專利名稱：表達病毒大包膜蛋白和目的蛋白融合體的病毒載體的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明通常涉及用于遞送目的多肽至受試者的病毒樣顆粒(VLPs)和編碼其的核酸分子。特別地，本發(fā)明利用禽類嗜肝DNA病毒顆粒的特性產(chǎn)生穩(wěn)定的重組VLPs，VLPs用于向受者遞送目的多肽。所述目的多肽可包含一種或多種能引起免疫應(yīng)答的抗原。包含所述目的多肽的VLPs用于將抗原遞送至受試者的免疫系統(tǒng)或用于抗原決定部位呈遞以在體外測定中檢測抗體。本發(fā)明擴展至用于產(chǎn)生、生產(chǎn)、遞送和監(jiān)控本發(fā)明VLPs的質(zhì)粒、細胞、試劑盒和方法。
現(xiàn)有技術(shù)描述在本說明書中由著者參考的文獻的詳細目錄匯集于說明書的結(jié)束部分。
此處對于現(xiàn)有技術(shù)的引用(包括任何一個或多個現(xiàn)有技術(shù)文獻)并不被認為承認或暗示所述現(xiàn)有技術(shù)是本領(lǐng)域狀態(tài)的一部分。
嗜肝DNA病毒是有包膜DNA病毒家族。哺乳動物嗜肝DNA病毒例如B型肝炎病毒的裝配非常復(fù)雜，并且成熟的病毒體是通過預(yù)先形成的細胞質(zhì)核心顆粒與在宿主內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)膜上預(yù)先裝配的表面蛋白的相互作用形成的。在與包膜蛋白的合適部分相互作用后，核殼與超過1000倍空的亞病毒顆(SVPs)一起出芽進入ER的腔中并在中間體前高爾基體區(qū)室中完成裝配(由Nassal，M.的綜述，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，214297-337，1996)。
在許多研究中，缺少核殼的病毒樣顆粒(VLPs)已被證明是很有前景的候選疫苗，因為其(i)是非感染性的并因此對生產(chǎn)和應(yīng)用是安全的，(ii)因為其提供抗原決定部位呈遞的必需空間結(jié)構(gòu)因此比亞單位疫苗更具免疫原性，和(iii)引起體液、細胞介導(dǎo)的和重要的粘膜免疫(Krueger等人，Biol.Chem.380275-276，1999)。
近來成功的VLP疫苗的例子(目前正在臨床實驗中)是重組的乳頭瘤病毒主要衣殼蛋白(L1)VLP，所述衣殼蛋白通過誘導(dǎo)強中和抗體應(yīng)答預(yù)防感染(Frazer，Virus Research，89271-274，2002)。
B型肝炎病毒(HBV)亞病毒顆粒(HBsAg-S)已被看作產(chǎn)生重組VLPs的候選者。幾個研究已考察了適合插入外源抗原決定部位的結(jié)構(gòu)域(Bruss等人，EMBO J.132273-2279，1994.，1994；Delpeyroux等人，J.Mol.Biol.195343-350，1987)，所述結(jié)構(gòu)域包括preS結(jié)構(gòu)域的N端融合(Prange等人，J.Gen.Virol.762131-2140，1995)。
最近，攜帶E2包膜蛋白C型肝炎病毒(HCB)高變區(qū)1的小的35個氨基酸的插入物的顆粒已成功地引起了抗體反應(yīng)(Netter等人，J.Virol.752130-2141，2001)，所述插入物插入至位于第二親水環(huán)上的暴露的“a”決定簇。特別地，當顆粒在哺乳動物細胞體統(tǒng)中產(chǎn)生時存在著顆粒穩(wěn)定性和所述HBsAg的‘a(chǎn)’決定簇的免疫反應(yīng)性丟失所能容忍的插入片段大小的限制(Prange等，1995，同上述；Bruss等人，J.Virol.653813-3820，1991)。
近來通過在酵母中表達登革熱病毒/HBsAg融合體已經(jīng)克服了具有巨大融合物的顆粒的不穩(wěn)定性(Bisht等人，J.Biotechnology.9997-110，2002)。
然而，在所有這些情況下，為了裝配嵌合顆粒，重組S蛋白必須與野生型S亞單位一起裝配。這些擴展的S鏈給包入至由所述HBsAg(包括L)形成的緊密的包膜網(wǎng)絡(luò)中帶來困難，因此它們的數(shù)目是受限的，并且對外源抗原決定部位產(chǎn)生的免疫應(yīng)答較低。
因此，需要改進的有效地整合目的多肽的VLPs。
發(fā)明概述在整個本發(fā)明書和以下的權(quán)利要求中，除非上下文有另外要求，單詞“包括”和變體“包含”及“含有”將被理解為表示包括所述的實體或步驟或成組的實體或步驟，但不排除任何其它的實體或步驟或成組的實體或步驟。
通過序列標識號(SEQ ID NO)表示核苷酸和氨基酸序列。SEQID Nos在數(shù)字上對應(yīng)序列標志<400>1、<400>2等。表1提供了序列標志概述。在權(quán)利要求之后提供了序列表。
鴨B型肝炎病毒(DHBV)和其它禽類嗜肝DNA病毒的包膜蛋白由兩種蛋白即大包膜蛋白(L)和小包膜蛋白(S)構(gòu)成，包膜蛋白通過來自單個preS/S開放閱讀框的不同框內(nèi)翻譯起始位點產(chǎn)生。L和S多肽具有共同的C端跨膜區(qū)或S結(jié)構(gòu)域，而L具有大約160個氨基酸的包含受體結(jié)合區(qū)域的N端延伸(或preS結(jié)構(gòu)域)。所述S多肽是主要的病毒包膜組成部分，其決定包膜的曲率并且甚至在核殼不存在的情況下可驅(qū)動顆粒分泌。相反地L多肽只能在與S共裝配時被轉(zhuǎn)運出去。
DHBV包膜蛋白的裝配和其涉及進入宿主細胞與由嗜肝DNA病毒采用的獨特的拓撲學(xué)轉(zhuǎn)換緊密相關(guān)，其中L蛋白的大N端preS結(jié)構(gòu)域是在翻譯后被轉(zhuǎn)運跨越ER膜的。該過程是受調(diào)控的，這樣通常只有大約50％的分子具有轉(zhuǎn)運的N末端并且成熟的顆粒含有混合的內(nèi)部/外部拓撲結(jié)構(gòu)，包括部分轉(zhuǎn)運的或中間體形式。
本發(fā)明部分根據(jù)下列驚人的發(fā)現(xiàn)DHBV的L多肽的大部分區(qū)域?qū)τ贚轉(zhuǎn)運和顆粒裝配是無關(guān)緊要的，包括在S結(jié)構(gòu)中與顆粒裝配所必需的S多肽的區(qū)域具有相同氨基酸序列的區(qū)域。因此，L多肽在其顆粒結(jié)合上比S多肽更加靈活并因此可進行更廣泛的操作。
