專利名稱：Jucara和acai果實基營養(yǎng)補充劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及制備穩(wěn)定的、可口地、凍干的水果基營養(yǎng)補充劑(fruit-based dietary supplement)的方法及其應用。
背景技術：
在過去的幾十年里，關于自由基對人類健康和疾病的重要性的認識開始增強。許多常見病和威脅生命的疾病，包括動脈硬化、癌癥和衰老，都有自由基反應作為潛在的損傷機制。經(jīng)過這段時期，我們對自由基與生命體相互作用的概念上的理解已經(jīng)發(fā)展并提供了空前的機遇以促進人類生命的質量甚至延長其長度。一類最普通的自由基是活性氧物質(ROS)。這是正常細胞呼吸和代謝的產(chǎn)物，通常受體內產(chǎn)生的抗氧化劑調節(jié)。由于污染等環(huán)境因子和吸煙或運動等生活方式因素的影響，自由基的生成會增加。這種增加會打破機體平衡，尤其是當機體衰老和抗氧化劑生成機制喪失了其以必要速率生成那些化合物的能力時，導致氧化應激。由此導致的損傷范圍可包括生物過程的破壞、殺死細胞和遺傳物質的變異，后者將導致癌癥發(fā)生。營養(yǎng)補充劑在抵御氧化應激效應和退行性疾病進展及衰老中的潛在應用在過去的二十年中已成為越來越多的研究的主題。如今市場上有許多產(chǎn)品包含不同水平的抗氧化劑。這些形成了食物、液體和營養(yǎng)補充劑的形式。這些重要的營養(yǎng)物通常富含于擁有維生素C、維生素E、B-胡蘿卜素及其它化合物的水果和蔬菜中?？寡趸瘎┘僬f假定補充營養(yǎng)抗氧化劑能夠減輕與疾病相關的氧化還原不平衡?？寡趸瘎┬惺菇Y合自由基、使其穩(wěn)定并將其清除出系統(tǒng)的功能，從而減少了自由基可能造成的損傷。目前已開發(fā)了合成的抗氧化劑如BHA(丁基化羥基苯甲醚)，BHT(丁基化羥基甲苯)和NDGA(去甲二氫愈創(chuàng)木酸)。天然抗氧化劑的例子有抗氧化酶類，如超氧化物岐化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶，以及非酶類抗氧化劑如生育酚(維生素E)、抗壞血酸(維生素C)、類胡蘿卜素和谷胱甘肽。然而，合成的抗氧化劑可能因在其體內的強毒性而導致過敏反應和腫瘤形成，并且由于溫度敏感性而易于分解。另一方面，雖然天然抗氧化劑在體內比合成的抗氧化劑安全，但卻有效果弱的問題。因此，要求開發(fā)在使用中無安全問題同時又具有優(yōu)秀抗氧化活性的新天然抗氧化劑。許多研究闡明了多酚黃酮類化合物的保護功能。黃酮類化合物的抗誘變、抗癌變和免疫刺激功能已有報道。黃酮類化合物是一大類天然存在的多酚化合物，發(fā)現(xiàn)于水果、蔬菜、谷物、樹皮、茶葉和酒中，已被證實有體內清除自由基的潛力。花色素苷是天然存在的化合物，是許多水果、蔬菜、谷物和花朵呈紅色、紫色和藍色的原因。例如，如藍莓、歐洲越桔(bilberry)、草莓、覆盆子、波森莓、marionberries、酸果蔓等漿果的顏色，歸因于許多不同的花色素苷。在自然界中已鑒定了超過300種結構不同的花色素苷。因為花色素苷是天然存在的，它們作為食物和飲料的著色劑的應用引起了許多興趣。原花色素苷是在水果和蔬菜中發(fā)現(xiàn)的另一類黃酮類化合物，雖然無色，但具有抗氧化活性。最近，對花色素苷色素的興趣加強了，因為其作為營養(yǎng)補充劑對健康可能有好處。例如，歐洲越桔(Vaccinium myrtillus)中的花色素苷長期以來一直被用來增進視敏度和治療循環(huán)障礙。有實驗證據(jù)表明某些花色素苷和黃酮類化合物具抗炎癥功能。另外，有報道稱口服花色素苷對治療糖尿病和潰瘍有好處，許多還有抗病毒和抗微生物活性。黃酮類化合物這些理想性質的化學基礎據(jù)信與其抗氧化能力有關。因此，與漿果及其它水果和蔬菜的抗氧化特性歸結于它們的花色素苷含量。如今的市場上有許多產(chǎn)品含有不同水平的抗氧化劑。這些形成了食物、液體和營養(yǎng)補充劑的形式。這些重要的營養(yǎng)物通常富含于擁有維生素C、維生素E、β-胡蘿卜素及其它化合物的水果和蔬菜中?？寡趸瘎┬惺菇Y合自由基、使其穩(wěn)定并將其清除出系統(tǒng)的功能，從而減少了自由基可能造成的損傷。由于許多水果和蔬菜中都含有這些重要的營養(yǎng)物，所以能夠評估這些食品中抗氧化劑吸收自由基的能力就十分重要。在Tufts大學的USDA研究者開發(fā)了一種稱為ORAC(Oxygen Radical AbsorbanceCapacity，氧基吸收能力)的實驗室檢測，對不同食物依其抗氧化劑含量和結合自由基能力進行分級。通過這種檢測，不同食物的抗氧化能力可進行比較和分析。需要鑒定具高ORAC分值的水果或蔬菜和基于其上的營養(yǎng)補充劑的開發(fā)和生產(chǎn)。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及具有高ORAC分值和環(huán)加氧酶抑制活性的
果實和Jucara果實的鑒定。一方面本發(fā)明提供一種營養(yǎng)補充劑組合物，包含凍干的果漿，其中總花色素苷(anthocyanin)濃度大于約l毫克/克總重，該組合物具有大于約350微摩爾TE/克總重的ORACFL值和小于約3％總重的殘留水含量。在一個實施方案中，該營養(yǎng)補充劑組合物中的凍干果漿是凍干的
果漿。在另一個實施方案中，該營養(yǎng)補充劑組合物中的凍干果漿是凍干的Jucara果漿。在一個實施方案中本發(fā)明的營養(yǎng)補充劑組合物進一步包含一種藥用載體。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明營養(yǎng)補充劑中花色素苷總濃度為從約1毫克/克總重到約500毫克/克總重。在另一個優(yōu)選實施方案中，營養(yǎng)補充劑中的總花色素苷濃度為從約1毫克/克至約100毫克/克總重。在還有另一個優(yōu)選實施方案中，營養(yǎng)補充劑中總花色素苷濃度為從約1毫克/克到約10毫克/克總重。在另一個優(yōu)選實施方案中，營養(yǎng)補充劑組合物具有從約350微摩爾TE/克總重到約10毫摩爾TE/克的ORACFL值。在另一個優(yōu)選實施方案中，營養(yǎng)補充劑組合物具有從約350微摩爾TE/克總重到約5毫摩爾TE/克的ORACFL值。在還有另一個優(yōu)選實施方案中，營養(yǎng)補充劑組合物具有從約350微摩爾TE/克總重到約1毫摩爾TE/克的ORACFL值。在一個優(yōu)選實施方案中，營養(yǎng)補充劑組合物的殘留水含量為從總重的約0.01％到約3％。在另一個優(yōu)選實施方案中，營養(yǎng)補充劑組合物的殘留水含量為從總重的約0.1％到約3％。在還有另一個優(yōu)選實施方案中，營養(yǎng)補充劑組合物的殘留水含量為從總重的約1％到約3％。另一方面，本發(fā)明提供一種包含凍干果漿的營養(yǎng)補充劑組合物，其中組合物具有大于約15阿司匹林(Aspirin)毫克當量/克總重的環(huán)加氧酶抑制活性和低于約3重量％總重的殘留水含量。在一個實施方案中，該營養(yǎng)補充劑組合物中的凍干果漿是凍干的
果漿。在另一個實施方案中，該營養(yǎng)補充劑組合物中的凍干果漿是凍干的Jucara果漿。在一個實施方案中本發(fā)明的營養(yǎng)補充劑組合物進一步包含一種藥用載體。在一個優(yōu)選實施方案中，營養(yǎng)補充劑組合物的環(huán)加氧酶抑制值為從約15阿司匹林毫克當量/克總重到約10,000阿司匹林毫克當量/克總重。在另一個優(yōu)選實施方案中，營養(yǎng)補充劑組合物的環(huán)加氧酶抑制值為從約15阿司匹林毫克當量/克總重到約1,000阿司匹林毫克當量/克總重。在還有的另一個優(yōu)選實施方案中，營養(yǎng)補充劑組合物的環(huán)加氧酶抑制值為從約15阿司匹林毫克當量/克總重到約100阿司匹林毫克當量/克總重。在一個優(yōu)選實施方案中，營養(yǎng)補充劑組合物的殘留水含量為從總重的約0.01％到約3％。在另一個優(yōu)選實施方案中，營養(yǎng)補充劑組合物的殘留水含量為從總重的約0.1％到約3％。在還有另一個優(yōu)選實施方案中，營養(yǎng)補充劑組合物的殘留水含量為從總重的約1％到約3％。另一方面本發(fā)明提供了生產(chǎn)穩(wěn)定和美味的水果基營養(yǎng)補充劑組合物的方法，該方法包含收獲果實；稱重果實；用水清洗果實；在約75℃至約100℃的溫度下用水洗滌果實為期約5秒鐘至10分種；給果實去殼(hulling)以從果實中分離果漿；將果漿凍至約-5℃以下；凍干果漿，其凍干條件能產(chǎn)生殘留水含量低于3重量％的顆粒狀、凍干果漿粉末，其中凍干果漿比果漿制劑更穩(wěn)定和可口。在一個實施方案中，果實是
果實。在另一個實施方案中，果實是Jucara果實。在一個實施方案中，清洗步驟包括用0.1％(v/v)的衛(wèi)生水清洗果實。在另一個實施方案中，檸檬酸在冰凍前被加入到果漿制劑中。在另一個實施方案中，洗滌步驟包括在溫度為約80℃下在水中清洗果實為期約10秒鐘。在還有另一個實施方案中，去殼步驟包括對果實機械去殼為期約2分鐘至5分鐘，去殼步驟使用每2千克果實約1升水。在還有另一個實施方案中，制作營養(yǎng)補充劑組合物的方法產(chǎn)生一種水果基營養(yǎng)補充劑組合物，該組合物具有高于約350微摩爾TE/克總重的ORCAFL值。在另一個實施方案中，制作營養(yǎng)補充劑組合物的方法產(chǎn)生一種水果基營養(yǎng)補充劑組合物，該組合物具有約從350微摩爾TE/克總重到約10毫摩爾TE/克總重的ORCAFL值。在另一個實施方案中，制作營養(yǎng)補充劑組合物的方法產(chǎn)生一種水果基營養(yǎng)補充劑組合物，該組合物具有從約350微摩爾TE/克總重到約5毫摩爾TE/克總重的ORCAFL值。在還有另一個實施方案中，制作營養(yǎng)補充劑組合物的方法產(chǎn)生一種水果基營養(yǎng)補充劑組合物，該組合物具有從約350微摩爾TE/克總重到約1毫摩爾TE/克總重的ORCAFL值。在另一個優(yōu)選實施方案中，制作營養(yǎng)補充劑組合物的方法產(chǎn)生一種水果基營養(yǎng)補充劑組合物，該組合物具有大于約15阿司匹林毫克當量/克總重的環(huán)加氧酶抑制值。在一個優(yōu)選實施方案中，制作營養(yǎng)補充劑組合物的方法產(chǎn)生一種水果基營養(yǎng)補充劑組合物，該組合物的環(huán)加氧酶抑制值為從約15阿司匹林毫克當量/克總重到約10,000阿司匹林毫克當量/克總重。在另一個優(yōu)選實施方案中，制作營養(yǎng)補充劑組合物的方法產(chǎn)生一種水果基營養(yǎng)補充劑組合物，該組合物的環(huán)加氧酶抑制值為從約15阿司匹林毫克當量/克總重到約1,000阿司匹林毫克當量/克總重。在還有另一個優(yōu)選實施方案中，制作營養(yǎng)補充劑組合物的方法產(chǎn)生一種水果基營養(yǎng)補充劑組合物，營養(yǎng)補充劑組合物的環(huán)加氧酶抑制值為從約15阿司匹林毫克當量/克總重到約100阿司匹林毫克當量/克總重。在還有的另一方面，本發(fā)明提供一種方法，預防或治療哺乳動物體內由病理性自由基反應導致的疾病或損傷，該方法包括給該哺乳動物施用有效量的本發(fā)明的水果基營養(yǎng)補充劑組合物，其中該組合物猝滅(quench)自由基并減少病理性自由基導致的損傷。在一個實施方案中，所述疾病或損傷選自由下列各項組成的組癌癥、結腸癌、乳腺癌、炎性腸病、局限性回腸炎(Crohn′s disease)、血管病、關節(jié)炎、潰瘍、急性呼吸窘迫綜合征、缺血-再灌注損傷、神經(jīng)變性疾病、自閉癥、帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、腸胃病、炎癥導致的組織損傷以及環(huán)境毒素導致的組織損傷。在還有的另一方面，本發(fā)明提供一種減輕哺乳動物內病理性自由基反應的有害效應的方法，所述哺乳動物遭受疾病或損傷，該疾病或損傷是由哺乳動物中的病理性自由基反應所導致的，所述方法包括向該哺乳物施用有效量的本發(fā)明的水果基營養(yǎng)補充劑組合物，其中該組合物猝滅自由基并減少病理性自由基導致的損傷。在一個實施方案中，所述疾病或損傷選自由下列各項組成的組癌癥、結腸癌、乳腺癌、炎性腸病、局限性回腸炎(Crohn′s disease)、血管病、關節(jié)炎、潰瘍、急性呼吸窘迫綜合征、缺血-再灌注損傷、神經(jīng)變性疾病、自閉癥、帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、腸胃病、炎癥導致的組織損傷以及環(huán)境毒素導致的組織損傷。在還有的另一方面，本發(fā)明提供一種方法以抑制哺乳動物體內環(huán)加氧酶活性，該方法包括給該哺乳動物施用有效量的本發(fā)明的水果基營養(yǎng)補充劑組合物。在一個實施方案中，該水果基營養(yǎng)補充劑組合物中進一步包含藥用載體。在另一個實施方案中，該水果基營養(yǎng)補充劑組合物通過選自下組的施用途徑施用口服、靜脈內、腹膜內、皮下、肌內、關節(jié)內、動脈內、大腦內、小腦內、支氣管內、鞘內、局部的、和氣溶膠途徑。另一方面，本發(fā)明提供一種方法以預防或治療與哺乳動物體內環(huán)加氧酶活性增強相關的疾病或損傷，該方法包括給該哺乳動物施用有效量的本發(fā)明的水果基營養(yǎng)補充劑組合物。在一個實施方案中，該水果基營養(yǎng)補充劑組合物中進一步包含藥用載體。在另一個實施方案中，該水果基營養(yǎng)補充劑組合物通過選自下組的施用途徑施用口服、靜脈內、腹膜內、皮下、肌內、關節(jié)內、動脈內、大腦內、小腦內、支氣管內、鞘內、局部的、和氣溶膠途徑。在一個實施方案中，所述疾病或損傷選自由下列各項組成的組癌癥、結腸癌、乳腺癌、炎性腸病、局限性回腸炎(Crohn′sdisease)、血管病、關節(jié)炎、潰瘍、急性呼吸窘迫綜合征、缺血-再灌注損傷、神經(jīng)變性疾病、自閉癥、帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、腸胃病、炎癥導致的組織損傷以及環(huán)境毒素導致的組織損傷。本發(fā)明的這些以及其它目的將在本發(fā)明下面提供的詳細描述中顯現(xiàn)。
附圖簡述參照下述附圖本發(fā)明可被更充分地理解，圖表只起說明作用。

圖1顯示了凍干
粉的典型吸收譜。圖2顯示了由LC/MS/MS色譜技術測定的凍干Jucara粉的花色素苷譜圖(profile)。圖3是一幅示意圖，顯示了凍干Jucara粉的花色素苷的化學結構。圖4顯示了由LC/MS/MS色譜技術測定的凍干
粉的花色素苷譜圖。圖5是一幅示意圖，顯示了凍干
粉內花色素苷的化學結構。圖6顯示了由HPLC和質譜色譜技術測定的凍干Jucara粉內酚化合物的譜圖。圖7是一幅示意圖，顯示了凍干Jucara粉內酚化合物的化學結構。圖8顯示了由色譜技術測定的凍干
粉和凍干Jucara粉內原 花色素苷(proanthocyanin)的譜圖。圖9是示意圖，顯示了凍干
盼和凍干Jucara粉內原花色素苷化合物的化學結構。圖10是柱狀圖，比較了由ORAC分析技術測定的所選蔬菜的抗氧化活性。圖11是柱狀圖，比較了由ORAC分析技術測定的所選新鮮水果的抗氧化活性。圖12是柱狀圖，比較了由ORAC分析技術測定的所選新鮮水果的抗氧化活性。圖13是柱狀圖，比較了由ORAC分析技術測定的凍干
粉和凍干Jucara粉與所選新鮮水果的抗氧化活性。圖14是柱狀圖，比較了由ORAC分析技術測定的凍干
和所選新鮮水果的抗氧化活性。圖15是柱狀圖，比較了由ORAC分析技術測定的凍干
粉和所選新鮮蔬菜的抗氧化活性。圖16是柱狀圖，比較了由ORAC分析技術測定的所選水果、蔬菜和堅果的抗氧化活性。 圖17是柱狀圖，比較了由ORAC分析技術測定的所選堅果的抗氧化活性。圖18是柱狀圖，比較了由ORAC分析技術測定的脫水
和所選脫水水果和蔬菜的抗氧化活性。圖19是柱狀圖，比較了由ORAC分析技術測定的凍干
粉和所選新鮮蔬菜的抗氧化活性。圖20是柱狀圖，比較了由ORAC分析技術測定的脫水
和所選脫水水果和蔬菜的抗氧化活性。圖21是一柱狀圖，比較了由ORACHO分析技術測定的水果、蔬菜的抗氧化活性。圖22是流程示意圖，詳述了
果汁制備。圖23是用于
果汁制備的去殼設備示意圖。圖24是流程示意圖，詳述了凍干
粉的制備方法。
發(fā)明詳述因此應當理解下面在不同細節(jié)水平所述發(fā)明的某方面、方式、實施方案、變化和特征是為了提供對本發(fā)明充分的理解。通常，這些公開內容提供了有益的營養(yǎng)補充劑組合物、這些組合物與其它營養(yǎng)補充劑組合物的組合以及其生產(chǎn)和應用的方法。因此，本發(fā)明的多個方面涉及到某特定營養(yǎng)補充劑組合物的治療或預防性應用以預防或治療由病理性自由基反應引起的疾病或損傷。本發(fā)明的多個方面進一步涉及到特定營養(yǎng)補充劑組合物的治療或預防性應用以預防或治療與環(huán)加氧酶酶活性增強相關的疾病或損傷。因此，后附多個闡明這些方面的詳細實施方案。應當理解所述對醫(yī)學病癥的治療和預防的多種方式意指“充分”，即包括全部但也包括不完全治療或預防，從中獲得了一些生物學和醫(yī)學相關的結果。定義此處所述“受試者”，優(yōu)選指哺乳動物，如人類，但也可以是動物，如家養(yǎng)動物(如狗、貓之類)、農(nóng)場動物(如牛、羊、豬、馬之類)和實驗動物(如大鼠、小鼠、豚鼠之類)?；衔锏摹坝行Я俊保绱颂幩?，指足以獲得理想治療和/或預防效果的數(shù)量，例如，可導致對所處理疾病產(chǎn)生預防或使其相關癥狀得到減輕的數(shù)量。給受試者施用的化合物的量將取決于疾病的種類和嚴重性以及個體的特征，如一般健康狀況、年齡、性別、體重及耐藥性。用量還將取決于疾病的程度、種類和嚴重性。熟練技術人員能夠根據(jù)這些及其它因素決定合適的劑量。典型地，本發(fā)明中化合物的有效量，足以獲得治療或預防效果，范圍從每天約0.000001mg/千克體重到每天約10,000mg/千克體重。優(yōu)選地，劑量范圍從每天約0.0001mg/千克體重到每天約100mg/千克體重。本發(fā)明的化合物也可以彼此組合施用，或者與一種或多種另外的治療化合物組合施用。“
