如下構建。用MluI和XbaI從pCIN1(Rees等，1996，BioTechniques 20 102-110)的衍生物pBS-CIN4IN切下EMCV內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)和新霉素基因的序列。該IRESNeo盒隨后插入pTRE2載體(Clontech)的相應MluI/XbaI位點以產(chǎn)生中間質粒pTRE2IRESNeo。使用引物CprMEFor5′ATTTAGGTGACACTATAGAGTAGTTCGCCTGTGTGA 3′和CprMERev 5′GAGGAGATCTAAGCATGCACGTTCACGGAGAGA 3′通過高可靠性Pfu DNA聚合酶(Promega)從FLSDX質粒DNA模板(Khromykh et al.，1998，J.Virol.72 5967)經(jīng)PCR擴增編碼Kunjin(KUN)CprME基因盒的序列以產(chǎn)生在5’和3’末端具有BglII限制酶位點的片段。應注意的是該片段5’末端的BglII位點位于正向引物下游100個核苷酸處并恰好位于天然KUN翻譯起始密碼子緊鄰上游。然后將該含有KUN CprME序列的BglII-BglII片段插入pTRE2IRESNeo載體中的位于IRESNeo序列上游的BamHI位點以產(chǎn)生pTRE2CprME-IRESNeo質粒(圖1A)。
先前已經(jīng)描述了用于不同復制子RNA體外轉錄的基于RNA的KUN復制子載體和其它編碼不同異源基因的KUN復制子構建體(Khromykh & Westaway，1997，J.Virol.71 1497；Anraku et al.，2002，J.Virol.76 3791；Liu，2002#1264；Varnavski & Khromykh，1999，Virology255 366；Vamavski et al.，2000，J.Virol.74 4394)。通過將含有RSV M2cDNA序列的片段(其用合適引物逆轉錄(RT)和PCR擴增來自RSV感染細胞的RNA而制備)克隆進RNAleu載體(Anraku等，2002，文獻同上)而構建編碼呼吸道合胞病毒(RSV)的M2基因的KUN復制子。
2型登革病毒(DEN2)復制子構建體pDENCΔprME和MpDENΔprME通過在結構基因內(nèi)產(chǎn)生大的同框缺失而衍生自質粒pDVWS601，該質粒含有相應于DEN-2新幾內(nèi)亞C株基因組的全長cDNA克隆。pDENΔCprME保留了C基因開始的81個核苷酸和E基因的最后72個核苷酸，而pDENΔprME保留了prM基因開始的21個核苷酸以及E基因的最后72個核苷酸。
細胞系、病毒和抗體BHK21和Vero細胞系在37℃、5％CO2下在補加10％胎牛血清和青霉素/鏈霉素的Dulbecco’s改良的Eagle’s培養(yǎng)基(Life Technologies)中培養(yǎng)。野生型(wt)KUN病毒株MRM61C如前所述在Vero細胞中生長(Westaway et al.，1997，J.Virol.71 6650)。如前所述在兔中產(chǎn)生抗KUN NS3多克隆抗體(Westaway et al.，1997，J文獻同上)?？筀UN表位3.91D單克隆抗體(MAb)在小鼠中產(chǎn)生(Adams et al.，1995，Virology 206 49)。DNA轉染在60mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)BHK21細胞24小時，之后用2微克質粒DNA采用Lipofectamine Plus試劑(Life Technologies)如廠商所述進行轉染。
產(chǎn)生病毒樣顆粒(VLP)并確定其效價用SP6RNA聚合酶體外轉錄KUN復制子RNA并基本上如先前所述(Khromykh & Westaway，1997，文獻同上)電穿孔進tetKUNCprME細胞。常規(guī)地，將約30微克RNA電穿孔進3×106個細胞。然后將電穿孔的細胞接種進100mm培養(yǎng)皿并在不同體積培養(yǎng)基中于37℃保溫至8天。在這一期間通常在3-5個時間點收集培養(yǎng)液(CF)并用同體積的新鮮培養(yǎng)基更換以多次收獲VLP。通過用收集的CF的10倍系列稀釋液感染Vero細胞并在感染后30-40小時用抗NS3抗體進行IF分析而計數(shù)NS3表達為陽性的細胞數(shù)來確定感染性VLP的效價。
免疫熒光在用復制子RNA或VLP轉染后28-48小時將培養(yǎng)細胞的蓋玻片在4％低聚甲醛中固定，并通過間接免疫熒光(IF)分別使用抗NS3或抗E抗體分析KUN NS3或E蛋白的表達。Northern印跡分析用Trizol試劑(Life Technologies)從用或未用強力霉素培養(yǎng)的tetKUNCprME細胞和從正常BHK21細胞中提取總RNA。將20微克RNA在1％甲酰胺-TAE瓊脂糖凝膠上分離，然后通過用20xSSC經(jīng)毛細管印跡轉移至Hybond-N(Amersham-PharmaciaBiotech)上。使用分離自pTRE2INeoCprME的一個AflII-PstI片段作為模板制備標記探針。這一32P標記探針使用Redprime II試劑盒(Amersham-Pharmacia Biotech)如廠商所述制備?；旧先鐝S商所述用ExpressHyb溶液(Clontech)在68℃將RNA用32P標記DNA探針雜交。條帶通過在X光膠片上曝光或通過磷成像儀觀察，并用ImageQuant軟件(Molecular Dynamics)量化。Western印跡分析tetKUNCprME細胞在60mm培養(yǎng)皿中補加或不加強力霉素培養(yǎng)2天，用Trizol試劑如廠商所述提取細胞蛋白。還回收了BHK21細胞蛋白用作陰性對照。每一樣品的蛋白質濃度用BioRad蛋白質分析(BioRad)根據(jù)廠商所述進行確定。5微克總細胞蛋白在12.5％凝膠上經(jīng)SDS-PAGE分離并轉移至Hybond-P膜(Amersham-Pharmacia Biotech，UK)上。膜在封閉緩沖液(含5％脫脂乳/0.1％Tween 20的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS))中于4℃保溫過夜。將KUN抗E MAb在封閉緩沖液中1∶10稀釋并在室溫與膜保溫2小時。膜用0.1％Tween-20/PBS洗3次各5分鐘，然后加入第二抗體。第二抗體山羊抗小鼠辣根過氧化物酶在封閉緩沖液中1∶2000稀釋并與膜在室溫保溫2小時。再次用0.1％Tween-20/PBS洗膜，用ECL+Plus試劑盒(Amersham-Pharmacia Biotech)顯色。然后膜以變化的時間間隔在X光膠片上曝光。