因此本發(fā)明提供了主要包含小包膜(S)多肽或其功能衍生物或同源物的病毒樣顆粒(VLPs)。此外，并且根據(jù)本發(fā)明，其包含含有目的多肽(POI)和至少大包膜(L)多肽的顆粒結(jié)合部分或其功能性衍生物或同源物的融合多肽。因為L多肽在VLP裝配期間不被排除并且因為其可在不會顯著地影響顆粒穩(wěn)定性的情況下被廣泛地應(yīng)用于運載異源多肽，本發(fā)明的VLP在遞送目的多肽至受試者方面尤其有用。此外，由于抗原性POI的抗原決定部位被有效地展現(xiàn)于VLP中，所述VLPs可用于檢測抗體的測定中。
本發(fā)明對DHBV進行特別的描述，但是本發(fā)明也擴展至來自其它具有L和S包膜多肽蛋白的病毒的L和S多肽，其中L不會從顆粒裝配中被排除。例如，也涉及來自其它禽類嗜肝DNA病毒的L和S多肽，包括例如但不限于蒼鷺(HHBV)、雪雁(SGHBV)和與DHBV表現(xiàn)相似亞顆粒形態(tài)學(xué)即具有L和S包膜蛋白的嗜肝DNA病毒。在所有嗜肝DNA病毒中L和S多肽的S結(jié)構(gòu)域高度保守，例如在TM1和TM2之間的區(qū)域表現(xiàn)出高達70％的氨基酸相似性。
本發(fā)明提供了病毒樣顆粒(VLP)，其包含i)包含目的多肽和至少禽類嗜肝DNA病毒的大包膜(L)多肽的顆粒結(jié)合部分或其功能性衍生物或同源物的多肽，和ii)禽類嗜肝DNA病毒的小包膜(S)多肽或其功能性衍生物或同源物。
本發(fā)明進一步提供病毒樣顆粒(VLP)，其包括i)包含目的多肽(POI)和至少DHBV的大包膜(L)多肽的顆粒結(jié)合部分或其功能性衍生物或同源物的融合多肽，和ii)DHBV的小包膜(S)多肽或其功能性衍生物或同源物。
通過將一個或多個POIs引入L多肽，所述POI與L一起被轉(zhuǎn)運入主要由S多肽構(gòu)成的顆粒結(jié)構(gòu)中。
盡管提供了幾個L多肽顆粒結(jié)合部分的例子，但根據(jù)此處提供的教導(dǎo)，產(chǎn)生更小或更大的L多肽部分和確定其與目的異源(或內(nèi)源)蛋白一起是否能在VLP內(nèi)結(jié)合成顆粒在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的技術(shù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明絕不受限于作為示例的構(gòu)建體。
本發(fā)明的病毒樣顆粒用于疫苗組合物以提高有效的免疫應(yīng)答。在特定的實施方案中，所述病毒樣顆粒具有有利地被抗原呈遞細胞例如樹突細胞吸收的合適大小。例如，DHBV VLPs顯著大于哺乳動物的HBVVLPs。
使用包含編碼與S多肽分開地或一起的重組L多肽的核酸分子的表達質(zhì)粒制備本發(fā)明的重組VLPs。表達質(zhì)粒以便利地適合于在酵母、桿狀病毒或禽類或哺乳動物的表達系統(tǒng)中表達的形式存在。包含編碼本發(fā)明重組L多肽的的核酸分子的質(zhì)粒也可用于將核酸構(gòu)建體直接遞送至受試者的細胞中。
可選擇地，提供試劑盒以幫助本發(fā)明融合蛋白的重組生產(chǎn)。
本發(fā)明進一步提供了用于產(chǎn)生重組病毒樣顆粒和包含來自禽類嗜肝DNA病毒或其它非L排除病毒的L和S多肽的病毒樣顆粒的組合物以用作疫苗或抗原資源的方法，其中所述L多肽包含一個或多個來源于一個或多個異源來源的目的抗原。
附圖概述

圖1是用于產(chǎn)生pCDL-E2.465的克隆策略的概述。
圖2A是DHBV的大(L)和小(S)包膜蛋白的概述。L和S由來自單個開放閱讀框的差異翻譯產(chǎn)生，這樣L蛋白由161個氨基酸的preS結(jié)構(gòu)域和167個氨基酸的C端S結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其包含S蛋白。通過方框表示三個跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)。
圖2B表示HCV E2胞外域(從氨基酸384至465)的82個氨基酸部分插入L的pres結(jié)構(gòu)域的位置，產(chǎn)生E2.465/L嵌合包膜蛋白。
圖2C提供顯示所述E2.465/L嵌合體被運送穿過ER的Western印跡的結(jié)果。用于蛋白酶保護分析的ER微粒體制備自用pCDL-E2.465和pCI-S(小S蛋白表達質(zhì)粒)轉(zhuǎn)染的LMH細胞。如上面各泳道標示的，在去垢劑NP-40存在或不存在的情況下用胰蛋白酶降解所述微粒體樣品或不作處理。通過SDS-PAGE和用可同時檢測E2.465/L和S蛋白的單克隆抗S抗體進行Western印跡雜交分析E2.465/L鏈的蛋白酶保護。E2.465/L免受胰蛋白酶降解(中間的泳道)表示轉(zhuǎn)運至ER腔中。
圖2D提供了顯示E2.465/L嵌合體被裝配成顆粒的Western印跡的結(jié)果。通過冷凍-解凍細胞3次、離心以獲取胞質(zhì)部分并通過從20％蔗糖至70％蔗糖的梯度在38,000r.p.m(SW41 rotor Beckman)下沉降顆粒來從用pCDL-E2.465和pCI-S轉(zhuǎn)染的禽類肝細胞瘤(LMH)細胞中分離細胞內(nèi)顆粒。在SDS-PAGE和通過Western印跡雜交分析包膜蛋白之前用甲酵沉淀20-70％蔗糖界面上的顆粒級分。
圖2E模仿L蛋白在ER(描述為微粒體囊)上的膜定位，表示翻譯后轉(zhuǎn)運至賦予E2.465/L雜合鏈免受胰蛋白酶降解的保護作用的微粒體腔內(nèi)。在顆粒裝配過程中，被裝配的包膜蛋白通過ER膜的內(nèi)葉面從ER出芽至ER腔內(nèi)。顆粒通過細胞囊泡運出途徑從細胞運出，使得可以分離來自細胞質(zhì)(如D中顯示)和細胞外區(qū)室的顆粒。如顆粒的草圖所表示的，轉(zhuǎn)運至ER腔的包膜蛋白結(jié)構(gòu)域最終被暴露于所述裝配顆粒的外側(cè)。
圖3是表示DHBV的基因組核苷酸序列的說明。
圖4提供DHBV的L和S多肽的氨基酸序列。起始位點用下劃線標記而終止位點以星號(*)標記。
圖5A是DHBV L和DHBV S蛋白的概述。
圖5B至5H是DHBV L嵌合體的概述。用方框標記的TM1-3表示跨膜結(jié)構(gòu)域。沿著DHBV L長度方向的數(shù)字代表相對于DHBV L序列的氨基酸位置。V表示TM1內(nèi)的缺失。