”是巴西北部Para地區(qū)特有的眾所周知的棕櫚樹種。
以細的樹干和圓蛋形簇狀果實為特征，其果實為深紫色，有時熟后甚至接近于黑色。
的拉丁名稱為阿薩依(Euterpe oleracea)，Martius；科，棕櫚科(Palmaceae)。英文也稱為“卷心棕櫚(Cabbage Palm)”。在巴西稱為
-do-para，
-do-baixo Amazonas，palmito
，acaizeiro，acal，assai，jicara，Jucara，palmiteiro，piria；在哥倫比亞稱為assai和manaca；及uacai；在蘇里南稱為manaka，pinapalm，prasara，wapoe，和wasei。
一詞還包括另一種Euterpe亞種，E.catinga Wallace，其在巴西也有發(fā)現(xiàn)并稱為″
″。最后，
也包括另一個Euterpe亞種，E.precatoria Martius，發(fā)現(xiàn)于玻利維亞并為南美地區(qū)所知，也稱為″
″和″jucara″?！錔ucara"是另一種棕櫚樹。Jucara的拉丁名為阿沙依(Euterpeedulis)，Martius；科，棕櫚科。在巴西也稱為assai，acai，plamito，palmito doce，iucara，palmito Jucara，ripeira，icara，Jucara，ensarova，palmiteiro。Jucara一詞還包括另一個Euterpe亞種，E.espiritosantensis Fernandes，其在巴西也有發(fā)現(xiàn)并稱為″Jucara″。最后，
也包括另一個Euterpe亞種，E.precatoriaMartius，發(fā)現(xiàn)于玻利維亞并為南美地區(qū)所知，也稱為″
″和″Jucara″。所有本申請中引用的參考文獻在此結合作為參考?？寡趸阅芗捌鋺帽景l(fā)明鑒別出兩個科的棕櫚樹(
和Jucara)的果實，具有比其它任何檢測的水果或蔬菜顯著更高的ORAC分值。已知
果實含有高比例的單不飽和及多不飽和脂肪酸，以及相對低濃度的飽和脂肪和反式脂肪酸。還已知
果實富含類脂、纖維和蛋白，并含有維生素E和花色素苷，兩種已知的抗氧化劑。然而，這些果實在過去沒有被充分利用，因為
果實非常易于因氧化和細菌、真菌及酵母等微生物污染而迅速腐敗。因此，由
果實制備的水果和果汁腐敗很快，迅速失去其可口性和抗氧化功能-幾乎一半的花色素苷在果實采摘后兩天內分解。為了能將產(chǎn)品推向更廣大的市場，在克服
果實和果汁迅速腐敗的努力中，一些公司已經(jīng)嘗試將果漿冷凍。然而，用這種方式對
果實進行簡單冷凍需要密切監(jiān)視溫度-即使是微小的溫度偏差也將導致變質酶和發(fā)酵劑的活化。另外，當融化這樣冷凍的果漿以使用時，這些試劑仍然被活化并導致果漿粗糙(grittiness)。前述問題，與其它問題一起，被本發(fā)明所解決。明確地，如實施例中所描述，本發(fā)明提供了穩(wěn)定的和可口的
基營養(yǎng)補充劑組合物，其具有比其它任何檢測的冷凍水果或蔬菜顯著更高的花色素苷濃度和更高的ORAC分值。作為本發(fā)明的結果，目前已明確
果實提供了一個營養(yǎng)補充劑的很好的來源。在本發(fā)明之前，該水果主要用作能量飲料或作為具短暫架上保存期的冷凍處理物(frozen treat)的一部分。本發(fā)明的
基營養(yǎng)補充劑組合物提供了穩(wěn)定的和可口的產(chǎn)品，具有顯著更長的架上保存時間，同時顯著提高了
果實的抗氧化性能。本發(fā)明使該水果的高營養(yǎng)特性不但得到保持，而且顯著增強，并放心享用而不必擔心快速腐敗。雖然前述討論主要集中于
果實和由其衍生的營養(yǎng)補充劑，本發(fā)明還提供了Jucara-基營養(yǎng)補充劑組合物，該組合物也具有比其它任何所測定的凍干果實或蔬菜組合物顯著更高的花色素苷濃度并產(chǎn)生更高的ORAC分值。如下將述，Jucara果實，及由其衍生的營養(yǎng)補充劑，也含有極高水平的原花色素苷類并對羥基自由基(hydroxyl radical)和過氧化亞硝酸鹽顯示高抗氧化活性。根據(jù)本發(fā)明，
果實和Jucara果實、果汁、營養(yǎng)補充劑及其它由
果實和Jucara果實衍生的組合物用于治療、逆轉、和/或預防自由基和氧化應激的有害效應。自由基和氧化應激在過去的幾十年里，自由基，具高度反應性及因此所導致高度破壞性的分子，其對人類健康和疾病的重要性已越來越多地被認識。許多常見病和威脅生命的人類疾病，包括動脈硬化癥、癌癥和衰老，都以自由基反應作為潛在的損傷機制。自由基是一個在外圍軌道上具有一個或多個未配對電子的分子。這些分子種類中許多都是以氧(有時是氮)為中心的。實際上，我們呼吸的氧分子就是一個自由基。這些高度不穩(wěn)定的分子傾向于與鄰近分子迅速反應，貢獻、吸引或甚至共享它們的外圍電子。這個反應不但改變了鄰近的靶分子，有時是以意義深遠的方式，而且還經(jīng)常通過靶分子傳遞未配對電子，產(chǎn)生次級自由基或其它ROS，其可繼續(xù)與新的靶分子反應。實際上，ROS的高活性許多是源于其產(chǎn)生了這樣的分子鏈式反應，將其效果有效地放大了許多倍。抗氧化劑能提供保護是因為它們能清除在ROS對許多生物分子造成損傷前將其清除，或防止氧化損傷擴散，例如，通過打斷脂質過氧化作用的自由基鏈式反應。ROS和人類健康由于我們的身體持續(xù)地暴露于來自外部的(陽光、其它形式的射線、污染)和內源性自由基及其它ROS中，ROS介導的組織損傷是大量疾病發(fā)生的最后共同通路。射線損傷射線損傷代表了一種重要的ROS介導的疾病的原因。極端的例子包括太陽內部和熱核爆炸中心的物理化學反應。至于更常遇到的射線水平，取決于具體情況，所受損傷的約三分之二并非由射線本身介導，而是由繼發(fā)產(chǎn)生的ROS導致。這并有僅僅適用于射線損傷的急性毒性形式，還適用于慢性、誘變(和由此導致的致癌)效果。這個原理一個重要的臨床應用在癌癥放射性治療中常常遇到。大型腫瘤經(jīng)常生長得超出了其血液供應的能力而使中心的腫瘤細胞死亡，盡管周圍的細胞仍然能得到良好的氧供應。在這兩個區(qū)域之間是一個供氧貧乏的腫瘤區(qū)域，但仍能保持存活。這類腫瘤的放射性治療對周圍區(qū)域特別有效，在這些區(qū)域有充足的氧濃度供應以形成殺腫瘤性ROS。氧貧乏的中心區(qū)所受損傷程度顯著減小。雖然在中心的死細胞無論如何不能存活，但在這兩個區(qū)域之間的氧供應貧乏、但仍活著的細胞可在放射性治療中存活安全的數(shù)量，并因此導致腫瘤的后期局部復發(fā)。這就是為什么許多大腫瘤通過放射性治療(以在其邊緣殺死腫瘤)和手術切除包括這些特別危險的殘存細胞在內的瘤體相結合的方式進行治療的原因。癌癥和其它惡性腫瘤癌癥和其它惡性腫瘤都有基于細胞遺傳信息改變而導致的不受約束的細胞生長和增殖。大多數(shù)情況下，例如，通常約束細胞生長和復制的一個或多個基因發(fā)生突變，或者是發(fā)生失活。這些遺傳缺陷直接引起遺傳密碼的缺失和序列改變，遺傳密碼即是細胞內的DNA基團。這種DNA損傷常見的最終通常原因是自由基損傷。我們的DNA以每天計所受的無數(shù)損傷中，大多數(shù)被胞內的正常DNA修復機制所修復，盡管其中一些導致了細胞死亡。由于這些損傷是零星發(fā)生的并在基因組內呈一定隨機分布，大多數(shù)致死性DNA損傷是臨床無關性的，僅導致在上百萬細胞中損失一些細胞。然而，如果在影響生長調節(jié)的損傷中有一個細胞存活，它就可以不受約束地增殖并迅速生長通過正向自然選擇而占據(jù)細胞數(shù)量的主要部分。其結果就是腫瘤，常常是惡性的，其中生長和增殖機制顯著缺失。因此，對遺傳物質的自由基損傷是致癌的主要最后共同通路。ROS在胞內的產(chǎn)生不僅可通過外部的放射性源，也可作為體內正常代謝過程的副產(chǎn)物而生成。內源性自由基的一個重要來源是某些藥物、污染物及其它化學試劑和毒品的正常代謝，這些物質通稱異生素。雖然這些中的一部分具有直接毒性，但許多其余物質通過這些機體對其解毒的代謝過程產(chǎn)生大量自由基流。一個例子是對除草劑百草枯的代謝。曾有一段時間，藥品實施管理局(drug enforcement authorities)使用這種除草劑來殺滅大麻植物。種植者意識到他們能夠在大麻枯萎前收獲噴灑過藥物的植株。許多吸食這類產(chǎn)品者隨后死于急性肺損傷。幸運地，該方法已經(jīng)被作為解決此毒品問題的特別不人道的方式而廢止了。百草枯的故事是自由基毒性代謝機制特別突出的例子，許多經(jīng)常遇到的異生素，包括香煙的煙霧、空氣污染物、和甚至酒精也是有毒的，它們在我們體內分解代謝產(chǎn)生的自由基的效果，常常在很大程度上是致癌的。此外，越來越多的證據(jù)表明飲食中富含水果和蔬菜，這富含天然抗氧化劑，少含飽和脂肪酸(特別易受ROS攻擊而損傷的靶體)，降低了動脈硬化和癌癥的風險。動脈硬化癥動脈硬化是發(fā)達社會中死亡和過早傷殘的主要原因。此外，目前的預測估計到2020年心血管病，尤其是動脈硬化，將成為全球總疾病負擔的最主要原因，總疾病負擔定義為從健康壽命中因傷殘或早死所減去的年數(shù)。動脈硬化是一個復雜的過程，可導致心臟病發(fā)作、中風、和因動脈粥樣硬化斑堵塞動脈而導致的肢體喪失。這種硬化斑是氧化了的脂肪的一種形式。當自由基與脂質反應，其后果是脂質過氧化，與黃油暴露于空氣中的氧時變得腐臭是同樣的過程。雖然許多因素影響動脈硬化的發(fā)展和嚴重性，一個主要的因素是ROS-介導的我們低密度脂蛋白(LDLs，或″壞膽固醇″)的過氧化反應。預防心臟病和中風的食療方法就是部分基于在降低脂肪本身攝取的同時，加入食物抗氧化劑以限制LDL的氧化。這些方法已經(jīng)使心臟病的死亡率顯著降低，但本發(fā)明的組合物在將來可以提供一個安全的藥學預防，而不必象食療和運動一樣依賴于人的意志。神經(jīng)疾病和神經(jīng)變性疾病神經(jīng)疾病和神經(jīng)變性疾病影響了數(shù)以百萬的美國人。這包括抑郁癥、強迫性神經(jīng)疾病、阿爾茨海默氏病、過敏、厭食、精神分裂癥，以及其它由神經(jīng)遞質水平的不適當?shù)恼{節(jié)或免疫系統(tǒng)功能不適當?shù)恼{節(jié)導致的神經(jīng)性病癥，以及如ADD(注意力缺陷障礙)和ADHD(注意缺陷障礙[伴多動])等行為失常。大量的這類疾病似乎都有ROS毒性作為其神經(jīng)細胞破壞基本機理的重要組成部分，包括，但不限于，肌萎縮性側索硬化(ALS，或Lou Gehrig’s病)、帕金森氏病和阿爾茨海默氏癥。缺血-再灌注損傷當某個器官缺少血液供應(缺血)時會被損傷，這不僅是由暫時性缺氧導致，還由與再灌注血液恢復供應時而再引入的氧發(fā)生反應所產(chǎn)生的ROS所導致。在某些臨床表現(xiàn)中，這種損傷可通過施用抗氧化劑而預防，給藥有時甚至可在缺血期后，但要在再灌注之前。例如，在含有抗氧化劑和其它試劑的溶液中保存腎臟、肝臟及其它器官如今是移植前的常規(guī)程序。另一個例子是心臟外科手術中阻止心跳前阻斷自由基產(chǎn)生酶功能的藥物的應用。這些藥物輔助預防當心臟重新啟動和血流恢復后的再灌注損傷。這種再灌注損傷機制還被發(fā)現(xiàn)在外傷、大手術或休克后的多器官衰竭病人中起重要作用。多器官功能衰竭目前是重癥護理室中最主要的致死因素，正進行廣泛努力以更好地了解ROS是如何在此癥候中起作用的。衰老衰老是一個非常復雜的科學認識尚相對模糊的過程。目前有證據(jù)表明衰老是一系列的過程，即，一系列受控的機制，并不僅僅是長年累月里磨損和損傷的被動積累。如果衰老是一系列的過程，這些過程中的一些是可能被控制的，或至少是可更改的。這些過程中最重要者包括由自由基和其它ROS介導的分子損傷的積累。最近的研究顯示ROS代謝的治療操作確實能夠顯著地延長小鼠的總壽命。孤獨癥孤獨癥是一種困擾著數(shù)以千計美國人的缺陷性神經(jīng)障礙，包括許多亞類，有各種各樣的假定病因，幾乎沒有成文的改善方法。孤獨譜系的癥狀可能在出生時就體現(xiàn)出來，或者可能較晚才開始，例如，在兩歲或三歲時。孤獨癥沒有明確的生物學標志。此癥的診斷通過考查兒童符合行為癥狀的程度來進行，其行為癥狀的特征有交際能力弱、社會能力和認知能力怪癖、和不良行為方式等。已開發(fā)了許多不同的對孤獨癥的治療方法。然而這些治療方法中許多都是針對疾病的癥狀而不是原因。例如，從精神分析學到精神藥理學的療法已被應用于孤獨癥的治療。盡管某些臨床癥狀可經(jīng)這些治療而減輕、案例中的較小部分顯示最好也只不過是有一定的改善作用。只有一小部分孤獨癥患者變得能夠象自信的成年人那樣生活。在初步研究中，一種
-基的營養(yǎng)補充劑被提供給一個言語非常有限的孤獨癥兒童，隨后報道該兒童的言語有了顯著提高。環(huán)加氧酶抑制劑的性質和應用本發(fā)明鑒定出兩個科的棕櫚樹(
和Jucara)的果實，對環(huán)加氧酶的兩種異構體，COX-1和GOX-2，都具有顯著的抑制功能。環(huán)加氧酶(有時稱作前列腺素內過氧化物合酶)與前列腺素的合成有關。COX-1表達被認為是組成型的，因為觀察到基底水平的COX-1的mRNA和蛋白的存在并產(chǎn)生前列腺素以完成正常的生理功能。相反地，COX-2的表達是誘導型的。根據(jù)本發(fā)明，
果實和Jucara果實、果汁、營養(yǎng)補充劑、和其它由
果實和Jucara果實衍生的物質用于治療、逆轉、和/或預防與環(huán)加氧酶活性增加相關的疾病或損傷。胃十二指腸粘膜防御胃上皮處于一系列內生性有毒因子的持續(xù)攻擊之下，這些因子包括HCl、胃蛋白酶原/胃蛋白酶、和膽汁酸鹽。此外，穩(wěn)定的外源性物質流如藥物、酒精、細菌遇到胃粘膜。一個高度復雜的生物系統(tǒng)在適當?shù)靥峁┓烙员苊庹衬p傷或修復可能發(fā)生的損傷。前列腺素類在胃上皮防御/修復中起重要的作用。胃粘膜含有豐富的前列腺素。這些花生四烯酸的代謝物調節(jié)粘膜碳酸氫鹽和粘液的釋放，抑制胃壁細胞分泌，并對保持粘膜血流和周圍細胞重建很重要。前列腺素類是衍生自酯化的花生四烯酸，該酸由磷脂(細胞膜)經(jīng)磷脂酶A2的作用而形成。控制前列腺素合成中限速步聚的一個關鍵酶是環(huán)加氧酶(COX)，該酶以兩種異構形式存在(COX-1，COX-2)，每一種都在結構、組織分布和表達上有獨特的特征。COX-1在包括胃、血小板、腎和內皮細胞等的組織宿主內表達。此異構體能組成型的方式表達并在保持腎功能完整、血小板聚集和胃腸粘膜完整中起重要作用。相反地，COX-2的表達可被炎癥刺激所誘導，而且它被表達于巨噬細胞、白細胞、成纖維細胞和滑膜細胞中。用于組織炎癥的非類固醇類消炎藥(NSAIDs)的有益效果歸因于COX-2的抑制。COX-2-抑制劑具有將胃腸道毒性最小化的同時提供降低組織炎癥的有益效果的潛力。類風濕性關節(jié)炎類風濕性關節(jié)炎(RA)是一種不明病因的慢性多系統(tǒng)疾病。盡管有許多系統(tǒng)性表現(xiàn)，RA的典型特征是持續(xù)性炎性滑膜炎，通常涉及對稱分布的外周關節(jié)?；ぱ籽装Y導致關節(jié)破壞和骨腐蝕及繼發(fā)性關節(jié)完整性改變的可能是此病的標志。RA醫(yī)學處理的第一步是應用非類固醇類抗氧化藥物(NSAIDs)和簡單鎮(zhèn)痛劑以控制局部炎癥進程的癥狀和跡象。這些藥劑在減輕病征和癥狀上是快速有效的，但它們在疾病的發(fā)展上似乎只有很小的效果。NSAIDs阻斷了Cox酶的活性并因此阻斷了前列腺素類、環(huán)前列腺素、和血栓素類的生成。結果，它們具有了鎮(zhèn)痛、消炎和退熱的功能。此外，這些藥劑可能發(fā)揮其它消炎效用。由于這些藥劑都與廣泛的毒副作用譜有關，本發(fā)明的天然營養(yǎng)補充劑組合物可提供NSAIDs的無毒替代物。癌癥環(huán)加氧酶已在許多癌癥中有所研究，COX-1或COX-2似乎在幾種癌癥形式中有作用。例如，COX-1和COX-2都顯示出在肺癌小鼠中被高度表達(Bauer等.，2000，Carcinogenesis 21，543-550)。據(jù)報道COX-1在人巨噬細胞中被煙草致癌物質所誘導并與NFκB的激活相關(Rioux&Castonguay，2000，Carcinogenesis 21，1745-1751)。據(jù)報道COX-1但不是COX-2在人卵巢癌中被表達(Dor et al.，1998，J.Histochem.Cytochem.46，77-84)。根據(jù)Ryu等人(2000，Gynnecologic Oncology 76，320-325)的研究，COX-2的表達在子宮頸癌一期的表達很高。據(jù)報道COX-2在人子宮頸癌中被過量表達(Kulkarni et a1.，2001，Clin.Cancer Res.7，429-434)。最后，據(jù)報道COX-1在子宮頸癌中被正調控并提議用COX-1抑制劑來治療子宮頸腫瘤病癥。Sales等，US專利申請20030220266。根據(jù)本發(fā)明，
果實和Jucara果實、果汁、營養(yǎng)補充劑、和其它由