RT-PCR和測序用Trizol從60mm培養(yǎng)皿中的tetKUNCprME細胞提取總RNA。用One-Step RT-PCR試劑盒(Invitrogen)將0.1微克RNA進行逆轉錄和擴增。所用寡核苷酸引物為針對KUN CprME區(qū)的正向引物CoreXbaI 5′GGCTCTAGACCATGTCTAAGAAACCAGGA3′和反向引物cprMERev 5′GAGGAGATCTAAGCATGCCGTTCACGGAGAGA3′。然后將該cDNA產(chǎn)物用作模板利用覆蓋這一區(qū)域的全序列的6個不同引物經(jīng)BigDye Terminator Mix(Applied Biosystem)進行測序。
KUN VLP和IL-2組合腫瘤療法將5×104個LLOva腫瘤細胞(Nelsonet al.，J Immunol.2001，166 5557-66)皮下注射在各組雌性C57BL/6J小鼠(6-8周齡，每組n＝3)的背上，每只小鼠4個腫瘤(每組n＝12個腫瘤)。一旦腫瘤可觸知(＞1×1mm2)，2組小鼠用108pfu(于200微升中)KUN VLPMpt注射，另兩組對照用PBS注射，它們均間隔10天腹膜內(nèi)注射兩次。在首次VLPMpt或PBS注射后4天，來自VLPMpt和對照的各1組腹膜內(nèi)接受2劑2000IU鼠IL-2，兩劑之間間隔2天。其它2組不接受IL-2。每天記錄腫瘤大小，當腫瘤大小達到15×15mm2時對小鼠實行安樂死(Anraku et al.，2002，文獻同上)。評估KUN復制子病毒樣顆粒(VLP)在KUN tetKUNCprME復制子包裝細胞系(A8細胞系)中擴增和傳播的能力細胞正常BHK21細胞和KUN tetKUNCprME KUN復制子包裝細胞(A8細胞系)(Harvey et al，J Virol.2004，78531-8，引入本文作參考)在補加10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco極限基本培養(yǎng)基(DMEM；Invitrogen，San Diego，Calif.)中于37℃在CO2溫箱中生長。KUN復制子VLP如(Harvey et al，J Virol.2004，文獻同上)所述制備KUN repPAC/β-gal復制子VLP。簡而言之，用編碼使得易于比較基因表達的β-半乳糖苷酶基因和用于選擇的嘌呤霉素抗性基因的體外轉錄的KUN repPAC/β-gal RNA電穿孔A8細胞。在RNA轉染后不同時間點收集細胞培養(yǎng)液，收獲的培養(yǎng)液中包含衣殼化的復制子KUN repPAC/β-gal RNA的VLP的效價通過感染Vero細胞并在感染后48小時用X-Gal染色而得的β-gal陽性細胞數(shù)而計算。KUN repPAC/β-gal復制子VLP感染、X-Gal染色和β-gal分析在24孔板中的90％鋪滿的BHK21和KUN KUN復制子包裝A8細胞用repPAC/β-gal VLP以感染復數(shù)(MOI)為1進行感染，并在不含強力霉素的培養(yǎng)基中保溫。感染后48、96和144小時，用4％甲醛-磷酸鹽緩沖鹽水固定細胞并原位用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖吡喃糖苷(X-Gal)染色，或者將細胞胰蛋白酶化、計數(shù)并溶解以利用商購的β-gal檢測試劑盒根據(jù)廠商指導(Promega，Madison WI)進行β-Gal分析。
結果能包裝KUN復制子RNA成VLP的四環(huán)素誘導型BHK細胞系tetKUNCprME的建立據(jù)我們所知，目前尚未報道同時表達所有三個黃病毒結構病毒的穩(wěn)定細胞系。我們先前產(chǎn)生了穩(wěn)定表達KUN C蛋白的Vero細胞系，但是表達水平很低(Westaway et al.，1997.Virology.23431-41)。我們先前嘗試用標準(非誘導型)DNA表達載體產(chǎn)生持續(xù)表達在獨立啟動子控制下的所有三個KUN結構基因(獨立表達C和prM-E)的穩(wěn)定細胞系，但是表達非常不穩(wěn)定，在幾次細胞傳代后僅產(chǎn)生10-20％陽性表達細胞(未示出)。使用這些細胞系產(chǎn)生KUN復制子VLP的嘗試僅獲得了非常低的VLP效價(未示出)。
首先，用pEFIRES-P(Hobbs et al.，1998，Biochem Biophys ResCommun.252368-372)的衍生物即含有編碼四環(huán)素反式激活蛋白的序列的pEF-tTA-IRESpuro質粒DNA(圖1A)轉染BHK21細胞，以建立穩(wěn)定表達四環(huán)素反式激活蛋白的BHK細胞系BHK-Tet-Off。轉染后2天加入濃度為10微克/ml的嘌呤霉素以選擇細胞克隆。從這一轉染中成功分離和培養(yǎng)了5個細胞克隆。然后通過用質粒pTRE2luciferase(Clontech)轉染分析這些克隆在強力霉素(一種與四環(huán)素具有相同抗菌譜但具有更高的特異性和更長的半衰期的抗生素)的存在和不存在下的誘導表達。所有BHK-Tet-Off細胞克隆均證實有不同程度的誘導和背景水平(結果未示出)。用兩個與未誘導細胞相比顯示最高倍螢光素酶表達誘導的BHK-Tet-Off細胞克隆建立表達KUN結構蛋白即核心(C)、膜(prM)和包膜(E)的穩(wěn)定BHK細胞系。