圖6A和6B是表示用pSigLΔTM1-E2.661(A)或pCDLΔTM1-MSP2(B)轉(zhuǎn)染的LMH細胞的膜部分的Western印跡結(jié)果的概述。MV標記(40-120kDa)用于表示嵌合體L蛋白的大小。
圖7A和7B是表示來自蔗糖分級梯度級分的Western印跡的概述，所述Western印跡顯示D1/S(A)和在酵母中產(chǎn)生的嵌合L VLPs、DLΔTM1-E2.465/S(B)和DLΔTM1-HpreS(C)具有相同的顆粒密度。將產(chǎn)生于酵母的通過20％蔗糖至70％蔗糖梯度的VLPs進一步在20-70％蔗糖分級梯度中在38,000rpm下進行沉降5小時。將從梯度中(號碼2-11)收集的級分在SDS-PAGE上跑膠并用抗DHBV S結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體進行Western印跡雜交。
圖8是表示DHBV L蛋白的Western印跡的概述，其中用經(jīng)酵母產(chǎn)生的DL/S VLPs免疫過的一只大鼠的順序釋放的血檢測所述蛋白。Pre表示免疫前所取的血，并且編號1-5表示在第3，6，9和13周獲得的大鼠血清。
表1
發(fā)明詳述本發(fā)明是部分基于下列發(fā)現(xiàn)DHBV的L多肽可被顯著地修飾但仍保持在病毒樣顆粒裝配的過程中與DHBV的S多肽結(jié)合的能力。
此處建議使用L多肽或其功能性衍生物或同源物遞送目的多肽或肽至受試者。特別地，建議使用L多肽遞送作為病毒樣顆粒部分的目的抗原至受試者的免疫系統(tǒng)。
在廣泛的實施方案中本發(fā)明提供了包含融合(嵌合)多肽的病毒樣顆粒(VLP)，所述融合多肽包含目的多肽(POI)和大包膜(L)多肽的顆粒結(jié)合部分。
所述病毒樣顆粒主要由小包膜(S)多肽構(gòu)成。
因此，本發(fā)明進一步提供了VLP，所述VLP包含i)含有目的多肽(POI)和至少大包膜(L)多肽的顆粒結(jié)合部分或其功能性衍生物或同源物的融合多肽，和ii)禽類嗜肝DNA病毒的小包膜(S)多肽或其功能性衍生物或同源物。
更特別地，本發(fā)明進一步提供了VLP，其包括i)包含目的多肽(POI)和至少DHBV的大包膜(L)多肽的顆粒結(jié)合部分或其功能性衍生物或同源物的融合多肽，和ii)DHBV的小包膜(S)多肽或其功能性衍生物或同源物。
優(yōu)選地至少部分所述POI暴露于所述病毒樣顆粒的表面。
術(shù)語“病毒樣顆?！痹谄渥顝V義上用于表示顆?；蛉S蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，其象有包膜病毒的亞病毒顆粒一樣通過脂雙層內(nèi)的包膜多肽自組配或折疊形成顆粒。本發(fā)明的病毒樣顆粒可以是重組或合成的，或可包含合成或重組成分的組合。
除非上下文清楚地指出，否則此處涉及的單數(shù)形式例如“a”、“an”或“the”包括復(fù)數(shù)方面。因此，例如“a polypeptide of interest”包括單個多肽以及二個或多個這樣的多肽。
此處涉及的術(shù)語“多肽”是指氨基酸的聚合物并且不應(yīng)當受任何特定長度的限制。因此，所述術(shù)語包括蛋白質(zhì)、寡肽、肽和抗原決定部位。所述術(shù)語不排除多肽的修飾，例如肉豆蔻基化、糖基化、磷酸化、加上N端信號序列等。包括在此定義范圍內(nèi)的是，例如含有一個或多個氨基酸(例如包括，非天然氨基酸例如在表面2中所給出的氨基酸)類似物的多肽或具有取代連接的多肽。
此處涉及的類似物包括但不限于對側(cè)鏈的修飾、在肽、多肽或蛋白質(zhì)合成過程中整合入非天然氨基酸和/或其衍生物以及使用交聯(lián)劑和對蛋白質(zhì)分子或其類似物施以構(gòu)象限制的其它方法。
本發(fā)明涉及的側(cè)鏈修飾的例子包括氨基官能團的修飾，例如通過與醛反應(yīng)然后用NaBH4還原進行的還原烷基化、用甲基乙酰亞胺酸酯進行乙酰亞胺化、用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)對氨基官能團三硝基芐化、用琥珀酸酐和四氫鄰苯二甲酸酐?；被倌軋F，和用吡哆醛-5-磷酸接著用NaBH4還原來吡哆醛化賴氨酸。
精氨酸殘基的胍基官能團可通過與反應(yīng)物例如2，3-丁二酮、苯甲酰甲醛和乙二醛形成雜環(huán)縮合產(chǎn)物進行修飾。
羧基官能團可通過碳二亞胺活化來修飾，碳二亞胺活化是通過形成O-?；愲迦缓笱苌癁槔缦鄳?yīng)的酰胺來進行的。
巰基官能團可通過某些方法進行修飾，所述方法為例如用碘乙酸或碘乙酰胺進行羧基甲基化、過甲酸氧化成磺基丙氨酰、與其它硫醇化合物形成混合二硫化物、與順丁烯二酰亞胺、順丁烯二酐或其它取代順丁烯二酰亞胺反應(yīng)、使用4-氯汞苯甲酸、4-氯汞苯磺酸、氯苯汞、2-氯汞-4-硝基酚和其它汞化物形成汞衍生物；在堿性pH下用氰酸進行甲氨?；皇榛腚装彼釟埢?。
色氨酸殘基可通過例如用N-溴琥珀酰亞胺氧化或用2-羥基-5-硝基芐溴或sulphenyl halide烷基化吲哚環(huán)來進行修飾。另一方面，酪氨酸殘基可通過用四硝基甲烷形成3-硝基酪氨酸衍生物來進行改變。
組氨酸殘基咪唑環(huán)的修飾可通過用碘乙酸衍生物進行烷基化或用二乙基焦碳酸鹽進行N-乙酯基化。
在肽合成過程中整合入非天然氨基酸和衍生物的例子包括但不限于使用正亮氨酸、4-氨基丁酸、4-氨基-3-羥基-5-苯戊酸、6-氨基己酸、叔丁基甘氨酸、正纈氨酸、苯基甘氨酸、鳥氨酸、肌氨酸、4-氨基-3-羥基-6-甲基庚酸、2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D型同分異構(gòu)體。此處涉及的非天然氨基酸的目錄顯示于表2。
表2非常規(guī)氨基酸代碼
例如，可使用交聯(lián)劑穩(wěn)定3D構(gòu)象，使用同源雙功能交聯(lián)劑例如具有(CH2)n(n＝1至n＝6)間隔子官能團的雙功能亞胺酯、戊二醛、N-羥基琥珀酰亞胺酯和異雙功能試劑，所述異雙功能試劑通常含有氨基反應(yīng)性部分例如N-羥基琥珀酰亞胺和另外的基團特異性反應(yīng)性部分例如馬來酸亞胺或二硫部分(SH)或碳二亞胺(COOH)。此外，通過例如整合入Cα和Nα-甲基氨基酸和在氨基酸的Cα和Cβ原子之間引入雙鍵可限制肽的構(gòu)象。