果實和Jucara果實合成的物質用于治療、逆轉、和/或預防與環(huán)加氧酶活性增加相關的癌癥。藥用組合物和制劑本發(fā)明的水果基營養(yǎng)補充劑可單獨用于飲料、保健品、輸注液、或食物原料，或與其它營養(yǎng)補充劑或治療劑相結合。本發(fā)明的水果基營養(yǎng)補充劑可單獨使用或進一步與藥用化合物、載體、或具有有利傳遞性能(即適于傳遞給受試者)的輔劑制成制劑使用。這樣的組合物典型地包含本發(fā)明的水果基營養(yǎng)補充劑和藥用載體。此處術語“藥用載體”傾向于包括任何及所有與藥用相容的溶劑、分散介質、包衣、抗細菌和抗真菌化合物、等滲和緩釋化合物，以及類似物質。合適的載體見述于最新版的《Remington′s藥學》，業(yè)內的標準參考書，在此一并作為參考。這種載體或稀釋劑的優(yōu)選實施例包括，但不限于，水、生理鹽水、林格氏液、葡萄糖溶液、以及5％人血清白蛋白。脂質體和非水性載體如非揮發(fā)性油也可使用。用這些介質和化合物制備藥學活性物質是業(yè)內周知的。除非任何常規(guī)介質或化合物與該活性成分不相容，否則將其用于此組合物都是計劃中的。附加的活性化合物也可被結合到此組合物中來。本發(fā)明的藥用組合物制成與計劃施用途徑相容的制劑。施用途徑的例子包括口服、靜脈內、腹膜內、皮下、肌內、關節(jié)內、動脈內、大腦內、小腦內、支氣管內、鞘內、局部的、和氣溶膠途徑。pH可用酸或堿調節(jié)，如鹽酸或氫氧化鈉?？诜M合物通常包括一種惰性稀釋劑或可食用載體。它們可被包被于凝膠膠囊、囊片中或壓縮至片劑中。為了達到經(jīng)口治療施用的目的，本發(fā)明的水果基營養(yǎng)補充劑可整合于賦形劑中并以片劑、錠劑或膠囊的形式使用?？诜M合物還可利用流動載體制備以用作漱口劑，其流動載體中的化合物經(jīng)口應用發(fā)出嗖嗖聲(swished)并被吐出或咽下。藥物相容性粘合化合物，和/或賦形物質可包括進來作為組合物的一部分。片劑、丸劑、膠囊、錠劑之類可含有任意的下列組合物，或具相似性質的化合物粘合劑如微晶纖維素、西黃蓍膠、或凝膠；賦形劑如淀粉或乳糖，分散劑如海藻酸、Primogel、或玉米淀粉；潤滑劑如硬脂酸鎂或Sterotes；助流劑如膠狀二氧化硅；甜味化合物如蔗糖或糖精；或調味化合物如薄荷、水楊酸甲酯、或橙味劑(orange flavoring)。本發(fā)明中水果基營養(yǎng)補充劑也可制成栓劑形式的藥用組合物(如，與常規(guī)栓劑基質如可可脂和其它甘油酯一起)或用于直腸傳遞的保留灌腸劑。在一個實施方案中，本發(fā)明的水果基營養(yǎng)補充劑與能保護化合物不被機體快速清除的載體共同制備，這些載體如可控釋放制劑，包括植入物和微囊傳遞系統(tǒng)。可使用生物可降解的、生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐類、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯類(polyorthoesters)、和聚乳酸。制備這些制劑的方法對專業(yè)技術人員將是熟知的。這些材料還可從Alza公司和Nova醫(yī)藥公司以商業(yè)途徑獲得。Liposomal懸液也可用作藥用載體。這些可根據(jù)業(yè)內周知的方法制備，例如，如美國專利No.4,522,811中所述。制成劑量單位形式的口服制劑或腸道外制劑對易于施用和劑量均勻特別有利。術語劑量單位形式指適合作為對治療對象的單位劑量的物理不連續(xù)的單元，每個單位包含經(jīng)計算與所需藥用載體聯(lián)合能產(chǎn)生理想治療效果的預定劑量的活性化合物。本發(fā)明劑量單元形式的規(guī)格確定于和依賴于水果基營養(yǎng)補充劑的獨特性質和要獲得的特定治療效果，以及這些個體治療用活性化合物混合技術中固有的限制。藥用組合物可與施用說明書一起置于容器、包裝或分配器內。本發(fā)明經(jīng)參考下面實施例進一步說明，這些實施例并不意味著限制本發(fā)明的范圍。本領域技術人員將熟知許多修改，無論是對材料還是方法，可在不偏離本發(fā)明目的和權利的情況下實施。
實施例實施例1凍干
的組成分析凍干
OPTACAI；Lot#231003/0410-C的組分分析詳述于下面表1和表2。表1 表2除非另有說明，所有方法依Official Methods of Analysis ofAOAC International，17版，2000年(下文，AOAC)中所述進行。待測樣品的含水量依AOAC方法參考#926.08測定。待測樣品蛋白含量依AOAC方法參考#991.20E測定。待測樣品脂肪含量依AOAC方法參考#933.05測定。待測樣品灰分含量依AOAC方法參考#935.42測定。待測樣品碳水化合物含量根據(jù)差異計算。待測樣品的熱量含量應用Atwarter因子計算。糖含量用AOAC方法參考#982.14測定。待測樣品內總食物纖維素用AOAC方法參考#991.43測定。待測樣品膽固醇含量用AOAC方法參考#994.10測定。待測樣品脂肪酸譜用AOAC方法參考#969.33測定。待測樣品鈉、鈣和鐵含量用AOAC方法參考#984.27測定。待測樣品內維生素C含量用AOAC方法參考#967.22測定。待測樣品內維生素A含量依Reynolds和Judds，Analyst，109489，1984所述方法測定。微生物測定基本按實施例36(見下文)中所詳述進行。痕量礦物質/金屬用IBC實驗室(Integrated BiomoleculeCorporation，Tucson，AZ)的IPC/MS(Aligent HP-7500a)方法分析。實施例2凍干
組成分析凍干
FD漿果粉(lot#231003/0410-C)成分分析由IBC實驗室(Integrated Biomolecule Corporation，Tucson，AZ)進行。結果詳見下面表3。表3除非另有說明，所有方法依Official Methods of Analysis ofAOAC International，17版，2000年(下文，AOAC)中所述進行。待測樣品的含水量依AOAC方法參考#926.08測定。待測樣品蛋白含量依AOAC方法參考#991.20E測定。待測樣品脂肪含量依AOAC方法參考#933.05測定。待測樣品灰分含量依AOAC方法參考#935.42測定。待測樣品碳水化合物含量根據(jù)差異計算。待測樣品的熱量含量應用Atwarter因子計算。糖含量用AOAC方法參考#982.14測定。待測樣品內總食物纖維素用AOAC方法參考#991.43測定。待測樣品膽固醇含量用AOAC方法參考#994.10測定。待測樣品脂肪酸譜用AOAC方法參考#969.33測定。待測樣品鈉、鈣和鐵含量用AOAC方法參考#984.27測定。待測樣品內維生素C含量用AOAC方法參考#967.22測定。待測樣品內維生素A含量依Reynolds和Judds，Analyst，109489，1984所述方法測定。痕量礦物質/金屬用IBC實驗室(Integrated Biomolecule Corporation，Tucson，AZ)的IPC/MS(AligentHP-7500a)方法分析。實施例3凍干
營養(yǎng)分析一份100克凍干
的營養(yǎng)分析由Silliker，Inc.IllinoisLaboratory(Chicago Heights，IL；laboratory ID No.170547501)進行。結果詳見于下面表4。表4除非另有說明，所有方法依Official Methods of Analysis ofAOAC International，17版，2000年(下文，AOAC)中所述進行。待測樣品的含水量依AOAC方法參考#926.08測定。待測樣品蛋白含量依AOAC方法參考#991.20E測定。待測樣品脂肪含量依AOAC方法參考#933.05測定。待測樣品灰分含量依AOAC方法參考#935.42測定。待測樣品碳水化合物含量根據(jù)差異計算。待測樣品的熱量含量應用Atwarter因子計算。糖含量用AOAC方法參考#982.14測定。待測樣品內總食物纖維素用AOAC方法參考#991.43測定。待測樣品膽固醇含量用AOAC方法參考#994.10測定。待測樣品脂肪酸譜用AOAC方法參考#969.33測定。待測樣品鈉、鈣和鐵含量用AOAC方法參考#984.27測定。待測樣品內維生素C含量用AOAC方法參考#967.22測定。待測樣品內維生素A含量依Reynolds和Judds，Analyst，109489，1984所述方法測定。實施例4凍干Jucara果實的營養(yǎng)分析100g份量凍干Jucara果實的營養(yǎng)分析由Silliker，Inc.IllinoisLaboratory(Chicago Heights，IL；laboratory ID No.171378581)進行。結果詳見于下面表5。表5除非另有說明，所有方法依Official Methods of Analysis ofAOAC International，17版，2000年(下文，AOAC)中所述進行。待測樣品的含水量依AOAC方法參考#926.08測定。待測樣品蛋白含量依AOAC方法參考#991.20E測定。待測樣品脂肪含量依AOAC方法參考#933.05測定。待測樣品灰分含量依AOAC方法參考#935.42測定。待測樣品碳水化合物含量根據(jù)差異計算。待測樣品的熱量含量應用Atwarter因子計算。糖含量用AOAC方法參考#982.14測定。待測樣品內總食物纖維素用AOAC方法參考#991.43測定。待測樣品膽固醇含量用AOAC方法參考#994.10測定。待測樣品脂肪酸譜用AOAC方法參考#969.33測定。待測樣品鈉、鈣和鐵含量用AOAC方法參考#984.27測定。待測樣品內維生素C含量用AOAC方法參考#967.22測定。待測樣品內維生素A含量依Reynolds和Judds，Analyst，109489，1984所述方法測定。實施例5凍干
粉中甾醇類的定量分析凍干
粉(#001
Powder；Flora ID No.210823003)中甾醇成分用高分辨氣相色譜(HRGC)(Flora Research Laboratories，Grand Pass，OR)測定，如表6所述。表6待測樣品中固醇含量用配備了FID和自動進樣器的HewlettPackard 5890 II系列氣相色譜儀測定，采用INA方法109.001。用5-α-膽甾烷作標準物(Matreya，Inc.Pleasant Gap，PA)。這些分析所用的柱子是Restek Rtx-5，5％二苯基-95％二甲基聚硅氧烷，60m×0.25mm，0.25μm膜厚。實施例6凍干
殘留水含量(Residual Humidity)分析
制劑的殘留水含量在凍干前后用Instituto Adolfo Lutz(1976)(UNIVERSIDADE DE
PAULO，F(xiàn)aculdáde do Ciencias FarmacéuticasDepartamento de Alimentos e Nutricilio Experimental Laboratorio de Analistede Alimentos)方法測定。
果漿粗制品的水含量為85.37+/-0.14％。凍干
果漿的殘留水含量為1.06％。antocianinas總共(mg/100g
果漿)為239.32+/-0.74，用Francis&Fuleki，(J.Food Sci，v.33，p.72-77，1968)方法測定。圖1顯示了凍干
粉的典型吸收譜。實施例7 Jucara和
制劑中花色素苷和酚類化合物分析I.概述A原花色素類(proanthocyanidins)原花色素可能有助于解釋“法國悖論”，或為什么低冠心病發(fā)病率存在于法國以脂肪類食物和紅酒消費高而知名的省份中。紅酒可被認為是一些有效的黃酮類化合物的酒精浸出液，這些黃酮類化合物包括葡萄籽中的原花色素類。在一個挑戰(zhàn)性的研究中，F(xiàn)ulvio Ursini，M.D.，來自意大利Padova大學，對志愿者喂以配有或不配有紅酒的高脂肪餐。他發(fā)現(xiàn)在那些喝紅酒者體內餐后血漿內過氧化物水平要低得多(Ursini F，等Post-prandial plasma peroxidesa possible link between diet andatherosclerosis.Free Rad Biol Med 1998；25250-2.)。伴有疫學證據(jù)的一系列動物和體外研究以及少量的初級人體研究揭示了與這些化合物相關的大量保健效果。這些益處中主要的是對心臟病和癌癥的抗氧化性保護。原花色素類一更專業(yè)地稱為原花色素低聚物，并由此稱為OPC-是一類黃酮類化合物。以前稱為“縮合單寧”，所有原花色素都是化學相似的，區(qū)別僅在于它們聚酚環(huán)的形狀及連接物的輕微變化。自然中，一大堆不同的原花色素總是被同時發(fā)現(xiàn)，范圍從單個單元到許多相連單元(低聚物)的復雜分子。原花色素是一組高度特異的生物類黃酮，從1960年代后期開始因其血管壁增強功能和自由基清除活性而得到廣泛研究。原花色素是已知最具潛力的自由基清除劑，具有比維生素E高達50倍和比維生素C高達20倍的抗氧化能力。原花色素還具對細胞膜的親和性，這為降低毛細血管通透性和脆性提供了營養(yǎng)支持。盡管生物類黃酮在自然界中廣泛分布，強效的原花色素化合物是最豐富的并可從海岸松樹皮和葡萄種子或果仁中得到。歐洲越桔浸出物含有聲稱具增視功能和已證明有血管增強功能的花色素類。據(jù)稱歐洲越桔能降低視覺疲勞并通過其對視紫紅質-視蛋白系統(tǒng)的親和而改善從亮處到暗處的調節(jié)性，視紫紅質-視蛋白系統(tǒng)是介導亮和暗視覺和昏暗處視覺適應的色素系統(tǒng)。然而，在以色列和美國做的兩項軍用研究并未能從歐洲越桔浸出物中發(fā)現(xiàn)任何這種好處。無論如何，該浸出物可能促進了視網(wǎng)膜自身的酶學抗氧化防御。在血管系統(tǒng)中花色素浸出物通過增加細胞內維生素C水平來支持血管壁的完整性，降低了某些蛋白水解酶/溶酶體酶的透化效果，穩(wěn)定細胞膜，并刺激膠原和結締基質組織的合成。葡萄籽(種子)是原花色素或pycnogenols的潛在資源。JacquesMasquelier，Ph.D.，原花色素研究的開創(chuàng)者和術語″pycnogenol″的創(chuàng)造者，在其第二階段的原花色素研究中使用了葡萄種子浸出物。體外研究認為OPC類還提供了癌癥保護。Vaccinium-科漿果中的OPC類，包括藍莓、越橘(lingonberry)和酸果蔓，能阻斷腫瘤生長，這通過阻止腫瘤細胞內蛋白合成而防止其增殖而實現(xiàn)(Bomser J，和Madhavi D.L.In vitro anticancer activity of fruit extracts from Vacciniumspecies.Planta Med，1996；62212-6.)。同樣是在實驗室中，大麥麩中的OPC使為骨髓白血病細胞轉變?yōu)榉前┬?Tamagawa K，和Fukushima S.Proanthocyanidins from barley bran potentiate retinoic acid-inducedgranulocytic and sodium butyrate-induced monocytic differentiation of HL60cells.Biosci Biotechnol Biochem，1998；621483-7.)。另一個體外實驗發(fā)現(xiàn)一種獲得專利的葡萄種子浸出物殺死了癌細胞，抑制了人乳腺癌、肺癌、胃癌和骨髓性白血病細胞的達73％的細胞生長，并提高了正常細胞的生長(Ye，X.和Krohn.R.L.The cytotoxic effects of a novel 1H636 grape seedproanthocyanidin extract on cultured human cancer cells.Mol Cell Biochem，1999；19699-108.)。原花色素可保護機體免受許多潛在毒性試劑的損傷。醋氨酚，泰諾林TM中的活性組合物，是潛在的肝毒素，在美國每年導致75,000例需住院治療的中毒。動物實驗顯示用100mg/kg的一種專利葡萄種子浸出物預處理一周防止了醋氨酚對肝臟的損傷。器官的損傷通過研究肝細胞受損狀況和監(jiān)測動物的健康來評估(Ray SD，等A novel proanthocyanidin 1H636 grape seed extract increases in vivo bcl-XI expression and preventsacetaminophen-induced programmed and unprogrammed cell death in mouseliver.Arch Biochem Biophys.，1999；369(1)42-58.)。原花色素類可能比預防疾病做得更多；它們能幫助延緩衰老并減少衰老的可見跡象。氧化損傷導致了我們皮膚上大多數(shù)衰老的可見跡象。通過防止這種損傷，皮膚將保持年輕的樣子。達到這個目的的一個方法是減少紫外(UV)線的損傷效果。防曬產(chǎn)品已經(jīng)合并了多種抗氧化劑意在它們將防止陽光對皮膚的損傷。在一項研究中，葡萄種子的OPC類獨自發(fā)揮了與維生素E有相同效果的抗氧化作用-可保護不同多不飽和脂肪酸免受紫外線導致的過氧化反應(Carini M.，等The protection ofpolyunsaturated fatty acids inmicellar systems
UVB-inducedphoto-oxidation by procyanidins from Vitis vinifera L.，and the protectivesynergy with vitamin E.Intl J Cosmetic Sci.，1998；20203-15.)。同樣是在該研究中，葡萄源OPC類與維生素E協(xié)同作用，使其失活形式轉變?yōu)榛钚孕问讲⒁虼似鸬接行У木S生素E補充劑的作用。衰老過程的一部分是彈性蛋白酶對皮膚的降解，該酶與炎癥反應有關。OPC類特異性地阻斷彈性蛋白酶，因此保持了彈性蛋白的完整性(Meunier MT，和Villie F.The interaction of Cupressus sempervirens L.proanthocyanidoiic oligomers with elastase and elastins.J Pharm Beig.，1994；49453-61.)。如果動物實驗的結果可適用于人類，OPC類甚至能幫助長出一頭更濃密的頭發(fā)。日本研究者給小鼠剃毛后發(fā)現(xiàn)它們毛發(fā)中的40％能自然生長回復。然而，當將三種花色素中的任一種的1％溶液施用于皮膚，70％到80％的毛發(fā)生長回復了。試管實驗證實OPC類確實刺激了毛發(fā)角質形成細胞生成比對照多三倍的毛發(fā)(Takahashi T，et al.Procyanidin oligomersselectively and intensively promote proliferation of mouse hair epithelial cellsin vitro and activatehairfollicle growth in vivo.J Invest Dermatol.，1999；112310-6.)。B.酚類化合物藤黃菌素-4’-葡萄糖苷抑制巨噬細胞中促炎癥反應細胞因子的生成。抗癌類黃酮毒性真核DNA拓撲異構酶III.凍干JUCARA粉中花色素苷的測定凍干Jucara粉中的花色素昔譜用LC/MS/MS測定并顯示于圖2。圖2中LC/MS/MS的峰結果總結于表7。花色素苷和OPC分析(酚類化合物)按下面詳述進行。簡要地，粉狀樣品同時差別地被水和乙酸乙酯萃取。收集各層并過濾除去固體。完整的花色素苷從水層用HPLC在Zorbax 5μm 150×4.6mm的C-18柱上以梯度流動相(1ml/分鐘流量)分析，流動相包括A(0.5％磷酸)、B(水∶乙腈∶乙酸∶磷酸-50∶48.5∶1∶0.5)，梯度程序為初始100％A，20分鐘80％A，30分鐘40％A，36分鐘80％A。用外部標準物進行定性/定量。低聚原花色甙從乙酸乙酯層在蒸發(fā)干燥并復溶于無水乙醇后分析。色譜在Phenyl-hexylLuna 3μm 250×3.5mm柱上用梯度流動相進行，流動相包括。A(水∶乙腈∶乙酸-89∶9∶2)、B(水∶乙腈-20∶80)，梯度程序為初始100％A，25分鐘60％A，32分鐘100％B，40分鐘100％A。通過基于母體表兒茶酸和兒茶酸環(huán)結構的消光系數(shù)的原理進行鑒定/定量。表7凍干Jucara粉中的花色素苷類的結構見圖3III.凍干