細胞用pTRE2CprME-IRESNeo質粒DNA(圖1A)轉染，所述質粒通過將KUN CprME基因盒和腦心肌炎病毒內(nèi)部核糖體進入位點—新霉素磷酸轉移酶基因盒(IRESNeo)亞克隆進pTRE2載體(Clontech，North Ryde，Australia)而構建。轉染的細胞在還含有10μg/ml嘌呤霉素和0.5μg/ml強力霉素的培養(yǎng)基中用0.5mg/ml遺傳霉素(G418)進行選擇以建立穩(wěn)定的包裝細胞系。為了選擇最有效的包裝細胞系，將賦予對G418和嘌呤霉素的抗性的一些細胞克隆用KUN復制子RNA(RNAleu)電穿孔并在不含強力霉素條件下培養(yǎng)以確定它們是否能產(chǎn)生感染性KUN復制子VLP。在收獲的培養(yǎng)液(CF)中存在的感染性VLP的效價(感染單位(IU)/ml)如先前所述(Khromykh et al.，1998，J Virol.72 7270-7279；Westaway et al.，1997，JVirol.71 6650-6661)通過感染Vero細胞隨后用抗NS3抗體進行免疫熒光分析而確定。
4個細胞克隆即#A3、#A8、#E1和#E5能產(chǎn)生VLP，其效率在RNA轉染后53小時為5×104至2×108IU/ml不等(表1)。產(chǎn)生2×108IU/ml的VLP的最有效的細胞克隆#A8被命名為tetKUNCprME，并用于所有進一步的研究。TetKUNCprME細胞中產(chǎn)生的mRNA所編碼的KUN CprME序列與野生型KUN CprME序列的相同性通過在逆轉錄(RT)-PCR擴增分離自tetKUNCprME細胞的總RNA后測序完整CprME區(qū)而證實。在質粒DNA pTRE2CprME-IRESNeo中存在的序列中未發(fā)現(xiàn)核苷酸變化。
在tetKUNCprME細胞中的CprME表達和分泌的KUN復制子VLP的優(yōu)化生產(chǎn)為檢查tetKUNCprME細胞的培養(yǎng)液中分泌的KUN蛋白和KUNVLP的水平，我們應用了先前描述的抗原捕獲ELISA(Hunt et al.，2002，文獻同上)。在分析前從培養(yǎng)48小時的誘導和未誘導的tetKUNCprME細胞收集的CF中，這兩個CF樣品中均沒有可檢測水平的KUN E蛋白(圖1B)。但是當細胞用RNAleu復制子RNA電穿孔時，在電穿孔后45小時在來自誘導的細胞的CF樣品中注意到大大增加的ELISA讀數(shù)，而在來自未誘導的細胞的CF樣品中僅檢測到微小的ELISA讀數(shù)增加(圖1B)。當這些CF樣品中的VLP在Vero細胞上滴定時，VLP的效價與ELISA結果的相關性很好。在收集自未誘導的細胞的CF樣品中檢測到的500IU VLP/ml產(chǎn)生約0.11的ELISA讀數(shù)OD450，而在來自誘導的細胞的CF樣品中的2.1×108IUVLP給出的ELISA讀數(shù)約為0.63(圖1B)。
為了檢查tetKUNCprME細胞系中CprME mRNA轉錄水平和CprME基因的胞內(nèi)表達水平，將細胞在培養(yǎng)基中在強力霉素存在和不存在下培養(yǎng)48小時。正常BHK21細胞用作陰性對照。CprMEmRNA轉錄通過總細胞RNA與32P標記CprME特異性cDNA探針的Northern印跡雜交而分析(圖3A)，KUN蛋白的表達用KUN抗E抗體經(jīng)Western印跡分析而分析(圖3B)。結果顯示在存在強力霉素時(未誘導的細胞)產(chǎn)生的CprME mRNA和KUN E蛋白非常少，相反，除去強力霉素導致CprME mRNA水平增加約30倍，這通過比較相應的標記條帶中的相對磷成像儀計數(shù)而表明(圖3A)。還檢測到了KUN E蛋白產(chǎn)生水平的基本相似的增加(圖3B)。
為了優(yōu)化VLP產(chǎn)生，用在不同時間點收獲培養(yǎng)液以及從培養(yǎng)基中除去強力霉素而進行研究。在KUN復制子RNA(RNAleu)電穿孔后，向細胞中加入含有強力霉素(0.5μg/ml)的培養(yǎng)基進一步培養(yǎng)16或30小時，然后用不含強力霉素的新鮮培養(yǎng)基更換。設立一個一直不含強力霉素的電穿孔細胞的60mm2培養(yǎng)皿作為對比。在電穿孔后53小時和68小時從每一培養(yǎng)皿中收獲培養(yǎng)液并在Vero細胞上進行感染性分析檢測。結果顯示除去強力霉素以誘導CprME表達而進行VLP生產(chǎn)的最佳時間是在RNA電穿孔后立即除去(表2)。從培養(yǎng)基中除去強力霉素的延遲使得所產(chǎn)生的VLP量顯著降低。
為了確定最佳VLP收獲方案和tetKUNCprME細胞產(chǎn)生高水平編碼各種異源基因的VLP的能力，將KUN復制子RNA RNAleu和編碼不同異源基因如鼠多表位(RNAleuMpt)、HIV-1gag(KUNgag)、嘌呤霉素乙酰轉移酶(repPAC)、嘌呤霉素乙酰轉移酶和β-半乳糖苷酶(repPACβ-gal)以及綠色熒光蛋白(repGFP)的復制子RNA(Anraku etal.，2002，文獻同上；Liu et al.，2002，J Virol.76 10766-10775；Varnavski& Khromykh，1999，Virology 255 366-375；Varnavski et al.，2000，J Virol.74 4394-4403)電穿孔進tetKUNCprME細胞。在RNA電穿孔后不同時間收獲VLP并在每次收獲VLP時用新鮮培養(yǎng)基更換原培養(yǎng)基以使得多次收獲VLP(表3)。根據(jù)復制子RNA的性質和VLP收獲方案，從電穿孔后第3天開始幾乎所有VLP效價均在107至109IU/ml范圍，并且甚至在直至轉染后10天的第3次或第4次連續(xù)收獲中仍保持很高效價(表3)。使用最佳VLP收獲方案從最初轉染的3×106個tetKUNCprME細胞產(chǎn)生的總VLP達到5.4×1010個感染性顆粒(表3中的repPACβ-gal RNA exp 2)，并且當使用其它收獲方案和不同的KUN復制子RNA時總VLP產(chǎn)量在1.6×109至1.3×1010個感染性顆粒/3×106個電穿孔細胞的范圍內(nèi)(表3)。