術(shù)語“融合多肽”或“嵌合多肽”或“雜合多肽”可交互使用，表示包含兩個或更多個相連的作為同一表達產(chǎn)物中的部分表達的或通過合成方式產(chǎn)生的多肽、蛋白質(zhì)或肽。融合多肽可包含兩個或多個L和POI多肽和間隔區(qū)域，例如連接體或間隔子區(qū)域。特別地，允許或直接地或間接地有助于表面拓樸學(xué)或在顆粒中增加目的多肽對蛋白酶的抗性的區(qū)域是想要的，例如N端信號序列。信號序列的例子是前催乳激素，然而，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，還有許多其它合適的信號序列。間隔子區(qū)域的例子是跨膜結(jié)構(gòu)域?？蛇x擇的或此外，可包括促進胞質(zhì)拓撲學(xué)的區(qū)域。可通過蛋白酶保護測定或通過確定與抗體的相互作用來估測病毒顆粒中的多肽拓撲學(xué)，所述相互作用由L多肽、S多肽、目的多肽或由這些多肽的融合產(chǎn)生的抗原決定部位決定。因此，“融合多肽”中的術(shù)語“融合”不是“病毒融合”的意思。
術(shù)語“目的多肽”是指任何有利地作為病毒樣顆粒的部分被遞送至受試者的多肽。例如，涉及促進和/或介導(dǎo)特定生物化學(xué)或生理學(xué)反應(yīng)的兩個或多個多肽或多肽的基質(zhì)可以病毒顆粒的形式被遞送至受試者。所涉及的特定反應(yīng)是對抗原的免疫應(yīng)答。因此所述術(shù)語包括任何目的抗原性多肽。抗原性多肽可與免疫強化多肽例如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的細胞因子共表達。本發(fā)明的多肽和肽(POIs)可進一步與作為靶向和/或標記分子的分子在L中表達或合成，所述靶向和/或標記分子是例如，但不限于，幫助靶向和/或標記特定細胞例如樹突細胞或其它抗原呈遞細胞的分子。
此處所使用的“受試者”是指動物，優(yōu)選地是哺乳動物和更優(yōu)選地是可從本發(fā)明的病毒顆粒的施用中獲益的人。對從此處描述的分子中獲益的動物類型沒有限制。無論是人或非人動物的患者都可稱作個體、受試者、動物、宿主或受者。本發(fā)明的分子和方法應(yīng)用于人醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)以及通常地于馴養(yǎng)或野生動物的飼養(yǎng)中。為方便，“動物”包括禽類物種例如家禽禽類、鳥類飼養(yǎng)場的鳥類或獵禽。
所述優(yōu)選的動物是人或其它靈長類、家畜動物、實驗室測試動物、陪伴動物或捕獲的野生動物。
實驗室測試動物的例子包括鴨子、雪雁、小鼠、大鼠、兔子、豚鼠和倉鼠。兔和嚙齒動物例如大鼠和小鼠提供了方便的測試系統(tǒng)或動物模型。家畜動物包括綿羊、母牛、豬、山羊、馬和驢。也涉及非哺乳動物例如鳥類品種，斑馬魚和兩棲類動物。
術(shù)語“抗原”或“抗原性多肽”廣義上包括能在受試者中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的多肽。所述抗原性多肽可包括單個抗原決定區(qū)域到多個包括重復(fù)抗原決定部位區(qū)域的抗原決定部位區(qū)域。盡管涉及來自傳染性因子的抗原例如病毒、細菌、真菌、原生動物、吸蟲、線蟲、朊病毒等以及腫瘤相關(guān)的抗原，所述抗原性多肽可來自單個或多個來源。許多因子和腫瘤相關(guān)蛋白的抗原性區(qū)域在本領(lǐng)域是眾所周知的?？乖抢鐏碜约纳x、細菌、病毒、癌癥的抗原和此處描述的包括來自肝炎的E2多肽、來自瘧原蟲(P.falciparum)的MSP2多肽和來自麻疹的H蛋白的抗原。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，預(yù)防性或治療性疫苗的有效免疫通常會引起強烈的CTL和T輔助細胞應(yīng)答以及強烈的體液應(yīng)答。
所述目的抗原性多肽可包含來自一個或多個來自不同生物體、物種或亞種的多肽的抗原決定部位區(qū)域。例如，可對病毒和細菌或多個病毒或多個細菌的感染同時進行接種疫苗。
短語“顆粒結(jié)合部分”是指，對所有L多肽而言，用來將L多肽整合至病毒樣顆粒中所需的L多肽的部分。例如，L的S結(jié)構(gòu)域的TM1區(qū)域?qū)τ贚與所述顆粒的締合不是必需的因此可從此處使用的L多肽中略去。事實上，如此處所提到的，L多肽的TM1下游序列(或TM2和5’半胱氨酸環(huán)的下游)足以滿足顆粒結(jié)合。類似地，L的preS結(jié)構(gòu)域不是將L裝配入顆粒中所需要的。缺少TM1的L的S結(jié)構(gòu)域是L的顆粒結(jié)合部分的例子。很明顯，根據(jù)本發(fā)明許多不同的顆粒結(jié)合部分是可獲得的。該部分的特征是可變的，并且可使用本領(lǐng)公開的和此處提到的方法根據(jù)經(jīng)驗進行確定。
盡管L的最小功能性部分在一些應(yīng)用中是有利的，但本發(fā)明提供了間插有POI的全長L多肽或其中將POI附加在末端的全長L多肽。優(yōu)選地所述POI被引入至L的表面暴露部分。
術(shù)語“來源于”是指特定的組分或組分群來自于所描述的來源，但不一定需要從所述特定的來源直接獲得。
術(shù)語“分離的”包括指VLPs已經(jīng)過至少一個純化步驟，方便地以在樣品中純物質(zhì)的％來描述。優(yōu)選的形式包括在樣品中VLP物質(zhì)具有至少50％的純度、更優(yōu)選地至少60％、更優(yōu)選地至少70％、更優(yōu)選地至少大約80％、更優(yōu)選地至少大約90％。
本發(fā)明的一個有利方面是VLPs可以大體上一致的大小產(chǎn)生。
在本發(fā)明的另一方面，涉及分離的病毒樣顆粒(VLP)，其包含i)包含目的多肽(POI)和至少禽類嗜肝DNA病毒例如DHBV的大包膜(L)多肽的部分S結(jié)構(gòu)域或其功能性衍生物或同源物的融合多肽；和ii)禽類嗜肝DNA病毒例如DHBV的小包膜(S)多肽或其功能性衍生物或同源物，其中至少部分所述POI暴露于病毒樣顆粒的表面。
根據(jù)要求，可方便地使用信號序列以實現(xiàn)特定POI/L多肽在一些表達系統(tǒng)中的表達。如此處所描述的，強信號序列的存在也可用于增強在VLP表面表達的POI量。