粉中花色素苷的測定凍干
粉中的花色素苷譜用LC/MS/MS測定并顯示于圖4。圖4中LC/MS/MS的峰結果概括于表8。表8
依前所述進行分析凍干
粉中的花色素苷類的結構見圖5。IV.凍干Jucara粉和凍干
粉中花色素苷的含量凍干Jucara粉和凍干
粉中花色素苷的含量概括于表9。表9花色素苷的含量
依前所述進行分析。V.凍干Jucara粉中各種酚類的鑒定用HPLC和質譜分析凍干Jucara粉中各種酚類譜系并示于圖6。圖6中的HPLC峰結果概括于下面表10。表10酚類峰鑒別及其質譜數(shù)據(jù)凍干Jucara粉中存在的各酚類化合物的結構顯示于圖7。凍干
粉中未發(fā)現(xiàn)有大量的酚類化合物。分析依前文所述進行。VI.凍干
粉和凍干JUCARA粉中原花色素類的測定凍干
粉和凍干Jucara粉的原花色素類譜用色譜法測定并顯示于圖8。如圖8所詳示，原花色素譜。B1是表兒茶精和兒茶素。從B2到B8的峰代表從二聚體到八聚體的B類原花色素苷。A2是由質譜顯示具有一個A類黃烷間鍵的二聚物。圖8所顯示的峰結果總結于表11。表11凍干樣品中的原花色素含量 Jucara含有非常高水平的原花色素，以及，抗羥基自由基和過氧化亞硝酸鹽的高抗氧化活性。圖9顯示了凍干
粉和凍干Jucara粉中檢測到的原花色素類的典型結構。分析依前文所詳述進行。實施例8凍干
漿果粉中花色素苷含量組成分析凍干
FD漿果粉(lot#MAL001)中花色素苷成分的分析由IBC實驗室(Integrated Biomolecule Corporation，Tucson，AZ)完成。結果詳示于下面表12。表12花色素苷和OPC分析依Brunswick實驗室所用方法進行。簡要地，粉狀樣品同時分別用水和乙酸乙酯萃取。收集各層并過濾除去固體。完整的花色素苷從水層用HPLC在Zorbax 5μm 150×4.6mm的C-18柱上以梯度流動相(1ml/分鐘流量)分析，流動相包括A(0.5％磷酸)、B(水∶乙腈∶乙酸∶磷酸-50∶48.5∶1∶0.5)，梯度程序為初始100％A，20分鐘80％A，30分鐘40％A，36分鐘80％A。用外部標準物進行定性/定量。低聚原花色甙從乙酸乙酯層在蒸發(fā)干燥并復溶于無水乙醇后分析。色譜在Phenyl-hexyl Luna 3μm 250×3.5mm柱上用梯度流動相進行，流動相含有A(水∶乙腈∶醋酸-89∶9∶2)B(水∶乙腈-20∶80)，采用下述程序-初始100％A，25分鐘60％A，32分鐘100％B，40分鐘100％A。通過基于母體表兒茶酸和兒茶酸環(huán)結構的消光系數(shù)的第一原理進行鑒定/定量。實施例9凍干
的脂肪酸分析凍干
果漿的脂肪酸分析由Silliker，Inc.Illinois Laboratory(Chicago Heights，IL；laboratory ID No.170547512)完成。結果詳述于表13、表14和表15。表13表14表15除非另有說明，所有方法依Official Methods of Analysis of AOAcInternational，17版，2000年(下文，AOAC)中所述進行。待測樣品的脂肪酸譜依AOAC方法參考#969.33測定。實施例10凍干Jucara果實的脂肪酸分析凍干Jucara果實的脂肪酸分析由Silliker，Inc.Illinois Laboratory(Chicago Heights，IL；laboratory ID No.171378575)完成。結果詳述于表16、表17和表18。表16表17表18除非另有說明，所有方法依Official Methods of Analysis of AOAcInternational，17版，2000年(下文，AOAC)中所述進行。待測樣品的脂肪酸譜依AOAC方法參考#969.33測定。實施例11凍干
的氨基酸分析通過離子交換色譜和柱后衍生化分析氨基酸氨基酸分析依下述常規(guī)步聚進行。A.原理本方法用6N鹽酸水解后再用離子交換色譜定量測定氨基酸含量。鄰苯二甲醛(O-phthaldehyde)被用于柱后衍生及隨后的熒光檢測。B.范圍本方法適用于配料、含有混合飼料蛋白的物質。C.關鍵點干燥樣品時避免蒸發(fā)時間過長?？赡軙l(fā)生某些氨基酸的損失。D.試劑和藥品及方法
1.水，HPLC級，EM Science EM WA0004-1或家用水純化系統(tǒng)
2.鄰苯二甲醛，試劑級，Anresco 0317。
3.氨基酸標準溶液，2.5pmol/mL，Sigma A9531。
4.甲醇，HPLC級，chempure 831-295或相當產(chǎn)品
5.Brij 3溶液，30％(w/w)，Sigma 430Agr.6
6.2-巰基乙醇，(2-羥基乙硫醇)，Sigma M-6250。
7.L-正亮氨酸，Sigma N-6877。
8.皮氏緩沖液，pH 2.2、3.28和7.40，Picketing laboratories Na 220、Na 328和Na 740。
9.氫氧化鉀，顆粒，Chempure 831-706。
10.氫氧化鈉，顆粒，Chempure 832-050。
11.鹽酸，6N標準溶液，Chempure RR-155。
12.乙二胺四乙酸EDTA四鈉鹽，水合物，Sigma ED4SS。
13.氮源
14.硼酸，Chempure 830-314。
15.正亮氨酸內標-在分析天平上稱重0.1mg，0.1640g的正亮氨酸。轉移到1000mL容量瓶中。加入250mL HPLC級水。加入1mL濃鹽酸并混勻。用HPLC級水補齊體積，混合并超聲處理。此溶液將含1.25pxn/mL L-正亮氨酸。冷藏以避免細菌生長。
16.氨基酸標準溶液-將氨基酸標準溶液瓶暖至室溫。吸取5.0mL到50ml容量瓶中。吸取10.0mL的1.25pm/mL L-正亮氨酸內標到相同的50ml容量瓶。用HPLC級水補齊體積。充分混全并超聲處理幾分鐘。轉移標準溶液入4mL Waters樣品瓶中，0℃保存。
17.氫氧化鉀溶液，50％-在最大載量天平上，稱150g的氫氧化鉀置入稱重過的1升Nalgene容器中。用150g去離子水溶解，如有必要則攪拌。用前使溶液冷卻至室溫。
18.硼酸緩沖液-稱122克硼酸入稱重過的2000ml燒杯并加入1800ml的HPLC級水。用50％氫氧化鉀溶液調pH到11.0。轉移此溶液至4升玻璃水壺中用HPLC級水充滿(4升)并充分混合。終溶液的pH應在10.4。
19.皮氏緩沖液流動相
a.pH 3.28-此緩沖液可從瓶中取出使用。用0.45pm過濾膜過濾并在用于HPLC前真空超聲脫氣。
b.pH 7.40-此緩沖液可從瓶中取出使用。用0.45pm過濾膜過濾并在用于HPLC前真空超聲脫氣。
20.氫氧化鈉，0.2N-稱16克氫氧化鈉顆粒入一個2升容量瓶。加入約1000mL HPLC級水并混合至氫氧化鈉溶解。稱0.5g EDTA，加入此容量瓶。用HPLC級補劑體積，混合并用0.45mm濾膜過濾。用塑料加侖壺作為HPLC用的容器。定期過濾。
21.鄰苯二甲醛-稱1.4g鄰苯二甲醛(OPA)晶體入50mL燒杯。加20mLHPLC級甲醇并超聲處理至晶體溶解。將溶液加入到一個約含1500ml硼酸緩沖液的2升容量瓶中混勻。在通風櫥中，加入4.0mL 2-巰基乙醇(惡臭！)。用硼酸鹽緩沖液補齊體積并混勻。用0.45pm濾器過濾溶液。將濾過的溶液傾入兩個1升的Nalgene瓶中并在每個瓶中加3.0mL Brij-35。用氮蓋住瓶子并充分混合。冷藏至需用。OPA溶液在此條件下穩(wěn)定約1周(可延長至2周)。E.設備及儀器
1.Waters 712B型自動注射器或等價產(chǎn)品。
2.Waters 6000型泵(2)，Water 2100或等價產(chǎn)品。
3.Digital Pro380附Waters Expert軟件或等價產(chǎn)品。
4.Kratos FS-950熒光檢測器或等價產(chǎn)品。
5.Kratos URS 051柱后泵或等價產(chǎn)品
6.Fiatron柱加熱器，Eppendorf CII-30或等價產(chǎn)品。
7.Fisher Isotemp爐，215P型或等價產(chǎn)品。
8.Savant Speed Vac濃縮器，SVC-20011型。
9.Savant冷凝疏水器，RT-490型。
10.Savant化學疏水器，SCT-120型。
11.Savant一次性酸蒸汽中和倉，DC12OA型。
12.Precision直驅真空泵，Dd-310型或等價產(chǎn)品。
13.真空計，Waters Pico-Tag工作站或等價產(chǎn)品。
14.Glass-Col小型脈沖旋渦器，58216型或等價產(chǎn)品。
15.Beckman pH140計，Beckman 123118或等價產(chǎn)品
16.Mettler分析天平，AE16O型或等價產(chǎn)品
17.Millipore溶劑過濾器，Waters 85116
18.Interaction-載鈉離子交換柱，帶保護柱。Interaction色譜儀AMI 1.
19.Bransonic超聲水浴220型
20.Mettler頂加載天平，P-1000型
21.Pipeman。Gilson，1ml和5ml，Rainin P4000和P-5000
22.通用lit pipes槍頭，1mL SoS mL，Rainin
23.帶Luer-Lok的Plastipak注射器，3cc×1/10cc，BI)9585或等價產(chǎn)品。
24.針式濾器，聚丙烯，聚四氟乙烯，0.45微米，Nalgene 199-2045。
25.Magna尼龍66膜，47mm直徑，0.45微米孔徑，F(xiàn)isher N045P0410。
26.RepipetII分配器，S mL，F(xiàn)isher 13-687-62A。
27.Universal fir pipes槍頭，200-100C)d.VWR 53508-819。
28.一次性培養(yǎng)管，12×75mm，硼硅酸鹽玻璃，VWR 60825-550或等價產(chǎn)品。
29.樣品瓶組，4mL，包括接頭和PFET隔膜，Waters 73108
30.帶彈簧的低體積插入物，塑料，4mL樣品瓶用，Waters 72163。
31.Firestone閥，快速沖洗，Ace Glass mc，8766
32.培養(yǎng)管，一次性，20×150mm，螺口蓋，硼硅酸鹽玻璃，VWR60826.280。
33.一次性培養(yǎng)管的螺口蓋，20mm 0])，PTFB墊，VWR 60828-570。
34.Brinkman離心磨碎機，ZM-1型(帶0.5ruin screen)或等價產(chǎn)品。F.樣品制備樣品被盡可能研磨細以保持最小失水。用Brinkman離心磨碎機(型號ZM-1)或等價產(chǎn)品研磨樣品，用0.5mm篩得到研細的研磨物。G.步驟
1.分析天平校正并歸零。
2.在氨基酸分析稱重前對樣品的蛋白含量有所了解是有幫助的。對此有所了解后，在分析天平上稱出相當于含20mg蛋白的樣品(參見FreeAmino Acid Determination附錄)。對于幾乎純凈的樣品，稱大約38mg。在實驗室記事本上記錄所稱重量。樣品隨后定量地轉移入有標記的20×150旋轉螺口培養(yǎng)管。
3.用Repipet II分配器，將15mL 6N鹽酸加入每個培養(yǎng)管。因為樣品經(jīng)過研磨且數(shù)量很少，避免使用可能造成培養(yǎng)管內樣品損失的汲出(drafts)。
4.在通風櫥內，將75微升2-巰基乙醇加入每個培養(yǎng)管(注1)。這能夠更好的測定L-蛋氨酸峰。
5.將每個培養(yǎng)管firestone化(注2)，在氮氣(10-12psi)和真空間至少每種切換5次。
6.樣品在氮下時旋上PTFE-表面的蓋子。
7.培養(yǎng)管置于爐內110℃±2℃24小時。
8.組裝Savant蒸發(fā)系統(tǒng)。使用前至少2小時前開啟系統(tǒng)電源，這樣冰箱單元才能有足夠的時間達到-92℃的工作溫度。真空泵油徹底脫氣。如果需要，這一點通過打開泵上載氣閥和打開泵進行。通常一小時是足夠的。完成后合上載氣閥并關閉泵。
9.24小時后，從爐中取出培養(yǎng)管并冷卻至室溫。
10.向每個培養(yǎng)管中加入5mL HPLC級水。旋上蓋子充分混合。
11.向每個培養(yǎng)管中加入5mL正亮氨酸內標(1.25pm/mL)(注3)。(在此如必要的話分析可暫停至下一天進行。如需保存過夜則將培養(yǎng)管保存于0℃。)
12.使用1mL的pipetman，將2mL水解產(chǎn)物轉移至有標記的12×75mm一次性培養(yǎng)管。
13.打開高速真空濃縮器的蓋子，將含2mL水解產(chǎn)物的試管圍繞轉子置入位置以使負載良好平衡。
14.關上蓋子，打開通風口開始離心。當轉子達到其操作轉速進時，關閉真空計的通風口打開真空泵。如有必要，蒸發(fā)過程可能需過夜進行。當在一天的晚些時候蒸發(fā)許多樣品將會是這樣。
15.樣品干燥后(真空計讀數(shù)小于500毫升)，緩慢打開通風口向箱內通入空氣。關閉泵，當箱內徹底通氣后立即關閉離心機，取出試管。
16.將3mL皮氏鈉稀釋劑220加入每個試管并在旋渦混合前作短暫超聲處理。
17.在3mL注射器上附0.45pm濾器。制備的水解產(chǎn)物濾至一個有標記的含有帶彈簧的Waters低體積插入物的4mL小瓶中，然后置于712B上。
18.HPLC條件
a.所有緩沖液和OPA溶液真空超聲脫氣。緩沖液管置入相應的緩沖液中，OPA管置入OPA溶液中。用3.28緩沖液以0.5mL/分鐘的流速平衡柱子至少20分鐘。
b.熒光計的靈敏度檔設到450，范圍為0.5，時間常數(shù)為1秒，背景抑制為′to″。
c.柱加熱器溫度設為60℃并在運行中監(jiān)控。
d.開啟OPA泵并將流速設為0.50mL/分鐘(如有必要在下游調節(jié))。
e.將標準樣置于WISP的位置#1和#2上。建立多個方法和/或方法表并注入20F1標準樣。用60分鐘完成運行。觀察結果的色譜。如色譜不滿意則注射第三次。
f.每測5個樣品作一個標準樣。更新了的響應系數(shù)將會產(chǎn)生并被應用于隨后的進樣。
g.如果譜峰超出了窗口，重處理樣品并在校正表中調整保留時間以march該樣品的保留時間。打印并保存更正過的新譜圖。
h.用2種緩沖液進行梯度洗脫使用Waters軟件，用2個緩沖液建立一個令人滿意的梯度以洗脫氨基酸。泵表19如下表19標準泵表J.計算
響應因子＝氨基酸量(mg)×正亮氨酸面積(內標)
氨基酸面積
然后RF×樣品氨基酸面積＝氨基酸濃度(mg)
正亮氨酸內標面積
由于樣品體積決定了最終濃度，氨基酸濃度乘以樣品體積＝最終氨基酸濃度K.注釋
1.如果必要，可以用巰基乙酸替換-如果所用Brij-35不能很好保留Lrs quek。
2.Firestone步驟包括在超聲浴內交替抽空和用氮氣清洗酸-樣品溶液。這使溶液脫氣并在酸上面創(chuàng)造了一個惰性氣體氛圍從而使水解過程中氨基酸的氧化達到最小。
3.用一個5mL的pipetman，用室溫水校至5.000B±0.005g。
4.在良好真空下，樣品會在管內凍結。如果是這樣，約45至60分鐘后，取出試管并在含熱水的燒杯內加熱水解產(chǎn)物。將試管放回轉子繼續(xù)蒸發(fā)。L.確認M.質量控制
1.依照質量保證手冊中所詳述的標準品質量保證規(guī)范
2.對照標準品(第二標準品)應包括于每次樣品檢測中。目前使用酪蛋白作為對照品。
3.對照標準品的結果將被記錄于實驗室記錄本中。
4.標準品重復測定誤差不得超過8％。
5.記錄本由進行檢測的分析員初始化并注明日期。
6.記錄本登記由本部門內另一分析員檢查、了解、初始化并注明日期。N.參考文獻
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5.IAOAGVol.68，No.5，1985，pp811-821.Sample Preparation forChromatography of Amino AcidsAcid Hydrolysis of Proteins.II.凍干
果漿的氨基酸分析凍干