為了檢查KUN復制子VLP是否能通過在tetKUNCprME細胞中傳播但不在正常BHK細胞中傳播而擴增，將細胞用RNAleuMpt VLP以低MOI(0.1)進行感染并在不加強力霉素的培養(yǎng)基中溫育。用KUN抗NS3抗體對感染的細胞進行IF分析表明在感染后第2天至第3天陽性細胞灶(foci)大小顯著增加(圖4，第1和2組)，從而證實了VLP在tetKUNCprME細胞中的擴增和傳播。相反，在VLP感染后第2天和第3天在感染的正常BHK21細胞中僅檢測到幾個陽性細胞(圖4，第3和4組)。在一獨立的實驗中，在用0.1MOI RNAleuMptVLP感染tetKUNCprME細胞后檢測到VLP效價從保溫第3天到第5天大約增加了10倍(結果未示出)，由此進一步證實VLP通過在包裝細胞中傳播而擴增。
所述結果令人信服地證實，與我們先前公開的使用致細胞病變性SFV復制子表達KUN結構基因的方案(Varnavski & Khromykh，1999，文獻同上)相比，tetKUNCprME細胞系能產(chǎn)生大大增加(約1500倍)量的KUN復制子VLP。
這應該與所報道的穩(wěn)定表達蜱傳播腦炎(TBE)prME基因的CHO細胞系的產(chǎn)生及其在包裝缺失了prME基因的TBE復制子RNA中的應用(Gehrke et al，2003，J.Virol.77 8924-8933)相比。在表達prME的CHO細胞中獲得的分泌的TBE復制子VLP的最高效價是5×107IU/ml，這比在tetKUNCprME細胞中獲得的KUN復制子VLP的最高效價(1.6×109IU/ml，表3)低約32倍。另外，每106個轉染細胞產(chǎn)生的TBE復制子VLP的總最大量是約108IU，其比獲得的KUN復制子VLP總最大量(5.4×1010IU，表3)低約540倍。然而，考慮到在所用細胞系(TBE用CHO，KUN用BHK)、復制子RNA(TBE具有核心基因，而KUN無核心基因)、電穿孔條件(即對于TBE RNA沒有報道轉染細胞數(shù)和RNA量及電穿孔儀設置)和收獲VLP方案方面的差異，很難在這兩個系統(tǒng)之間進行包裝效率的進一步比較。
但是，很清楚本發(fā)明的tetKUNCprME細胞提供了誘導型表達的靈活性、明顯更高的效價、連續(xù)的收獲以及所產(chǎn)生的復制子VLP的更高的總量。另外，tetKUNCprME細胞能夠包裝來自不同黃病毒的復制子RNA(見下述)。
KUN結構蛋白在tetKUNCprME細胞中的穩(wěn)定表達為了確定KUN CprME基因表達的穩(wěn)定性，將tetKUNCprME細胞在不含嘌呤霉素和G418的條件下培養(yǎng)傳代12次，然后用KUN復制子RNA(RNAleu)電穿孔以確定VLP產(chǎn)生的效率。在傳代過程中在培養(yǎng)基中存在強力霉素以保證抑制CprME表達。在所有三種抗生素即嘌呤霉素、G418和強力霉素存在下培養(yǎng)傳代12代的tetKUNCprME細胞被平行電穿孔以比較VLP生產(chǎn)效率。在電穿孔復制子RNA后立即除去強力霉素以誘導CprME表達并使VLP產(chǎn)生。在復制子RNA轉染后48小時從在傳代過程中保持在嘌呤霉素和G418選擇條件下的細胞收集的VLP的效價類似于同一時間從保持在沒有嘌呤霉素和G418選擇條件下的細胞收集的VLP的效價(分別為2.2×106IU/ml和1.7×106IU/ml)。盡管在這一實驗中VLP效價低于其它大多數(shù)包裝實驗中的效價，但是所述結果清楚表明在未經(jīng)抗生素選擇而傳代至少12代之后的tetKUNCprME細胞中KUN結構蛋白表達的穩(wěn)定性，因此提示KUN結構基因盒穩(wěn)定整合進細胞基因組內(nèi)。
在復制子VLP制備物中不含感染性KUN病毒在KUN復制子RNA的C基因的C-末端區(qū)和E基因的N-末端區(qū)與tetKUNCprME細胞中產(chǎn)生的CprME mRNA之間存在重疊序列可能潛在地促進同源重組，使得可能在VLP制備物中產(chǎn)生感染性KUN病毒。在先前開發(fā)的包裝系統(tǒng)中，我們通過從SFV復制子載體產(chǎn)生的兩個不同mRNA分別表達C基因和prM-E基因而消除了任何潛在重組的可能性。但是我們使用KUN RNA進行的無數(shù)互補實驗(綜述見Khromykh，2000，文獻同上)以及用YF RNA進行的互補實驗(Lindenbach & Rice，1997，J Virol.71 9608-17；Lindenbach & Rice，1999，J Virol.73 4611-21)(其中在缺陷和輔助RNA之間存在延長的互補區(qū))未能檢測到應該可以通過同源重組產(chǎn)生的任何重組感染性病毒。為了檢查在用tetKUNCprME細胞產(chǎn)生KUN復制子VLP過程中是否產(chǎn)生了任何重組的復制型KUN病毒，將在用RNAleu RNA轉染后2天收獲的CF用于感染生長在蓋玻片上的Vero細胞。感染的細胞溫育5天，通過免疫熒光檢查其E蛋白表達。來自感染的蓋玻片的組織培養(yǎng)液隨后在Vero細胞新鮮培養(yǎng)物上再次傳代5天，并用抗E抗體經(jīng)IF檢查。在兩代中均未檢測到E陽性細胞(結果未示出)。用抗NS3抗體進行的平行標記顯示在第1代中有許多陽性細胞，但是在第2代中沒有陽性細胞(結果未示出)，證實VLP僅在第1輪感染中輸送復制子RNA。類似地，盡管病毒基因組序列中在prM-E和復制子RNA之間存在重疊，在穩(wěn)定表達prM-E基因的CHO細胞中包裝TBE復制子RNA甚至在包裝細胞系傳代若干次后也不會產(chǎn)生任何感染性TBE病毒。