示例性L部分是DHBV S結(jié)構(gòu)域的氨基酸24至167部分或，更優(yōu)選地至少是TM2(包括TM1和TM2之間的5’半胱氨酸環(huán))和DHBV的L多肽的下游序列。
在本發(fā)明的一個特定實施方案中，所述目的多肽位于L多肽的S結(jié)構(gòu)域氨基酸序列或除去TM1結(jié)構(gòu)域的S結(jié)構(gòu)域的氨基末端。在另一個實施方案中，所述POI位于L多肽的pre-S結(jié)構(gòu)域或L多肽的N末端。
通過向L的pre-S結(jié)構(gòu)域或L的S結(jié)構(gòu)域的N端或缺少TM1的S結(jié)構(gòu)域的N端引入一個或多個POIs，所述POI與L一起被轉(zhuǎn)運至主要由S多肽構(gòu)成的顆粒結(jié)構(gòu)中。這有利于每個VLP含有高拷貝數(shù)量的POI。
在一個實施方案中本發(fā)明的病毒樣顆粒用于疫苗組合物中以提高有效的免疫應(yīng)答。特別地，所述病毒樣顆粒具有有利地被抗原呈遞細胞例如樹突細胞吸收的合適大小。特別地，對于哺乳動物嗜肝DNA病毒顆粒，這些顆粒通常大約為20納米，而禽類嗜肝DNA病毒是多晶的并且直徑通常在35和60納米之間。有效的免疫應(yīng)答是能夠在受試者中減少靶抗原數(shù)量和可以預(yù)防感染或疾病狀況發(fā)展(預(yù)防性疫苗)或可治療當前的感染或疾病狀況(治療性接種)的應(yīng)答。
在不受限于任何特定理論的情況下，本發(fā)明的VLPs能夠刺激體液和/或細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。異源抗原被靶向至加工和呈遞MHC I類和II類抗原的合適途徑，并且被靶向至引起特別是T細胞應(yīng)答的樹突細胞。
在另一方面，優(yōu)選的L多肽包含或由基本上如SEQ ID NO7和SEQ ID NO9所列氨基酸序列，或與SEQ ID NO7和SEQ ID NO9具有至少50％相似性的氨基酸序列構(gòu)成。
甚至更優(yōu)選地，所述％相似性超過60％同一性、更優(yōu)選地70％同一性、然而更優(yōu)選地至少大約80％、而更優(yōu)選地大約90-95％的同一性。
優(yōu)選的L多肽來源于禽類嗜肝DNA病毒，例如但不限于DHBV。重要的是，應(yīng)用于本發(fā)明的嗜肝DNA病毒或包膜多肽不會從VLP裝配中排除L。
本發(fā)明L多肽的功能性衍生物包括親本分子的片段或部分，其保持L多肽與由S多肽形成的顆粒結(jié)合的能力，或至少其中這種能力沒有明顯丟失。
本發(fā)明的S多肽的功能性衍生物保留了S多肽形成病毒樣顆粒的能力，或至少這種能力沒有明顯丟失。
明顯丟失表示L顆粒與S以低于大約1∶1或優(yōu)選地低于1∶2，甚至更優(yōu)選地低于1∶3，而更優(yōu)選地低于1∶4的比例被裝配入顆粒中。
優(yōu)選的S多肽來源于禽類嗜肝DNA病毒，例如但不限于DHBV，或包含或由基本上由SEQ ID NO13所列氨基酸序列構(gòu)成。
術(shù)語“功能性衍生物”也擴展至具有一個或多個氨基酸突變或修飾的多肽。突變可來自氨基酸的添加、插入、缺失或替代。替代優(yōu)選地是下列組內(nèi)的保守氨基酸替代甘氨酸和丙氨酸；纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；絲氨酸和蘇氨酸；賴氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。修飾可包括添加增強病毒裝配或穩(wěn)定的側(cè)翼序列。
優(yōu)選地，衍生物與所述親本分子的全部或部分具有至少60％的氨基酸相似性，或更優(yōu)選地至少80％，或最優(yōu)選地90％或更大的相似性。
因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含融合多肽的VLP，所述融合多肽包含POI和L多肽的顆粒結(jié)合部分，其中所述L多肽包含基本如SEQ ID NO7或SEQ ID NO9所列的氨基酸序列或與其具有至少大約50％相似性的氨基酸序列，或其功能性衍生物或同源物。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含融合多肽的VLP，所述融合多肽包含POI和L多肽的顆粒結(jié)合部分，其中所述L多肽由基本如SEQ ID NO6或SEQ ID NO8所列的核苷酸序列或能夠在中等嚴緊條件下與SEQ ID NO6或SEQ ID NO8或其互補形式雜交的核苷酸序列編碼。
使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)例如此處描述或提及或Sambrook等人總結(jié)的技術(shù)，在體外或體內(nèi)裝配本發(fā)明的VLPs。特別地，產(chǎn)生用來表達一種或多種如此處描述的重組包膜蛋白的表達質(zhì)粒。
因此，在另一方面，本發(fā)明提供了用于裝配包含目的多肽(POI)和至少禽類嗜肝DNA病毒例如DHBV的大包膜多肽(L)的顆粒結(jié)合部分或其功能性衍生物或同源物的VLP的分離的或重組的多肽。
在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了當在細胞中表達時能夠裝配入VLP的重組多肽，所述多肽包含目的多肽(POI)和至少禽類嗜肝DNA病毒例如DHBV的大包膜多肽(L)的顆粒結(jié)合部分或其功能性衍生物或同源物。
優(yōu)選地，所述L的顆粒結(jié)合部分至少包括L的S結(jié)構(gòu)域或除去TM1結(jié)構(gòu)域的L的S結(jié)構(gòu)域或其功能性衍生物。
更優(yōu)選地，POI位于L的pre-S結(jié)構(gòu)域、或L的S結(jié)構(gòu)域的氨基末端側(cè)、或除去TM1結(jié)構(gòu)域的L的S結(jié)構(gòu)域。
根據(jù)本發(fā)明的這個方面，所述L多肽包含基本如SEQ ID NO7或SEQ ID NO9所列的氨基酸序列或包含與SEQ ID NO7或SEQ ID NO9具有至少50％相似性的氨基酸序列。
如此處所描述的，L多肽的顆粒結(jié)合部分由基本如SEQ ID NO7或SEQ ID NO9所列氨基酸序列或包含與SEQ ID NO7或SEQ ID NO9具有至少50％相似性的氨基酸序列的其功能性衍生物構(gòu)成。