果漿的氨基酸分析由Silliker，Inc.Illinois Laboratory(Chicago Heights，IL；laboratory ID No.170547512)完成。結果詳見表20。表20實施例12凍干Jucara果實的氨基酸分析凍干Jucara果實的氨基酸分析由由Silliker，Inc.IllinoisLaboratory(Chicago Heights，IL；laboratory ID No.171378575；如實施例11所詳述)完成。結果詳見表21。表21實施例13用ORACFL分析對凍干Arai和所選蔬菜的抗氧化能力進行的比較分析I.常規(guī)ORAC分析ORAC分析是Cao等人開發(fā)，并最初報道于1993年″Cao G，Alesslo HM，Cutler RG，Oxygen radical absorbance capacity assay forantioxidant.Free Rad.Biol.Med.199314303-11″。為使分析過程自動化進行了一些修改并報道于1995年″Automated Assay of Oxygen RadicalAbsorbance Capacity with the COBAS FARA II Guohua Cao，Carl P.Verdon.Akin H.B.WU，Hong Wang和Ronald L.Prior，CLINICAL CHEMISTRY，Vo1.41，No.12，1995″。從那以后，自動化了的ORAC分析得到廣泛覆蓋和應用，并且因此，ORAC值已經(jīng)變得常見于研究中和天然產(chǎn)物市場。BrunswickLaboratories于1997年購買了兩臺COBAS FARA 11分析儀，復制了由Cao、Prior等人開發(fā)的自動化方法，如今，已經(jīng)建立了一個包含超過5000個點的數(shù)據(jù)庫，包括了水果、蔬菜、飲料、谷物、功能性/工程性食物、浸出物以及其它天然產(chǎn)品資源的ORAC數(shù)據(jù)。Brunswick Laboratories，與USDA一起，引進了一種新的熒光探針，熒光素，在與β-藻紅蛋白進行并行比較下已經(jīng)在幾百個樣品中進行了檢測。熒光素，不象β-PE，不與待測樣品相互反應，并且作為合成的化合物，熒光素沒有可檢測到的批間差異。最重要的是，在相同條件下進行多次檢測的樣品保持了一致和可重復的結果以熒光素作為熒光探針的ORAC分析的開發(fā)已經(jīng)通過與初始自動化ORAC分析的開發(fā)者們合作而被實施了，初始的自動化ORAC分析以β-PE為熒光探針?；趶V泛的機械化研究，兩個團體都鎖定了基于熒光素的ORAC分析作為新的ORAC方法標準。此處所述這兩種ORAC分析方法通過使用下標區(qū)分藻紅蛋白使用PE，ORACPE，熒光素使用FL，ORACFL。II.對凍干
粉的分析及其和和所選蔬菜的的比較用ORACFL分析技術測定比較了凍干
粉(Brunswick Lab ID.02-0104.；Brunswick Laboratories，Wareham，MA)的抗氧化活性和所選蔬菜的抗氧化活性(如上所述)(圖10)。凍干
粉的ORAC值測定為442μmolTE/g。這個值比紫甘藍高出10倍(42μmol TE/g)(圖10)。ORACFL分析，以熒光素作為熒光探針，提供了抗氧化劑對過氧化氫殘基清除能力的測定方法，過氧化氫殘基是體內最常見的反應性氧化物(ROS)之一。ORAChydro反應了水溶性抗氧化劑的能力。Trolox，一種水溶性維生素E類似物，被用作校正標準物，所得ORAC結果表示為微摩爾Trolox當量(TE)/克。實施例14用ORACFL分析對凍干
和所選新鮮水果的抗氧化能力進行的比較分析用ORACFL分析技術測定比較了凍干
粉(231003/0410-C；Brunswick Lab ID.03-2096；Brunswick Laboratories，Wareham，MA)的抗氧化活性和所選新鮮水果的抗氧化活性(如上所述)(圖11)。如圖11所示，凍干
粉的ORAC值(536μmole TE/g)比無論是新鮮
(185μmole TE/g)還是黑樹霉(black raspberry)(164μmole TE/g)的ORAC值都高2倍以上。ORACFL分析，以熒光素作為熒光探針，提供了抗氧化劑對過氧化氫殘基清除能力的測定方法，過氧化氫殘基是體內最常見的反應性氧化物(ROS)之一。ORAChydro反應了水溶性抗氧化劑的能力。Trolox，一種水溶性維生素E類似物，被用作校正標準物，所得ORAC結果表示為微摩爾Trolox當量(TE)/克。實施例15用ORACFL分析對凍干
和所選新鮮水果的抗氧化能力進行的比較分析用ORACFL分析技術測定比較了凍干
粉(Brunswick Lab ID.02-0104；Brunswick Laboratories，Wareham，MA)的抗氧化活性和所選新鮮水果的抗氧化活性(如上所述)(圖12)。凍干
粉的ORAC值測定為442μmole TE/g。這個值是黑樹霉(164μmole TE/g)的2倍以上。ORACFL分析，以熒光素作為熒光探針，提供了抗氧化劑對過氧化氫殘基清除能力的測定方法，過氧化氫殘基是體內最常見的反應性氧化物(ROS)之一。ORAChydro反應了水溶性抗氧化劑的能力。Trolox，一種水溶性維生素E類似物，被用作校正標準物，所得ORAC結果表示為微摩爾Trolox當量(TE)/克。實施例16用ORACFL分析對凍干
和所選水果的抗氧化能力進行的比較分析用ORACFL分析技術測定比較了凍干
粉(Brunswick Lab ID.02-0104；Brunswick Laboratories，Wareham，MA)的抗氧化活性和所選水果的抗氧化活性(如上所述)(圖13)。如圖13所示，凍干
粉的ORAC值為442μmol TE/g。凍干Jucara粉的ORAC值為1193TE/g。ORACFL分析，以熒光素作為熒光探針，提供了抗氧化劑對過氧化氫殘基清除能力的測定方法，過氧化氫殘基是體內最常見的反應性氧化物(ROS)之一。ORAChydro反應了水溶性抗氧化劑的能力。Trolox，一種水溶性維生素E類似物，被用作校正標準物，所得ORAC結果表示為微摩爾Trolox當量(TE)/克。實施例17用ORACFL分析對脫水
和所選新鮮水果的抗氧化能力進行的比較分析用ORACFL分析技術測定比較了凍干
粉(23100/0410-C；Brunswick Lab ID 03-2096；Brunswick Laboratories，Wareham，MA)的抗氧化活性和所選新鮮水果的抗氧化活性(如上所述)(圖14)。如圖14所示，凍干
粉的ORAC值(536μmol TE/g)是黑樹霉(164μmol TE/g)ORAC的3倍以上。ORACFL分析，以熒光素作為熒光探針，提供了抗氧化劑對過氧化氫殘基清除能力的測定方法，過氧化氫殘基是體內最常見的反應性氧化物(ROS)之一。ORAChydro反應了水溶性抗氧化劑的能力。Trolox，一種水溶性維生素E類似物，被用作校正標準物，所得ORAC結果表示為微摩爾Trolox當量(TE)/克。實施例18用ORACFL分析對凍干
和所選新鮮蔬菜的抗氧化能力進行的比較分析用ORACFL分析技術測定比較了凍干
粉(231003/0410-C；Brunswick Lab ID.03-2096；Brunswick Laboratories，Wareham，MA)的抗氧化活性和所選新鮮蔬菜的抗氧化活性(如上所述)(圖15)。如圖15所示，凍干
粉的ORAC值(536μmol TE/g)是紫甘藍的ORAC值(42μmol TE/g)的10倍以上。ORACFL分析，以熒光素作為熒光探針，提供了抗氧化劑對過氧化氫殘基清除能力的測定方法，過氧化氫殘基是體內最常見的反應性氧化物(ROS)之一。ORAChydro反應了水溶性抗氧化劑的能力。Trolox，一種水溶性維生素E類似物，被用作校正標準物，所得ORAC結果表示為微摩爾Trolox當量(TE)/克。實施例19用ORACFL分析對所選水果、蔬菜和堅果的抗氧化能力進行的比較分析圖16顯示用ORAC分析技術測定的水果、蔬菜和堅果的抗氧化活性(Brunswick Laboratories，Wareham，MA；如上詳述)。ORACFL分析，以熒光素作為熒光探針，提供了抗氧化劑對過氧化氫殘基清除能力的測定方法，過氧化氫殘基是體內最常見的反應性氧化物(ROS)之一。ORAChydro反應了水溶性抗氧化劑的能力。Trolox，一種水溶性維生素E類似物，被用作校正標準物，所得ORAC結果表示為微摩爾Trolox當量(TE)/克。實施例20用ORACFL分析對凍干
和所選堅果的抗氧化能力進行的比較分析用ORACFL分析技術測定比較了凍干
粉(Brunswick Lab ID.02-0104；Brunswick Laboratories，Wareham，MA)的抗氧化活性和所選堅果的抗氧化活性(如上所述)。凍干
粉的ORAC值為442μmol TE/g。這個值是美洲山核桃的ORAC值(164μmol TE/g)的4倍以上(圖17)。ORACFL分析，以熒光素作為熒光探針，提供了抗氧化劑對過氧化氫殘基清除能力的測定方法，過氧化氫殘基是體內最常見的反應性氧化物(ROS)之一。ORAChydro反應了水溶性抗氧化劑的能力。Trolox，一種水溶性維生素E類似物，被用作校正標準物，所得ORAC結果表示為微摩爾Trolox當量(TE)/克。實施例21用ORACFL分析對脫水
和所選脫水水果和蔬菜的抗氧化能力進行的比較分析用ORACFL分析技術測定比較了脫水
(BrunswickLaboratories，Wareham，MA)的抗氧化活性和所選脫水水果和蔬菜的抗氧化活性(如上所述)(圖18)。如圖18所示，脫水
粉的ORAC值(536μmolTE/g)比脫水黑樹霉(340μmol TE/g)ORAC值高。ORACFL分析，以熒光素作為熒光探針，提供了抗氧化劑對過氧化氫殘基清除能力的測定方法，過氧化氫殘基是體內最常見的反應性氧化物(ROS)之一。ORAChydro反應了水溶性抗氧化劑的能力。Trolox，一種水溶性維生素E類似物，被用作校正標準物，所得ORAC結果表示為微摩爾Trolox當量(TE)/克。實施例22用ORACFL分析對脫水
和所選新鮮蔬菜的抗氧化能力進行的比較分析用ORACFL分析技術測定比較了脫水
(BrunswickLaboratories，Wareham，MA)的抗氧化活性和所選新鮮蔬菜的抗氧化活性(如上所述)(圖19)。如圖19所示，脫水
粉的ORAC值(536μmol TE/g)比紫甘藍的ORAC值(42μmol TE/g)高出10倍以上。ORACFL分析，以熒光素作為熒光探針，提供了抗氧化劑對過氧化氫殘基清除能力的測定方法，過氧化氫殘基是體內最常見的反應性氧化物(ROS)之一。ORAChydro反應了水溶性抗氧化劑的能力。Trolox，一種水溶性維生素E類似物，被用作校正標準物，所得ORAC結果表示為微摩爾Trolox當量(TE)/克。實施例23 ORAChydro分析對脫水水果和蔬菜的抗氧化能力進行的比較分析表22總結了脫水水果和蔬菜(Brunswick Laboratories，Wareham，MA)經(jīng)ORAChydro分析技術測定的抗氧化活性(如上所述)。ORACFL分析，以熒光素作為熒光探針，提供了抗氧化劑對過氧化氫殘基清除能力的測定方法，過氧化氫殘基是體內最常見的反應性氧化物(ROS)之一。ORAChydro反應了水溶性抗氧化劑的能力。Trolox，一種水溶性維生素E類似物，被用作校正標準物，所得ORAC結果表示為微摩爾Trolox當量(TE)/克。表22實施例24 ORAChydro分析對脫水水果和蔬菜的抗氧化能力進行的比較分析表23總結了脫水水果和蔬菜(Brunswick Laboratories，Wareham，MA)經(jīng)ORAChydro分析技術測定的抗氧化活性(如上所述)。ORACFL分析，以熒光素作為熒光探針，提供了抗氧化劑對過氧化氫殘基清除能力的測定方法，過氧化氫殘基是體內最常見的反應性氧化物(ROS)之一。ORAChydro反應了水溶性抗氧化劑的能力。Trolox，一種水溶性維生素E類似物，被用作校正標準物，所得ORAC結果表示為微摩爾Trolox當量(TE)/克。表23實施例25用ORACFL分析對凍干
和所選脫水水果和蔬菜的抗氧化能力進行的比較分析用ORACFL分析技術測定比較了凍干
粉末(231003/0410-C；Brunswick Lab ID.03-2096；Brunswick Laboratories，Wareham，MA)的抗氧化活性和所選脫水水果和蔬菜的抗氧化活性(如上所述)(圖20)。如圖20所示，凍干
粉的ORAC值(536μmol TE/g)高于脫水黑樹霉的ORAC值(340μmol TE/g)。ORACFL分析，以熒光素作為熒光探針，提供了抗氧化劑對過氧化氫殘基清除能力的測定方法，過氧化氫殘基是體內最常見的反應性氧化物(ROS)之一。ORAChydro反應了水溶性抗氧化劑的能力。Trolox，一種水溶性維生素E類似物，被用作校正標準物，所得ORAC結果表示為微摩爾Trolox當量(TE)/克。實施例26用Trans-Reveratrol分析對凍干
粉進行的抗氧化能力分析凍干
粉(231003/0410-C；Brunswick Lab ID.03-2096；Brunswick Laboratories，Wareham，MA)的抗氧化活性經(jīng)Trans-Resveratrol分析(如上所述)測定為1.1μg/g。使用HP1100系列HPLC用HPLC色譜法分析樣品，配有帶2個條形預過濾器和自動取樣器/進樣器的Phenomenex Luna Phenyl-Hexyl(250×4.6mM)，二元HPLC泵，柱加熱器，二極管陣列檢測器，和熒光探測器。流動相A2是去離子水∶乙腈∶乙酸(89∶9∶2v/v)。流動相B2是乙腈∶去離子水(80∶20v/v)。所有生物樣品存放于-80℃冷凍機內至分析用。所有干燥的和水果樣品用20ml甲醇(MeOH)萃取。萃取后的樣品用超聲處理1小時。將所有樣品在4℃下以14000rpm離心5分鐘。以1ml/min的流速用35分鐘的運行時間和10分鐘運行后時間來分析樣品。保留時間大約是26分鐘。梯度如下設置10分鐘處0％B；25分鐘處40％B；32分鐘處100％B；35分鐘處100％B。監(jiān)測280nm處的光吸收。用HPLC定量化合物是在已知溶液中測定化合物未知濃度的過程。這包括向HPLC注入一系列已知濃度的Resveratrol標準化合物溶液進行檢測。這些已知濃度的譜圖將給出一系列與所注化合物濃度相關的譜峰。實施例27 Jucara和
制劑中對羥基和過氧化亞硝酸鹽的抗氧化活性分析I.概述A.過氧化亞硝酸鹽過氧化亞硝酸鹽是一氧化氮(NO)和過氧化物的細胞毒產(chǎn)物。過氧化亞硝酸鹽是非常強的氧化劑，比一氧化氮或過氧化物分別作用的毒性大得多。多種病理與過氧化亞硝酸鹽的形成有關，過氧化亞硝酸鹽是NO和過氧化物反應形成的強氧化劑。此反應是迄今已知最快的NO反應，將兩個相對非反應性的基團轉變?yōu)橐粋€更具活性的氧化劑，過氧化亞硝酸鹽。當更多NO生成時，和/或當發(fā)生O2-水平上升時，就不可逆地生成過氧化亞硝酸鹽。過氧化亞硝酸鹽是包含于許多病理生理過程中的強氧化劑。過氧化亞硝酸鹽可在細胞脂膜間自由運輸。過氧化亞硝酸鹽的滲透系數(shù)計算值可與水良好比擬并且比過氧化物高約400倍，因此是一種重要的生物效應分子，這不僅是因為其活性，還因為其擴散性(Lee，J.，Maria，S.S.Peroxynitrite rapidly permeates phospholipid membranes.Proc Natl Acad Sci.，1997.)?？紤]到這些，糖尿病、動脈硬化癥和缺血-再灌注損傷等病理與以O2水平升高為特點的氧化應激相關，O2-可導致過氧化亞硝酸鹽形成。最近的證據(jù)還顯示多種硬化癥和阿爾茨海默癥與過氧化亞硝酸鹽形成有關。另外，過氧化亞硝酸鹽還包含于缺血和再灌注、敗血癥和成人呼吸性窘迫癥中。缺血和再灌注相伴于分別由黃嘌呤氧化酶和NAPDH氧化酶活化而導致的過氧化物水平升高。因此，過氧化亞硝酸鹽似乎與許多存在著NO和O2-不平衡的病理有關。過氧化亞硝酸鹽的形成對非特異性免疫很理想，但對在NO的信號傳遞過程中可能不好。生物學上過氧化亞硝酸鹽從一氧化氮和過氧化物的反應中形成。過氧化物岐化酶(SOD)降低了過氧化物并預防過氧化亞硝酸形成(見我的綜述Pryor，W.A.和Squadrito，G.L.(1995).Am.J.Physio.(Lung Cell.Mol.Physiol.12)268，L699-L722).The chemistry of peroxynitritea productfrom the reaction of nitric oxide with superoxide)。過氧化亞硝酸鹽是強氧化劑，其自身可氧化許多生物分子。然而，在生物系統(tǒng)中，它通常與二氧化碳相結合以形成反應性中間產(chǎn)物，如ONOOCO2-、O2NOCO2-、COO3-和NO2-。在這些中間產(chǎn)物中，只有COO3-和NO2-參與了與生物靶分子的雙分子反應；CO2的加合物ONOOCO2-和O2NOCO2-壽命太短而在能發(fā)生雙分子反應前就降解了。已知由過氧化亞硝酸鹽等導致的氧化應激損傷血管上皮，此過程導致動脈硬化(Thom，S.R.和Ischiropoulos，H.Mechanism of oxidativestress from low levels of carbon monoxide.Health Effects Institute ResearchReport，number 80，1997.)。B.羥基自由基(hydroxyl radical)如果自由基的功能是破壞分子和組織，那么羥基自由基就是自由基中的自由基。它與其路徑上發(fā)現(xiàn)的實際上是任何分子以擴散速率發(fā)生反應，包括DNA、膜脂、蛋白和糖類等大分子。以DNA來說，羥基自由基可引起鏈斷裂以及脫氧核糖和嘌呤及嘧啶堿基中的化學變化。受損傷的蛋白，其中的許多是神經(jīng)元的關鍵酶，喪失了其功效，細胞功能衰退。許多組織內的蛋白氧化，包括大腦，已被提出作為與衰老有關的功能缺陷的原因。羥基是衍生自過氧化氫(H2O2)的第三代基團，依次地，過氧化氫衍生白超氧化物岐化酶反應產(chǎn)生的過氧化物基團。過氧化氫在鐵或銅等轉換金屬的存在下被谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶還原成羥基。II.結果凍干
粉和凍干Jucara粉(Brunswick Lab ID.BrunswickLaboratories，Wareham，MA)的抗氧化能力經(jīng)ORAC分析技術測定(如上所述)并在概括于下面表24。表24的HORAC結果表達為微摩爾沒食子酸當量/克。表24中的NORAC結果表達為微摩爾Trolox當量/克。實施例28