在VLP制備物中不含感染性KUN病毒的另外的證據(jù)通過病毒檢測的最靈敏的方法即顱內(nèi)注射哺乳幼鼠而檢驗。將10只一組的2-3日齡Balb/C哺乳幼鼠用4×106IU KUN-MPt VLP或用1pfu wt KUN病毒(毒株MRM61C)顱內(nèi)接種作為陽性對照。用1pfu wt KUN病毒注射的全部10只小鼠在接種后4天均出現(xiàn)后肢麻痹并不得不處死。相反，所有VLP注射的小鼠在實驗期間(21天)均保持健康并顯示正常發(fā)育。這些用KUN復制子VLP進行的體外和體內(nèi)結果以及用TBE復制子VLP進行的體外結果(Gehrke etal.，2003，文獻同上)清楚表明在表達連續(xù)結構基因盒的包裝細胞中生產(chǎn)黃病毒復制子VLP不會導致產(chǎn)生任何重組病毒。對比之下，在表達連續(xù)新培斯病毒結構基因盒的BHK包裝細胞系中產(chǎn)生的108IU新培斯病毒復制子VLP含有約105pfu的由重組產(chǎn)生的感染性病毒(Polo et al.，1999，Proc NatlAcad Sci USA.964598-4603)。在包裝細胞中將這些結構基因分成兩個獨立的表達盒似乎將感染性病毒污染降低至不可檢測的水平，但是卻同時將復制子VLP的效價降低至5×106至1×107VLP/ml(Poloetal.，1999，文獻同上)。
在tetKUNCprME細胞中將西尼羅病毒和登革病毒復制子包裝成分泌的感染性VLP為了檢查tetKUNCprME細胞能否用于包裝來自其它黃病毒的復制子RNA，我們使用了來自緊密相關的西尼羅(WN)病毒和來自遠緣相關的2型登革病毒(DEN2)的復制子RNA。僅保留了C基因開始的20個密碼子和E基因的最后密碼子的在結構區(qū)具有大缺失的WN復制子構建體“Replicon”先前有描述(Shi等，2002，Virology，296 210-233；Lo等，2003，J Virol 7710004-10014)。
2型登革病毒(DEN2)復制子構建體pDENΔCprME或pDENΔprME復制子RNA通過在結構基因內(nèi)產(chǎn)生大的同框缺失而衍生自質粒pDVWS601，該質粒含有相應于DEN-2新幾內(nèi)亞C株基因組的全長cDNA克隆(Pryor等，2001，Am J Trop Med Hyg 65427-434)。pDENΔCprME保留了C基因開始的27個密碼子和E基因的最后24個密碼子，而pDENΔprME保留了完整的C基因、prM基因開始的7個密碼子以及E基因的最后24個密碼子。
為進行包裝實驗，將DENΔCME或DENΔME復制子RNA電穿孔進tetKUNCprME細胞中并在不含強力霉素的培養(yǎng)基中保溫。實驗中包括KUN復制子RNA(RNAleu)以用于比較VLP產(chǎn)量。用交叉反應性KUN抗NS3抗體在轉染后2天進行的IF分析表明在用DENΔCME和DENΔME RNA轉染后分別有約80％和95％的陽性細胞。KUN復制子RNARNAleu轉染產(chǎn)生約95％NS3陽性細胞。在電穿孔后2天收集培養(yǎng)液，在Vero細胞上經(jīng)感染性分析而滴定。從DENΔCME和DENΔME復制子RNA產(chǎn)生的感染性VLP效價分別是8×104IU/ml和1.8×105IU/ml。KUN復制子RNA在同一實驗中產(chǎn)生的VLP的效價為2.2×107IU/ml。
在一個獨立的實驗中，將WN復制子RNA電穿孔進tetKUNCprME細胞導致在電穿孔后第4天檢測到約70-80％的NS3陽性細胞和產(chǎn)生7×107IU/ml分泌的VLP。在同一實驗中進行的KUN復制子RNA RNAleu的電穿孔導致在電穿孔后第4天檢測到約80-90％的NS3陽性細胞和產(chǎn)生108U/ml VLP。
通過將一種病毒的結構基因用其它黃病毒的結構基因替換而成功產(chǎn)生嵌合黃病毒證實當一種黃病毒的結構蛋白從同一RNA分子順式表達時能夠包裝另一種黃病毒的RNA。我們的結果首次證實用反式提供的KUN結構蛋白包裝不同黃病毒復制子RNA?？紤]到KUN與WN病毒的NY99株之間非常高的同源性(Lanciotti等，1999，Science 2862333-2337；Liu等，2003，文獻同上)以及它們相對相似的復制效率，所觀察到的KUN和WN復制子RNA的相似的包裝效率并不令人吃驚。與KUN復制子RNA相比DEN2復制子RNA的包裝效率低100倍可能由許多因素所致，包括這兩種病毒之間的顯著的序列差異以及登革病毒普遍的較低復制效率。用全長感染性DEN2cDNA進行的先前的實驗顯示在RNA轉染進BHK細胞后產(chǎn)生分泌的DEN2病毒的效率相對較低(Gualano等，1998，J Gen Virol 79437-446)。盡管我們沒有比較DEN2和KUN復制子RNA在tetKUNCprME細胞中的復制效率，但是很可能DEN2復制子RNA的復制會比KUN復制子RNA低，使得可供用于包裝的RNA較少。優(yōu)化的包裝也可能需要RNA和同一病毒的核心蛋白之間的特異相互作用，但是還沒有鑒定黃病毒RNA或核心蛋白中決定包裝特異性的信號/基序。本發(fā)明的包裝系統(tǒng)很可能對于未來包裝信號的研究作出貢獻，并增加對黃病毒組裝和分泌過程的了解。
用在tetKUNCprME細胞中制備的高劑量KUN復制子VLP免疫接種改善了針對編碼的免疫原的CD8+T細胞應答包裝細胞系使得能產(chǎn)生具有高100倍的效價的KUN復制子VLP，因此使得能在接種實驗中測試增加劑量的VLP。通過體外(exvivo)IFNγELISPOT分析(圖5A)測定，編碼鼠多表位的KUN復制子VLP(KUN-Mpt VLP)劑量從106到107IU VLP的10倍增加誘導了多3-4倍的SIINFEKL表位特異性CD8T細胞。從107到108IUVLP的進一步的10倍增加僅微微增加了所誘導的SIINFEKL特異性CD8T細胞數(shù)(圖5A)。在一個獨立的實驗中，用2.5×107IU編碼呼吸道合胞病毒(RSV)M2基因的KUN VLP接種BALB/c小鼠1次。編碼RSV M2基因的KUN復制子通過在RNAleu載體中克隆進一個含有RSV M2cDNA序列的DNA片段而構建，所述DNA片段通過逆轉錄(RT)和PCR擴增從用RSVA2分離株感染的細胞分離的RNA而制備。產(chǎn)生了特異于RSV M2表位SYIGSINNI的高強CD8+T細胞應答，ELISPOT分析表明每106個脾細胞平均有1400個斑點(圖5B，KUN-M2VLP)，標準鉻釋放分析表明在效應子被稀釋至效應子靶比率為2∶1時有超過45％的特異性溶解(圖5C，KUN-M2VLP)。這些應答超過了所報道的用編碼RSV M2的復制型重組痘苗病毒接種后的應答(Aung et al，1999，J Virol 738944-8949；Kulkarni et al，1993，J Virol 67 4086-4092；Simmons et al，2001，J Immunol 1661106-1113)。