禽類嗜肝DNA病毒表現(xiàn)相當高的序列同一性并且因此考慮具有高于70％相似性或同一性的序列。
本發(fā)明擴展至L多肽或其顆粒結(jié)合部分在制備VLP中的應(yīng)用，所述L多肽或其顆粒結(jié)合部分由基本如SEQ ID NO6或SEQ ID NO8所列的核苷酸序列或與SEQ ID NO6和SEQ ID NO8具有至少大約50％相似性的核苷酸序列或能夠在中等嚴緊雜交條件下與SEQ ID NO6或SEQ ID NO8的互補形式雜交的連續(xù)核苷酸序列編碼。
在本發(fā)明進一步方面，所述L多肽進一步包含信號序列。這樣的序列在增強POI在VLP的表面表達上特別有用。
優(yōu)選的L多肽是DHBV L多肽或其功能性衍生物。
而在另一方面，本發(fā)明提供了包含編碼適合用于生產(chǎn)重組VLP的融合多肽的核苷酸序列的核酸分子，其中所述核酸分子編碼POI和L多肽的顆粒結(jié)合部分，并且其中編碼L多肽的顆粒結(jié)合部分的核苷酸序列包含SEQ ID NO6或SEQ ID NO8所列的序列或能夠在低嚴緊雜交條件下與其或與其互補形式雜交的連續(xù)核苷酸序列，或其功能性衍生物或同源物。
而在另一方面，本發(fā)明提供了包含編碼適合用于生產(chǎn)重組VLP的融合多肽的核苷酸序列的核酸分子，其中所述核酸分子編碼POI和L多肽的顆粒結(jié)合部分，并且其中編碼L多肽顆粒結(jié)合部分的核酸編碼SEQ ID NO7或SEQ ID NO9所列的氨基酸序列或與其具有至少大約50％相似性的氨基酸序列或其功能性衍生物或同源物。
在另一方面，本發(fā)明提供了包含編碼適合用于生產(chǎn)重組VLP的融合多肽的核苷酸序列的核酸分子，其中所述核酸分子編碼POI和L多肽的顆粒結(jié)合部分，并且其中編碼L多肽顆粒結(jié)合部分的核酸編碼SEQID NO7或SEQ ID NO9所列的氨基酸序列。
另外本發(fā)明的另一方面提供了用于制備重組VLP的重組核酸分子，所述核酸分子包含編碼至少禽類嗜肝DNA病毒例如DHBV的L多肽的顆粒結(jié)合部分或其功能性衍生物或同源物的核苷酸序列，所述核苷酸序列包含一個或多個適合于接受第二個編碼一個或多個目的多肽的克隆位點，其中所述目的多肽作為與所述L多肽形成的融合多肽被表達。本發(fā)明的表達載體也可以方便地表達其它包膜蛋白例如L或，優(yōu)選地，S多肽。因此可常規(guī)地使用雙向或雙順反子啟動子以表達來自相同載體的重組L以及S多肽。此外，使用信號序列以增強POI的表達(包括表面表達)。明確包括含有本發(fā)明重組核酸分子的細胞和試劑盒。
因此本發(fā)明提供了將POI遞送至受試者或細胞的方法，其包括在包含來自禽嗜肝病毒例如DHBV的L多肽或其功能性衍生物或同源物的VLP中表達POI以使至少部分POI在VLP的表面表達。在一個方面，所述VLP在體外表達系統(tǒng)中產(chǎn)生。在另一方面，所述VLP在體內(nèi)產(chǎn)生。當POI是抗原性多肽時，優(yōu)選的細胞是免疫系統(tǒng)的細胞例如抗原呈遞細胞。
特別地提供了本發(fā)明的所有或部分核酸分子的互補形式。
本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易地認識到，術(shù)語“核酸”、“核苷酸”和“多核苷酸”包括RNA、cDNA、基因組DNA、合成形式或混合的聚合物、有義鏈和反義鏈，并且可以是化學(xué)或生化修飾的或可包含非天然的或衍生核苷酸堿基。這類修飾包括，例如，標記、甲基化、用類似物(例如嗎啉環(huán))替代一個或多個天然發(fā)生的核苷酸、核苷酸間修飾例如不帶電荷連接(例如，甲基磷酸酯、磷酸三酯、磷酰胺、氨基甲酸酯等)、帶電荷連接(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、側(cè)鏈部分(例如多肽)、插入物(例如吖啶、補骨脂素等)、螯合劑、烷化劑和被修飾的連接(例如α-異頭核酸等)。被包括的還有模仿多核苷酸通過氫鍵和其它化學(xué)相互作用與指定序列結(jié)合的能力的合成分子。這類分子在本領(lǐng)域是已知的并且包括，例如，用肽鍵替換分子主鏈中的磷酸鍵的分子。
此處所用的術(shù)語“相似性”包括在核苷酸和氨基酸水平上進行比較的序列之間的精確同一性。當在核苷酸水平上存在非同一性時，“相似性”包括導(dǎo)致不同氨基酸的序列差異，但所述不同氨基酸彼此之間在結(jié)構(gòu)、功能、生物化學(xué)和/或構(gòu)象水平上是相關(guān)的。
當在氨基酸水平上存在非同一性時，“相似性”包括相互之間在結(jié)構(gòu)、功能、生物化學(xué)和/或構(gòu)象水平上相關(guān)的氨基酸。在特定的優(yōu)選的實施方案中，在同一性水平上而非相似性上進行核苷酸和序列比較。
用于描述兩個或多個多核苷酸或多肽之間相互關(guān)系的術(shù)語包括“參照序列”、“比較窗口”、“序列相似性”、“序列同一性”、“序列相似性百分比”、“序列同一性百分比”、“基本相似”、和“基本同一”?！皡⒄招蛄小遍L度至少為9-12個但通常是15-18和通常至少21-25或更多，例如30個單體單位，包括核苷酸和氨基酸殘基。因為兩個多核苷酸可各自包含(1)兩個多核苷酸之間相似的序列(即只是完整的多核苷酸序列的一部分)和(2)兩個多核苷酸之間有差異的序列，因此通常通過在“比較窗口”上比較兩個多核苷酸的序列以確定和比較局部區(qū)域的序列相似性來進行兩個(或多個)多核苷酸之間的序列比較。“比較窗口”是指被用于與參照序列比較的通常12個連續(xù)殘基的概念片段。當與參照序列(不包含加入或缺失)比較以最優(yōu)化兩個序列的比對時，比較窗口可包含大約20％或更少的加入或缺失(即缺口)?？赏ㄟ^計算機化的算法工具(Wisconsin GeneticsSoftware Package Release 7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Drive Madison，WI，USA)或通過目測進行用于比對比較窗口的最優(yōu)化序列比對，通過任何被選擇的各種方法產(chǎn)生最佳比對(即導(dǎo)致在比較窗口上最高的百分比同源性)。也可以參考BLAST程序集，例如由Altschul等人于Nucleic AcidResearch，253389-3402，1997中公開的。在Ausubel等人(同上)的Unit 19.3中可找到序列分析的詳細討論。