和Jucara制劑類似超氧化物岐化酶的活性和環(huán)加氧酶抑制活性的分析I.過氧化物(O2-)清除活性(SOD)分析A.背景據(jù)估計成人(70kg體重)總耗氧的1％被轉化為過氧化物陰離子。在休息狀態(tài)下一個成人利用3.5mL O2/kg/min，這將導致0.147mol/天O2-。O2-據(jù)信是其它反應性氧化物如過氧化氫、過氧化亞硝酸鹽和羥基(來自過氧化氫)產(chǎn)生的原因。因此，人體內O2-清除能力是抵御氧化應激的第一道防線。實際上，據(jù)報道在轉基因蠅內超氧化物岐化酶和過氧化氫酶的過表達使壽命延長達三分之一，也許，歸因于減少了的氧化應激，這種減少可從低蛋白羰基含量得到反映(Orr和Sohal，Science 2631128-1130，1994)。血內過氧化物清除能力是一個人抗氧化狀態(tài)的非常重要的參數(shù)。本分析是設計用來以高通量的方式對此參數(shù)進行精確定量。B.實驗方法儀器Precision 2000八通道液體處理系統(tǒng)和來自Bio-tek Inc.(Winooski，VT)的Synergy HT microplate UV-VWAS和熒光儀。試劑Hydroethidine來自Polysciences，Inc.(Warrington，PA)。黃嘌呤氧化酶(源于酪乳，目錄號X4875)、黃嘌呤、超氧化物岐化酶(源于牛紅細胞，目錄號S 2515)購自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。i.試劑準備緩沖液。緩沖液包括含100μM二乙烯三胺五乙酸(DTPA)的75mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)。為制備此緩沖，稱取0.0393g二乙烯三胺五乙酸(DTPA)加入10mL ORAC緩沖液工作溶液。這產(chǎn)生了10mL的10mMDTPA貯存液。接下來，向2mL DTPA貯存液中加入198mL ORAC緩沖液工作溶液。這產(chǎn)生了200mL的100μM含DTPA的O2-緩沖液工作溶液。黃嘌呤氧化酶。購自Sigma的黃嘌呤氧化酶懸液(存于冰箱)用緩沖液稀釋20倍以形成均勻溶液。取19mL O2-緩沖液并加入1mL黃嘌呤氧化酶懸液。這產(chǎn)生了20mL的黃嘌呤氧化酶工作溶液，每天新鮮配制。黃嘌呤溶液。稱取黃嘌呤(15mg)置于干凈的玻璃瓶內。加5mL0.1N氫氧化鈉(0.1N NaOH)，旋渦混合并超聲處理溶液至固體溶解。加95mL O2-緩沖液并旋渦混合。這產(chǎn)生了100mL的黃嘌呤溶液。此溶液存放于室溫以避免黃嘌呤沉淀。黃嘌呤溶液每天新鮮配制。Hydroethidine(HE)工作溶液。二氫乙錠貯存液-將0.04g二氫乙錠加入20mL乙腈中。這產(chǎn)生了20mL的HE貯存液(2mg/mL)，分裝于小瓶中-80℃保存。然后，將0.125mL二氫乙錠(HE)貯存液加入到24.875mL黃嘌呤溶液中。超聲處理并加熱至溶液澄清。這產(chǎn)生了25mL的Hydroethidine(HE)工作溶液，每天新鮮配制。超氧化物岐化酶工作溶液(SOD)。將三萬單位SOD(Sigma)重構于10mL緩沖溶液中。將此溶液分裝成小份(0.4mL每小瓶，貯存液)并保存于-20℃。這產(chǎn)生了3000單位，被稀釋至30單位備用(見下)。200μL SOD3000單位貯存液加入19.8mL O2-緩沖液中以制備20mL SOD 30單位工作液。對照。貯存液錳(III)5，10，15，20四氯化物儲存液1144μM，保存于-80℃。為了制備工作溶液，用O2-緩沖液將貯存液稀釋100倍并旋渦混合。取9.9mL O2-緩沖液加入100μL錳貯存液，10mL的11.44μM錳工作液，置于G1孔和G12孔作為對照。分析方法此分析在配有96-孔微孔板的Precision 2000液體處理系統(tǒng)上進行，采用下面步驟
●在一號板(聚丙烯)中，將200μL樣品加入孔B1、C1、E1、F1和B12、C12、E12、F12。
●將200μL SOD工作溶液加入D1和D12孔中。
●將200μL O2-緩沖液加入到A1、H1、A12，和H12孔中。
●將200μL錳工作液加入G1和G12孔中。
●試劑依如下方式載入precision 2000中B架上的杯中
B1中20mL O2-緩沖液
B2中20mL HE
B4中20mL黃嘌呤氧化酶溶液
●在Precision2000上進行A x2稀釋(ORAC x2)。進行稀釋以使所有樣品、標準品、和空白都稀釋2、4、8、16、32倍。
●將每個孔中的25μL溶液轉移到反應板中(聚苯乙烯，320μL)然后加入150μL HE工作溶液。
●在37℃下溫育讀數(shù)板20分鐘。
●溫育結速后，通過運行AAPH附加(B4)程序加入黃嘌呤氧化酶。這使得20μL黃嘌呤氧化酶工作液被加入到2號板的所有孔中。
●加入黃嘌呤氧化酶后，將板置于讀板儀下。
●在激發(fā)光濾光器在485±25nm和發(fā)射光濾光器在590±30nm下每分鐘讀取反應板和熒光連續(xù)十分鐘，讀數(shù)參比于下面設為5000單位的D1孔。2號板設計(聚丙烯)每孔含150μL HE工作溶液，25μL樣品，和25μL黃嘌呤氧化酶(在預熱后30分鐘加入)。C.數(shù)據(jù)處理從原始數(shù)據(jù)中得到線性曲線，通過用來控制讀板儀的KC-4程序計算曲線斜率。輸出斜率并用微軟Excel軟件進一步計算。簡化的化學動力學O2-經(jīng)下面由黃嘌呤氧化酶催化的反應持續(xù)產(chǎn)生。過氧化物生成的速率是恒定的并對黃嘌呤是偽零級，黃嘌呤對于黃嘌呤氧化酶是大量過剩的。
(1)所形成的過氧化物或者與HE反應或者被超氧化物岐化酶清除。
(2)
(3)
(4)。假設穩(wěn)態(tài)O2-濃度、O2-清除劑(SOD)不存在(Vo)和存在(V)情況下的熒光增長速率具有下列關系
Vo/V＝1+k3[SOD]/(k2.[He]) (5)對Vo/V和[SOD]繪圖將給出一條截距在(0，1)且斜率為k3/k2[HE]的直線。對于未知樣品，未知樣品和標準樣品間斜率的比為
{k3/k2[HE]}/{ks/k2[HE])＝k3/ks (6)方程(5)將根據(jù)對一個樣品Vo/V和濃度作圖曲線中所用的濃度，以SOD測定當量/克或每升樣品為單位，給出一個樣品的相對SOD活性。II.環(huán)加氧酶分析A.簡介炎癥是我們的免疫系統(tǒng)對因病毒和微生物等病原體以及化學或物理創(chuàng)傷造成的侵入物的響應。有時會疼痛，炎癥通常是發(fā)熱反應。但在一些例子中炎癥發(fā)展到慢性狀態(tài)，與關節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥甚或癌癥等衰老性疾病相關。實驗生物學和系統(tǒng)生物學研究已闡明了復雜的炎癥過程。在許多其它方式中，控制炎癥的一種方式是抑制與炎癥直接相關的環(huán)加氧酶-2(COX-2)的活性。還發(fā)現(xiàn)非固醇類消炎藥(NSAIDs)是優(yōu)良的COX抑制劑。NSAID類的有益效果可聯(lián)系到對COX-2和COX-1的抑制。這些合成的COX抑制劑包括阿司匹林、布洛芬、napoxen和塞來考昔(celebrexTM)。更多的研究成果已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了更具選擇性和活性的COX-2抑制劑作為新一代NSAIDs。從歷史看，炎癥用的草藥已經(jīng)被用了幾千年。實際上，Celsus圍繞AD40定義“發(fā)紅、灼熱、疼痛、瘤”(紅、熱、痛和腫)是，目前，炎癥癥狀。只是在最近植物浸出物的反應機理才在分子生物學水平有所研究，采用COX-1和COX-2抑制劑分析作為從草藥混合物中分離有效組合物的指導。這個方法還在營養(yǎng)藥物工業(yè)中使對鎮(zhèn)痛和消炎草藥補充劑的效果得以更好評估和優(yōu)化。為了滿足工業(yè)上植物源樣品COX抑制能力的測定要求，采用了一種體外COX-1和COX-2抑制劑篩選分析法，加以改進以提高效率和降低成本。此處所述是適用于植物產(chǎn)品的COX-1和COX-2抑制活性分析的細節(jié)。B.分析原理COX-1和COX-1都催化花生四烯酸的氧化生成前列腺素類(圖1)。酶活性可通過耗氧速率進行測定。實際上，酶的活力單位被定義為“一單位酶37℃下在0.1M tris-HCl緩沖液pH 8.0中，含100mM花生四烯酸、5mM EDTA、2mM苯酚和1mM血色素，每分鐘消耗1nmol氧氣”。用Oxytherm實時監(jiān)測氧濃度(圖2)，Oxytherm是一種氧濃度測定系統(tǒng)，購自Hansatech。初始耗氧速率得自動力學曲線。在抑制劑存在下，初始速率下降。IC50，初始耗氧速率下降50％時的濃度，被用來表示COX-1和2的抑制活性。選擇性表示為COX-1和COX-2的IC50的比值。樣品通常溶于二甲基亞砜(DMSO)、乙醇或水中。C.實驗細節(jié)(1)分析條件
儀器Oxytherm
緩沖液0.1M Tris-HCl，pH 8.0，含5mM EDTA，2mM苯酚和1mM血紅素
溫度37℃
初始[O2]212mM
酶體積5mL(或～100單位)
總體積0.5mL
樣品體積5mL
底物5μL花生四烯酸(濃度10mM溶于0.01M NaOH溶液)
血紅素5mL(終濃度1mM)
數(shù)據(jù)記錄速度每秒5次讀數(shù)(2)實驗步驟加入半毫升Tris緩沖液(37℃烘箱溫育)到反應箱內后再加入5mL溶于DMSO的100mM血紅素。向此溶液中加入5mL COX-1(或10mLCOX-2)酶溶液(直接使用獲自供應商的產(chǎn)品)?；旌衔餃赜?分鐘。加入五毫升樣品(溶于DMSO或乙醇)并溫育1分鐘。加入五毫升花生四烯酸并觀察反應速率。通過動力學曲線獲得初始速率。樣品萃取和溶解固體樣品根據(jù)其溶解性用二甲基亞砜(DMSO)、乙醇、50％丙酮水溶液或水萃取。水基液體樣品直接檢測或必要時用水稀釋。油基樣品溶解于DMSO或乙醇用于分析。質量控制IC50當50％的酶活被抑制時的樣品濃度。較低的IC50意味著高活性。IC50比此數(shù)值表示樣品對COX酶抑制的選擇性。當比值為1時，無選擇性。如果比值小于1，樣品對COX-1的抑制強于COX-2。如果比值大于1，樣品對COX-2的抑制更強。標準偏差為約20％。D.參考文獻
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和凍干Jucara粉的過氧化物陰離子清除能力凍干
粉和凍干Jucafra粉的過氧化物陰離子清除能力如上所述測定(Brunswick Lab ID.Brunswick Laboratories，Wareham，MA)。研究得最多的天然來源的超氧化物岐化酶(SOD)是小麥芽SOD。小麥芽的SOD活性是每克基質160至500單位。比較而言，凍干
粉和凍干Jucafra粉的氧化物清除能力非常強，如下表25所概括。表25 如上詳述測量在凍干
粉和凍干Jucara粉(Brunswick Lab ID．Brunswick Laboratories，Wareham，MA)存在或不存在時環(huán)加氧酶(COX)活性(1類COX，即，COX I；和2類COX，即，COX II)的活性。如表25(見上)和表26(見下)所總結，凍干
粉和凍干Jucara粉抑制了COX酶。如表26所示，凍干
粉和凍干Jucara粉抑制了COX I和COX II兩種同功酶。凍干
粉和凍干Jucara粉，因此在預防和治療與COX I和COXII活性相關的炎癥疾病中，如關節(jié)炎，是有效的。表26 實施例29用ORACHO分析對水果和蔬菜的抗氧化能力進行的比較分析圖21顯示了用ORAC分析技術(Brunswick Laboratories，Wareham，MA；如上所述)測定的水果和蔬菜的抗氧化活性。ORACFL分析，以熒光素作為熒光探針，提供了抗氧化劑對過氧化氫殘基清除能力的測定方法，過氧化氫殘基是體內最常見的反應性氧化物(ROS)之一。ORAChydro反應了水溶性抗氧化劑的能力。Trolox，一種水溶性維生素E類似物，被用作校正標準物，所得ORAC結果表示為微摩爾Trolox當量(TE)/克。實施例30
果汁制備圖22詳述
果汁制備的流程圖，包括水果洗滌和其巴氏消毒。對果實和果汁更好的保存將使該食物的消費得以保持其營養(yǎng)價值并將易于其在收獲季節(jié)之間的商品化組織。
果汁的制備和處理過程見圖22。果實去殼(hulling)可通過若干不同方式進行，軟化條件依不同的產(chǎn)品而變化。I.果漿提取過程優(yōu)化-軟化和機械去殼果實去殼可通過若干方式進行，每個生產(chǎn)商都有其自己的方式處理
(軟化時間和溫度，每千克果實用水量，果實停留在機器內的時間)。為了保持我們實驗中的重復性并確保良好的結果，有必要優(yōu)化和系統(tǒng)化果實提取過程。大多數(shù)情況下，
果實去殼在一種有垂直軸的、特別精制的用于
果實的去殼機上。典型機械去殼機的圖片見圖23。該機器設計每次處理2千克
以使每批處理的果實數(shù)量能最小。浸泡果實的時間和水溫依供貨商的不同而不同。果實可在攪拌前在室溫流水下浸泡幾個小時或者也可在溫水中短時間(10或20分鐘)內被軟化。在實驗室中，考查了幾個軟化時間(0，5，10，15，20，30分鐘)和浸泡水溫(30，40，45，50和60℃)。盡管結果提示不同軟化條件之間沒有顯著性差異，觀察到當
在45℃水中軟化20分鐘時有更大的產(chǎn)量?？側r間，以及其間的用水量和用水方式，構成了對產(chǎn)量和果汁密度的十分重要的變量?？疾榱?個總去殼時間(從2:30到5:00變化)并且對于每個總時間，考查了首次注水前的不同去殼時間，以及將水注入去殼機的不同方式(去殼過程末期果汁的滴落時間設為45秒)。總用水量為1升每2公斤果實(為了得到理想的果汁，不很濃，不很淡)。根據(jù)這些研究，注意到去殼總時間和去殼機內的置水方式對干物質中的產(chǎn)量有非常顯著的效果。根據(jù)這些經(jīng)驗，設置如下果汁制備步驟
1.稱取2千克原料(
)。
2.準備5個容器，每個裝有200mL水。
3.將
置入機器中，在時間0處開機。
4.去殼1分鐘后，立即放置第一個200mL水容器。
5.在1分30秒；2分；2分30秒；和3分鐘后，分別加入其余四個容器中的一個。
6.讓其滴落45秒至3分45秒。分析了部分果汁的再循環(huán)效果。盡管此制備果汁的技術十分普遍，未發(fā)現(xiàn)干物質產(chǎn)量的差別。II.
果實收獲后微生物學性狀的演化當比較收獲期和收獲間期時
的特性和質量，發(fā)現(xiàn)在味覺質量和科學指標的數(shù)據(jù)上(微生物學，重量，顏色)有顯著變化。例如，在Belm出售的收獲期的
，便宜又豐富。它具有好的質量，因為它來自于Beim附近的地區(qū)，沒有遭受運輸過程中的變化。另一方面，在收獲間期，
生產(chǎn)數(shù)量少，其味覺特性不如收獲期的
并且更貴。收獲間期出產(chǎn)的
來自遠得多的地區(qū)(Maranho，Maraj島)，在到達Belm港前經(jīng)歷了漫長旅途。果實收獲至出售/消費間的時間間隔十分重要(水果收獲后在室溫下維持的最長時間有48小時就很長了)。發(fā)現(xiàn)購自收獲間期的
比收獲期的有更多的微生物載量。在收獲期，每克新鮮
的平均微生物載量為106微生物/克干果漿-相當于10ml果汁。在收獲間期，每克的微生物平均載量上升到109，表明高出1000倍的微生物載量。因此，有必要確定導致污染增加的原因主要是因為那些地區(qū)低質量的棕櫚樹、不良運輸條件，還是因為在收獲后的時間增加，導致新鮮水果中已經(jīng)存在的微生物的自然生長。研究了收獲和處理之間時間間隔的影響并將其與微生物載量相關聯(lián)。30小時期間內在不同時間間隔處檢測新鮮水果(取自收獲后10小時)中微生物載量。結果顯示水果原始微生物載量有可檢測的和規(guī)律性的增加。剛收獲后每克干果漿的微生物載量為約105-106微生物(細菌，霉菌和酵母)而40小時后達到最大值，稍高于每克干果漿109微生物。由于收獲后40小時觀察到的微生物載量十分相似于收獲間期的值，可能可以推斷收獲期內外微生物載量的不同主要是由于果實表面微生物的自然生長，而不是那些地區(qū)棕櫚樹的低質量。因此，
就在剛剛收獲后使用，在微生物載量有明顯增加之前，以避免產(chǎn)品質量的變化(不僅是微生物增加導致的性質改變還有因為為保存產(chǎn)品而必需采用熱輻射處理而導致的變化)。然而，下面評估了降低微生物載量的方法。III.清洗研究了清洗方法對降低果汁中微生物載量的效果。研究使用了收獲間期的
，這意味著具有嚴重污染水平的
。在處理之前，用0.1％(v/v)濃度的衛(wèi)生水(hygienic water)清洗水果，使得微生物載量降低2到400倍(考慮用沒加化學物質的飲用水清洗
)。IV.洗滌洗滌過程被作為
果汁制備的初始步驟，因為它在處理
之前降低了微生物載量，而沒有明顯改變其質地。對于
果實，在處理步驟前的洗滌已被描述作幫助保持果汁的質量和完整性，從而，保持了
果汁的感官特征、質地和營養(yǎng)等品質(Tournas，1994)。洗滌包括在處理前將果實在熱水或沸水中或蒸汽中置一段時間(Cruess，1995)。選擇此處理，旨在降低果實表面存在的污染劑，被果實的物理結構所解釋。此果實只有一小層淺層果漿，果漿與熱水或蒸汽間的短暫接觸可使不是十分高溫或長時間的處理產(chǎn)生積極的效果。研究的進行不僅采用了收獲期的
還采用了收獲間期的
，嘗試了一些不同溫度(從75℃到100℃)和幾個洗滌時間(從5秒到10分鐘)(Rogez et al.，1996)。處理對微生物載量(細菌，霉菌和酵母)的降低有顯著影響。然而，洗滌條件對過氧化物酶的失活沒有效果，因為這些酶更加抗熱。只有更高的洗滌溫度和更長的時間才能部分降低過氧化物酶的活性(達20％)。但更苛刻的處理(即溫度高于80℃且時間長于10秒)導致見于果汁的表面的果汁中脂肪物質(微黃色的油)的分離。這種質地的改變降低了消費者對產(chǎn)品的接受程度，因為其外觀。由于更多的激烈洗滌造成的口感特點的損失高得多，且不能進一步減少微生物載量，所以選用溫度80℃時間10秒作為
果實的更好的洗滌條件。實施例31
飲料制備的方法和制備標準I.混合指導
14∶1脫水需要重量比為13份水/液體與1份脫水物。使用
的可能的飲料種類幾乎是無限的。下面提供3個例子
混合物1將二十五克
粉加入到325ml冷水中。中速混合混合物至少30秒以充分水化粉末。如果混合可持續(xù)約1分種將增進其質感。
混合物2將二十五克
粉加入到200ml水和125克冰中，混合30秒?；旌峡沙掷m(xù)一分鐘。
混合物3用125ml奶或奶油替代冰產(chǎn)生美味的smoothie。因為
含糖和維生素C量低，所以很少需要預防氧化/發(fā)酵。推薦加入糖和維生素C。純
的味道相當溫和，顏色是很深的栗色。1-2匙糖或其它甜味劑的加入很好地美化了風味。顏色可通過加入維生素C(一種酸)而變得更紅。加入紅色食物色素也將創(chuàng)造出更開胃或吸引人的外觀。而且，在混合物內加入一支香蕉，以及噴灑水果格蘭諾拉麥片干配菜，也能為
飲料制備提供創(chuàng)造性的改變。II.儀器混合器；Gram天平；毫升測量裝置III.