對照KUN VLP未能誘導顯著的特異性應答(圖5B和5C，KUNVLP對照)，用SYIGSINNI肽配制的肽疫苗誘導低了若干倍的應答(圖5B和5C，SYIGSINNI/TT/M720)。
用于癌癥的治療性疫苗治療的高效價KUN VLP通過基于CD8T細胞的療法治療已建立的腫瘤需要非常大量的抗癌CD8T細胞(Overwijk et al，2003，J Exp Med 198 569-80)。我們在本文顯示出通過增加VLP劑量誘導更多的CD8T細胞。因此，我們希望確定是否高劑量VLP接種可治療性應用以傳遞顯著的抗癌活性。這一模型中，編碼含有卵清蛋白CD8T細胞表位SIINFEKL的鼠多表位(Mpt)的VLP被用作治療劑以對抗表達模型腫瘤抗原卵清蛋白的Lewis肺細胞(LLOva；Nelson et al，2001，文獻同上)。
在指示的時間(圖6，箭頭)用108KUN VLPMpt(圖6，VLPMpt)或PBS(圖6，對照)、伴有或不伴有IL-2、腹膜內(nèi)接種具有建立的LLOva腫瘤的各組小鼠兩次。VLPMpt接種明顯顯示腫瘤的生長。IL-2單獨或與VLP接種組合不明顯影響腫瘤生長。
因此，可以得出如下結論治療性給予高效價的能誘導高水平SIINFEKL特異性CD8T細胞的VLPMpt疫苗能明顯減慢預先存在的LLOva腫瘤的生長。IL-2單獨或與VLP治療組合均沒有顯著效應。
將在NS2A和NS5中具有適應性突變的KUN復制子RNA包裝成病毒樣顆粒先前的報道顯示在nsP2中具有一些適應性(非致細胞病變性)突變的新培斯病毒和SFV復制子RNA不能被有效包裝成VLP，而在nsP2中具有其它適應性突變的RNA可以被包裝成VLP(Perri et al，2002，J Virol 74 9802-9807)。
我們通過將KUN復制子RNA轉染進我們最近報道的四環(huán)素誘導型包裝BHK細胞系tetKUNCprME中檢查了它們的包裝能力。每2天收獲分泌的VLP，共收獲6-8天，并且如材料和方法部分所述確定VLP效價。具有NS2A/A30P突變的復制子RNA的包裝效率與野生型RNA相似；其它的突變RNA在第2天的包裝效率降低50至500倍，但是除了在NS2A中有組合突變的突變RNA之外所有突變RNA的包裝效率在第6天均恢復到接近野生型的水平(表4)。在NS2A中有組合突變的RNA在第8天的包裝效率仍比野生型RNA低40倍。總之，僅有NS2A/A30P突變不影響復制子RNA的包裝效率，而其它突變均降低包裝效率。
使用在tetKUNCprME細胞中獲得的VLP產(chǎn)生穩(wěn)定表達細胞系我們檢測了顯示提供在倉鼠細胞系中建立持久復制這一優(yōu)點的NS2A中的適應性突變是否也會在其它細胞系中、特別是在人細胞系中提供類似的優(yōu)點。用含有包裝的野生型和突變的復制子RNA的VLP分別以MOI為1和10(在Vero細胞上滴定的值)感染兩個細胞系HEK293和Hep-2的單層，并在含有1μg/ml的嘌呤霉素的培養(yǎng)基中繁殖7天。對嘌呤霉素抗性集落的X-gal染色顯示在HEK293和HEp-2細胞中，NS2A/A30P突變體的集落數(shù)相對于野生型復制子增加約50倍，NS2A/N101D突變體增加約20倍(圖7)。在用0.01MOI的復制子VLP感染BHK細胞后觀察到類似的野生型和NS2A突變的復制子RNA之間的集落數(shù)差異(圖7)。令人感興趣的是，感染HEK293和HEp-2細胞分別需要多10和100倍的VLP才能產(chǎn)生與在BHK21細胞中產(chǎn)生的類似數(shù)目的嘌呤霉素抗性集落(圖5)。在野生型KUN病毒復制效率方面也觀察到了這些細胞系之間的類似的差異(未示出)。在另外的實驗中，在Vero細胞中觀察到了比在BHK細胞中高約20倍的野生型KUN病毒的有效復制(結果未示出)。這些結果證實了在NS2A中具有適應性突變的親代復制子RNA在不同細胞系中建立持久復制的能力這一優(yōu)點。復制子VLP感染的BHK、Vero、HEK293和HEp-2細胞在具有嘌呤霉素的選擇性培養(yǎng)基中的生長導致建立穩(wěn)定表達野生型和NS2A突變的復制子RNA的細胞群，其中突變的保留通過測序證實(未示出)。在采用BHK、Vero、HEK293和HEp-2細胞的所有實驗中，NS2A/A30P突變使得更有效更快速地建立穩(wěn)定表達的細胞系(結果未示出)。與在BHK細胞中的結果一致，在HEp-2和293細胞中建立的嘌呤霉素抗性細胞系中RNA復制和β-gal表達的效率也是類似的(結果未示出)。
使用tetKUNCprME包裝細胞增強Kunjin復制子載體表達異源基因為了檢測KUN復制子VLP能否通過在KUN包裝A8細胞傳播而擴增并且不在正常BHK細胞中擴增，將所述細胞用repPAC/β-galVLP以感染復數(shù)(MOI)為1進行感染，并在不含強力霉素的培養(yǎng)基中溫育。X-gal染色分析感染的A8包裝細胞顯示從感染后第2天(48小時)至第6天(144小時)β-gal陽性細胞數(shù)顯著增加(圖8A)，表明β-gal VLP在A8細胞中擴增和傳播。相反，在感染的正常BHK21細胞中僅檢測到幾個陽性細胞，并且在KUN復制子VLP感染后第2天至第6天細胞中β-gal陽性細胞數(shù)幾乎沒有改變(圖8A)。另外，從感染后第2天起，在KUN repPAC/β-gal VLP感染的A8KUN包裝細胞中的β-gal陽性細胞數(shù)比在正常BHK21細胞中的多很多(圖8A)，表明復制子VLP的擴增和傳播在早期第2天即存在。