此處所用的術(shù)語“序列相似性”和“序列同一性”是指在比較窗口上基于核苷酸與核苷酸或基于氨基酸與氨基酸的序列同一或者功能或結(jié)構(gòu)相似的程度。因此，例如，“序列同一性百分比”是通過在比較窗口上比較兩個最佳排列的序列，確定在兩個序列上出現(xiàn)相同的核酸堿基(例如A、T、C、G、I)或相同的氨基酸殘基(例如Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Iys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的數(shù)目以獲得匹配位置數(shù)目，用匹配位置數(shù)目除以比較窗口中的總位置數(shù)目(即，窗口大小)，并將所述結(jié)果乘以100產(chǎn)生序列同一性百分比來計算的。為了本發(fā)明的目的，“序列同一性”可理解成表示通過DNASIS計算機程序(用于Windows的2.5版，獲自Hitachi Software engineering Co.，Ltd.，South San Franci sco，California，USA)使用如在伴隨軟件的參考手冊中所使用的標準默認值計算的“匹配百分比”。與此類似的說明也適用于序列相似性?？烧J為保守氨基酸的變換提供了相似性序列但非同一性序列。
特別優(yōu)選的核酸分子編碼L多肽的顆粒結(jié)合部分并包含基本上如SEQ ID NO6或SEQ ID NO8所列的連續(xù)核苷酸序列或具有與SEQ IDNO6或SEQ ID NO8至少大約50％相似性的核苷酸序列。優(yōu)選地，相似性％與編碼L多肽顆粒結(jié)合部分的序列相關(guān)。
此外，本發(fā)明涉及編碼L多肽顆粒結(jié)合部分的核酸分子，其包含基本上如SEQ ID NO6或SEQ ID NO8所列的核苷酸序列或能夠在中等嚴緊條件下與SEQ ID NO6或SEQ ID NO8或其互補形式雜交的核苷酸序列。
本發(fā)明核酸分子的功能性衍生物包括其片段或具有一個或多個核苷酸突變或修飾的序列。
突變包括一個或多個核苷酸缺失、插入或替代。可選擇地或此外，可通過加入序列或部分以增強功能例如增強的穩(wěn)定性或活性或引入新的活性來修飾衍生物。例如，修飾可包括加入促融合(fusagenic)劑以增強膜通透性、影響轉(zhuǎn)錄前或轉(zhuǎn)錄后修飾事件的修飾、或產(chǎn)生包含標記、標簽和其它用于鑒別、純化等的修飾的融合蛋白。
所述核酸分子的功能性衍生物保持親本分子編碼具有S多肽顆粒裝配功能或L多肽顆粒結(jié)合功能的多肽的能力。
所述核酸分子的片段可包括具有親本功能的其部分或一個或多個其小部分。
本發(fā)明核酸序列的功能性同源物包括來自不同物種(通過共同的系統(tǒng)發(fā)生行為發(fā)生關(guān)系的物種)的直向同源基因序列同時也包括來自其它物種的作為趨同進化的結(jié)果與本發(fā)明核酸序列相似的基因序列，其中所述同源物是在功能和結(jié)構(gòu)上與本發(fā)明核酸序列相關(guān)的，因此容易通過基于雜交的方法或通過與公開的基因組數(shù)據(jù)庫進行序列比較來進行鑒定和/或分離。例如，大約20個禽類嗜肝DNA病毒的核苷酸序列是公共可獲得的(Triyatni等人，J.Gen.Virol，82373-378，2001)。
如本領(lǐng)域所熟知的，可在利用不同嚴緊雜交條件的測定中估計核酸水平上的相似性，例如如Ausubel等人(同上)所描述的。
此處提及的嚴緊雜交條件優(yōu)選地是指允許在基本相似的分子間進行選擇性雜交或退火的條件。滿足該標準的雜交溶液的雜交溫度組成和離子強度可根據(jù)大量已被很好表征的因素例如長度、互補程度和GC含量進行變化。對于更長的序列，通?？赡苡嬎阍诟鞣N條件下的雙螺旋核酸序列的預(yù)期熔解點。雜交可針對完整的或具有能充分提供其編碼的多肽的特性和功能性的最小長度的部分本發(fā)明多核苷酸。
低嚴緊雜交條件包括從至少大約0至至少大約15％v/v甲酰胺和從至少大約1M至至少大約2M的鹽(用于雜交)，和至少大約1M至至少大約2M的鹽(用于洗滌條件)。通常，低嚴緊是從大約25-30℃至大約42℃?？筛淖儨囟炔⑶矣酶叩臏囟热〈柞０泛?或給出其它的嚴緊條件。
中等嚴緊包括從至少大約16％v/v至至少大約30％v/v甲酰胺和從至少大約0.5M至至少大約0.9M的鹽(用于雜交)，和至少大約0.5M至至少大約0.9M的鹽(用于洗滌條件)。高嚴緊包括從至少大約31％v/v至至少大約50％v/v甲酰胺和從至少大約0.01M至至少大約0.15M的鹽(用于雜交)，和至少大約0.01M至至少大約0.15M的鹽(用于洗滌條件)。通常在Tm＝69.3+0.41(G+C％)下進行洗滌。然而，隨著錯配堿基對數(shù)目每增加1％，雙螺旋DNA的Tm就下降1℃(Bonner等人，1974)。甲酰胺在這些雜交條件下是可選的。因此，如下確定特別優(yōu)選的嚴緊水平低嚴緊是6×SSC緩沖液，0.1％w/v SDS，溫度于25-42℃下；中等嚴緊是2×SSC緩沖液，0.1％w/v SDS，溫度在從20℃至65℃范圍內(nèi)；高嚴緊是0.1×SSC緩沖液，0.1％w/vSDS，溫度至少在65℃以上。
可將適合用于制備重組VLPs的本發(fā)明的重組核酸分子導(dǎo)入有助于VLP產(chǎn)生的載體中。
載體優(yōu)選地含有克隆位點并且能在確定的宿主細胞中自我復(fù)制?？蛇x擇地，所述載體可整合入基因組中并且與其被導(dǎo)入的染色體一起復(fù)制。載體通常也包括選擇標記。