果漿鑒定和質量標準1.目的本規(guī)則目的是建立用于飲料的適于
完整果漿和
的最小鑒定和質量標準。本規(guī)則不適于用于其它任何用途的
果漿。2.定義
完全果漿和
是
樹(Euterpe oleracea，Mart.)果實的可食用部分用適當技術性方法軟化后的提取產(chǎn)物。3.分類產(chǎn)品將根據(jù)向果漿中加入水/液體量進行分類，如下
3.1
完全果漿是未加水而從
提取的果漿，用機械方法，未過濾。它可進行物理儲存過程。
3.2稠或特制
(A類)是加水提取的果漿，含14％以上總固體量并且外觀非常濃稠。
3.3中等或正常
(B類)是加水提取的果漿，含11％至14％總固體量并且外觀濃稠。
3.4稀或普通
(C類)是加水提取的果漿，含8％至11％總固體量并且外觀不濃稠。4.基本配料
完全果漿和
得自新鮮、成熟和健康的果實，根據(jù)前述規(guī)格，且無任何使本產(chǎn)品不適于消費的塵土、寄生蟲或微生物。5.可選配料5.1水用于果漿提取的水必須是可飲用水。5.2 Acidulante對于經(jīng)巴氏消毒保存于室溫的
，可根據(jù)“生產(chǎn)管理規(guī)范”(GMP)加入檸檬酸。6.組成6.1
完全果漿和
必須保有符合該水果特征的組成，沒有變更、與其它品種水果混合或任何非法操作。6.2
完全果漿必須符合下列物理、化學和感官特征6.2.1物理和化學表276.2.2感官特征體觀面糊狀，從包括果實的表面中呈深色點
顏色紫色
果肉的純紫色和綠色
果肉淺綠色
味道特征性的(見下)6.3
(特級、正常或普通)必須符合下列物理、化學和感官特征。6.3.1物理和化學特征表286.3.2感官特征體觀乳濁液必須在加熱甚至到80℃時保持穩(wěn)定。
顏色對紫
果漿為Violet紫色，對綠
果漿為淺綠色。氣味特征性(見下)6.4完全
果漿和
可能含有限制水平以內的果實非食用部分，該限制水平不改變產(chǎn)品的質量和感官特征。完全
果漿和
必須符合《一般水果果漿質量標準》內指定的所有其它物理、化學、顯微鏡、微生物和感官特征。6.5
完全果漿和
中霉菌和酵母總數(shù)的上限是5×103。7.添加劑用于直接消費的最大1千克包裝的完全
果漿和
必須通過物理過程保存，禁止使用化學防腐劑或色素物質，除非從
果實中得到的色素。實施例32凍干
的制備一種制備凍干
粉的方法詳見圖24。如其所示，采集
果實并去核。然后取出果漿并冰凍。來自許多
果實的果漿被凍干以產(chǎn)生凍干粉。凍干的
粉比未處理的
果實果漿制劑穩(wěn)定，后者在數(shù)小時內即迅速降解，這使它們變得不好吃。在處理過程中和冰凍前向
果實果漿加檸檬酸對進一步穩(wěn)定果實果漿制劑是有用的。檸檬酸可用于穩(wěn)定其它經(jīng)本發(fā)明中方法處理的水果果漿制劑，如Jucara。由于酶和與從果實取出的果漿數(shù)量相比在果皮上的高比例的發(fā)酵劑載量，
的生產(chǎn)是一個特別不可逆的事件序列。由于這個原因，
生產(chǎn)傳統(tǒng)上限于本地并立刻消費。
冰凍果漿必須保存在-5℃或更低的溫度。在更高溫度下，酶類和發(fā)酵劑變得活躍并改變果漿的特征。一個效應是產(chǎn)生不可溶化合物，前述的grit，這在最后一批中是明顯的。這些不溶物見于第一批
脫水物(來自兩個處理器)并發(fā)現(xiàn)是由脫水制備過程中解凍所引起的。這個問題通過不使冰凍的
果漿在經(jīng)冰凍干燥脫水前預融而得到解決。就是說，一旦Azurai果漿冰凍后，在凍干脫水前不能使其在-5℃以上的溫度融化。脫水前未預融制備的
果漿產(chǎn)生顆粒狀、凍干的
粉，脫水十分成功并保持了質量、色澤、品質和風味。因此，本發(fā)明提供了一種方法制備水果基營養(yǎng)補充劑，其中果漿的制備方法中一旦果漿被分離和冰凍在脫水前就不得預融。本方法對從許多水果中制備凍干實果粉是有用的，比如，但不限于，
果實和Jucara果實，可被再脫水并保持優(yōu)質顏色、品質和味道。這種顆粒，凍干的果實粉避光儲存于塑料紋的箔袋中直至使用。實施例33凍干
制劑對所選微生物穩(wěn)定性的攻擊性檢測I.目標本研究的目標是實施初步的攻擊檢測以評估產(chǎn)品在受酵母、霉菌、乳酸菌、沙門氏菌和葡萄球菌中的每一株攻擊時的微生物穩(wěn)定性(Silliker Laboratories Research Center，South Holland，IL)。II.應用本研究提供了一種對可能的酸敗生物和兩種病原體的產(chǎn)品篩查。它適于收集關于產(chǎn)品的原始數(shù)據(jù)和/或在開發(fā)中比較許多產(chǎn)品制劑。III.限制每種攻擊生物只使用一個菌株，存在產(chǎn)品對該菌株生長有抗性但對其它菌株易感的可能性。生長于對照產(chǎn)品內的攻擊生物中，不到研究結束不進行檢測。本研究受限于時間間隔、儲存溫度和報道的范圍。本研究不預期超出四周的結果。IV.材料與方法A.受檢產(chǎn)品從客戶處得到標有“
果實-凍干”的一個3.5千克的可封口箔袋的產(chǎn)品。產(chǎn)品保存于環(huán)境溫度至研究開始。B.攻擊菌用來自Silliker Research Culture Collection(SRCC)的凍干的Aspergillus niger(霉菌)、Zygosaccharomyces bailii(酵母)、Lactobacillusfructivorans(乳酸菌)、Salmonella typhimurium和Staphylococcus aureus攻擊產(chǎn)品，如表29所列。用平板計數(shù)法檢驗存活的細胞或孢子數(shù)量。表29C.待測樣品制備和儲存將產(chǎn)品無菌依100克小份分裝入6個無菌容器內。一份用作陰性對照。其余小份接種約每克10000克隆形成單位濃度的培養(yǎng)物。接種后，充分混合樣品并儲存于75°F。D.樣品分析在第0天和第28天分析未接種的對照份的攻擊菌。在第0、7、14、21和28天分析被接種的各份。在每個時間段從每份中取出一個單獨的11-克樣品用平板計數(shù)法分析攻擊菌。V.結果和討論食品的微生物穩(wěn)定性可通過對其用酸敗性和病原性微生物進行攻擊而測定。如果攻擊生物的水平在儲存過程中沒有增加，則產(chǎn)品制劑可抗微生物生長并認為其是微生物學穩(wěn)定的。結果顯示于30和表31。如數(shù)據(jù)所示，在儲存過程中酵母、霉菌、乳酸菌、細菌、沙門氏菌和葡萄球菌在對照或接種了的小份中沒有增加。這樣，當儲存于75°F并用酵母、霉菌、乳酸菌、細菌、沙門氏菌和葡萄球菌攻擊下，
果實凍干產(chǎn)品至少28天內是微生物學穩(wěn)定的。如下所示，本產(chǎn)品在攻擊下是穩(wěn)定的。表30
果實-凍干的未接種對照樣表31
果實-凍干的接種樣VI.凍干AAI的貯存期研究凍干
制劑貯存期的研究由Silliker Laboratories實施并列于下面表32內。表32貯存期研究結果一種食品的味道、氣味和外觀(感官質量)是消費者用以判斷食品可接受程度的根本標準。這些品質在食品內的微生物區(qū)系-細菌、酵母和霉菌-生長并代謝可用營養(yǎng)時開始變化。感官性變化在微生物數(shù)量很高以前一般不易覺察。引起酸敗所需微生物的數(shù)量依食品種類和其中生長的微生物種類不同而不同。但是，通常，貯存期末限制了存放時間。因此，凍干
果實產(chǎn)品的貯存期為存于75°F至少12個月。實施例34大鼠內14天處理后觀察期研究’
果漿-凍干’急性口服毒性(限制檢測)進行大鼠內14天施用后觀察期的研究以評估凍干
果漿的急性口服毒性(研究代碼PCDL-0221；Pharmaceutical Control andDevelopment Laboratory Co.Ltd.，9.Mexik6i Street Budapest，H-1149)。I.一般信息A.劑量2000mg/kg體重的單次口服限制劑量的
果肉凍干物(批號22.10)通過強飼法口服施用于大鼠。觀察實驗動物的死亡率和中毒癥狀14天。在第15天開展總病理檢查。實驗動物的體重對應于它們的種類和在研究過程中的年齡?？诜┯?,000mg/kg劑量的’
果漿-凍干’未發(fā)生死亡。未觀察到中毒的臨床癥狀。第15天進行的預定的尸體解剖揭示沒有毒性總病理變化?？傻贸鼋Y論2000mg/kg單口服劑量的
果實凍干物在雄性和雌性大鼠內未發(fā)現(xiàn)副作用。B.目的開發(fā)在大鼠體內單劑量口服施用凍干
果漿的潛在毒性效果的數(shù)據(jù)。受檢物預期用于營養(yǎng)補充劑。C.研究類別臨床前毒理研究符合美國藥品食品監(jiān)督管理局的非臨床實驗研究實驗管理規(guī)范和Hungarian Act 1998XXVIII.管理動物保護的原則。限制實驗。D.對研究草案的偏離i.用于已消失的生產(chǎn)商的T61材料的特征原始草案Hoechst Veterinar GmbH最終報告Intervet International原因生產(chǎn)商名稱變更ii.死亡率原始草案施用4小時后進行觀察，之后每天兩次。最終報告施用4小時后進行觀察，之后在工作日開始和結束的時候每天進行兩次，周末每天進行一次，直到第15天早晨。原因過程被描述得比原來更為精確。iii.一般狀態(tài)，外觀，行為和臨床癥狀原始方法在施用后期間，對動物每天兩次檢查直至第15天早晨。最終報告在施用后期間，除周末對動物每天兩次檢查直至第15天早晨，周末檢查一次。原因過程被描述得比原來更為精確。II.待檢物和參考物A.待檢物特征待檢物特征詳見下面表33。表33 B.微生物分析微生物限制檢測由PCDL的微生物部依c.USP實施。C.用于懸浮待檢物的物質特征i.甲基纖維素甲基纖維素(批號127H1066；有效期02/2003)購自Sigma并在使用前存于室溫。ii.蒸餾水蒸餾水(批號A0010102；有效期03/2003)購自PCDL并在使用前存于室溫。iii.驗尸前過麻醉用品的特征T61(批號09W008；有效期05/2006)，每升含有0.2g乙甲丁酰胺，0.005g terracing鹽酸鹽和0.05g美貝碘銨，購自Intervet International并在使用前存于室溫下毒品用安全盒內。iv.待檢物配制在不早于施用前30分鐘稱取必要量的待檢物懸浮于含1％甲基纖維素的溶液中。制備下列懸液
2000mg/kg正常劑量5.0g
果漿加50ml 1％甲基纖維素溶液。在處理中用OP-951型Radelkis磁力攪拌器攪拌懸液。v.配制的待檢物的濃度控制取配制好的待檢物樣品檢查濃度和均一性。濃度和均一性檢查通過稱重法進行。所測懸液上部、中部和下部(均一性檢查)的三份三平行樣本的濃度在可接受的±10％范圍內，即，上+4.4±4.6％，中+4.0±4.8％，下+5.4±2.8％III.檢測系統(tǒng)A.動物Sprague Dawley大鼠，Crl∶CD BR(到達時6-7周齡)被用于本研究。雄性體重范圍從143.9g到159.4g。雌性體重從140.5g到161.4g。定購的動物群30(雄性15只，雌性15只)。研究中所用動物數(shù)量20(雄性10只，雌性10只)。大鼠購自Charles River Hungary Ltd。到達時動物是SPF并在研究過程中保存于常規(guī)環(huán)境。根據(jù)國際慣例通常用大鼠進行毒理實驗。Sprague Dawley株是具有充足譜系數(shù)據(jù)的周知的實驗模型。用耳朵標號鑒別動物并以5只同性的數(shù)量養(yǎng)于籠中?；\子貼有標簽，注明大鼠的ID號、研究編號、給藥途徑、性別和實驗期結束日期。動物飼養(yǎng)條件列于表34。環(huán)境條件列于表35。表34動物飼養(yǎng)條件表35環(huán)境條件連續(xù)記錄溫度和相對濕度。除了給藥前的禁食期、給藥期間和給藥后觀察的最初二小時，動物可自由獲得標準大鼠和小鼠鼠食VRF-1。食物的組成受控于制造商Altromin GmbH，D-4937 Lage/LippeLange Str.42。食品依制造日期區(qū)分(30.09.2002)，穩(wěn)定性4個月。大鼠經(jīng)飲水瓶可自由獲得自來水。飲用水由PCDL微生物系每月檢查。給藥前觀察動物5天。只有無任何臨床癥狀的健康的動物才用于本研究。動物分組按計算機產(chǎn)生的隨機表格進行。動物基于其體重被隨機分組，從而使每個組中的體重分布相似。IV.實驗設計劑量水平和分組列于表36。表36 劑量選擇的原理如下所述。預計人
果漿的日劑量為大約1000mg每天，對應于一個成人(70千克)14mg/kg體重或一個4歲兒童(20kg)50mg/kg。本研究所用2000mg/kg限制劑量對應于一個成人消費的140倍的日劑量或40倍兒童劑量，如果兒童的體重以5g計的話。V.給藥施用是強飼口服。施用途徑依國際慣例選擇?？诜緩绞墙邮艽龣z品的人類的預期途徑。待檢品的施用以單劑量實施。待檢品以20mg/kg體重的量施用。實驗期包括5天環(huán)境適應、給藥日、包括給藥日在內的14天給藥后觀察期，和第15天尸檢。VI.觀察，檢測A.致死率施用4小時后進行觀察，之后在工作日開始和結束的時候每天進行兩次，周末每天進行一次，直到第15天早晨。死亡時間應盡可能精確記錄。B.一般狀態(tài)，外觀，行為和臨床癥狀受藥前進行一次仔細的大鼠臨床觀察，然后，在給藥6小時后連續(xù)進行。在其后的時期里，除了周末檢查一次外，每天檢查兩次檢查動物直到第15天早晨。記錄要被觀察的癥候，包括皮膚、毛發(fā)、眼睛和可見粘膜的變化；分泌物和排泄物的出現(xiàn)和自律活性(例如，流淚、豎毛、腹瀉、瞳孔尺寸、非正常呼吸方式)。此外，步態(tài)、體態(tài)和對抓取的反應的潛在變化以及發(fā)生嗜睡、戰(zhàn)栗、痙攣或緊張的運動，重復或怪異的行為。C.體重在動物剛到實驗室時、隨機分組那天、給藥日和尸檢前實驗的第2、8、和15天對其稱重。VII.尸和組織檢查A.尸檢所有給藥后觀察期結束時存活的大鼠在T61過麻醉下解剖檢查。仔細觀察和記錄外部和內部狀態(tài)。未進行器官的顯微境檢查。VIII.評價，統(tǒng)計分析雄性組和雌性組分別評價A.參數(shù)值計算了關于體重的平均值和標準偏差。B.非參數(shù)值(致死率和臨床癥狀)制表列出死亡率、臨床癥狀和粗查結果。IX.方法實驗依照現(xiàn)行藥物控制和開發(fā)實驗室有限公司(Pharmaceutical Control and Development Laboratory Co.Ltd.)毒理部的標準操作程序進行。X.動物保護為了動物的利益避免對動物不必要的使用。命令對明顯垂死的動物的溫柔殺死由研究的主管人員負責。本方法(限制性檢測)使用了相比于其它已知和承認的急性毒理實驗減少了的實驗動物數(shù)量。XI.數(shù)據(jù)記錄和歸檔如標準操作程序所指示，以如下正確的形式保存所有原始數(shù)據(jù)
待檢品重量
動物房日志
體重日志
死亡和臨床觀察日志
尸檢記錄研究所得數(shù)據(jù)收集于研究文件夾中。研究記錄，所有研究中和研究結果的數(shù)據(jù)，與研究有關的所有文檔和信息，待檢樣品的對照樣和最終報告將在PCDL的檔案中保存至少15年然后提供給資助者。Xll.結果A.死亡率給藥后觀察期的14天內觀察到的死亡率概括于下面表37。表37 表38概括了‘
果漿-凍干’大鼠內急性毒理研究(限制性檢測)中給藥后觀察期的14天內雄性受檢對象的單獨的死亡數(shù)據(jù)。表38雄性 表39概括了‘
果漿-凍干’大鼠內急性毒理研究(限制性檢測)中給藥后觀察期的14天內雌性受檢對象的單獨的死亡數(shù)據(jù)。表39雌性 給大鼠單劑量口服施用2,000mg/kg劑量的‘
果漿-凍干’后未發(fā)生死亡。所有雄性和雌性存活至14天觀察期結束。B.臨床癥狀在14天給藥后觀察期內觀察到的臨床癥狀概括于下面表40表40 表41概括了‘
果漿-凍干’大鼠內急性毒理研究(限制性檢測)中14天給藥后觀察期內雄性受檢對象的單獨的臨床癥狀。表41雄性 表42概括了‘
果漿-凍干’大鼠內急性毒理研究(限制性檢測)中14天給藥后觀察期內雌性受檢對象的單獨的臨床癥狀。表42雌性 在給藥日和14天給藥后觀察期內未觀察到任何給藥組動物中毒。C.體重在14天給藥后觀察期內觀察到的雄性體重概括于下面表43。表43雄性 在14天給藥后觀察期內觀察到的雌性對象體重概括于下面表44。表44雌性 在14天給藥后觀察期內觀察到的雄性受檢對象體重變化概括于下面表45。表45雄性 在14天給藥后觀察期內觀察到的雌性受檢對象體重變化概括于下面表46。表46雌性 在14天給藥后觀察期內觀察到的雄性受檢對象個體體重概括于下面表47。表47雄性 在14天給藥后觀察期內觀察到的雌性受檢對象個體體重概括于下面表48。表48雌性 在14天給藥后觀察期內觀察到的雄性受檢對象個體體重變化概括于下面表49。表49雄性 在14天給藥后觀察期內觀察到的雌性受檢對象個體體重變化概括于下面表50。表50雌性 D.宏觀病理學受檢動物的宏觀病理學結果概括于表51。受檢雄性動物的宏觀病理學結果概括于表52。表52雄性 所有動物存活至預期在第15天的尸檢，所有動物檢驗證明沒有毒理學變化。E.評價單劑量口服施用2,000mg/kg‘
果漿-凍干’劑量后未發(fā)生死亡。未發(fā)生中毒臨床癥狀。按計劃在第15天進行的尸檢揭示無中毒性宏觀病理學變化。結論是未發(fā)現(xiàn)2,000mg/kg的單口服劑量‘