β-gal分析溶解的KUN復制子VLP感染的細胞表明在感染A8細胞后從第2天至第6天感染保溫期間β-gal表達有一約3倍的增加(圖8B)，相比之下感染正常BHK21相比后從第2天至第6天感染保溫期間β-gal表達僅增加1.3倍。從第2天至第6天repPAC/β-gal復制子VLP感染的A8包裝細胞正常BHK21細胞的β-gal表達的比率增加了2.3至5.2倍，因此進一步證實VLP通過在KUN復制子包裝細胞中傳播而擴增。從感染第2天至第6天觀察到的相對不高的增加(3至5倍)可能是由于新感染的老齡(鋪滿后2-6天齡)A8包裝細胞支持有效的KUN RNA復制的能力減弱所致，不是一定代表VLP的傳播效率低下。研究人員先前在許多實驗中已觀察到相對于活躍分裂的BHK細胞在老齡BHK細胞中KUN RNA復制效率較低。總之，上述數(shù)據(jù)表明KUN RNA復制子VLP可以在復制子包裝細胞(A8細胞系)中擴增和傳播。
討論我們已在本文描述了一種用表達KUN病毒結構基因的四環(huán)素誘導型穩(wěn)定包裝細胞系tetKUNCprME將黃病毒復制子RNA衣殼化成病毒樣顆粒的新的包裝系統(tǒng)。高達約4×108VLP/ml的VLP高效價以及多達10天的多次VLP收獲使得從單次初始電穿孔3×106個細胞的總收率達到約6.5×109VLP。這相對于先前開發(fā)的采用致細胞病變的SFV復制子RNA用于瞬時表達KUN結構基因的KUN復制子包裝系統(tǒng)(Khromykh et al，1998，J Virol 72 5967-5977；Varnavski & Khromykh1999，文獻同上)代表了一個大的進步，并且使得大規(guī)模商業(yè)生產(chǎn)KUN復制子VLP用于未來的疫苗和基因治療應用變得可行。在包裝細胞中產(chǎn)生的高效價KUN復制子VLP在疫苗中的用途通過在接種小鼠中產(chǎn)生針對來自呼吸道合胞病毒的編碼的免疫原的強CD8+T細胞應答而得以證實。另外，tetKUNCprME細胞能夠將登革病毒復制子包裝成分泌的感染性VLP，表明可以應用tetKUNCprME細胞從遠緣相關黃病毒生產(chǎn)衣殼化復制子的VLP。
本發(fā)明的誘導型包裝構建體克服了結構蛋白顯著的細胞毒性問題。另外，考慮到包括疫苗和/或蛋白質生產(chǎn)用途在內(nèi)的KUN復制子VLP的目的用途，本發(fā)明的誘導型包裝系統(tǒng)避免了在VLP制備物中存在抗生素。
在除去強力霉素時，在建立的tetKUNCprME細胞系中觀察到約30倍的KUN CprME mRNA轉錄和CprME表達的誘導，并且在誘導表達時在tetKUNCprME細胞中產(chǎn)生的KUN結構蛋白的量足以在KUN復制子RNA轉染后獲得高效價的分泌的感染性VLP。每毫升獲得了高達約4×108VLP的效價，這一收率等于或高于野生型KUN病毒在BHK細胞中的感染峰值時獲得的病毒效價(Khromykh &Westaway，1994 J Virol 68 4580-4588)。
重要的是，通過顱內(nèi)注射哺乳幼鼠而進行的最靈敏的檢測KUN病毒的方法清楚顯示在來自tetKUNCprME細胞的VLP制備物中不存在感染性KUN病毒。相比之下，表達新培斯病毒結構蛋白盒的BHK包裝細胞系每毫升產(chǎn)生1-5×108個新培斯病毒或SFV復制子VLP(Polo et al，1999，文獻同上)。這些α病毒復制子VLP制備物含有約105pfu/ml重組產(chǎn)生的感染性病毒。將結構蛋白分在包裝細胞系的兩個表達盒中看起來從這些病毒復制子VLP制備物中除去了污染使得感染性病毒呈不可檢出的水平，但是同時使復制子VLP的效價降至5×106-1×107VLP/ml(Polo et al，1999，文獻同上)。
在tetKUNCprME細胞中還實現(xiàn)了將DEN2復制子RNA包裝成分泌的VLP。
為了顯示高效價KUN復制子VLP在接種中的用途，在不同的小鼠株系中測試了兩種VLP。先前的研究顯示以每只小鼠至多106IU的劑量注射的KUN復制子VLP足以誘導能保護動物免受實驗性病毒和腫瘤攻擊的免疫應答(Anraku et al，2002，文獻同上)。使用在新的包裝細胞系中產(chǎn)生的VLP，在C57BL/6小鼠中證實了SIINFEKL特異性CD8T細胞對于KUN-Mpt VLP的劑量反應，其中增加劑量的VLP導致誘導的CD8T細胞的數(shù)目增加。另外，用2.5×107IU的編碼RSV M2基因的tetKUNCprME衍生的KUN復制子VLP單次接種免疫BALB/c小鼠，用體外(ex vivo)IFNγELISPOT分析測得每106個脾細胞誘導出1400個SYIGSINNI特異性CD8T細胞，在鉻釋放分析中在效應子∶靶細胞比率為2∶1時測得＞45％的溶解。
總之，本發(fā)明提供了一種能夠產(chǎn)生大量的、高效價的不含感染性病毒的分泌的KUN復制子病毒樣顆粒的包裝系統(tǒng)，并證實用這些顆粒免疫接種誘導了針對所編碼的免疫原的強免疫應答。因此證明所述包裝細胞系應該能夠用于制造基于KUN復制子的疫苗。另外，所述的包裝細胞系也能夠包裝其它黃病毒復制子，應該可以用于對黃病毒RNA包裝和病毒組裝的基礎研究中以及用于開發(fā)基于不同黃病毒復制子的基因表達系統(tǒng)。
本說明書的目的是描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，而不是限制本發(fā)明于任何一個實施方案或特征的具體組合。因此，本領域技術人員應該理解在說明書的基礎上可以對舉例示出的特定實施方案進行各種修飾和改變而不偏離本發(fā)明的范圍。
本說明書中引用的每一專利和科學文章、計算機程序和算法以其全文引入本文作參考。
表1 不同的tetKUNCprME細胞克隆的步驟效率
*2×106個細胞用約15微克的KUN復制子RNA即RNALeu電穿孔，電穿孔后53小時收獲的分泌的VLP的效價通過在Vero細胞上滴定而確定。
表2 CprME表達誘導時間對VLP生產(chǎn)的作用