可選擇的標記的例子包括賦予對化合物例如抗生素抗性的基因、賦予在選擇的底物上生長的能力的基因、編碼產(chǎn)生可檢測信號例如發(fā)光的蛋白的基因。大量的這類標記是公開和可獲得的，包括，例如抗生素抗性基因例如新霉素抗性基因(neo)和潮霉素抗性基因(hyg)?？蛇x擇標記也包括賦予在某種培養(yǎng)基底物上生長的能力的基因，例如tk基因(胸苷激酶)或賦予在HAT培養(yǎng)基(次黃嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶)上生長的能力的hprt基因(次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶)；和允許在MAX培養(yǎng)基(霉酚酸、腺嘌呤和黃嘌呤)上生長的細菌gpt基因(鳥嘌呤/黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶)。其它用于哺乳動物細胞的選擇標記和攜帶各種選擇標記的質(zhì)粒描述于Sambrook等人的MolecularCloning-A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour，New York，USA，1990中。
選擇標記可依賴于其自身啟動子進行表達并且標記基因可不必來自人基因組(例如原核標記基因可用于人細胞中)。然而，優(yōu)選地用已知在受體細胞中發(fā)揮功能的轉(zhuǎn)錄機器取代原來的啟動子?？色@得的大量用于這種目的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域，包括，例如，金屬硫蛋白啟動子、胸苷激酶啟動子、β-肌動蛋白啟動子、免疫球蛋白啟動子、SV40啟動子和人細胞巨化病毒啟動子。廣泛使用的例子是具有在SV40早期啟動子控制下的細菌新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因并且賦予哺乳動物細胞抗G18(與新霉素相關(guān)的抗生素)抗性的pSV2-neo質(zhì)粒。可使用許多其它變化以增強選擇標記在動物細胞中的表達，例如加上poly(A)序列和加上合成的翻譯起始序列。組成型或誘導(dǎo)型啟動子都可使用。
用于制備重組VLP的重組核酸分子優(yōu)選地以有助于導(dǎo)入編碼POI的核酸分子和顆粒裝配的試劑盒形式存在。
本發(fā)明的另一方面提供了包含編碼POI和至少DHBV的L肽顆粒結(jié)合部分或其功能性衍生物或同源物的核苷酸序列的表達載體，其中所述POI可以作為與所述L多肽形成的融合多肽進行表達。
本發(fā)明的另一方面提供了包含編碼POI和至少DHBV的L肽的S結(jié)構(gòu)域的部分或其功能性衍生物或同源物的核苷酸序列的表達載體，其中所述POI在L多肽氨基酸序列的S結(jié)構(gòu)域或其功能性衍生物或同源物之中或N末端進行表達。
優(yōu)選地，所述POI在L多肽的S結(jié)構(gòu)域的N末端上或多肽的pre-S結(jié)構(gòu)域內(nèi)表達。
如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，本發(fā)明的核酸分子可進行進一步修飾以確保其適合于在一系列細胞內(nèi)的表達、體外選擇、適合用于在其中克隆各種POIs。這類技術(shù)和策略對本領(lǐng)技術(shù)人員來說是熟知的并且可方便地參考Ausbel等人編著的short protocols in MolecularBiology，John Wiley and Sons，第5版，2002和/或Sambrook等人(同上)。
為確保表達，編碼POI和L多肽成分的核苷酸序列可有效地連接至一個或多個表達控制序列上。優(yōu)選地兩個或多個這樣的核苷酸序列在同一閱讀框內(nèi)。
在一個實施方案中表達載體被方便地整合入宿主細胞的基因組中并在宿主細胞啟動子的驅(qū)動下表達。
本發(fā)明也提供了被轉(zhuǎn)化或被轉(zhuǎn)染或包含核酸分子的微生物或宿主細胞，所述核酸分子包含編碼POI和至少DHBV的L肽顆粒結(jié)合部分或其功能性衍生物或同源物的核苷酸序列。酵母細胞是特別方便的宿主細胞。有利地使用原核或真核宿主細胞。通常原核細胞包括大腸桿菌(E.coli)、芽孢桿菌屬物種而真核細胞包括酵母、真菌、哺乳動物和昆蟲細胞。
本發(fā)明進一步提供了用作疫苗的包含來源于DHBV L和S多肽的病毒樣顆粒的組合物，其中L多肽包含一個或多個目的抗原。
本發(fā)明也涉及包含以與DHBV的L多肽顆粒結(jié)合部分或其功能性衍生物或同源物的融合蛋白表達的目的抗原和DHBV S多肽的疫苗，其中S多肽和抗原-L多肽可被裝配入VLP中，與合適的藥物可接受的稀釋劑和載體混合。所述疫苗可在使用前凍干和可進一步與合適的佐劑混合。因此所述疫苗可以試劑盒的形式存在。
“藥物可接受的”載體或稀釋劑是指由不是生物學(xué)上或其它方面不想要的物質(zhì)構(gòu)成的藥物學(xué)載體，即在不導(dǎo)致任何或明顯不利的反應(yīng)的情況下可與所選擇活性試劑一起給受試者施用的物質(zhì)。載體可包括賦形劑和其它添加物例如稀釋劑、去垢劑、著色劑、增濕或乳化劑、pH緩沖劑、防腐劑等。
可在藥物組合物中配制本發(fā)明的VLPs和多肽核酸分子，所述藥物組合物根據(jù)常規(guī)藥物配方技術(shù)制備而來。參見，例如，Remington′sPharmaceutical Sciences，第18版(1990，Mack Publishing，Company，Easton，PA，U.S.A.)。所述組合物可包含活性試劑或活性試劑的藥物可接受鹽。除了其中一種活性物質(zhì)外，這些組合物還可包括藥物可接受賦形劑、載體、緩沖液、穩(wěn)定劑或其它本領(lǐng)域熟知的物質(zhì)。這些物質(zhì)應(yīng)當是無毒的并且不應(yīng)當干擾活性成份的功效。所述載體可根據(jù)想要施用的制劑的形式采取廣泛的形式，例如局部、靜脈內(nèi)、口內(nèi)、鞘內(nèi)、神經(jīng)弓上(epineural)或腸胃外施用。
對于口內(nèi)施用，可將化合物配制成固體或液體的制劑例如膠囊、丸劑、片劑、錠劑、粉劑、懸浮劑或乳劑。以口服劑量形式制備組合物時，在口服液體制劑(例如，懸浮劑、酏劑和溶液)的情況下可使用任何常用的藥物介質(zhì)，例如，水、乙二醇、油、醇、增味劑、防腐劑、著色劑、懸浮劑等；或在口服固體制劑(例如，粉末、膠囊和片劑)的情況下可用載體例如淀粉、糖、稀釋劑、?；瘎櫥瑒?、粘合劑、崩解劑等。因為其容易施用，所以片劑和膠囊代表最有利的口服劑量單位形式，其中明顯地使用了固體藥物載體。如果想要，通過標準技術(shù)可對片劑進行糖包衣或腸包衣?？蓪⒒钚栽噭┭b入膠囊以使其穩(wěn)定地通過胃腸道但同時允許穿過血腦屏障。參見例如，國際專利
發(fā)明者D·A·安德森, E·V·L·格伽茨克 申請人:赫普吉尼克斯股份有限公司