果漿-凍干’在雄性和雌性大鼠內的副作用。實施例35對Jucara果漿‘凍干’的急性口服毒性的大鼠內14天給藥后觀察期研究(限制檢測)進行大鼠內14天施用后觀察期的研究以評估凍干Jucara果漿的急性口服毒性(研究代碼PCDL-0222；Pharmaceutical Control andDevelopment Laboratory Co.Ltd.，9.Mexik6i Street Budapest，H-1149)。I.一般信息A.劑量2000mg/kb體重的單口服限制劑量的’Jucara果漿-凍干’(批號2208)通過強飼法口服施用于大鼠。觀察實驗動物的死亡率和中毒癥狀14天。在第15天開展總病理檢查。實驗動物的體重對應于它們的種類和在研究過程中的年齡。口服施用2,000mg/kg劑量的’Jucara果漿-凍干’未發(fā)生死亡。未觀察到中毒的臨床癥狀。第15天按計劃進行的尸體解剖揭示沒有中毒性總病理變化。結論是2000mg/kg單口服劑量的’Jucara果漿-凍干’在雄性和雌性大鼠內未發(fā)現(xiàn)副作用。B.目的開發(fā)在大鼠體內單劑量口服施用Jucara果漿-凍干的潛在毒性效果的數(shù)據(jù)。受檢物預期用于營養(yǎng)補充劑。C.研究類別臨床前毒理研究符合美國藥品食品監(jiān)督管理局的非臨床實驗研究實驗管理規(guī)范和Hungarian Act 1998XXVIII.管理動物保護的原則。限制級實驗。D.對研究草案的偏離i.用于已消失的生產(chǎn)商的T61材料的特征原始草案Hoechst Veterinar GmbH最終報告Intervet International原因生產(chǎn)商名稱變更ii.死亡率原始草案施用4小時后進行觀察，之后每天兩次。最終報告施用4小時后進行觀察，之后在工作日開始和結束的時候每天進行兩次，周末每天進行一次，直到第15天早晨。原因過程被描述得比原來更為精確。iii.一般狀態(tài)，外觀，行為和臨床癥狀原始方法在施用后期間，對動物每天兩次檢查直至第15天早晨。最終報告在施用后期間，除周末對動物每天兩次檢查直至第15天早晨，周末檢查一次。原因過程被描述得比原來更為精確。II.待檢物和參考物A.待檢物特征待檢物特征詳見下面表53。表53B.微生物分析微生物限制檢測由PCDL的微生物部依c.USP實施。C.用于懸浮待檢物的物質特征i.甲基纖維素甲基纖維素(批號127H1066；有效期02/2003)購自Sigma并在使用前存于室溫。ii.蒸餾水蒸餾水(批號A0010102；有效期03/2003)購自PCDL并在使用前存于室溫。iii.驗尸前過麻醉用品的特征T61(批號09W008；有效期05/2006)，每升含有0.2g乙甲丁酰胺，0.005g terracing鹽酸鹽和0.05g美貝碘銨，購自Intervet International并在使用前存于室溫下毒品用安全盒內。iv.待檢物配制在不早于施用前30分鐘稱取必要量的待檢物懸浮于含1％甲基纖維素的溶液中。制備下列懸液2000mg/kg正常劑量5.0g Jucara果漿加50ml 1％甲基纖維素溶液。在處理中用OP-951型Radelkis磁力攪拌器攪拌懸液。v.配制的待檢物的濃度控制取配制好的待檢物樣品檢查濃度和均一性。濃度和均一性檢查通過稱重法進行。所測懸液上部、中部和下部(均一性檢查)的三份三平行樣本的濃度在可接受的±10％范圍內，即，上+9.4±4.2％，中+9.4±4.6％，下+6.6±2.0％III.檢測系統(tǒng)A.動物Sprague Dawley大鼠，Crl∶CD BR(到達時6-7周齡)被用于本研究。雄性體重范圍從143.8g到151.9g。雌性體重從144.2g到161.6g。定購的動物群30(雄性15只，雌性15只)。研究中所用動物數(shù)量20(雄性10只，雌性10只)。大鼠購自Charles River Hungary Ltd。到達時動物是SPF并在研究過程中保存于常規(guī)環(huán)境。根據(jù)國際慣例通常用大鼠進行毒理實驗。Sprague Dawley株是具有充足譜系數(shù)據(jù)的周知的實驗模型。用耳朵標號鑒別動物并以5只同性的數(shù)量養(yǎng)于籠中?；\子貼有標簽，注明大鼠的ID號、研究編號、給藥途徑、性別和實驗期結束日期。動物飼養(yǎng)條件概括于下面表54中。表54環(huán)境條件概括于下面表55中。表55連續(xù)記錄溫度和相對濕度。除了給藥前的禁食期、給藥期間和給藥后觀察的最初二小時，動物可自由獲得標準大鼠和小鼠鼠食VRF-1。食物的組合物受控于制造商Altromin GmbH，D-4937 Lage/Lippe Lange Str.42。食品依制造日期區(qū)分(30.09.2002)，穩(wěn)定性4個月。大鼠經(jīng)飲水瓶可自由獲得自來水。飲用水由PCDL微生物系每月檢查。給藥前觀察動物5天。只有無任何臨床癥狀的健康的動物才用于本研究。動物分組按計算機產(chǎn)生的隨機表格進行。動物基于其體重被隨機分組，從而使每個組中的體重分布相似。IV.實驗設計劑量水平和分組列于表56表56劑量選擇的合理性如下所述。預計人Jucara果漿的日劑量為大約1000mg每天，對應于一個成人(70千克)14mg/kg體重或一個4歲兒童(20kg)50mg/kg。本研究所用2000mg/kg限制劑量對應于一個成人消費的140倍的日劑量或40倍兒童劑量，如果兒童的體重以5g計的話。V.給藥施用是強飼口服。施用途徑依國際慣例選擇?？诜緩绞墙邮艽龣z品的人類的預期途徑。待檢品的施用以單劑量實施。待檢品以20ml/kg體重的量施用。實驗期包括5天環(huán)境適應、給藥日、包括給藥日在內的14天給藥后察期，和第15天尸檢。VI.觀察，檢測A.致死率施用4小時后進行觀察，之后在工作日開始和結束的時候每天進行兩次，周末每天進行一次，直到第15天早晨。死亡時間應盡可能精確記錄。B.一般狀態(tài)，外觀，行為和臨床癥狀受藥前進行一次仔細的大鼠臨床觀察，然后，在給藥6小時后連續(xù)進行。在其后的時期里，除了周末檢查一次外，每天檢查兩次檢查動物直到第15天早晨。記錄要被觀察的癥候，包括皮膚、毛發(fā)、眼睛和可見粘膜的變化；分泌物和排泄物的出現(xiàn)和自律活性(例如，流淚、豎毛、腹瀉、瞳孔尺寸、非正常呼吸方式)。此外，步態(tài)、體態(tài)和對抓取的反應的潛在變化以及發(fā)生嗜睡、戰(zhàn)栗、痙攣或緊張的運動，重復或怪異的行為。C.體重在動物剛到實驗室時、隨機分組那天、給藥日和尸檢前實驗的第2、8、和15天對其稱重。VII.尸和組織檢查A.尸檢所有給藥后觀察期結束時存活的大鼠在T61過麻醉下解剖檢查。仔細觀察和記錄外部和內部狀態(tài)。未進行器官的顯微境檢查。VIII.評價，統(tǒng)計分析雄性組和雌性組合物分別評價A.參數(shù)值計算了關于體重的平均值和標準偏差。B.非參數(shù)值(致死率和臨床癥狀)制表列出死亡率、臨床癥狀和粗查結果。IX.方法實驗依照現(xiàn)行藥物控制和開發(fā)實驗室有限公司(Pharmaceutical Control and Development Laboratory Co.Ltd.)毒理部的標準操作程序進行。X.動物保護為了動物的利益避免對動物不必要的使用。命令對明顯垂死的動物的溫柔殺死由研究的主管人員負責。本方法(限制性檢測)使用了相比于其它已知和承認的急性毒理實驗減少了的實驗動物數(shù)量。XI.數(shù)據(jù)記錄和歸檔如標準操作程序所指示，以如下正確的形式保存所有原始數(shù)據(jù)
待檢品重量
動物房日志
體重日志
死亡和臨床觀察日志
尸檢記錄研究所得數(shù)據(jù)收集于研究文件夾中。研究記錄，所有研究中和研究結果的數(shù)據(jù)，與研究有關的所有文檔和信息，待檢樣品的對照樣和最終報告將在PCDL的檔案中保存至少15年然后提供給資助者。Xll.結果A.死亡率給藥后觀察期的14天內觀察到的死亡率概括于下面表57。表57表58概括了‘Jucara果漿-凍干’大鼠內急性毒理研究(限制性檢測)中給藥后觀察期的14天內雄性受檢對象個體的死亡數(shù)據(jù)。表58雄性 表59概括了‘Jucara果漿-凍干’大鼠內急性毒理研究(限制性檢測)中給藥后觀察期的14天內雌性受檢對象的單獨的死亡數(shù)據(jù)。表59雌性 給大鼠單劑量口服施用2,000mg/kg劑量的‘Jucara果漿-凍干’后未發(fā)生死亡。所有雄性和雌性存活至14天觀察期結束。B.臨床癥狀在14天給藥后觀察期內觀察到的臨床癥狀概括于下面表60表60表61概括了‘Jucara果漿-凍干’大鼠內急性毒理研究(限制性檢測)中14天給藥后觀察期內雄性受檢對象的單獨的臨床癥狀。表61雄性表62概括了’Jucara果漿-凍干’大鼠內急性毒理研究(限制性檢測)中14天給藥后觀察期內雌性受檢對象的單獨的臨床癥狀。表62雌性在給藥日和14天給藥后觀察期內未觀察到任何給藥組動物中毒。C.體重在14天給藥后觀察期內觀察到的雄性體重概括于下面表63表63雄性在14天給藥后觀察期內觀察到的雌性對象體重概括于下面表64表64雌性在14天給藥后觀察期內觀察到的雄性受檢對象體重變化概括于下面表65表65雄性在14天給藥后觀察期內觀察到的雌性受檢對象體重變化概括于下面表66表66雌性在14天給藥后觀察期內觀察到的雄性受檢對象個體體重概括于下面表67表67雄性在14天給藥后觀察期內觀察到的雌性受檢對象個體體重概括于下面表68。表68雌性在14天給藥后觀察期內觀察到的雄性受檢對象個體體重變化概括于下面表69。表69雄性在14天給藥后觀察期內觀察到的雌性受檢對象個體體重變化概括于下面表70。表70雌性動物的體重和體重增加對應于其種類和研究中的年齡。D.宏觀病理學受檢動物的宏觀病理學結果概括于表71。表71受檢雄性動物的宏觀病理學結果概括于表72。表72雄性受檢雄性動物的宏觀病理學結果概括于表73。表73雌性所有動物存活至預期在第15天的尸檢，所有動物檢驗證明沒有毒理學變化。E.評價單劑量口服施用2,000mg/kg’Jucara果漿-凍干’劑量后未發(fā)生死亡。未發(fā)生中毒臨床癥狀。按計劃在第15天進行的尸檢揭示無中毒性宏觀病理學變化。結論是未發(fā)現(xiàn)2,000mg/kg的單口服劑量‘Jucara果漿-凍干’在雄性和雌性大鼠內的副作用。
等價方案盡管本發(fā)明已結合其特定的實施方案描述，應當理解它能被進一步改進。此外，本申請意欲覆蓋本發(fā)明的任何改變、應用或改編，包括這些從本公開內容的偏離，該偏離在本發(fā)明所屬領域內已知或者通過常規(guī)實踐獲得，而屬于后附權利要求的范圍內。
權利要求
1.一種營養(yǎng)補充劑組合物，包含凍干的阿沙依(Euterpe edulis)(Jucara)果漿，其中所述組合物
(a)包含總濃度大于約1毫克/克總重的花色素苷；
(b)ORACFL值大于約350微摩爾TE/克總重；和
(c)殘留水含量小于總重的約3重量％。
2.一種營養(yǎng)補充劑組合物，包含凍干的Jucara果漿，其中所述組合物
(a)環(huán)加氧酶抑制值大于約15阿司匹林mg當量/克總重；和
(b)殘留水含量小于總重的約3重量％。
3.權利要求1或2的組合物，其中的營養(yǎng)補充劑組合物進一步包含藥用載體。
4.一種生產(chǎn)穩(wěn)定的和可口的Jucara-基營養(yǎng)補充劑組合物的方法，該方法包括以下步驟
(a)收獲Jucara果實；
(b)稱重Jucara果實；
(c)用水清洗Jucara果實；
(d)用水在約75℃到100℃的溫度下洗滌Jucara果實約5秒到10分鐘的一段時間；
(e)給Jucara果實去殼以從Jucara果實中分離Jucara果漿；
(f)將Jucara果漿冷凍至低于約-5℃的溫度；和
(g)在產(chǎn)生顆粒狀的、殘留水含量低于3重量％的凍干Jucara果漿粉末的條件下凍干Jucara果漿；
其中凍干Jucara果漿粉末比Jucara果漿制劑更穩(wěn)定和更可口。
5.權利要求4所述的方法，其中清洗步驟包括用0.1％(v/v)的衛(wèi)生水清洗Jucara果實。
6.權利要求4所述的方法，其中洗滌步驟包括在約80℃的溫度下在水中洗滌Jucara果實約10秒鐘的一段時間。
7.權利要求4所述的方法，其中去殼步驟包括將Jucara果實機械去殼約2分種到約5分鐘的一段時間，去殼步驟的進行使用約1升水/2千克Jucara果實。
8.權利要求4所述的方法，其中Jucara-基營養(yǎng)補充劑組合物的ORACFL值大于約350微摩爾TE/克總重。
9.權利要求4所述的方法，其中Jucara-基營養(yǎng)補充劑組合物具有的環(huán)加氧酶抑制值大于約15阿司匹林毫克當量/克總重。
10.一種預防或治療哺乳動物中由病理性自由基反應所導致的疾病或損傷的方法，該方法包括向該哺乳動物施用有效量的權利要求1-3中任何一項的Jucara-基營養(yǎng)補充劑組合物，其中該組合物猝滅自由基并減少由病理性自由基所導致的損傷。
11.權利要求10所述的方法，其中的疾病或損傷選自由下列各項組成的組癌癥、結腸癌、乳腺癌、炎性腸病、局限性回腸炎、血管病、關節(jié)炎、潰瘍、急性呼吸窘迫綜合征、缺血-再灌注損傷、神經(jīng)變性疾病、自閉癥、帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、腸胃病、炎癥導致的組織損傷以及環(huán)境毒素導致的組織損傷。
12.一種減輕哺乳動物內病理性自由基反應的有害效應的方法，所述哺乳動物遭受疾病或損傷，該疾病或損傷是由哺乳動物中的病理性自由基反應所導致的，所述方法包括向該哺乳物施用有效量的權利要求1-3中任何一項的Jucara-基營養(yǎng)補充劑組合物，其中該組合物猝滅自由基并減少由病理性自由基所導致的損傷。
13.權利要求12所述的方法，其中的疾病或損傷選自由下列各項組成的組癌癥、結腸癌、乳腺癌、炎性腸病、局限性回腸炎、血管病、關節(jié)炎、潰瘍、急性呼吸窘迫綜合征、缺血-再灌注損傷、神經(jīng)變性疾病、自閉癥、帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、腸胃病、炎癥導致的組織損傷以及環(huán)境毒素導致的組織損傷。
14.一種抑制哺乳動物內環(huán)加氧酶的方法，該方法包括向該哺乳物施用有效量的組合物，該組合物包含權利要求1-3中任何一項的Jucara-基營養(yǎng)補充劑組合物。
15.權利要求14所述的方法，其中組合物進一步包含藥用載體。
16.權利要求14所述的方法，其中組合物通過選自下組的施用途徑施用口服、靜脈內、腹膜內、皮下、肌內、關節(jié)內、動脈內、大腦內、小腦內、支氣管內、鞘內、局部的、和氣溶膠途徑。
17.一種預防或治療哺乳動物體內與環(huán)加氧酶活性升高相關的疾病或損傷的方法，該方法包括向該哺乳物施用有效量的組合物，該組合物包含權利要求1-3中任何一項的Jucara-基營養(yǎng)補充劑組合物。
18.權利要求17所述的方法，其中組合物進一步包含藥用載體。
19.權利要求17所述的方法，其中組合物通過選自下組的施用途徑施用口服、靜脈內、腹膜內、皮下、肌內、關節(jié)內、動脈內、大腦內、小腦內、支氣管內、鞘內、局部的、和氣溶膠途徑。
20.權利要求17中所述方法，其中的疾病或損傷選自由下列各項組成的組癌癥、結腸癌、乳腺癌、炎性腸病、局限性回腸炎、血管病、關節(jié)炎、潰瘍、急性呼吸窘迫綜合征、缺血-再灌注損傷、神經(jīng)變性疾病、自閉癥、帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、腸胃病、炎癥導致的組織損傷以及環(huán)境毒素導致的組織損傷。
21.一種營養(yǎng)補充劑組合物，包含凍干的阿薩依(Euterpe oleracea)(Acai)果漿，其中組合物
(a)包含總濃度大于約1毫克/克總重的花色素苷；
(b)ORACFL值大于約350微摩爾TE/克總重；和
(c)殘留水含量小于總重的約3重量％。
22.一種營養(yǎng)補充劑組合物，包含凍干的Acai果漿，其中所述組合物
(a)環(huán)加氧酶抑制值大于約15阿司匹林mg當量/克總重；和
(b)殘留水含量小于總重的約3重量％。
23.權利要求21或22中的組合物，其中的營養(yǎng)補充劑組合物進一步包含藥用載體。
24.一種生產(chǎn)穩(wěn)定的和可口的Acai-基營養(yǎng)補充劑組合物的方法，該方法包括以下步驟
(a)收獲Acai果實；
(b)稱重Acai果實；
(c)用水清洗Acai果實；
(d)用水在約75℃到100℃的溫度下洗滌Acai果實約5秒到10分鐘的一段時間；
(e)給Acai果實去殼以從Acai果實中分離Acai果漿；
(f)將Acai果漿冷凍至低于約-5℃的溫度；和
(g)在產(chǎn)生顆粒狀的、殘留水含量低于3重量％的凍干Acai果漿粉末的條件下凍干Acai果漿；
其中凍干Acai果漿粉末比Acai果漿制劑更穩(wěn)定和更可口。
25.權利要求24所述的方法，其中清洗步驟包括用0.1％(v/v)的衛(wèi)生水清洗Acai果實。
26.權利要求24所述的方法，其中洗滌步驟包括在約80℃的溫度下在水中洗滌Acai果實約10秒鐘的一段時間。
27.權利要求24所述的方法，其中去殼步驟包括將Acai果實機械去殼約2分種到約5分鐘的一段時間，去殼步驟的進行使用約1升水/2千克Acai果實。
28.權利要求24所述的方法，其中Acai-基營養(yǎng)補充劑組合物的ORACFL值大于約350微摩爾TE/克總重。
29.權利要求24所述的方法，其中Acai-基營養(yǎng)補充劑組合物具有的環(huán)加氧酶抑制值大于約15阿司匹林毫克當量/克總重。
30.一種預防或治療哺乳動物中由病理性自由基反應所導致的疾病或損傷的方法，該方法包括向該哺乳動物施用有效量的權利要求21-23中任何一項的Acai-基營養(yǎng)補充劑組合物，其中該組合物猝滅自由基并減少由病理性自由基所導致的損傷。
31.權利要求30所述的方法，其中的疾病或損傷選自由下列各項組成的組癌癥、結腸癌、乳腺癌、炎性腸病、局限性回腸炎、血管病、關節(jié)炎、潰瘍、急性呼吸窘迫綜合征、缺血-再灌注損傷、神經(jīng)變性疾病、自閉癥、帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、腸胃病、炎癥導致的組織損傷以及環(huán)境毒素導致的組織損傷。
32.一種減輕哺乳動物內病理性自由基反應的有害效應的方法，所述哺乳動物遭受疾病或損傷，該疾病或損傷是由哺乳動物中的病理性自由基反應所導致的，所述方法包括向該哺乳物施用有效量的權利要求21-23中任何一項的Acai-基營養(yǎng)補充劑組合物，其中該組合物猝滅自由基并減少由病理性自由基所導致的損傷。
33.權利要求32所述的方法，其中的疾病或損傷選自由下列各項組成的組癌癥、結腸癌、乳腺癌、炎性腸病、局限性回腸炎、血管病、關節(jié)炎、潰瘍、急性呼吸窘迫綜合征、缺血-再灌注損傷、神經(jīng)變性疾病、自閉癥、帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、腸胃病、炎癥導致的組織損傷以及環(huán)境毒素導致的組織損傷。
34.一種抑制哺乳動物內環(huán)加氧酶的方法，該方法包括向該哺乳物施用有效量的組合物，該組合物包含權利要求21-23中任何一項的Acai-基營養(yǎng)補充劑組合物。
35.權利要求34所述的方法，其中組合物進一步包含藥用載體。
36.權利要求34所述的方法，其中組合物通過選自下組的施用途徑施用口服、靜脈內、腹膜內、皮下、肌內、關節(jié)內、動脈內、大腦內、小腦內、支氣管內、鞘內、局部的、和氣溶膠途徑。
37.一種預防或治療哺乳動物體內與環(huán)加氧酶活性升高相關的疾病或損傷的方法，該方法包括向該哺乳物施用有效量的組合物，該組合物包含權利要求21-23中任何一項的Acai-基營養(yǎng)補充劑組合物。
38.權利要求37所述的方法，其中組合物進一步包含藥用載體。
39.權利要求37所述的方法，其中組合物通過選自下組的施用途徑施用口服、靜脈內、腹膜內、皮下、肌內、關節(jié)內、動脈內、大腦內、小腦內、支氣管內、鞘內、局部的、和氣溶膠途徑。
40.權利要求33中所述方法，其中的疾病或損傷選自由下列各項組成的組癌癥、結腸癌、乳腺癌、炎性腸病、局限性回腸炎、血管病、關節(jié)炎、潰瘍、急性呼吸窘迫綜合征、缺血-再灌注損傷、神經(jīng)變性疾病、自閉癥、帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、腸胃病、炎癥導致的組織損傷以及環(huán)境毒素導致的組織損傷。
全文摘要
本發(fā)明涉及穩(wěn)定的、可口的、凍干的水果基營養(yǎng)補充劑。明確地，本發(fā)明涉及Acai果實和Jucara果實的具高抗氧化性能和環(huán)加氧酶抑制活性的組合物及其應用。本發(fā)明進一步提供從Acai果實和Jucara果實中制作穩(wěn)定的、可口的、凍干的水果基營養(yǎng)補充劑的方法。
文檔編號A23L1/30GK1791418SQ20048001385
公開日2006年6月21日 申請日期2004年3月22日 優(yōu)先權日2003年3月21日
發(fā)明者K·A·默多克, A·G·紹斯 申請人:K2A公司