*CprME表達的誘導通過在用RNALeu RNA電穿孔后所示時間除去強力霉素而起始。
表3 在tetKUNCprME包裝細胞系中編碼不同異源基因的分泌的KUN復制子VLP的產(chǎn)量
a-d3×106個細胞用約20微克RNA電穿孔，接種于1個10cm培養(yǎng)皿上，并在不同體積的培養(yǎng)基中溫育不同時間，之后收獲VLP。在每一培養(yǎng)皿中6mla、5mlb、10mld培養(yǎng)基用于最初VLP收獲并替換收獲的VLP以允許進一步的VLP生產(chǎn)和收獲。c10ml培養(yǎng)基在第4天和第6天收獲，15ml培養(yǎng)基在第10天收獲。
e3×106個電穿孔細胞接種在兩個10cm培養(yǎng)皿上，每一培養(yǎng)皿的細胞在10ml培養(yǎng)基中溫育，在每一指明的收獲日期用10ml新鮮培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基。通過組合每次收獲獲得的VLP量來計算總VLP產(chǎn)量?！?”表明在此時沒有收獲VLP，并且培養(yǎng)基保持不變至下一次收獲。
表4 在tetKUNCprME包裝細胞中具有不同細胞適應性突變的KUN復制子RNA包裝成VLP的包裝效率(pfu/ml)
權利要求
1.一種用于在動物細胞中調控型表達黃病毒結構蛋白的包裝構建體，所述載體包含一種與一種核苷酸序列可操縱地連接的可調控啟動子，所述核苷酸序列編碼一種包含C蛋白、prM蛋白和E蛋白的黃病毒結構蛋白翻譯產(chǎn)物。
2.權利要求1的包裝構建體，其中所述可調控啟動子是四環(huán)素阻抑型的。
3.權利要求2的包裝構建體，其中所述可調控啟動子是四環(huán)素阻抑型的CMV啟動子。
4.權利要求1的包裝構建體，其中所述核苷酸序列編碼一或多種分別與C蛋白、prM蛋白或E蛋白有至少80％氨基酸序列相同性的變異的或突變的黃病毒結構蛋白。
5.權利要求1的包裝構建體，進一步包含一種IRESNeo選擇標記核苷酸序列。
6.權利要求1的包裝構建體，其中所述C蛋白、prM蛋白和E蛋白是Kunjin病毒的結構蛋白。
7.一種包含權利要求1的包裝構建體的包裝細胞。
8.一種包含權利要求2的包裝構建體和一種四環(huán)素反式激活蛋白構建體的包裝細胞。
9.權利要求7或8的包裝細胞，其是BHK21細胞。
10.一種黃病毒包裝系統(tǒng)，其包含(i)權利要求1的包裝構建體；和(ii)一種黃病毒表達構建體，其包含(a)一種黃病毒復制子；(b)一種異源核酸；和(c)一種與所述復制子可操縱連接的啟動子。
11.權利要求10的黃病毒包裝系統(tǒng)，其中所述黃病毒復制子是Kunjin病毒復制子、登革病毒復制子或西尼羅病毒復制子。
12.權利要求10的黃病毒包裝系統(tǒng)，其中所述異源核酸編碼一或多種可在動物細胞中表達的蛋白質。
13.權利要求12的黃病毒包裝系統(tǒng)，其中所述一或多種蛋白質是免疫原性的。
14.權利要求10的黃病毒包裝系統(tǒng)，其中所述復制子編碼一或多種突變的結構蛋白。
15.權利要求14的黃病毒包裝系統(tǒng)，其中所述突變的結構蛋白包含選自如下一組的一種突變(i)NS1非結構蛋白中亮氨酸殘基250被脯氨酸取代；(ii)非結構蛋白NS2A中丙氨酸30被脯氨酸取代；(iii)非結構蛋白NS2A中天冬酰胺101被天冬氨酸取代；和(iv)非結構蛋白NS5中脯氨酸270被絲氨酸取代。
16.權利要求10的黃病毒包裝系統(tǒng)，其中所述可調控啟動子是四環(huán)素阻抑型的。
17.權利要求16的黃病毒包裝系統(tǒng)，其中所述可調控啟動子是四環(huán)素阻抑型的CMV啟動子。
18.一種包含權利要求10的黃病毒包裝系統(tǒng)的包裝細胞。
19.一種包含權利要求17的黃病毒包裝系統(tǒng)的包裝細胞。
20.權利要求10的包裝細胞，其是BHK21細胞。
21.一種產(chǎn)生黃病毒VLP的方法，包括如下步驟(i)將權利要求1的包裝構建體導入一種宿主細胞以產(chǎn)生包裝細胞；(ii)向所述包裝細胞中導入一種黃病毒表達構建體，所述黃病毒表達構建體包含(a)一種黃病毒復制子；(b)一種異源核酸；和(c)一種與所述復制子可操縱連接的啟動子；以及(iii)誘導所述包裝細胞產(chǎn)生一或多種VLP。
22.由權利要求21的方法產(chǎn)生的黃病毒VLP。
23.一種免疫治療組合物，其包含權利要求22的VLP和一種藥物學可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
24.權利要求23的免疫治療組合物，其是疫苗。
25.一種生產(chǎn)重組蛋白的方法，包括用權利要求21的VLP感染宿主細胞的步驟，由此編碼所述蛋白質的所述異源核酸在所述宿主細胞中表達。
26.權利要求25的方法，其中所述宿主細胞是哺乳動物細胞。
27.一種免疫接種動物的方法，包括將權利要求23的免疫治療組合物給予動物以在所述動物中誘導免疫應答。
28.權利要求27的方法，其中所述動物是哺乳動物。
29.權利要求28的方法，其中所述哺乳動物是人。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種四環(huán)素調控型黃病毒包裝系統(tǒng)，其利于動物細胞中黃病毒RNA復制包裝及病毒樣顆粒產(chǎn)生所必需的黃病毒結構蛋白的表達。這種調控型包裝系統(tǒng)與Kunjin、登革和西尼羅病毒及其它基于黃病毒復制子的表達系統(tǒng)相容，并產(chǎn)生出乎意料的高效價病毒顆粒。這種包裝系統(tǒng)的一種特殊應用是產(chǎn)生病毒樣顆粒，所述病毒樣顆粒包裝包含黃病毒復制子并編碼異源蛋白質或肽的RNA以在動物細胞中表達。更特別地，所述包裝系統(tǒng)能輸送誘導保護性CD8 T細胞介導的免疫應答的免疫原。
文檔編號C12N5/10GK1798845SQ200480015488
公開日2006年7月5日 申請日期2004年6月7日 優(yōu)先權日2003年6月6日
發(fā)明者亞歷山大·A.·赫羅梅赫 申請人:昆士蘭大學